Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплекс методов исследования NK-клеток в норме и при патологии

ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Комплекс методов исследования NK-клеток в норме и при патологии"

На правах рукописи

МУРУГИН ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧ

КОМПЛЕКС МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 1ЧК-КЛЕТОК В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

03.03.03 - иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 ОКТ 2Ш2

Москва, 2012 г.

005053492

005053492

Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Научный руководитель: Пащенков Михаил Владимирович

кандидат медицинских наук.

Официальные оппоненты: Яздовский Виктор Владимирович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского.

Чекнев Сергей Борисович доктор медицинских наук, заведующий лабораторией, ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Ведущая организация: ФБУН «Московский научно-

исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора.

Защита состоится 24 октября 2012 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций - Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу:

115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан 20 сентября 2012 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук

Сеславина Лия Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. ЫК-клетки являются важной составляющей иммунной системы; они играют важнейшую роль в противовирусном н противоопухолевом иммунитете. Нарушения функционирования 1ЧК-клеток лежат в основе патогенеза многих первичных и вторичных иммунодефицитов. Поэтому выявление функциональных дефектов ЫК-клеток позволит более детально оценить их вклад в патогенез этих заболеваний.

В настоящее время в лабораторной практике широко применяется только один стандартный метод оценки функциональной активности ЫК-клеток - тест на ЫК-активность фракции мононуклеарных клеток (МНК) по киллингу МНС-1-негативных клеток-мишеней. В то же время ЫК-активность определяется целым рядом параметров: процентным содержанием N К-клеток среди МНК, содержанием в литических гранулах МС-клеток перфорина и гранзимов, способность ЫК-клеток дегранулировать (т.е. высвобождать перфорин и гранзимы из гранул). Все эти параметры могут быть связаны с патогенезом заболеваний и имеют большую клиническую значимость.

В связи с этим разработка комплекса методов исследования ЫК-клеток, позволяющего оценить все эти параметры, является чрезвычайно актуальной задачей. Методологической основой данного комплекса методов является проточная цитометрия. Применение этого комплекса для обследования пациентов с первичными иммунодефицитами и инфекционными заболеваниями может быть использовано для совершенствования схем диагностики и лечения.

Цель работы. Разработка и применение комплекса методов исследования ЫК-клеток у здоровых лиц, при вирусных инфекциях и первичных иммунодефицитах. Задачи

1. Отработать методики оценки ЫК-активности, процентного содержания МК-клеток среди МНК, содержания литических гранул и

внутриклеточного перфорина в ИК-клетках, дегрануляции МК-клеток по экстернализации СБ 107а с помощью проточной цитометрии.

2. Уточнить значимость СБ 107а как маркера дегрануляции ЫК-клеток.

3. Оценить применимость маркера СЭбЗ для оценки дегрануляции ЫК-клеток.

4. Применить комплекс методов, перечисленных в п.1, для исследования - функций МК-клеток у здоровых лиц. Получить нормативные

показатели. Проанализировать корреляционные связи между отдельными параметрами системы МК-клеток.

5. Используя разработанный комплекс методов, оценить состояние системы МК-клеток при первичных иммунодефицитах (синдром Вискотта-Олдрича (СВО), хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ)), часто рецидивирующем герпесе (ЧРГ), а также у лиц пожилого возраста.

6. Провести фенотипический анализ дегранулирующей субпопуляции МК-клеток.

Научная новизна. Ж-клетки играют важную роль в защите от вирусных инфекций и злокачественных опухолей, а также в патогенезе ряда первичных и вторичных иммунодефицитов. Однако адекватная оценка функции МК-клеток в клинических условиях затруднена из-за отсутствия необходимой методологической базы. Научная значимость данной работы состоит в том, что впервые разработан и результативно применен методологический подход, позволяющий комплексно оценить ключевые функциональные параметры МК-клеток. Это позволило уточнить вклад МК-клеток в патогенез некоторых первичных и вторичных иммунодефицитов. Получен ряд обладающих новизной результатов.

