Компонентный анализ спектров флуоресценции как метод исследования структурных и физико-химических переходов в белках

Емельяненко, Виктор Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Компонентный анализ спектров флуоресценции как метод исследования структурных и физико-химических переходов в белках
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Компонентный анализ спектров флуоресценции как метод исследования структурных и физико-химических переходов в белках"

На правах рукописи

ЕМЕЛЬЯНЕНКО Виктор Иванович

КОМПОНЕНТНЫЙ АНАЛИЗ СПЕКТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПЕРЕХОДОВ В БЕЛКАХ

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Ои-зио --

Пущино-2007

003061623

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Бурштейн Эдуард Аронович

Официальные оппоненты: доктор физико - математических наук

Гапеев Андрей Борисович

доктор биологических наук Климов Вячеслав Васильевич

Ведущая организация:

Институт биологического приборостроения РАН, Пущино

Защита диссертации состоится «19» сентября 2007 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 002.093,01 при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д.З, Московская область, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан «16» августа 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд.физ-мат наук

Н Ф. Панина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Изучение структурных и физико-химических переходе» в белках имеет важнейшее значение в исследовании их биологических и физических свойств.

Среди различных физических и химических методов исследования заметную роль играют методы, основанные на регистрации и интерпретации изменений флуоресценции. Люминесцентная спектроскопия является мощным и универсальным методом изучения структурных, физико-химических и функциональных свойств белков. Флуоресцирующие аминокислотные остатки белка - триптофан, тирозин и фенилаланин (Конев, 1965; Бурштейн, 1976, 1977а; Лакович, 1986; Permyakov, 1993), или присоединенные красители (Weber & Farris, 1979; Владимиров и Добрецов, 1980; Semisotnov et а), 1991) несут информацию об изменении физических и химических свойств окружения в процессе перехода.

При анализе переходов чаще всего рассматриваются изменения интегральных значений параметров флуоресценции целого набора флуорофоров, которые могут быть расположены в разных участках белковой молекулы и находиться в процессе перестройки между разными структурными и (или) физическими состояниями. При этом теряется специфическая информация о различиях в изменении структурных и физических свойств в разных участках белковых молекул и о неодинаковом поведении отдельных популяций молекул в процессе перехода.

В связи с этим возникает необходимость разработки новых приемов анализа изменений спектров флуоресценции, которые должны обеспечить более полную их интерпретацию при исследовании структурных переходов в белках. Одним из таких подходов является разложение спектров флуоресценции на компоненты, соответствующие излучению отдельных флуорофоров или их групп, что позволяет следить за изменением состояния их окружения в процессе перехода.

Цели и задачи исследования. Главной целью настоящей работы является разработка и обоснование новых подходов в изучении состояний и структурных перестроек в белках, основанных на компонентном анализе составных спектров флуоресценции остатков триптофана или присоединенных флуоресцентных меток.

Для достижения этого было необходимо решить следующие задачи:

- Исследовать взаимозависимости параметров лог-нормальной функции, описывающей контуры спектров флуоресценции флуорофоров в различных условиях. Определить функцию, описывающую форму элементарного однородного спектра флуресценции флуорофора в белке.

- Разработать методы разложения составных спектров белков на индивидуальные лог-нормальные компоненты и проверить применимость предлагаемого подхода для анализа составных спектров флуоресценции белков.

- Исследовать на основе выбранных подходов структурные и физико-химические переходы в белках, вызываемые различными физико-химическими факторами.

- Охарактеризовать общие приемы и возможности использования компонентного анализа спектров флуоресценции для определения молекулярных особенностей структурных и физико-химических переходов в белках. Проанализировать методические особенности, информативность и пределы применимости разработанных подходов

Научная новизна и значимость работы. Показано, что широкие асимметричные спектры флуоресценции различных органических флуорофоров описываются четырехпараметрической функцией лог-нормального распределения.

Параметры различающихся по положению спектров излучения одного и того же вида флуорофора в окружении с различной полярностью и подвижностью строго взаимозависимы. Вследствие этого форма спектра флуоресценции триптофана и рада других сложных молекул определяется только положением его максимума и может быть представлена однопараметрической лог-нормальной функцией, что существенно упрощает процедуру компонентного анализа.

Показано, что сложные спектры белковой флуоресценции можно однознач^? разложить на компоненты, спектральные параметры которых характеризуют окружение индивидуальных флуорофоров в составе бежа или классов флуорофоров с одинаковыми спектральными характеристиками.

Разработанные приемы и методы повышают информативность спектр офлуоресцентного исследования природы структурных и физико-химических переходов в белках. Высокая точность описания формы спектра дает возможность проведения в дальнейшем более глубоких экспериментальных и теоретических исследований.

Практическая ценность. Разработанные методы и подходы используются в конкретных научных исследованиях. Эмпирическая однопараметрическая лог-нормальная функция используется в изучении как фотофизических свойств флуорофоров, так в исследовании белков методом флуоресценции.

Идентификация формы спектра флуоресценции элементарного состояния остатков триптофана позволила уточнить широко используемую

интерпретационную модель статистически дискретных состояний остатков триптофана в белках.

Разработаны алгоритмы описания и разложения на компоненты спектров флуоресценции органических флуорофоров, в том числе остатков триптофана в белках и органических флуоресцентных меток и зондов.

Предложенные подходы позволяют выделить в сложном спектре излучения спектральные компоненты отдельных флуорофоров или их классов в белке и исследовать локальные изменения их окружения в процессе структурного или физико-химического перехода, что расширяет арсенал методов изучения характеристик и природы функциональных переходов в белках

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1980-1991); Ш Всесоюзном совещании «Люминесцентные анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение» (Рига, 1988); Международной конференции «Физика и химия органических люминофоров 95» (Харьков, 1995); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Международной конференции по люминесценции и фотофизике в честь 100-летия Яблонского (Торунь, Польша, 1998); П и Ш Съездах биофизиков России (Москва, 1999 и Воронеж, 2004); научных конференциях ИТЭБ РАН; 7-ой Конференции но методам и приложению флуоресценции (Амстердам, Нидерланды, 2001).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах, содержит 19 рисунков, 9 таблиц, 2|0 ссылок на цитируемую литературу и состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы».

Материалы и методы

Препараты Аминокислоты и их производные получены от фирм Ferak и Chemapol; продан и акрилодан - от фирмы Molecular Probes. Спектроскопически чистые растворители получены от фирмы Aldrich Chemical Со. Мочевину и Kl (Реахим) дополнительно очищали путем перекристапизации из этанола. В опытах по тушению флуоресценции иодидом в раствор KI для предотвращения образования if добавляли до 0,1 MMNaaSaOj.

Мелитгин был выделен и очищен методом, описанным ранее (Демченко и др, 1987), Р-лактоглобулин получен по методике (Капланас и др., 1975). Бычий сывороточный альбумин (БСА) производства фирмы Sigma был предварительно обезжирен по (Chen, 1967) и очищен от димеров и агрегатов (Нямаа и др., 1984). Препараты лизоцима куриного

яйца дрожжевой 3-фосфоглицераткиназы, алкогольдегидрогеназы из печени лошади, фирмы Sigma были очищены от низкомолекулярных примесей диализом или на колонке с сефадекеом G-25. Субфрагмент 1 (S1) миозина (томер AI), актин, конъюгаты акрилодана с S1 миозина и с актином были получены Андреевым O.A. как описано в работе (Емельяненко и др., 2000).

Концентрации белков и продана определяли спектрофотометрически, используя значения молярных коэффициентов экстинкции, а конъюгатов белков с акрилоданом - по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

Спектральные измерения Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах Sbimadzu UV1600U или Specord UV-VIS (Carl Zeiss). Спектры флуоресценции измеряли на автоматизированном спектрофлуориметре лабораторного изготовления (Burstem et al., 1974) Температуру образца в кювете изменяли с помощью элемента Пельтье и измеряли с помощью калиброванной термопары. Величину pH растворов измеряли с помощью рН-метра рН-410 (Аквилон). Все спектры флуоресценции были исправлены на спектральную чувствительность прибора (Емельяненко, 1991). Преобразование спектра в шкалу волновых чисел осуществляли по формуле. I(v) = 1(A) Л2

Спектры флуоресценции красителей и их конъюгатов с белками были измерены Решетняк Я. К, спектры флуоресценции белка ОЕР-16 и его мутантов измерены D. Linke. Спектры флуоресценции 1- и 2-ацетилантраценов в различных растворителях были любезно предоставлены нам проф. А. С. Черкасовым (ГОИ, Ленинград), а спектры З-амино-М-метапфталимида - И. М. Гулисом (БГУ, Минск).

Обработка и анализ спектров флуоресценции. Параметры спектров флуоресценции в шкале волновых чисел (положение максимума vm, положения полумаксимальных амплитуд v+ и и_ и максимальную интенсивность 1т) определяли, аппроксимируя его лог-нормальной функцией вида:

/(v) = /даехр{-1п2-1п2(а-v)/(a-vj„)/In2p)) при v<a (1)

Д v) = 0 при у> а,

где р = (v„,-vj/(v+-vnj - параметр асимметрии спектра; а - vm+Hp/({f -1), Я = v+ - - полуширина спектра. Площадь под спектром вычисляли по формуле:

S=ImH(2n)in с ехр(с2/2)р/(р2-1) = Im S0 (vm, v+! к), (2)

где с = 1пр / 1п2, S0 - площадь под 1фивой (1) при 1т = 1.

Составные спектры представляли суммой однопараметрических лог-нормальных функций (1), полученной с учетом зависимости между v+ и к. от vm (см. далее).

= Imyl( v, Vmj), где j - номер компоненты

Компонентный анализ спектров флуоресценции проводили, обрабатывая одновременно весь массив спектров, полученных при разных значениях концентрации белка, тушителя, ионной силы или температуры, варьируя все максимальные амплитуды компонент и считая положения их максимумов постоянными для всего массива. Аппроксимацию экспериментальных спектров лог-нормальной функцией проводили, используя программу оптимизации, основанную на методе Маркуардта (Marquardt, 1963), минимизируя глобальный функционал:

ф-lLк 5л(1эхся — Уеыч) , где индекс к обозначает суммирование по числу экспериментальных спектров, i — по числу измеренных точек в спектре. Качество разложения оценивали по величине среднеквадратичной ошибки.