Так, впервые прямо показан дефект дегрануляции МК-клеток у детей с первичным иммунодефицитом - синдромом Вискотта-Олдрича, что сопровождается снижением МК-активности при нормальном внутриклеточном содержании СБ 107а и перфорина в МК-клетках. Впервые

показано отсутствие значимых нарушений дегрануляции ЫК-клеток и N реактивности у детей с хронической гранулематозной болезнью.

Также впервые обнаружен дефект дегрануляции ЫК-клеток у больных с часто рецидивирующим герпесом, наблюдающийся независимо от стадии заболевания (обострение или ремиссия).

Впервые обнаружено снижение дегрануляции ЫК-клеток у лиц пожилого возраста по сравнению с молодыми донорами. Нарушение дегрануляции ЫК-клеток у пожилых лиц не сопровождается снижением ЫК-активности и внутриклеточного содержания СО 107а в Ж.-клетках.

Кроме того, в работе впервые показано, что СБ 107а является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции, чем СБ63. Подтверждено, что СБ107а является адекватным маркером дегрануляции ЫК-клеток.

Разработанный комплекс методов позволяет принимать более обдуманные решения по диагностике и тактике лечения первичных и вторичных иммунодефицитов, сопровождающихся нарушением функции ЫК-клеток. Результаты, полученные с помощью этого комплекса методов, дают возможность предположить локализацию генетического дефекта у пациентов с первичными иммунодефицитами и, таким образом, определить направление генотипирования. При вторичных иммунодефицитах результаты комплексного исследования ЫК-клеток могут учитываться при выборе терапии, направленной на коррекцию функциональных нарушений ЫК-клеток.

Практическая значимость. В работе подтверждено, что разработанный комплекс методов обладает клинической значимостью в оценке функции ЫК-клеток при первичных иммунодефицитах и вирусных инфекциях.

Методы, входящие в комплекс, дают возможность установить причину нарушения функции ЫК-клеток (снижение процентного содержания ЫК-клеток среди мононуклеаров, снижение способности ЫК-клеток к

дегрануляции, снижение экспрессии цитотоксических белков ЫК-клетками). В зависимости от результатов исследования может проводиться целенаправленная диагностика, а также лечение, направленное на коррекцию выявленных нарушений. Разработанный комплекс методов исследования N К-клеток может применяться в лабораториях клинической иммунологии для выявления функциональных дефектов в системе >1К-клеток при первичных и вторичных иммунодефицитах.

Кроме того, методологическая база, примененная в данной работе, может служить основой для дальнейшего расширения комплекса методов исследования МК-клеток, в который может быть включено исследование экспрессии цитокинов при активации МК-клеток, а также исследование более широкого спектра цитотоксических белков.

Результаты диссертационной работы легли в основу методического пособия по оценке клеточного иммунитета.

Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе для студентов медицинских ВУЗов, в учебных программах повышения квалификации в системе последипломного образования.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Материалы исследований были представлены на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009) и XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011).

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 230 источников, и приложения. Работа содержит 36 таблиц и 19 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных групп. Возраст всех групп ниже представлен как медиана [10—90 процентили].

1. Группа пациентов с синдромом Вискотга-Олдрича — 15 мальчиков в возрасте 4 [1—14] лет, наблюдающихся в отделении иммунопатологии Детской городской клинической больницы №9 им. Г.Н.Сперанского г.Москвы (зав. отделением — профессор, д.м.н. А.П.Продеус). 8 пациентов на момент исследования получали иммуносупрессивную терапию.

2. Группа пациентов с хронической гранулематозной болезнью - 9 мальчиков в возрасте 9 [4—14] лет, наблюдавшихся в отделении клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы (зав. отделением — профессор, д.м.н. И.В.Кондратенко). 7 больных на момент исследования получали массивную антимикробную терапию.