Определение формы элементарного спектра флуоресценции флуорофоров

Лог-нормальная функция (1) была использована нами для описания формы спектров флуоресценции различных флуорофоров. Полученные

Ряс. 1. Аппроксимация спектров флуоресценции органических флуорофоров лог-нормальной функцией (1) (а) - экспериментальные значения интенсивносгей (точки) спектров и расчетные кривые (линия) для спектров бисульфата хинина в 1н НгБО.* (1), 1 -ацетилантрацена в метаноле (2), З-амино-Н-метилфталимида в гексане (3); продана в циклогексане (4), 2-аминогшридина в 1н НгЭС^ (5), ЭЬ -триптофана в воде (6), химогрипсиногена рН 8 (7) и ОЬ-тирозинав воде (8) Позиции параметров ут, у+,и v- , лог-нормальной функции указаны стрелками, (б) -относительные (в % к максимальной интенсивности) отклонения расчетных спектров от экспериментальных (стрелки - положение максимумов соответствующих спектров)

расчетные лог-нормальные кривые (1) описывают экспериментальные спектры разных флуорофоров, даже на их дальних крыльях (рис. 1а) Хорошее совпадение экспериментальных и теоретических спектров видно из графиков распределения остатков (рис 16). В результате подгонки

Результаты

V 10'\см1 [ 8

теоретической функции (1) к экспериментальным значениям интенсивности можно с высокой точностью определить значения параметров спектра 1т, и» и к., а также площадь под спектром

Зависимость между параметрами 14 и V-, характеризующими форму спектров флуоресценции растворов СЗ-замещенных производных

Ряс. 2. Линейная зависимость между параметрами у„, и v- для однородных спектров флуоресценции производных индола (о) и белков (х) азурина, химотрипсиногена А, ¡3 -лактоглобулина (рН 2,4), Ь-меромиозина, сывороточного

альбумина (рН 6), нейротоксина кобры, куриного кальдесмона и моноыерного мелитгина

индола и дипептидов триптофана в различных растворителях, представлена на рис. 2. Полученные линейные зависимости описываются уравнениями:

= 0,831ц,+ 7070 (см'1) (3)

= 1,177 уи- 7780 (см-1).

Это означает, что положение максимума полностью определяет форму спектра флуоресцении..

Однородные спектры триптофановой флуоресценции белков

Анализ параметров спектров флуоресценции белков (см. рис.2), содержащих различное число остатков триптофана, излучение которых обусловлено лишь одним спектральным классом (Витает е! а1., 1973; Бурштейн, 1977а) показал, что ц,, у+ и к. действительно соответствуют линейной зависимости (3). Характерной особенностью таких спектров является то, что, как и для однородных спектров производных индола в растворах, в присутствии тушителя форма спектра флуоресценции не изменяется и при данном положении максимума эти спектры имеют минимальную полуширину. Нами не выявлены спектры белков с меньшей полушириной, чем следует из соотношения (3).

Таким образом, форма элементарных спектров флуоресценции остатков триптофана в белках может быть описана однопараметрической лог-нормальной функцией в виде уравнений (1) и (3).

Влияние растворителя на форму и положение спектров флуоресценции продана и акрилодана

Для спектров флуоресценции метки продана и зонда акрилодана в конъюгате с трипептидом Ьуз-Сув-РЬе, измеренных в разных растворителях, также были получены линейные зависимости между

параметрами ут у_и (рис. 3). На этой зависимости можно выделить два линейных участка, которые соответствуют спектрам, измеренным в апротонных (>т >~21000 см"') и протонных (ц, <-21000 см-1) растворителях. Линейные зависимости описываются уравнениями:

(4)

(4а)

V- = 0,8858 ум+687,31 (см"1) у+= 1,1151 ут - 832,92 (см-1) для протонных растворителей и V. = 0,965 930,19 (см1) = 0,936 у„ + 2832,70 (см~!) для апротонных растворителей.

Рве 3 Зависимости полумаксимальных амплитуд и V- от положения максимума спектров флуоресценции ут для продана (о), конъюгата акрилодана с трипептидом (Л) в разных растворителях и конъюгата

22 24--26 акрилодана с Р- и Сг-шшшом (х)

у„10 ,см

Параметры спектров конъюгата акрилодана с Б- и в-актином также соответствуют этим зависимостям.

Таким образом, форма спектров флуоресценции производных диметиламинонафталина однозначно определяется положением его максимума. Уравнения (1) и (4,4а) являются аналитическим выражением формы спектра однородной флуоресценции продана и акрилодана в разных средах.

Выявленные закономерности позволяют предположить, что для спектров флуоресценции многих органических флуорофоров и их производных с различными заместителями в различных условиях окружения форма полосы (ширина и асимметрия) однозначно связана с положением ее максимума

Полученная нами однозначная линейная зависимость между положением максимума и положением полумаксимальных амплитуд позволяет уменьшить число параметров каждой лог-нормальной компоненты до двух - положения максимума и максимальной амплитуды. Это значительно упрощает задачу разложения составных спектров флуоресценции белков, содержащих флуорофоры в различном окружении.

Тестирование разложения спектров флуоресценции на элементарные лог-нормальные компоненты

Возможность применения аналитических выражений в виде функций (1) и (3) для определения параметров спектров излучения индивидуальных остатков или классов остатков проверена на экспериментальных спектрах

флуоресценции белка ОЕР-16 из наружной мембраны хлоропласте» гороха, содержащего два остатка триптофана (\У77 и \V100) и его однотриптофановых мутантов \V77F и W100F (рис. 4а). Несмотря на наличие в излучении растворов этих белков спектральной компоненты неизвестной природы с максимумом 320 нм, положение максимумов элементарных компонент точно соответствовало излучению W77 и \V100 в каждом из мутантов (335 и 339,5-341 нм, соответственно (рис. 46). Совпали и значения констант Штерна-Фольмера, характеризующие доступность остатков триптофана в интактном ОЕР-16 и в мутантах \VI00F и \V77F 0,83—1,2 и 1,9-2,3 М"1, соответственно (рис. 4а, б).

Ряс 4 Определение положения максимумов и вкладов остатков триптофана в спектрах флуоресценции однотриптофановых мутантов ОЕР-16 W100F в W77F (а) и разложение ва лог-нормальные компоненты спектров ОЕР-16 дикого типа (6) На вкладках представлены графики Штерна-Фольмера для каждого мутанта (а) и ОЕР-16 дикого типа (б); обозначения точек о - TrplOO, х - Ттр77, пунктир -компонента неизвестной природы

Сравнение параметров лог-нормальных компонент, полученных нами при разложении спектров флуоресценции белков (см. табл. 1), с параметрами компонент, приведенных в литературе показывает хорошее соответствие.

Таблица 1. Параметры компонент, полученных при разложении спектров флуоресценции белков различными методами

Белок, условия kl, нм at Лг, им аг Литература, метод

3-фосфоглицераткиназа 325 0,13 340 0,87 Privat et а!, 1980

pH 3,9 __ 324 0,30 341 0,70 Данная работа

Лизоцим, pH 5,2 345 Lehrer, 1971

328 348 Yamashita et al ,1995

330 0,51 345 0,49 Данная работа

Алкогольдегидрогиназа, 324 039 340 0,61 EftraketaL, 1987

pH 7,5 326 0,43 336 0,57 Wasylewski et al, 1988

326 0,52 334 0,48 Данная работа

Таким образом, разложением составных экспериментальных спектров на компоненты, задаваемые в виде двухпараметрических лог-нормальных функций, можно достоверно определять положение максимумов и вклады элементарных компонент, соответствующих излучению отдельных остатков триптофана, зондов и меток или их групп в белке, а также оценивать их доступность растворителю. Это создает возможность исследования характеристик структурных и физико-химических переходов в белках.

Исследование структурных переходов в мелиттине в процессе олигомеризации

Для проверки возможности применения компонентного анализа в исследовании перестроек белковых молекул был выбран хорошо охарактеризованный процесс тетрамеризации мелитшна из яда пчелы (26 остатков; 1 остаток триптофана), под действием изменений ионной силы и концентрации белка при разных температурах и значениях рН раствора.

Спектр излучения мономерного мелитшна имеет максимум при 349 им (рис. 5, спектр 1) и с большой точностью описывается одной элементарной лог-нормальной функцией (уравнения 1 и 3).

В присутствии 1 М (Хт = 335 им) и 2М КС1 (Хт = 332,5 им) ширина спектров мелитшна превышает теоретические значения для лог-нормальных функций с такими же положениями максимума. Спектры флуоресценции мелитгина при различных концентрациях КС1 описываются суммой трех двухпараметрических лог-нормальных

Рис. 5. Спектры флуоресценции мелштина при рН 7,4 в присутствии различных концентраций КС1: 1-ОМ, 2-0,5 М, 3 - 1,0 М, 4 - 2,0 М К.С1 Пунктиром представлены спектры лог-нормальных компонент 2т 22, щ21 спектра 2 с максимумами при 349 нм, 329 нм, и 344 нм, соответственно; 3 2 и 3 1- соответствующих компонент _ спектра 3,4 1 и 4 2 - компонент спектра 4

"зОО 320 340 360 380 400 1 описывается лог-нормальной

функцией с максимумом при 349 ам

Х,нм

3,0 -

г л пл.

отед. Р(Г зу

. § г /21

0,5 - й ,3г

компонент, в качестве одной из которых принят спектр излучения мономера (пунктирные спектры на рис. 5). Зависимости вкладов компонент от ионной силы показаны на рис. 6.0 наличии двух переходов с ростом ионной силы свидетельствуют изоэмиссионная точка при 346 нм в серии спектров при концентрациях КС! до 1 М и отход от нее при

дальнейшем росте ионной силы (рис. 5), а также различное поведение вкладов лог-нормальных компонент при концентрациях КС! свыше 1 М (рис. 6а). Следовательно, с ростом ионной силы до 1 М происходит кооперативный переход из мономерного состояния мелштина в некое промежуточное, а при концентрациях КС1 >1 М имеет место второй кооперативный переход. Этот вывод подтверждается представлением изменений спектров флуоресценции в форме «фазовых графиков» (рис. 66), на котором наблюдаются две линейные ветви и излом между ними при ~1 М КС1.

1,5 2,0 KCJ.M

1,15

го

1,Ю 1,05 1,00 0,95 0,90

2МШ

МКС1

с*

о\

схоомш

0,7

0,8

Ряс. б. а - Зависимость вкладов яог-нормальных компонент в общую площадь под спектрами флуоресценции (ОДНО-4 М мелинита при pH 7,4) от концентрации KCl (о) - вклада компоненты с Хв при 349 нм, (п>- при 344 нм, (Д) - при329 нм б-Фазовое представление изменений спектров флуоресценции мелитпша при изменении концентрации KCl в координатах интенсивностей флуоресценции при 360 и 320 ни

При исследовании тушения флуоресценции тетрамера мелштина (2,0 М KCl) иодидом (табл. 2) показано, что компоненты спектров имеют разные константы Штерна-Фольмера, т.е. определяющие их остатки триптофана имеют существенно разную доступность растворителю, чгго не согласуется с одинаковым состоянием субъединиц в кристаллической структуре тетрамерного мелштина.

Таблица 2. Параметры тушения компонент спектра флуоресценции тетрамерного мелитгана (2,0 М KCl, 7-10"5 М мелитгина)

Параметры Компонента I Компонента 2

Ха компоненты (по тушению KJ), нм 327,2±0,5 343,2±0,99

Ksv, М"1 - константа Штерна-Фольмера для тушения KI 2,33±0,66 9,20±1,73

а, - вклад компоненты в общий спектр 0,52±0,08 0,48±0,08

Исследование влияния концентрации мелитгана на процесс олигомеризации проведено в присутствии 0,8 М КС1 при рН 7,4. С ростом концентрации мелитгана от 3 10"5 до 2 10"2 М положения максимумов

спектров смещаются от 349 до 333 нм, т.е. до положения, соответствующего предельному сдвигу в 2 М KCl. Это означает, что и при промежуточном значении ионной силы и достаточно высокой концентрации белка завершаются оба перехода олигомеризации. Положения максимумов компонент, как и в зависимости от ионной силы, равны 329, 344 и 349 нм. В присутствии 0,8 М KCl при концентрации мелитгина более 0,2-0,3 мМ компонента с максимумом при 349 нм практически исчезает и спектры описываются суммой лишь двух компонент с при 329 и 344 нм (рис 7а).

Для выяснения стехиометрии олигомеризации мелитгина до образования интермедиата (концентрации KCl до 0,8 М и концентрациях белка до ~510 М) проведен анализ падения вклада мономерной компоненты в спектр флуоресценции при увеличении концентрации белка (рис. 7а). После поправки вкладов в излучение на соотношение квантовых

Рис. 7. а - Зависимости от концентрации мелитгина вкладов лог-иормальных компонент в общую площадь под спектрами флуоресценции в 0,8 М КС1 при рН 7,4 (вклады компоненты при 349 (о), 344 (□) и 329 нм (Л)

б - Определение стехиометрии олигомеризации мелитгина на стадии образования интермедиата по зависимости концентрации мономерной компоненты (аС) от общей концентрации мелитгина С Измерения проведены с ростом концентрации мелитгина до 5 10 М в 0,8 М КС1

выходов флуоресценции мономера и олигомера (суммы компонент 329 и 344 нм) определяли молярные вклады мономера а в общее содержание мелитгина. Равновесная олигомеризация описывается уравнением*

где К - константа равновесия олигомеризации; С - общая концентрация мелитгина; п - степень олигомеризации. После логарифмирования получаем:

1о^(1-а)С) = п-к>§»(аС)+ \ogK-Из линейного графика зависимости к^((1-а)С) от к^(аС) (рис. 76) следует, что п = 4,3±0,4, а = 16,9 ±2,0. Следовательно, уже на первой стадии перехода идет кооперативная тетрамеризация мелитгина

1о0[мелиттин]

К = (1-а)С/(аС)",

Индуцируемые рН переходы в тетрамере мелитгина

Измеренные при разных значениях рН спектры флуоресценции тетрамерного мелитгина описываются лог-нормальными компоненами с максимумами при 328 и 344 им. Зависимости их квантовых выходов от рН представлены кривыми 2 и 3 на рис. 8а.

В интервале рН от 7,0 до 9,0 выход флуоресценции компоненты при 328 нм падает на 25% без изменения выхода компонента при 344 ям, что приводит к длинноволновому сдвигу суммарного спектра (рис. 8а, кривая 4). Это свидетельствует об изменении структурного или динамического окружения остатка триптофана с коротковолновым положением максимума, т.к депротонирование в этой зоне рН какой-либо белковой группировки не вызывает усиления тушения флуоресценции остатков триптофана (Бурштейн, 1976).

4 2 I 1Я_ям 0,5

0,12 мо -"04

0,3 0,2 0,1 0,0

: б рН=в,9 \ рН»61 1

- -О

о 0 О Я рН-0,7

1 1 1 U I . I . 1 . 1

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Рис. 8 Влияние рН на флуоресценцию тетрамерного мелитгина (в 2,0 М КС1) а -зависимость от рН квантового выхода (q, кривая 1) н положения максимума спектров флуоресценции (кию, кривая 4) (С = 5 10"5 М, 2 М КС1 в 0,01 М ацетатном или 0,01 Трис-HCl буфере) Кривые 2 и 3 - зависимости квантовых выходов коротковолновой и длинноволновой лог-нормальных компонент спектра, соответственно от рН б -фазовое представление зависимости отрНв координатах вкладов ациа[ компонент

Другие изменения вкладов компонент в зависимости от рН наилучшим образом отражены на псевдо-фазовом графике в координатах вкладов (й|, an) (рис. 86). Такие графики выявили зоны структурных перестроек и зоны тушения флуоресценции.

Тепловые переходы в тетрамере мелиттина

Исследования тепловых переходов в белках по спектрам флуоресценции осложняются существованием фонового температурного тушения флуоресценции вследствие тепловой активации структурной подвижности в белке (Bushueva et al., 1975,1978,1980).

Разложение спектров тетрамерного мелиттина на лог-нормальные компоненты показало их различное поведение в процессе тепловой денатурации, что отражает изменения свойств разных остатков триптофана (рис. 10). Анализ зависимостей обратной величины площади под

спектрами компонент I (^=328 нм) и Л (Я=344 нм) от отношения температуры к вязкости Т/г}, пропорциональное коэффициенту диффузии, (рис. 106) показал, что при нагревании до ~60°С эти зависимости линейны, что характерно для чистого температурного тушения (ВшЬиеуа е* а1., 1978; 1980), и лишь при температуре >60°С наблюдается резкое отклонение от линейности и падение квантовых выходов обеих компонент. Учитывая, что температурное тушение компоненты I много более эффективно, чем компоненты П, можно считать, что результирующий длинноволновый сдвиг суммарного спектра от 20 до 60°С определяется не столько структурной перестройкой тетрамера, сколько более эффективным тушением коротковолновой компоненты соседними группами в белке.

Риг. 9 Влияние температуры яа флуоресценцию тетрамерного мелиггана. я -зависимость от температуры положения максимума спектров (кривая 1) и вкладов лог-нормальных компонент с положением максимумов при 328,344 и 351 им (кривые 2,3 и 4, соответственно) в нормированные по интенсивности спектры (С =5-10"5 М, 2 М КС! в 0,01 М трис-НС1, рН 7,4) б - зависимость от отношения Т/1) величин обратного квантового выхода 1/<ц компонент тетрамера мелиггана с Хщ, 328 (кривая 1) и 344 нм (кривая 2) в - фазовое представление в кординатах (1з9о, Ъго) для температурной зависимости спектров флуоресценции тетрамера мелиггана

В то же время, резкое падение квантовых выходов компонент I и П и рост компоненты Ш(Л1В=351нм) свидетельствуют о разрыхляющем структурном переходе в тетрамере. Это подтверждается и переломом при температуре ~66°С линейной зависимости в псевдо-фазовом графике (рис. 10в). Такая интерпретация полностью согласуется с результатами исследования влияния температуры на структуру окружения остатков Тгр19 в тетрамерном мелиттине методами ЯМР (1\уаёа1е е* а!., 1998). Истинного разворачивания субъединиц в структуре тетрамера при нагревании до 95°С не наблюдалось.

Таким образом, анализ температурных изменений вкладов лог-нормальных компонент спектров флуоресценции тетрамера мелитшна позволил выявить и правильно интерпретировать тонкие изменения в состоянии остатков триптофана, индуцированные ростом температуры

Денатурация р-лактоглобулина мочевиной

Денатурацию Р-лактоглобулина (р-ЛГ) из коровьего молока мочевиной исследовали при рН4,5 в присутствии 0Д5МКС1 при температуре 4°С. Спектр флуоресценции нативного Р-ЛГ имеет форму стандартной лог-нормальной функции с максимумом ~ 330 нм. Однокомпонентный характер спектра сохранялся при содержании мочевины до ~3 М. При более высоких концентрациях мочевины спектры флуоресценции р-ЛГ наилучшим образом описываются суммой трех лог-нормальных компонент с максимумами 330,349 и -335-340 нм.

Рис. 10. Зависимости от концентрации мочевины вкладов лог-нормальных компонент в общую площадь под спектрами флуоресценции р-лактоглобулина при рН 4,5 в присутствии 0,15 М КС1 при температуре 4°С

4 6 [Мочевина] М

Компонента 335-340 нм имеет наибольшие вклады при концентрациях мочевины 4М и 5М. При содержании мочевины >6М в спектре оставалась только компонента с максимумом при 349,0 нм.

Таким образом, использование компонентного анализа спектров триптофановой флуоресценции позволило показать, что в процессе денатурации Р-ЛГ мочевиной образуются интермедиаты при концентрациях денатуранта 4 М и 5 М.

Взаимодействие продана с бычьим сывороточным альбумином На рис. 11 представлены спектры флуоресценции свободного продана в воде и в комплексе с бычьим сывороточным альбумином (БСА) при разных их молярных соотношениях. При высоких молярных отношениях БСА:продан большинство молекул зонда связывается в наиболее сильном центре связывания ароматических лигандов

В семействе спектров, измеренных при молярных отношениях БСА:продан 0,22, 0,68, 2,2 и 4,5, появляется полоса флуоресценции связанного продана в области 450 нм, а в области -495 нм наблюдается изоэмиссионная точка. Это означает, что продан в исследуемой системе находится лишь в двух состояниях: свободном (или слабо связанном на поверхности белка) и в низкополярном центре связывания, близком по полярности к ацетонитрилу или ацетону. Спектры излучения разлагаются на две лог-нормальные компоненты (уравнения 1 и 4,4а) с положением максимумов при 524±3 и 454±2 нм (пунктирные линии на рис. 11).

1.0 и

отихд

Рис 11. Влияние связывания продана с БСА на спектры флуоресценции (о) - 3 цМ продана в 0,01 М трис, 0,15 М ИаС1, рН 7,0 в отсутствие (спектр 1) и присутствии БСА (спектры 2-5 соответствуют молярным отношениям БСА:продан 0,22, 0,62, 2,25 и 4,5) и их аппроксимация суммой двух лог-нормальных функций (сплошные линии) Пунктирные кривые - лог-нормальные компонент спектров

Их вклады зависят от отношения БСАшродан. Анализ изменения вкладов компонент показал, что константа равновесия образования комплекса равна ~1 1Q5 М"1. При этом квантовый выход флуоресценции продана в комплексе с БСА в 3,5 раза выше, чем у свободного красителя в растворе.

Флуоресценция акрилодана в конъюгате с субфрагментом S1 миозина

При молярном соотношении акрилодана к субфрагметнту S1 миозина 1:1 краситель связывается с наиболее реактивной тиольной группой Cys707. Спектры излучения такого конъюгата имеют максимум, равный 505 нм (рис. 12а), но полуширина спектра больше полуширины спектра акрилодана при этом положении максимума в соответствии с зависимостями (4) и (4а), т.е. спектр конъюгата неоднороден.