3. Группа пациентов с часто рецидивирующим герпесом - 34 человека в возрасте 33 [24—50] лет, из них 11 мужчин и 23 женщины, наблюдавшихся в отделении аллергологии и иммунотерапии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (зав. отделением — профессор, д.м.н. А.Е.Шульженко). Большинство пациентов с ЧРГ имели генитальную локализацию высыпаний с частотой обострений от 2 до 6 в год. Подгруппа из 24 пациентов была исследована в динамике: в ходе обострения и во время ремиссии. Остальные 10 человек были исследованы только в обострении.

4. Три группы здоровых доноров, давших добровольное согласие на участие в исследовании:

1) группа сравнения для детей с СВО и ХГБ — 28 доноров не старше 30 лет (возраст 25 [23—28] лет);

2) группа сравнения для пациентов с ЧРГ — 56 здоровых доноров (возраст 27 [23—35] лет), из них 21 мужчина и 35 женщин. Эта группа включала в себя всех доноров первой группы. По возрастному и половому составу эта группа достоверно не отличалась от группы с ЧРГ;

3) группа пожилых доноров — составили 15 человек (возраст 70 [67—77] лет), из них 10 мужчин и 5 женщин.

Исследование дегрануляцнн NK-клеток. Дегрануляцию NK-клеток оценивали методом проточной цитометрии по экстернализации маркера CD 1.07а после стимуляции in vitro. Использовали методику Alter et al. (2004) с модификациями. МНК выделяли из венозной крови на градиенте плотности фиколл-урографина, отмывали средой 199 (оба реагента ПанЭко. Россия) и ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), которая представляла собой RPMI-1640 (Панэко) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (РАА, Австрия) и 2 мМ L-глутамина (Sigma, США). В 96-луночные круглодонные планшеты вносили: моненсин (Sigma; конечная концентрация 10 мкМ), FITC-меченные антитела к CD107a (клон Н4АЗ, BD Pharmingen, США; конечное разведение 1/200) и МНК (5><105 клеток на лунку). В качестве индукторов дегрануляции NK-клеток использовали рецептор-зависимый стимул — клетки К562 (5х 105 клеток на лунку, соотношение эффектор:мишень = 1:1), а также рецептор-независимый стимул — форбол-12-миристат-13-ацетат + иономицин (ФМА+ИОН; конечные концентрации 100 нг/мл и 0,5 мкг/мл соответственно; оба Sigma). Максимальную дегрануляцию индуцировали ФМА+ИОН в комбинации с цитохалазином Б (ЦБ, Sigma, конечная концентрация 5 мкг/мл). В лунку отрицательного контроля вместо индукторов дегрануляции добавляли равный объем ПКС. Для контроля окраски на CD 107а в еще одну контрольную лунку не добавляли антитела к CD107a.

Циклогексимид (ЦГ, Sigma, конечная концентрация 10 мкг/мл) добавляли к МНК за 15 мин до добавления индукторов дегрануляции.

После добавления всех ингредиентов содержимое лунок однократно перемешивали, после чего планшет центрифугировали для осаждения клеток и инкубировали 4 ч в С02-инкубаторе (5% С02, 37°С). Затем планшет еще раз центрифугировали, отбирали супернатант и ресуспендировали клетки в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, Панэко) с 0,02% азидом натрия и 0,02%

ЭДТА для диссоциации клеточных агрегатов (5 мин, КТ). Затем клетки отмывали в ФСБ с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА, Панэко) и окрашивали РС5-меченными антителами к CD3 и РЕ-меченными антителами к CD56 (Beckman Coulter, США) для идентификации NK-клеток. Образцы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 с программным обеспечением СХР (все Beckman Coulter). NK-клетки идентифицировали как CD3"CD56+ лимфоциты. Рассчитывали процент CD107a+ NK-клеток по отношению ко всем NK-клеткам и ко всем МНК.