550 600 Я, нм

550 600 Л, нм

450 500 550 600 450 5 Л, нм

Рве 12. Аппроксимация экспериментальных спектров флуоресценции (точки) конъюгатов акрилодана с субфрагментом S1 миозина суммой двух лог-нормальных компонент (сплошные линии) при молярных отношениях 1:1 (а) и 2:1 (6) в присутствии разных концентраций тушителя KI (а - 0,0,05,0,15,0,20 и 0,30 М, б - 0, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20 и 0,30 М) (в) - комплекса конъюгата 1:1 с F-актином (сплошная линия) Пунктирные линии - лог-нормальные компоненты спектра

В отсутствие тушителя положения максимумов лог-нормальных компонент равны 451,5±3 и 506±1 нм с вкладами 11±3 и 89±3%, соответственно (рис. 12а). Спектр коротковолновой компоненты соответствует спектру модельного конъюгата акрилодана с трипептидом в хлороформе, а спектр длинноволновой компоненты близок к спектру этого

коньюгата в этаноле. С ростом концентрации иодида вклад коротковолновой компоненты возрастает, а вклад длинноволновой падает по закону Штерна-Фольмера с = 1,02±0,07 М"1. Это вдвое ниже доступности модельного коньюгата в воде Кву - 1,95±0,09 М"1, что коррелирует с низкой доступностью Суз707 в структуре 81.

Спектр флуоресценции акрилодана в конъюгате с Б1 при молярных отношениях краситель:81 2:1, когда кроме Сув707 акрилодан связывается и с Суэ697 в1 и с Сув178 связанной с ним легкой цепи, значительно отличается от спектра коньюгата 1:1 (рис. 136), максимум спектра смещен в длинноволновую сторону до 511 нм. Спектр описывается суммой компонент, с положением максимумов при 454±3 и 512±1 нм и вкладами 6±1 и 94±1%, соответственно. В присутствии иодида, как и в случае коньюгата 1:1, наблюдается тушение длинноволновой части спектра и относительное возгорание коротковолновой, с изоэмиссионной точкой при 476 нм (рис. 136). Интенсивность длинноволновой компоненты уменьшается по закону Штерна-Фольмера с = 2,8±0,14 М"\ что на ~ 40% превышает значение для модельного коньюгата в воде. Это, возможно, обусловлено существованием положительного заряда в окружении излучающего флуорофора в конъюгате 2:1. Поскольку, судя по кристаллической структуре, в отличие от Сув707 и Суэ697 субфрагмента в1 (11аутепХ е1 а1,1993), Суя178 легкой цепи хорошо доступен растворителю, можно полагать, что именно связанный с ним флуорофор вносит главный вклад в длинноволновую компоненту флуоресценции коньюгата 2:1.

При связывании коньюгата акрилодан-81 1:1 с Р-акшном положение максимума спектра комплекса, по сравнению со спектром коньюгата 1:1 смещено в коротковолновую сторону до 496 нм (рис. 12в). Положения максимумов компонент равны 453 нм и 501 нм с вкладами 16±3 и 84±3%, соответственно. В отличие от коньюгата 1:1, в спектре комплекса этого коньюгата с Б-актином относительный вклад коротковолновой компоненты возрастает без изменения положения полосы, а положение второй компоненты смещается на 6 нм в коротковолновую сторону. При связывании Б1 с Р-акпшом, вероятно, уменьшается полярность и (или) скорость релаксации окружения акрилодана, связанного с СуБ707.

Обсуждение результатов

Представленные результаты исследований позволяют подвести некоторые итоги и сформулировать ряд общих преимуществ, которые дает компонентный анализ спектров флуоресценции в исследовании структурных состояний и переходов белков.

Эмпирическая однозначная зависимость положения полумаксимальных амплитуд от положения максимума спектров флуоресценции флуорофоров показывает, что форма спектра излучения определяется только положением его максимума. Форма элементарных спектров флуоресценции остатков триптофана в белках или присоединенных красителей описывается однопараметрической лог-нормальной функцией.

По соотношению положения максимума спектра и его ширины на уровне полумаксимальной интенсивности можно оценить, однороден (однокомпонентен) ли спектр. Однокомпонентному спектру флуоресценции флуорофора соответствует полуширина, равная разности значений положения полумаксимальных амплитуд при данном положении максимума, для остатка триптофана- уравнение(3), для продана -уравнения (4) и (4а). Если полуширина спектра превышает это теоретическое значение, то спектр имеет составной характер, и целесообразно производить его разложение на лог-нормальные компоненты.

Определенность параметров лог-нормальных компонент значительно повышается при одновременной обработке всего массива спектров, полученных в эксперименте.

Получаемые при разложении компоненты следует рассматривать как принадлежащие группам флуорофоров с разньм типом окружения.

Опираясь на значения квантовых выходов флуоресценции белка и вклады отдельных компонент, можно оценить значения их квантовых выходов. Разложение спектров в присутствии разных концентраций тушителей позволяет определить константы Штерна-Фольмера для каждой компоненты, т.е. оценить доступность растворителю флуорофоров, которым принадлежат эти компоненты.

Изучение переходов в белках с использованием компонентного анализа спектров флуоресценции позволило получить более детальную информацию как о ходе перехода, так и о ряде его особенностей. Для процессов олигомеризации белков, связывания ионов или лигандов оказалось, что отдельные компоненты спектра (их положение максимума, выход излучения) более чувствительны к переходу. Это повысило качество регистрации перехода и позволило точнее определить такие его характеристики, как стехиометрия олигомеризации, связывание лиганда.

В случае тепловой денатурации особенно информативным оказался анализ линейности зависимостей обратных выходов излучения в отдельных компонентах от отношения абсолютной температуры к вязкости растворителя Т/ц, В зонах чистого температурного тушения эти зависимости должны быть линейными. Различная эффективность температурного тушения, либо тушения под действием других эффекторов (например, рН) приводит к сдвигам спектров флуоресценции белка,

которые обычно ошибочно приписывают структурному переходу. Анализ соотношения эффективности тушения отдельных компонент помогает избежал» такой ошибки интерпретации.

Применение компонентного анализа спектров флуоресценции позволило однозначно показать, что полностью тетрамеризованное состояние мелиттина содержит остатки триптофана в разном структурном окружении. Данных о протекании процесса олигомеризации мелиттина через интермедиат в литературе нет. Эта данные получены нами впервые.

Использование компонентного анализа спектров триптофановой флуоресценции позволило показать сложный характер процесса денатурации р-лактоглобулина мочевиной, протекающий с образованием интермедиатов, определить область существования и охарактеризовать их.

Параллельно с развитием методов, основанных на собственной флуоресценции белка, развиваются методы исследования белков и других биологических структур с использованием флуоресцентных красителей. Так как для характеристики окружения красителей в структуре белков и исследования ее перестроек используется анализ изменения спектров излучения, представляло интерес проверить возможность использования в этих случаях методов и подходов, развитых для анализа составных спектров, основанных на аналитическом описании формы спектров лог-нормальной функцией.

Анализ спектров флуоресценции присоединенных к белкам меток и зондов подтверждает возможность их разложения на лог-нормальные компоненты и позволяет получать дополнительную информацию об исследуемой системе.

Выводы

1. На основе описания гладких асимметричных спектров флуоресценции различных флуорофоров лог-нормальной функцией показано, что форма спектра полностью определяется положением его максимума. Это позволяет представить элементарные спектры флуоресценции остатков триптофана или присоединенных красителей в белке двухпараметрической лог-нормальной функцией, зависящей от положения максимума и максимальной амплитуды.

2. Разработаны приемы и методы для анализа составных спектров флуоресценции белков на элементарные лог-нормальные компоненты, что дает возможность изучать спектроскопические и структурно-физические свойства отдельных классов или индивидуальных флуорофоров в белке.

3. Исследование поведения отдельных компонент позволяет раздельно анализировать изменения состояния индивидуальных остатков триптофана или их групп в процессе перехода. В целом, это позволяет создать единый, основанный на измерениях спектров флуоресценции, подход к анализу перестроек и физико-химических переходов белков.

4. С помощью компонентного анализа спектров флуоресценции мелиттина обнаружено, что процесс его олигомеризации протекает через тетрамерный интермедиат, отличающийся по свойствам от тетрамера при максимальных концентрациях соли и белка.

5. Применение компонентного анализа спектров флуоресценции позволило однозначно показать, что мелитган в полностью тетрамеризованном состоянии содержит остатки триптофана в двух типах структурного окружения с сильно различающейся полярностью и доступностью ионным тушителям.

6. На примерах продана и акрилодана показано, что описание их спектров флуоресценции лог-нормальной функцией позволяет анализировать состояние окружения в белках флуоресцентных зондов (продана) и ковалентно связанных меток (конъюгатов акрилодана). Разложение составных спектров флуоресценции зондов и меток в белке позволяет анализировать изменения их окружения в процессах структурных и физико-химических переходов содержащих их белков.

Основные публикации по теме диссертации

1. Бурштейн Э.А., Емельяненко В.И., Веденкина Н.С. 1981. Аналитическое описание спектров флуоресценции триптофана и проверка справедливости модели дискретных состояний триптофановых остатков в белках. Тез. докл. IV Всес. Конф. по спектроскопии биополимеров. Харьков. С. 25-26.

2. Емельяненко В Л, Веденкина Н С., Бурштейн Э.А. 1982. Анализ формы спектров собственной флуоресценции белков. Тез. докл. Всес. Биофизич. съезда, Москва. С. 33-34.

3. Емельяненко В Л., Бурштейн Э.А. 1984. К проблеме разложения бесструктурного спектра флуоресценции белка на компоненты. Тез. докл V Всес. Конф. по спектроскопии биополимеров. Харьков. С. 8384

4. Емельяненко В.И., 1991. Аналитическое представление формы спектров флуоресценции стандартов. Калибровка спектрофлуориметра на спектральную чувствительность в УФ области. Ж Прикл Спектроск. 55:587-593.

5. Емельяненко В.И. 1995 Некоторые свойства тршггофаниловой флуоресценции белков Тез. докл. Международная научная конференция "Физика и химия органических люминофоров 95" Харьков С. 50

6. Burstein Е.A., Emelyanenko V.l. 1996. Log-nonnal Description of fluorescence Spectra of Organic Fluorophores. Photochem. Photobiol 64: 316-320.

7. Емельяненко В.И., Бурютейн Э.А. 1998. Аналитическое описание спектров флуоресценции ароматических аминокислот и белков Ж. Прика Спектроск. 65:360-365,

8. Емельяненко В Л., РешетнякЯ.К., Андреев OA., Бурштейн Э.А. 2000. Анализ лог-нормальных компонент спектров флуоресценции связанных с белком продана и акрилодана Биофизика. 45:207-219.

9. Emelyanenko V.I., Burstein ЕЛ. 2001. Dielectric relaxation times evaluation for environment of two individual tryptopha residues in the fibrinogen E-fragment Abstr. 7й Conference on Methods and Applications of Fluorescence. Amsterdam, The Netherlands. P.51.

10-Linke D., Frank I., PopeM.S., Soli J., Ilkavets I., Fromme P., BorsieinEA., Reshetnyak Ya.K. and Emelyanenko VJ. 2004. Folding kinetics and structure of OEP16 Biophys J., 86:1-9.

11 .Емельяненко В.И., Гршценко B.M., Бурштейн ЭЛ. 2005. Компонентный анализ спектров триптофановой флуоресценции мелиттина в процессе олигомеризации. Биофизика, 50:623-530.

12.Емельяненко ВЛ., Грищенко В.М., Бурштейн ЭЛ. 2007. Принципы использования компонентного анализа спектров флуоресценции для исследования переходов в белках. Тепловые и рН-индуцируемые переходы в тетрамерном мелитгине. Биофизика (в печати).

Принято в печать 29.07.2007. Заказ № 17. Тираж 70 экз. ООО «Фотон-век». ИНН 5039008988 г. Пущино. Московская область. (4967) 73-94-32 Ьеопкй@гатЫег га

Ы1р:/Ур])о1оп-¥ек.11аго(1.ги - кварцевые кюветы

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Емельяненко, Виктор Иванович

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

11.1. Введение.

11.2. Спектральные свойства собственных и присоединенных флуорофоров белка.

11.2.1. Собственные флуорофоры белка.

11.2.2. Присоединенные красители: продан и акрилодан.

11.2.3. Электронная структура полосы поглощения индольного флуорофора.

11.2.4. Электронная структура полосы поглощения продана.

11.3. Флуоресценция и факторы, влияющие на ее характеристики.

11.3.1. Спектры флуоресценции.

11.3.2. Природа флуоресцентного состояния триптофана.

11.3.3. Природа флуоресцентного состояния продана и его производных.

11.3.4. Влияние межмолекулярных взаимодействий на электронно-колебательные переходы.

11.3.5. Влияние универсальных взаимодействий на сдвиг и форму спектров флуоресценции.

11.3.6. Влияние специфических взаимодействий на спектры триптофановой флуоресценции.

11.4. Триптофановая флуоресценция белка.

11.4.1. Физические характеристики окружения флуорофоров в белках.

11.4.2. Квантовый выход и тушение флуоресценции внутренними группами белка.

11.4.3. Метод избирательного тушения флуоресценции.

11.4.4. Модель дискретных состояний остатков триптофана в белках.

11.5. Форма электронно-колебательного спектра многоатомных органических флуорофоров.

11.5.1. Теоретическое описание формы электронно-колебательных спектров.

11.5.2. Описание формы спектров флуоресценции математической функцией.

11.6. Компонентный анализ спектров флуоресценции белков.

11.6.1. Разложение спектров флуоресценции по степени доступности внешнему тушителю.

11.6.2. Разложение спектров флуоресценции по параметрам затухания флуоресценции.

11.6.3. Определение спектров индивидуальных флуорофоров с использованием направленных мутаций.

11.6.4. Расчетное разложение составных спектров методом наименьших квадратов.

11.7. Исследование структурных изменений и переходов в белках методом флуоресценции.

11.7.1. Параметры флуоресценции как мера завершенности перехода.

11.7.2. Обнаружение промежуточных состояний.

11.7.3. Использование флуоресцентных методов в изучении структурных переходов белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Компонентный анализ спектров флуоресценции как метод исследования структурных и физико-химических переходов в белках"

Актуальность проблемы. Развитие методов исследования структурных переходов и повышение их информативности в изучении механизмов физико-химических изменений в молекулах белков имеет важнейшее значение для фундаментальных исследований их биологических и физических свойств в различных областях биофизики, биохимии, молекулярной биологии и фармакологии. Задача изучения перестроек белковых молекул решается широким арсеналом физических и химических методов. Среди них важную роль играют методы, основанные на регистрации и интерпретации изменений флуоресценции.

Люминесцентная спектроскопия является мощным и универсальным методом изучения структурных, физико-химических и функциональных свойств белков. Флуоресцирующие аминокислотные остатки белка (триптофана, тирозина и фенилаланина) или присоединенные красители играют роль репортерных групп. Изменение физических и химических свойств окружения хромофора в процессе перехода несет информацию о локальных изменениях в молекуле белка. Такие параметры флуоресценции, как положение максимума спектра излучения и квантовый выход, чрезвычайно чувствительны к полярности и динамическим свойствам микроокружения флуорофора в структуре белка (Конев, 1965; Теренин, 1967; Бахшиев, 1972; Черницкий, 1972; Бурштейн, 1976, 1977а; Weber & Farris, 1979; Владимиров и Добрецов, 1980; Лакович, 1986; Semisotnov et al., 1991; Пермяков, 2003).

При использовании метода флуоресценции в исследовании белков чаще всего анализируют изменения только интегральных значений параметров, определяемых набором собственных или присоединенных флуорофоров, которые могут быть расположены в разных участках белковой молекулы и находиться в процессе перестройки между разными структурными и (или) физическими состояниями. При этом теряется специфическая информация о различиях в изменении структурных и физических свойств в разных участках белковых молекул и о неодинаковом состоянии отдельных популяций молекул, участвующих в процессе перестройки.

Спектры флуоресценции большинства сложных молекул представляют собой широкую асимметричную бесструктурную полосу и поэтому считались малоинформативными. Одним из способов анализа сложного спектра является описание его или его компонент математической функцией, график которой представляет их форму. Ранее было показано, что асимметричные спектры как поглощения (Siano & Metzler, 1969), так и флуоресценции (Бурштейн, 1976) описываются четырехпараметрической лог-нормальной функцией.

В связи с этим возникает необходимость в определении функции, описывающей спектр излучения одиночного типа флуорофоров, выявлении в сложном спектре этих составляющих и разработке новых приемов анализа спектров при исследовании структурных переходов в белках, которые должны обеспечить более полную структурную интерпретацию по измерениям флуоресценции.

Одним из таких подходов является разложение спектров флуоресценции на индивидуальные компоненты. Разложение спектров флуоресценции на «элементарные» компоненты повышает качество спектральной информации. В отличие от широко применяемых методов исследования переходов по интегральным характеристикам флуоресценции белка (общий квантовый выход, интенсивности при фиксированных длинах волн, положение максимума спектра), такой подход позволяет следить за изменением состояния отдельных флуорофоров или их групп в процессе перехода. На основании связи между спектральными параметрами отдельных компонент и характеристикой факторов окружения, их фотофизических и фотохимических взаимодействий в макромолекуле в процессе перестройки, можно детально интерпретировать изменения в окружении отдельных флуорофоров или их классов с одинаковыми спектрами в результате различных физико-химических воздействий на белковую структуру (Burstein et al., 1973; Бурштейн, 1977а, 1983; Reshetnyak & Burstein, 2001а) и получить более строгую и конкретную информацию о процессах, происходящих в разных участках белковой системы.

Для достижения этого было необходимо решить следующие задачи:

Параметры различающихся по положению спектров излучения одного и того же вида флуорофора в окружении с различной полярностью и подвижностью строго взаимозависимы. Вследствие этого форма спектра флуоресценции триптофана и ряда других сложных молекул определяется только положением его максимума и может быть представлена однопараметрической лог-нормальной функцией, что существенно упрощает процедуру компонентного анализа.

Показано, что сложные спектры белковой флуоресценции можно однозначно разложить на компоненты, спектральные параметры которых характеризуют окружение индивидуальных флуорофоров в составе белка или классов флуорофоров с одинаковыми спектральными характеристиками.

Разработанные приемы и методы повышают информативность спектрофлуоресцентиого исследования природы структурных и физико-химических переходов в белках. Высокая точность описания формы спектра дает возможность проведения в дальнейшем более глубоких экспериментальных и теоретических исследований.

Идентификация формы спектра флуоресценции элементарного состояния остатков триптофана позволила уточнить широко используемую интерпретационную модель статистически дискретных состояний остатков триптофана в белках.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1980-1991); III Всесоюзном совещании «Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение» (Рига, 1988); Международной конференции «Физика и химия органических люминофоров 95» (Харьков, 1995); Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); Международной конференции по люминесценции и фотофизике в честь 100-летия Яблонского (Торунь, Польша, 1998); II и III Съездах биофизиков России (Москва, 1999 и Воронеж, 2004); научных конференциях ИТЭБ РАН; 7-ой Конференции по методам и приложению флуоресценции (Амстердам, Нидерланды, 2001).

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

11.1. Введение

Флуоресцентная спектроскопия является одним из широко используемых методов исследования структуры, динамики, функциональных свойств белков и их взаимодействия с различными агентами. Широкое применение метода обусловлено его высокой чувствительностью к свойствам окружения как собственных флуорофоров, так и присоединенных флуоресцентных красителей, используемых в качестве репортерных меток, а также возможностью использования различных характеристик флуоресцентных сигналов. Это позволяет получать различную структурную и физико-химическую информацию о свойствах исследуемого объекта и характеризовать разного рода изменения в белке (Конев, 1965; Бурштейн, 1976, 19776; Демченко, 1981, 1988; Лакович, 1986; Eftink, 1991; Semisotnov et al., 1991; Кузнецова и Туроверов, 1998; Пермяков, 2003).

Излучение хромофора характеризуется формой спектра возбуждения и излучения, положением максимума спектра, квантовым выходом, временем жизни возбужденного состояния и его поляризацией. Спектральные характеристики излучения флуорофора в белке зависят от его природы и свойств его окружения, а также от процессов, происходящих за время жизни возбужденного состояния после поглощения кванта света. Изменение окружения флуорофора, вызванное структурными изменениями в белке, изменениями рН, температуры, появлением или исчезновением тушащих групп и молекул и состава растворителя, проявляется в характерных изменениях разных параметров флуоресценции (Бурштейн, 1976, 1977а; Лакович, 1986).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Емельяненко, Виктор Иванович

VI. выводы

5. Применение компонентного анализа спектров флуоресценции позволило однозначно показать, что мелиттин в полностью тетрамеризованном состоянии содержит остатки триптофана в двух типах структурного окружения с сильно различающейся полярностью и доступностью ионным тушителям.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Емельяненко, Виктор Иванович, Пущино

1. Аборнев С.М., Бурштейн Э.А. 1992. Методы разложения составных спектров триптофановой флуоресценции белков на лог-нормальные компоненты методом наименьших квадратов. Молек. биология. 26: 890-897.

2. Антипова-Коротаева И.И., Казанова Н.Н., Гусакова Н.Н. 1983. О влиянии нормально распределенного шума на результаты разделения сложных спектров на компоненты. Ж прикл. спектроск. 38: 626-631.

3. Баранов В.И., Савин Ф.А., Грибов Л.А. 1983. Программы расчета электронно-колебательных спектров многоатомных молекул. М.: Наука. 192 с.

4. Бахшиев Н.Г. 1972. Спектроскопия межмолекулярных взаимодействий. Л.: Наука. 265 с.

5. Бахшиев Н.Г. 1998. Неспецифическая сольватация и колебательные спектры криорастворов. Полуэмпирическая теория влияния растворителя на положение колебательных полос двухатомных молекул. Опт. и спектр. 85: 566-571.

6. Бахшиев. Н.Г. 2001. Полуэмпирический расчет абсолютногосольватационного смещения электронных и колебательных спектров молекул при фазовом переходе газ-раствор. Опт. и спектр. 91:721-727.

7. Боковой В.А., Морозов Ю.В. 1988. Ионные и таутомерные равновесия бензимимидазола и его пиридоксильных производных. Анализ электронных спектров с колебательной структурой. Ж. физ. хим. 62:2372-2380.