При исследовании фенотипа дегранулирующих NK-клеток докрашивание клеток после инкубации проводили РС5-меченными моноклональными антителами (МАТ) к CD3, РС7-меченными МАТ к CD56 и одним из следующих МАТ, меченных PE: CD8, CD57, CD94, CD159a, CD335 (все Beckman Coulter). При оценке CD63 в качестве маркера дегрануляции использовали РЕ-меченные МАТ к CD63 вместе с FITC-меченными МАТ к CD 107а. После инкубации клетки докрашивали РС5-меченными МАТ к CD3 и РС7-меченными МАТ к CD56.

Исследование NK-актнвностн. NK-активность МНК исследовали методом проточной цитометрии по киллингу клеток-мишеней К562, меченных CFSE (5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидиловый эфир, Molecular Probes, США). Для мечения клетки К562 (107/мл в ФСБ) инкубировали с CFSE (0,6 мкМ) в течение 10 мин в темноте при 37°С, после чего отмывали, ресуспендировали в ПКС и добавляли в 96-луночный круглодонный планшет по 8><103 клеток на лунку. МНК добавляли к клеткам-мишеням так, чтобы соотношение эффектор:мишень (Э:М) составило 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1 и 3,125:1. Для контроля спонтанной гибели клеток-мишеней использовали лунки, куда вместо МНК добавляли ПКС. Планшет центрифугировали для осаждения клеток и инкубировали 4 ч в С02-инкубаторе. Затем клетки ресуспендировали и окрашивали пропидий-йодидом (PI, Sigma, конечная концентрация 1 мкг/мл, 10 мин при КТ в темноте). Пробы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500;

определяли процент погибших мишеней (РГ+СР5Е+ событий) по отношению ко всем СРБЕ+ событиям. Процент киллинга рассчитывали по формуле:

% погибших мишеней в опыте - % спонтанной гибели % киллинга =----х 100%.

100% - % спонтанной гибели

Литическая единица-20 (ЛЕ20) — это количество МНК, необходимое для киллинга 20% мишеней К562. Количество ЛЕ20 на 105 МНК рассчитывали по формуле:

105

ЛЕ20 на 103 МНК =-,

8ХЮ3ХЭ:М20

где 8хЮ3 — количество мишеней на лунку; Э:М2о — соотношение Э:М, при котором киллинг составил бы 20%. Если 20%-ный киллинг не достигался при Э:М=50:1, то количество ЛЕ20 на 105 МНК приравнивали к 0.

Внутриклеточная окраска на СБ107а и перфорин. Свежевыделенные МНК ресуспендировали в ФСБ с 0,5% БСА и окрашивали РС5-меченными МАТ к СОЗ (1/50) и РЕ-меченными МАТ к СБ56 (1/50). Затем клетки отмывали в ФСБ и фиксировали 4% параформальдегидом на ФСБ (15 мин., 4°С), после чего пермеабилизировали с помощью 0,1% сапонина на ФСБ с 0,5% БСА и окрашивали внутриклеточно антителами к СБ 107а и перфорину (разведение антител 1/100). В каждом опыте делали изотип-контроль внутриклеточной окраски, используя иммуноглобулины того же изотипа и метки, что и специфические антитела. Клетки анализировали на проточном цитометре Смогшее РС500. Экспрессию внутриклеточных молекул представляли как средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) клеток при окраске специфическими антителами минус СИФ при окраске изотип-контролем.

Сочетаннын анализ дегрануляции и внутриклеточной экспрессии

перфорипа и гранзима А. Чтобы оценить остаточные уровни перфорина и

гранзима А в ЫК-клетках после дегрануляции, реакцию дегрануляции

ставили с РГГС-меченными МАТ к СО 107а, докрашивали клетки РС5-

меченными МАТ к СЭЗ и РС7-меченными МАТ к С056, после чего

8

фиксировали и пермеабилизировали. Внутриклеточную окраску проводили с помощью РЕ-меченных МАТ к гранзиму А и перфорину (оба 1/50). Клетки отмывали и анализировали на цитометре Cytomics FC500 как описано выше.