8. Бурштейн Э.А. 1968. Тушение собственной флуоресценции белков. 1. Принципы метода. Растворы триптофана, тирозина и денатурированных белков. Биофизика. 13: 433-442.

9. Бурштейн Э.А. 1976. Люминесценция белковых хромофоров. Модельные исследования. «Итоги науки и техники», сер. Биофизика. Т.6. М: ВИНИТИ. 214 с.

10. Бурштейн Э.А. 1977а. Собственная люминесценция белка. Природа и применение. «Итоги науки и техники», сер. Биофизика. Т.7. М: ВИНИТИ. 190 с.

11. Бурштейн Э.А. 19776. Изучение быстрой подвижности белковых структур методами собственной флуоресценции. В сб.: «Равновесная динамика нативной структуры белка». Пущино. С. 60-83.

12. Бурштейн Э.А. 1983. Собственная люминесценция белка как метод изучения быстрой структурной динамики. Молек. биология. 17: 455-467.

13. Бусел Е.П. 1973. Люминесцентные свойства основных хромофоров белка. «Итоги науки и техники», сер. Молек. биол. Т.З М: ВИНИТИ. С. 85-126.

14. Бусел Е.П., Бушуева Т.Л., Бурштейн Э.А. 1970. Пути дезактивации возбужденного состояния индола и его производных в водных растворах. Исследование методом температурного тушения в Н2О и D20. Ж. прикл. спектроск. 29: 501-507.

15. Владимиров Ю.А. 1965. Фотохимия и люминесценция белков. М.: Наука.

16. Владимиров Ю.В., Бурштейн Э.А. 1960. Спектры люминесценции ароматических аминокислот и белков. Биофизика. 5: 385-392.

17. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. 1980. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука.

18. Грищенко В.М., Емельяненко В.И., Ивкова М.Н., Безбородова С.И., Бурштейн Э.А. 1976. Внеклеточная РНКаза С2. II Исследование структурных состояний методом флуоресцентной спектроскопии. Биорганическая химия. 2: 207-216.

19. Гулис И.М., Комяк А.И. 1978. Особенности индуктивно-резонансногопереноса энергии в условиях неоднородного уширения электронных уровней органических молекул. Ж. прикл. спектроск. 32: 897-902.

20. Давыдов А.С. 1973. Квантовая механика. М.: Наука. 703 с.

21. Демченко А.П. 1981. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков. Киев: Наукова Думка. 210 с.

22. Демченко А.П., Ладохин А.С., Костржевская Е.Г., Диброва Т.Г. 1987. Структурно-динамические свойства окружения триптофанового остатка в мелиттине. Молек. биология. 21: 663-671.

23. Демченко А.П. 1988. Люминесценция и динамика структуры белков. Киев: Наукова Думка. 280 с.

24. Емельяненко В.И. 1991. Аналитическое представление формы спектров флуоресценции стандартов. Калибровка спектрофлуориметра на спектральную чувствительность в УФ области. Ж. прикл. спектроск. 55: 587-593.

25. Емельяненко В.И., Решетняк Я.К., Андреев О.А., Бурштейн Э.А. 2000. Анализ лог-нормальных компонент спектров флуоресценции связанных с белком продана и акрилодана. Биофизика. 45: 207-219.

26. Капланас Р.И., Буколова Т.Г., Бурштейн Э.А. 1975. Флуоресценция лактоглобулина АВ в различных физико-химических условиях. Молек. биология. 9: 795-804.

27. Конев С.В. 1965. Электронно-возбужденные состояния биополимеров. Минск: Наука и техника. 184 с.

28. Коровина В.М., Бахшиев Н.Г. 1989. Влияние межмолекулярныхвзаимодействий в растворах на спектроскопические параметры вибронных компонент электронных полос поглощения молекул фенола. Ж прикл. спектроск. 50:285-291.

29. Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 1998. Что определяет характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология. 40: 747-763.

30. Лакизова И.Ю., Елякова Л.А., Емельяненко В.И., Пермяков Е.А., Бурштейн Э.А. 1988. Сравнительное изучение Р-1,3-глюканаз морских моллюсков по флуоресценции триптофана. Биофизика. 33: 31-35.

31. Лакович Дж. 1986. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. 496 с.

32. Лихтенштейн Г.И. 1974. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. М.: Наука. 256 с.

33. Мазуренко Ю.Т., Бахшиев Н.Г. 1970. Влияние ориентационной дипольной релаксации на спектральные, временные и поляризационные характеристики люминесценции растворов. Опт. и спектроск. 28:905-913.

34. Мазуренко Ю.Т., Смирнов В.А. 1978. Стохастическая модель электронно-колебательных спектров сложных молекул. 1. Общие соотношения и случай экспоненциальной релаксации ядерной системы. Опт. и спектроск. 45:23-29.

35. Мазуренко Ю.Т., Смирнов В.А. 1979. Стохастическая модель электронно-колебательных спектров сложных молекул. 3. Численное моделирование спектров и сравнение с опытом. Опт. и спектроск. 47: 650-655.

36. Мазуренко Ю.Т., Удальцов B.C. 1982. Кинетическая флуоресцентная спектроскопия релаксационных процессов в возбужденных молекулярных системах. В сб. «Возбужденные молекулы. Кинетика превращений». JL: Наука. 103 с.

37. Морозов Ю.В., Савин А.Ф. 1985. Электронная спектроскопия и электронное строение молекул. Молек. биология. 19: 132-142.

38. Морозов Ю.В., Бажулина Н.П., Боковой В.А., Чехов В.О. 1987. Принципы разложения спектров биологически активных соединений на полосы, соответствующие отдельным электронным переходам. Биофизика. 32: 699-715.

39. Морозов Ю.В., Бажулина Н.П. 1989. Электронное строение, спектроскопия и реакционная способность молекул. М.: Наука. 288 с.

40. НепорентБ.С. 1972а. Внутримолекулярные взаимодействия и вибронные спектры многоатомных молекул: II. Роль колебательных релаксаций в образовании диффузных и сплошных конфигурационных спектров. Опт. и спектроск. 32: 252-258.

41. Нямаа Д., Бат-Эрденэ О., Бурштейн Э.А. 1984. Влияние среды наструктурные и функциональные свойства сывороточных альбуминов. I. Влияние ионной силы раствора на сывороточный альбумин человека вЫ-форме. Молек. биология. 18: 839-847.

42. Пекар С.И. 1953. О влиянии деформации решеток электронами наоптические и электрические свойства кристаллов. Yen. физ. наук. 50: 197-252.

43. Пермяков Е.А. 1977. Кооперативное замораживание внутримолекулярной подвижности белков. В сб.: «Равновесная динамика нативной структуры белка». Пущино. С. 83-89.

44. Пермяков Е.А., Дейкус Г.Ю. 1995а. Аналитическое описание электронно-колебательных спектров белков. Молекуляр. биология. 29: 159-167.

45. Пермяков Е.А., Дейкус Г.Ю. 19956. Исследование конформационных переходов в белках по триптофановой флуоресценции и фосфоресценции при низких температурах. Молекуляр. биология. 29: 339-344.

46. Пермяков Е.А. 2003. Метод собственной люминесценции белка. М.: Наука. 189 с.

47. Решетняк Я.К., Бурштейн Э.А. 1997а. Отнесение компонент спектра флуоресценции белка к остаткам триптофана по свойствам их микроокружения в трехмерной структуре. Биофизика. 42: 293-300.

48. Решетняк Я.К., Бурштейн Э.А. 19976. Отнесение компонент спектрафлуоресценции сериновых протеаз к кластерам остатков триптофана. Биофизика. 42: 785-798.

49. Смирнов B.C., Питерская И.В., Бахшиев Н.Г. 1990. Изучениезакономерностей релаксационного уширения спектров флуоресценции активированных растворов. Опт. и спектроск. 68: 1194-1197.

50. Соловьева Г.С.,Либов B.C. 1976. О методе определения частотыэлектронного перехода в сплошных спектрах. Опт. и спектроск. 41:573-577.

51. Степанов. Б.И., Грибковский В.П. 1963. Введение в теорию люминесценции. Минск: Наука и техника. 353 с.

52. Теренин А.Н. 1967. Фогоника молекул красителей. J1.: Наука. 616 с.

53. Тихонов А.Н., Арсении В.Я. 1986. Методы решения некорректных задач. М.: Наука. 287 с.

54. Туроверов К.К., Кузнецова И.М., Зайцев В.Н. 1984. Интерпретация УФ-флуоресценции азурина на основе данных рентгеноструктурного анализа. Биоорг. химия. 10: 792-805.

55. Черкасов А.С. 1960. О влиянии растворителя на спектры флуоресценции ацетилантраценов. Изв. АН СССР. Сер. физ. наук. 24:591-595.

56. Черкасов А.С. 1962. О роли донорно-акцепторных взаимодействий во влиянии растворителя на спектры флуоресценции некоторых производных антрацена и фталимида. Опт. и спектроск. 12: 73-80.

57. Черницкий Е.А. 1972. Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетке. Минск: Наука и техника. 278 с.

58. Франк-Каменецкий М.Д., Лукашин А.В. 1975. Электронно-колебательные взаимодействия в многоатомных молекулах. Усп. физ. наук. 116: 193-229.

59. Эфтинк М.Р. 1998. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков. Биохимия. 63: 327-337.

60. Andrews L.J., Forster L.S. 1974. Fluorescence characteristic of indoles in non-polar solvents: lifetimes, quantum yields and polarization spectra. Photochem. Photobiol. 19: 353-360.

61. Auer Y.T. 1973. Far-ultraviolet absorption and circular dicroism spectra of L-tryptophan and same derivatives. J. Am. Chem. Soc. 95: 3003-3011.

62. Baiter A., Nowak W., Pawelkiewicz W., Kowalczyk A. 1988. Same remarks on the interpretation of the spectral properties of prodan. Chem. Phys. Lett. 143: 565-570.

63. Beechem J.M., Knutson J.R., Ross J.B.A., Turner B.W., Brand L. 1983. Global resolution of heterogeneous decay by phase modulation fluorometry: Mixtures and proteins. Biochemistry. 22: 6054-6058.

64. Bello J., Bello H.R., Granados E. 1982. Conformation and aggregation of melittin: Dependence on pH and concentration. Biochemistry. 21: 461^465.

65. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 72: 248-254.

66. Brown L.R., Lauterwein J., Wiitrich K. 1980. High resolution proton NMR studies of self agregation of melittin in aqueous solution. Biochim. Biophys. Acta. 622:231-244.

67. Bublitz G.U., Boxer S.G. 1997. Stark spectroscopy: Application in chemistry, biology and material science. Annu. Rev. Phys. Chem. 48: 213-242.

68. Bunker C.E., Bowen T.L., Sun Y.-P. 1993. A photophysical study ofsolvatochromic probe 9-propionyI-2-(dimethyIamino)naphthalene (prodan) in solution. Photochem. Photobiol. 58: 499-505.

69. Burstein E.A., Vedenkina N.S., Ivkova M.N. 1973. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. Photochem. Photobiol. 18: 263279.