Статистическая обработка результатов. Использовали программы GraphPad Instat 3.06 и Statsoft Statistica 6.0. Все данные представляли как медиана (10-й — 90-й процентиль). Если в группе было менее 10 измерений, то вместо 10-го и 90-го процентилей указывали минимум и максимум группы. Две группы сравнивали при помощи U-теста Манна-Уитни. Три группы сравнивали с помощью теста Крускала-Уоллиса; при получении в этом тесте значения р<0,05 проводили попарное сравнение групп с помощью U-теста Манна-Уитни. Парные измерения сравнивали с помощью теста Уилкоксона. Корреляции оценивали с помощью критерия Пирсона. Различия и корреляции считали достоверными при р<0,05. Корреляции считали слабыми при |г|<0,4, средней силы — при |г|=0,4-Ю,7, сильными — при |г|>0,7.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Валидация CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток. NK-

клетки экстернализируют CD107a при активации (Alter et al., 2004). Хотя роль CD107a как маркера дегрануляции была всесторонне изучена для CD8+ Т-клеток (Betts et al, 2003), для NK-клеток аналогичная работа не была проведена. Появление CD 107а на поверхности NK-клеток может быть как результатом дегрануляции (т.е. внутриклеточного перераспределения уже имеющегося CD 107а), так и следствием синтеза de novo (т.е. процесса, не связанного с дегрануляцией). Однако ЦГ (ингибитор синтеза белка) не влиял на экстернализацию CD 107а, вызванную К562 и ФМА+ИОН+ЦБ (таблица 1), что исключает появление CD107a на поверхности в результате синтеза de novo.

Таблица 1. Процент №С-клеток, экстернализирующих СП 107а при 4-часовой инкубации с указанными активаторами и ЦГ. Показаны медианы (минимум— максимум). ____

Без активаторов К562 ФМА+ИОН+ЦБ

-ЦГ 0,8 (0,6-2,0) 12,5 (7,1-25,9) 88,3 (59,6-97,5)

+ЦГ (10 мкг/мл) 0,8 (0,4-2,4) 11,1 (6,4-26,6) 85,1 (66,2-97,1)

Если СБ 107а является маркером дегрануляции, то его появление на поверхности МС-клетки должно сопровождаться падением внутриклеточного содержания белков цитотоксических гранул, в частности гранзима А. Однако Тотевси е1 а1. (2009) сообщили об одинаковом содержании перфорина и гранзимов в СОЮ7а+ и СО 107а" ЫК-клетках после дегрануляции. Для изучения этого вопроса исследовали внутриклеточный уровень гранзима А (СИФ) в МС-клетках, стимулированных К562 или ФМА+ИОН+ЦБ (рис. 1). При инкубации с клетками К562 уровень гранзима А в МС-клетках, не экстернализирующих СБ 107а (СОЮ7апег) существенно не менялся по сравнению с неактивированными ЫК-клетками, тогда как в МС-клетках с высокой экстернализацией СО 107а (СО 107а'"8Н) снижался более чем в 2 раза. При активации ФМА+ИОН+ЦБ уровень гранзима А в СОЮ7апе8 МС-клетках даже несколько возрастал, тогда как в СОЮ7а|п' (экстернализирующих промежуточные уровни СО 107а) и в С0107аЫ8Н МС-клетках он был, соответственно, в 2 и 4 раза ниже, чем в СОЮ7апе8. Таким образом, чем выше экстернализация СО 107а, тем меньше остаточное содержание гранзима А в МС-клетках, что подтверждает роль СО 107а как маркера дегрануляции.

--*- CD107a (поверхи., 4 ч)

Рисунок 1; Экстернализация CD 107а и внутриклеточное содержание гранзима А в CD3 CD56 NK-клетках здорового донора после 4-часовой инкубации без активаторов, с клетками К562 (1:1) или с ФМА+ИОН+ЦБ. Регионами на графиках выделены клетки, не экспрессирующие поверхностный CD 107а (neg, от negative) экспрессирующие промежуточные (int, от intermediate) и высокие (high) уровни CD 107а. Цифры на графиках — СИФ гранзима А в соответствующих регионах

К562

Без активаторов

ФМА+ИОН+ЦБ

Аналогичные данные были получены и для внутриклеточного содержания перфорина.

Киллинг МНС-1-негативных мишеней, таких, как клетки К562, осуществляют только ЫК-клеткн. Действительно, при инкубации МНК с клетками К562 только МК-клетки (СОЗ~СС56+) экстернализировали СО 107а; СБЗ+С056+ Т-клетки отвечали слабо, а СБЗ+СБ56" Т-клетки не отвечали вовсе (таблица 2).

Таблица 2. Экстернализация СБ 107а различными субпопуляциями лимфоцитов здоровых доноров (до 50 лет) при 4-часовой инкубации. Показаны медианы, в скобках— 10-й и 90-й процентили. N=40._

Субпопуляция лимфоцитов % СОЮ7а+ клеток

Без активаторов К562

С03~С056+ МК-клетки 0,4 (0,1-0,8) 11,2 (5,1-21,8)

СОЗ+СБ56+ Т-клетки 0,6(0,2-1,2) 1,9 (0,9-4,9)

СБЗ+СВ56" Т-клетки 0,2 (0,0-0,4) 0,3 (0,1-0,8)

Учитывая вышеизложенное, была проанализирована связь между экстернализацией СИ 107а МК-клетками и ЫК-активностыо МНК. Была выявлена корреляция между процентом N К-клеток, экстернализирующих СОЮ7а, и ПК-активностью у здоровых доноров (таблица 3). Коэффициент корреляции был выше, если процент СБШа-экстернализирующих №<_-клеток выражали по отношению ко всем МНК (г=0,72, р<0,001), а не по отношению к ЫК-клеткам (г=0,42, р<0,05). Это легко объяснимо тем обстоятельством, что для оценки ЫК-активности использовались МНК, а не изолированная популяция ЫК-клеток. Была выявлена также тривиальная связь между МК-актиштостыо и процентом №С-клеток среди МНК (г=0,64, р<0,001), однако эта корреляция была слабее, чем корреляция между МК-активностыо и процентом СБШа-экстернализирующих N К-клеток (выраженным по отношению ко всем МНК). ЫК-активность не коррелировала с СИФ СБ 107а на СОЮ7а+ ЫК-клетках и с внутриклеточным содержанием СИ 107а и перфорина в ЫК-клетках до дегрануляции.

В совокупности, приведенные данные подтверждают, что СО 107а является информативным маркером дегрануляции МК-клеток.

Таблица 3. Коэффициенты корреляции (г) между МК-активностью МНК и указанными параметрами МК-клеток у здоровых доноров.___

Параметр 1 Параметр 2 (¡ЧК-актнвность) г

% МК-клеток среди МНК %киллинга при Э:М = 50:1 0,64***

% МК-клеток, дегранулирующих в ответ на К562, по отношению ко всем МК-клеткам % киллинга при Э:М = 50:1 0,42*

% МК-клеток, дегранулирующих в ответ на К562, по отношению ко всем МНК % киллинга при Э:М = 50:1 0,72***

СИФ СО 107а на МК-клетках, дегранулирующих в ответ на К562 % киллинга при Э:М = 50:1 0,03

Внутриклеточное содержание СО 107а в МК-клетках (СИФ) % киллинга при Э:М = 50:1 0,19

Внутриклеточное содержание перфорина в МК-клетках (СИФ) % киллинга при Э:М = 50:1 0,07