70. Burstein E.A., Permyakov E.A., Yashin V.A., Burkhanov S.A., Finazzi-Agro A. 1977. The fine structure of luminescence spectra of azurin. Biochim. Biophys. Acta, 491: 155-159.

71. Burstein E.A. 1996. An improved algorithm of resolution of fluorescence spectra into quencher accessibility-associated components. Photochem. Photobiol. 63: 278-280.

72. Burstein E.A., Abornev S.M., Reshetnyak Ya.K. 2001. Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. I. Decomposition algorithms. Biophys. J. 81: 1699-1709.

73. Bushueva T.L., Busel E.P., Bushuev V.N., Burstein E.A. 1974. The interaction of protein functional groups with indole chromophore. 1. Imidazole group. Studia biophys. 44: 129-139.

74. Bushueva T.L., Busel E.P., Burstein E.A. 1975a. Interaction of protein functional groups with indole chromophore. Temperature dependence of the of fast fluorescence quenching processes. Studia biophys. 51: 173-182.

75. Bushueva T.L., Busel E.P., Burstein E.A. 1975b. The interaction of proteinfunctional groups with indole chromophore. Amine, amide and thiol groups. Studia biophys, 52: 41-52.

76. Bushueva T.L., Busel E.P., Burstein E.A. 1978. Relationship of thermal quenching of protein fluorescence to intramolecular structural mobility. Biochim. Biophys. Acta. 534: 141-152.

77. Bushueva T.L., Busel E.P., Burstein E.A. 1980. Some regularities of dynamicaccessibility of buried fluorescent residues by external quenchers in proteins. Arch. Biochem. Biophys. 204: 161-166.

78. Callis P.R. 1997. 'Laand 'Lh transition of tryptophan: Applications of theory and experimental observation to fluorescence of proteins. Methods Enzymol. 278: 113-150.

79. Cerezo F.V.,Rocafort S.C., Sierra P.S., Garcisco-Blanco F. 2001. Photophysical study of probes acrilodan, ANS and prodan in aqueous mixtures of various alcohols. Helvetica Chim. Acta. 84: 3306-3312.

80. Chakrabarti A. 1996. Fluorescence spectrum of bound prodan. Biochem. Biophys. Res. Communs. 226: 485-497.

81. Chang C.-T., Wu C.-Y., Muirhead A.R. Lombardi J.R. 1974. The dipole moment in the lowest singlet л*-л state of indole determined by optical Stark effect. Photochem. Photobiol. 19: 347-351.

82. Chedad A., van Dael I I., Vanhooren A., Hanssens I. 2005. Influence of Trpmutation on native, intermediate, and transition states of goat-lactalbumin: An equilibrium and kinetic study. Biochemistry. 44: 15129-15138.

83. Chen R.F. 1967. Removal of fatty acids from serum albumin by charcoal treatment. J. Biol.Chem. 242: 173-181.

84. Chen Y., Liu В., Barkley M.D. 1996, The peptide bond quenches indole fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 118: 9271-9278.

85. Chen Y., Barkley M.D. 1998. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37: 9276-9282.

86. Cowgill R.W. 1970a. Fluorescence and protein structure. XVII. On the mechanism of peptide quenching. Biochim. Biophys. Acta. 200: 18-25.

87. Cowgill R.W. 19706. Fluorescence and the structure of proteins. XVIII. Spatial requirements for quenching by disulfide groups. Biochim. Biophys. Acta. 207: 556-559.

88. Demchenko A.P. 1985. Fluorescence molecular relaxation studies of protein dynamics. FEBS Lett. 182: 99-102.

89. Demchenko A.P. 1986. Ultraviolet spectroscopy of proteins. Springer, Berlin etc.

90. Demchenko A.P. 1988. Red-edge-excitation fluorescence spectroscopy of single proteins. Eur. Biophys. J. 16: 121-129.

91. Demchenko A.P., Klymchenko A.S., Pivovarenko V.G., Ercelen S., Duportail G., Mely Y. 2003. Fluorescence news: Multiparametric color-changing fluorescence probes. J. Fluoresc. 13: 291-295.

92. Demchenko A.P., Ladokhin A.S. 1988. Temperature-dependent shift offluorescence spectra without conformational changes in protein. Studies of dipole relaxation in melittin molecule. Biochim. Biophys. Acta. 955: 352— 360.

93. Efitink M.R., Ghiron C.A. 1981. Fluorescence quenching studies with proteins. A review.Analyt. Biochem. 114: 199-227.

94. Eftink M.R., Wasylewski Z., Ghiron C.A. 1987. Phase-resolved spectral measurements with several two tryptophan containing proteins. Biochemistry. 26: 8338-8346.

95. Eftink M.R., Selvidge R.A., Callis P.R., Rehms A.A. 1990. Photophysics of indole derivatives: Experimental resolution of La and Lb transition and comparison with theory. J. Phys. Chem. 94: 3469-3479.

96. Eftink M.R. 1991. Fluorescence techniques for studing protein structure. Methods. Biochem. Anal. 35: 127-205.

97. Eftink M.R. 1994. The use fluorescence methods to monitor unfolding transition in proteins. Biophis. J. 66: 482-501.

98. Eisinger J., Navon G. 1969. Fluorescence quenching and isotope effect of tryptophan. J. Chem. Phys. 50: 2069-2077.

99. Eisinger J., Dale R.E. 1974. Interpretation of intramolecular energy transfer experiments. J. Mol. Biol. 84: 643-647.

100. Finazzi-Agro A., Giovagnoli C., Avigliano L., Rotilio G., Mondovi B. 1973.

101. Tryptophan luminescence quenching in azurin. Eur. J. Biochem. 34: 20-24.

102. Fisher H.F. 1964. A limiting law relating the size and shape of protein molecules to their composition. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 51: 1285-1291.

103. Gasymov O.K., Abduragimov A.R., Yusifov T.N., Glasgov D.J. 2004. Interstrand loops CD and EF act as pH-dependent gates to regulate fatty acid ligand binding in tear lipocalin. Biochemistry. 43: 12894-12904.

104. Gopalan V., Golbik R., Schreiber G., FershtA.R., Altman S. 1997. Fluorescence properties of a tryptophan residue in an aromatic core of the protein subunit of ribonuclease P from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 267: 765-769.

105. Grabowski Z.R., Rotkiewicz K., Rubaszewska W., Kirkor-Kaminska E. 1978. Spectroscopy and kinetics of the twisted internal charge-transfer (TICT) excited state formation in /^-substituted dialkylanilines. Acta phys. pol. A54, 6: 767-776.

106. Grabowski Z.R., Rotkiewicz K., Siemiarczuk A., Cowley D.J., Bauman W. 1979. Twisted intennolecular charge transfer states (TICT). A new class of excited states with a full charge separation. Nouveau J. Chim. 3:443-453.

107. Goto Yu., Hagihara Yo. 1992. Mechanism of the conformational transition of melittin. Biochemistry. 31: 732-738.

108. Habermann E. 1972. Bee and wasp venoms. Science. 177: 314-322.

109. Haskard C.A., Li-Chan E.C.Y. 1998. Hydrophobicity of bovine serum albumin and ovalbumin determined using uncharged (prodan) and anionic (ANS~) fluorescence probes. J. Agric. Food. Chem. 46: 26712677.

110. Hatefi Y., Hanstein W.G. 1969. Solubilization of paticulate proteins and nonelectrolytes by chaoprotpic agents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.62: 1129-1136.

111. Haugland R.P. 1996. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Molecular Probes Inc., Eugene, OR.

112. Heisel. F., Miehe J. A., Szemik A.W. 1987. Experimental evidence of an intramolecular reaction in excited prodan solution. Chem. Phys. Lett. 138:321-326.

113. Hershberger M.V., Lumry R., Verall R. 1981. The 3-methylindole/n-butanol exciplexes; evidence for two exciplexes sites in indole compounds. Photochem. Photobiol. 33: 609-617.

114. Hiratsuka T. 1998. Prodan fluorescence reflects differences in nucleotide-induced conformational states in the myosin head and allows continuous visualization of the ATPase reactions. Biochemistry. 37: 7167-7176.

115. John E., Janig F. 1988. Dynamics of melittin in water and membranes asdetermined by fluorescence anisotropy decay. Biophys. J. 54: 817-827.

116. Knutson J.R., Beechem J.M., Brand L. 1983. Simultaneous analysis of multiple fluorescence decay curves. A global approach. Chem. Phys. Lett. 102: 501-507.

117. Kragh-Hansen U. 1981. Molecular aspects of ligand binding to human serum albumin. Pharmacol. Rev. 114: 199-227.

118. Kuntz I.D. 1971. Hydration of macromolecules. III. Hydration ofpolypeptieds. J. Amer. Chem. Soc. 93: 514-516.

119. Kuntz I.D., Kauzmann J.R. 1974. Hydration of proteins and polypeptides. Adv. Protein. Chem. 28: 239-345.

120. MacGregor R.B., Weber G. 1986. Estimation of the polarity of the protein interior by optical spectroscopy. Nature. 319: 70-73.

121. Maki K., Cheng H., Dolgikh D., Roder H. 2007. Folding kinetics ofstaphylococcal nuclease studied by tryptophan engineering and rapid mixing methods. J. Mol. Biol. 368: 244-255.

122. Maroncelli ML, Fleming G.R. 1987. Picosecond solvation dynamics of coumarin-153: The importance of molecular aspects of solvation. J. Chem. Phys. 86: 6221-6239.

123. Marquardt D.W. 1963. An algorithm for least-square estimation of nonlinear parameters. J. Soc. Indust. Appl. Math. 11: 431-441.

124. Marriott G., Zachel K., Jovin T.M. 1988. Spectroscopic and functional characterization of an environmentally sensitive fluorescent actin conjugate. Biochemistry. 27: 6214-6228.

125. Martensson L.G., Jonasson P., Freskgard P.O., Svensson M., Carlsson U.,

126. Jonsson B.-I I. 1995. Contribution of individual tryptophan residues to the fluorescence spectrum of native and denatured forms of human carbonic anhydrase. Biochemistry. 34: 1011-1021.

127. Mataga N., Kaifu Y., Koizumi M. 1956. Solvent effects upon fluorescence spectra and dipole-moments of excited molecules. Bull. Chem. Soc. Japan. 29: 465470.

128. Mazumdar M., Parrack P.K., Bhattacharya B. 1992. Interaction of prodan withtubulin. A fluorescence spectroscopic study. Eur. J. Biochem. 204: 127-132.

129. Meagher J.L., Beechem J.M., Olson S.T., Gettins P.G. 1998. Deconvolution of the fluorescence emission spectrum of human antithrombin and identification of the tryptophan residues that are responsive to heparin binding. J. Biol. Chem. 273: 23283-23289.

130. Melhuish W.H. 1975. Modified technique for determining the wavelength-sensitiving curve of a spectrofluorimeter. Appl. Optics. 14: 26-27.

131. Metzler D.E., Harris C.M., Johnson R.J., Siano D.B., Thomson J.A. 1973. Spectra of 3-hydroxypyridines. Band-shape analysis and evaluation of tautomeric equilibria. Biochemistry. 12: 5377-5392.