*р < 0,05, ***р< 0,001

СБбЗ как маркер дегрануляции ГЧК-клеток. Сравнивали кинетику появления СО 107а и СБбЗ на поверхности МК-клеток в ходе инкубации. Оказалось, что при стимуляции клетками К562 маркер СП 107а раньше появляется на мембране МК-клеток, чем СОбЗ. Так, в течение первых 15 минут инкубации с К562 экстернализация СО 107а и СОбЗ наблюдается, соответственно, на 3,8 (2,6-9,8)% и 0,7 (0,5-1,2)% МК-клеток, в течение первых 30 минут — на 4,3 (3,3-10,5)% и 1,8 (0,5-3,7)%. При более длительной инкубации (2 и 4 ч) процент МК-клеток, экстернализировавших СОбЗ, становится незначительно выше, чем процент экстернализировавших СО 107а. При стимуляции ФМА+ИОН+ЦБ процент МК-клеток, экстернализировавших СОЮ7а, был минимум в 1,5 раза выше, чем процент С063+ клеток, во все сроки инкубации. При инкубации без индукторов дегрануляции экстернализация СОЮ7а наблюдалась менее чем на 1% МК-клеток. Однако экстернализация СОбЗ в этих условиях постепенно нарастала и к 4 ч составляла 2,6 (1,3-7,4) %.

Учитывая более высокую спонтанную экстернализацию СБ63 и менее выраженную индуцированную, особенно при активации ФМА+ИОН+ЦБ, а также относительно позднее появление СБ63 на поверхности ИК-клеток, СБ63 является менее чувствительным и менее специфичным маркером дегрануляции ЫК-клеток, чем СО 107а.

Показатели функционального состояния 1ЧК-клеток у лиц пожилого возраста. У пожилых лиц (65 лет и старше) по сравнению с молодыми (40 лет и моложе) было резко снижено процентное содержание ЫК-клеток, дегранулирутощих в ответ как на рецепторный стимул (клетки К562), так и на нерецепторные стимулы — ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ, причем указанные межвозрастные различия наблюдались как у мужчин, так и у женщин (таблица 4). Внутриклеточная экспрессия СБ 107а в ЫК-клетках у пожилых не была снижена, что исключает роль этого фактора в снижении экстернализации СБ 107а.

Таблица 4. Процент ИК-клеток, дегранулирутощих в ходе инкубации с указанными активаторами (по отношению ко всем КК-клеткам)- Показаны медианы, в скобках — 10-й—90-й процентили.___

Без активаторов К562 ФМА+ИОН ФМА+ИОН+ЦБ

Все Молодые (п=38) 0,38 (0,2-0,8) 12,2 (5,2-22,3) 12,2 (5,2-26,1) 67,4 (22-88,3)

Пожилые (п=15) 0,29 (0,1-0,5) 3,9 (2,3-7,3)*** 1,9 (0,4-7,6)*** 17,1 (0,5-39,3)***

Мужчины Молодые (п=14) 0,37 (0,2-0,7) 11,7 (7,5-15,6) 10,7 (5,8-16,3) 57,2 (30,1-82,9)

Пожилые (п=10) 0,28 (0,1-0,5) 3,4 (2,1-8,6)** 1,8 (0,4-5,3)** 26,0 (10,0^48,9)*

Женщины Молодые (п=24) 0,38 (0,2-0,8) 12,7 (5,2-24,7) 14,0 (5,1-29,3) 67,4 (28,6-88,8)

Пожилые (п-5) 0,29 (0,2-0,4) 5,0 (3,9-7,2)* 2,0 (0,4-7,7)** 8,7 (0,6-27,9)***

*р < 0,05, **р < 0,01, ***р <0,001 при сравнении с соответствующей

подгруппой молодых доноров (тест Манна-Уитни).

Несмотря на сниженную дегрануляцию ЫК-клеток, показатели N реактивности МНК в двух возрастных группах практически не различались (таблица 5). Нормальная ЫК-активность при сниженной дегрануляции у пожилых не объяснялась повышенным содержанием N К-клеток среди МНК:

13

у пожилых доноров процент NK-клеток составил 8,0 (2,9—15,4)% от всех МНК, у молодых — 9,0 (5,1—16,8)% (р = 0,41).

Таблица 5. 1ЧК-активность МНК у пожилых и молодых доноров. Даны проценты киллинга мишеней К562 для различных соотношений Э:М, а также количество ЛЕ;0 на 105 МНК (медианы, в скобках — 10-й—90-й процентили).__

Соотношение Э:М ЛЕго на

3,125:1 6,25:1 12,5:1 25:1 50:1 105 МНК

Молодые 5,8 9,6 19,4 32,9 43,6 0,94

(п=38) (1,5-10,6) (4,4-24,5) (10,1-39,4) (15,8-64,1) (26,3-72,8) (0,4-2,3)

Пожилые 5,1 9,7 20,1 31,2 43,0 1,0

(п=15) (3,9-10,3) (4,6-17,8) (8,5-41,7) (14,2-55,6) (25,0-65,0) (0,4-2,1)

Также у пожилых лиц, по сравнению с молодыми, была нарушена корреляция между дегрануляцией N К-клеток и показателями ЫК-ахтивности, при сохранной корреляции между процентом ЫК-клеток среди МНК и ЫК-активностыо (таблица 6). В целом, данные позволяют предположить, что хотя киллинг клеток К562 и у молодых, и у пожилых осуществляется МК-клетками, киллерная активность ЫК-клеток у пожилых в меньшей степени зависит от дегрануляции.

Таблица 6. Коэффициенты корреляции между указанными парамеграми ЬГК-клеток в исследованных группах. __

Параметр 1 Параметр 2 (NK-активность) Группы

Молодые Пожилые

% всех ГЖ-клеток среди МНК % киллинга мишеней при Э:М= 50:1 0,59** 0,8**

ЛЕ20 на 105МНК 0,82*** 0,78**

% ЫК-клеток, дегранулирующих в ответ на К562, по отношению к ЫК-клеткам % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 0,46* -0,17

ЛЕ20 на 10' МНК 0,47* -0,2

% №С-клеток, дегранулирующих в ответ на К562, по отношению ко всем МНК % киллинга мишеней при Э:М= 50:1 q 7*** 0,61*

ЛЕ2о на 105МНК 0,86*** 0,57

*р < 0,05, **р< 0,01, ***р < 0,001.

Показатели функционального состояния NK-клеток при СВО. У

больных СВО, по сравнению со здоровыми донорами, была резко снижена доля NK-клеток, дегранулирующих в ответ на стимуляцию клетками К562 (почти до значений спонтанной дегрануляции) (рис. 2, таблица 7). Ответ на

нерецепторную стимуляцию (ФМА+ИОН, ФМА+ИОН+ЦБ) был снижен менее значительно. Снижение дегрануляции у больных СВО не зависело от проводимой на момент исследования иммуносупрессивной терапии. Внутриклеточное содержание СОЮ7а и перфорина — маркеров литических гранул — укладывались в диапазон значений донорской группы. Следовательно, снижение экстернализации СО 107а 1чГК-клетками при СВО обусловлено не снижением исходного содержания СО 107а и/или литических гранул, а нарушением дегрануляции. В соответствии с резко сниженной дегрануляцией, К[К-активность МНК у больных СВО была резко снижена (% киллинга мишеней, количество ЛЕ20 на 105 МНК) (таблица 8). Корреляции между ЫК-активностью МНК и показателями дегрануляции ЫК-клеток, имеющиеся в группе доноров, в группе больных СВО полностью отсутствовали (таблица 9). Процентное содержание всех МК-клеток среди МНК у больных СВО составило 5,3 (1,1-22,2)%, что было ниже, чем у доноров (9,4 (5,2-19,1)%), однако из-за большого разброса значений в группе СВО различие не было достоверным.

Таким образом, при СВО снижена дегрануляция ЫК-клеток преимущественно в ответ на рецепторный стимул (К562), что сопровождается