132. Metzler C.M., Cahill A.E., Petty S., Metzler D.E., Lang L. 1985. The widespread application of lognormal curves for the descriptio of absorption spectra. Appl. Spectrosc. 39: 333-339.

133. Metzler C.M., Viswanath R., Metzler D.E. 1991. Equilibria and absorption spectra of tryptophanase. J. Biol. Chem. 266: 9374-9381.

134. Morii H., Honda S., Ohashi S., Uedaira H. 1994. a-Helical assembly ofbiologically active peptides and designed helix bundle protein. Biopolymers. 34:481^188.

135. Mukamel S. 1985. Fluorescence and absorption of large anharmonic molecules. Spectroscopy without eigenstates. J. Phys. Chem. 89: 1077-1087.

136. Nakamura M., Sekino-Suzuki N., Mitsui K., Ohno-Iwashita Y. 1998. Contribution of tryptophan residues to the structural changes in perfringolysin О during interaction with liposomal membranes. J. Biochem. 123: 1145-1155.

137. Nowak W., Adamczak P., Baiter A., Sugita A. 1986. On the possibility of fluorescence from twisted intramolecular charge transfer states of 2-dimethylamino-6-acylnaphthalenes. A quantum-chemical study. J. Mol. Struct. (Theochem). 139: 13-22.

138. Pandit A., Larsen O.F.A., van Stokkum I.H.M., van Grondelle R., Kraayenhof R., van Amerongen H. 2003. Ultrafast polarized fluorescence measurements on monomeric and self-associated melittin. J. Phys. Chem. В107: 3086-3090.

139. Piatt J.R. 1949. Classification of spectra of cata-condensed hydrocarbons. J. Chem. Phys. 17: 484-495.

140. Permyakov E.A., Burstein E.A. 1975. Relaxation processes in frozen aqueous solutions of proteins: temperature dependence of fluorescence parameters. Studia biophys. 51: 91-103.

141. Permyakov E.A., Burstein E.A. 1977a. Fast relaxation processes in proteinpowders. Effect of water content on the temperature dependence of protein fluorescence spectrum position. Studia Biophys. 64: 83-93.

142. Permyakov E.A., Burstein E.A. 1977b. Relaxation processes in frozen aqueous solutions. Effects of water isotopic composition and of chromophore localization on the relaxation freezing. Studia biophys. 64: 163-172.

143. Permyakov E.A., Yarmolenko V.V., Emelyanenko V.I., Burstein E.A., Closset J., Gerday Ch. 1980. Fluorescence studies of the calcium binding to whiting (<Gadus merlangus) parvalbumin. Eur. J. Biochem. 109: 307-315.

144. Permyakov E.A., Shnyrov V.L. 1983. A speclrofluorimetric study of theenvironment of tryptophans in bacteriorhodopsin. Biophys. Chem. 18: 145-152.

145. Pohlmeyer K., Soil J., Steinkamp S., Hinnah S., Wagner R. 1997. Isolation and characterization of an amino acid-selective chanel protein present in the chloroplastic outer envelope. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 9504-9509.

146. Prendergast F.G., Meyer M., Carlson G.K., lida S., Potter J.D. 1983. Synthesis, spectral properties, and use of 6-acryloyl-2-dimethylaminonaphtalene (acrylodan). J. Biol. Chem. 258: 7541-7544.

147. Privat J.P., Wahl Ph., Auchet J.-C., Pain R.H. 1980. The time resolvedspectroscopy of tryptophyl fluorescence of yeast 3-phosphoglycerate kinase. Biophys. Chem. 11: 239-248.

148. Quay S.C., Condie C.C. 1983. Conformational studies of aqueus melittin: Thermodynamic parameters of the monomer-tetramer self-association reaction. Biochemistry. 22: 695-700.

149. Quay S.C., Condie C.C., Minton K.W. 1985. Conformational studies of aqueous melittin: Collisional quenching of tryptophan-19 fluorescence in melittin. Biochim. Biophys. Acta. 831: 22-29.

150. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Bose K., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. 1993. Three-dimension structure of myosin subfragment-1: Amolecular motor. Science. 261: 50-58.

151. Rehms A.A., Callis P.R. 1987. Resolution of La and Lb bands in methyl indoles by two-photon spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 140: 83-89.

152. Reshetnyak Ya.K., Burstein E.A. 2001a. Decomposition of protein tryptophanfluorescence spectra into log-nonnal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan classes in proteins. Biophys. J. 81: 1710-1734.

153. Rottenberg H. 1992. Probing the interactions of alcohols with biological membranes with the fluorescent probe prodan. Biochemistry. 31: 9473-9481.

154. Royer C.A., 2006. Probing protein folding and conformational transition with fluorescence. Chem.Rev. 106: 1769-1784.

155. Semisotnov G., Rodionova N., Razgulyaev O., Uversky V., Gripas A.,

156. Gilmanshin R. 1991. Study of the "molten globule " intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe. Biopolymers. 31: 119-128.

157. Siano D.B., Metzler D.E. 1969. Band shapes of the electronic spectra of complex molecules. J. Chem. Phys. 51: 1856-1861.

158. Sire 0., Alpert В., Royer C.A. 1996. Probing pH and pressure effets on the apomyoglobin heme pocket with the 2'-(N,N-dimethylamino)-6-naphthoyl-4-?nms-cyclohexanoic acid fluorophore. Biophys. J. 70: 2903-2914.

159. Slater L.S., Callis P.R. 1995. Molecular orbital theory of the 'La and 'Lb states of indole. An ab initio study. J. Phys. Chem. 99: 8572-8581.

160. Song P.-S., Kurtin W.E. 1969. The charge distribution in the excited states of some indoles. Photochem. Photobiol. 9: 175-177.

161. Strickland E.H., Horwitz J., Billups C. 1970. Near-ultraviolet absorbtion bands of tryptophan. Studies using indole and 3-methylindole as models. Biochemistry. 9: 4914-4921.

162. Strickland E.H., Billups C., Kay E. 1972. Effects of hydrogen bonding and solvents upon the tryptophanyl 'La absorbtion band. Studies using 2,3-dimethylindole. Biochemistry. 11: 3657-3662.

163. Sun M., Song P.-S. 1977. Solvent effects on the fluorescent states of indole derivatives dipole moments. Photochem. Photobiol. 25: 3-9.

164. Szabo A.G., Stepanik T.M., Wayner D.M., Young N.M. 1983. Conformational heterogenety of copper binding site in azurin. A time-resolved fluorescence study. Biophys. J. 41: 233-244.

165. Takashi R., Duke J., Ue K., Morales M.F. 1976. Defining the "fast-reacting" thiols of myosin with 1,5 IAEDANS. Arch. Biochem. Biophys. 175:279-283.

166. Talbot J.C., Dufourcq J., de Bony J., Faucon J.F., Lussan C. 1979. Conformational change and self association of monomeric melittin. FEBS Lett. 102: 191-193.

167. Tatischeff J., Klein R. 1975. Influence of the environment on the excitation wavelength dependence of the fluorescence quantum yield of indole. Photochem. Photobiol., 22: 221-229.

168. Teale F.W.J, Weber G. 1957. Ultraviolet fluorescence of aromatic amino acids. Biochem. J. 57: 476-482.

169. Teale F.W.J, Weber G. 1958. Ultraviolet fluorescence of proteins. Biochem. J. 2: 15-23.

170. Terwilliger T.C., Eisenberg D. 1982. The structure of melittin. II. Interpretation of the structure. J. Biol. Chem. 257: 6016-6022.

171. Terwilliger Т.С., Weissman L., Eisenberg D. 1982. The structure of melittin in form I crystals and its implication for melittin's lytic and surface activities. Biophys.J. 37:353-361.

172. Timasheff S.N., Mecanti L., Basch J.J., Townend R. 1966. Conformation transition of bovine lactoglobulins F, B, and C. J. Biol. Chem. 241: 2496-2501.

173. Toptygin D., Brand L. 2000. Spectrally- and time-resolved fluorescence emission of indole during solvent relaxation: A quantitative model. Chem. Phys. Lett. 322:496-502.

174. Tran C.D., Beddard G.S. 1985. Studies of the fluorescence from tryptophan in melittin. Eur. Biophys. J. 13: 59-64.

175. Valeur В., Weber G. 1977. Resolution of the fluorescence excitation spectrum of indole into 'La and 'Lb excitation bands. Photochem. Photobiol. 25: 441-444.

176. Valeva A., Palmer M., Bhakdi S. 1997. Staphylococcal a-toxin: Formation of the heptameric pore is partially cooperative and proceeds through multiple inermediate stages. Biochemistry. 36: 13298-13304.

177. Viard M., Gallay J., Vincent M., Meyer O., Robert В., Paternostre M. 1997.1.urdan solvatochromism: Solvent dielectric relaxation and intramolecular excited-state reaction. Biophys. J. 73: 2221-2233.

178. Vogel H. 1981. Incorporation of melittin into phosphatidylcholine bilayers. Study of binding and conformational changes. FEBS Lett. 134: 37-43.

179. Wagner P.D., Weeds A.G. 1977. Studies on the role of myosin alkali lightchains. Recombination and hybridization of light chains and heave chains in subfragment-1 preparations. J. Mol Biol. 109: 455-470.

180. Wahl P., Auchet J.-C. 1972. Resolution des spectres de fluorescence au mouen des declins. Application a l'etude de la serum albumine humaine. Biochim. Biophys. Acta. 285:99-117.

181. Walker M.S., Bednar T.W., Lumry R. 1967. Exciplex studies. 2. Indole and indole derivatives. J. Chem. Phys. 47: 1020-1028.

182. Wasylewski Z., Koloczek II., Wasniowska A. 1988. Fluorescence-quenching-resolved spectroscopy of proteins. Eur. J. Biochem. 172: 719-724.

183. Wearsch P., Voglino L., Nicchitta Ch. 1998. Strutural transitions accompanyng the activation of peptide binding to the endoplasmic reticulum Hsp90 chaperone GRP94. Biochemistry. 37: 5709-5719.

184. Weber G. 1960. Fluorescence-polarization spectrum and electronic-energy transfer in tyrosine, tryptophan and related compounds. Biochem. J. 75: 335-345.

185. Weber G. Farris F.J. 1979. Synthesis and spectral properties of a hydrofobicfluorescent probe: 6-Propionil-2-(dimetilamino)naphtalene. Biochemistry. 18:3075-3078.

186. Willaet,K., Engelborghs Y. 1991. The quenching of tryptophan fluorescence by protonated and unprotonated imidazole. Eur. Biophys. J. 20: 177-182.

187. Xiao M., Tartakowski A., Andreev O.A., Borejdo J. 1999. Binding of SI (A 1) and SI (A2) to F-actin. Biochemistry. 35: 523-530.

Информация о работе

Емельяненко, Виктор Иванович
кандидата физико-математических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Компонентный анализ спектров флуоресценции как метод исследования структурных и физико-химических переходов в белках - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы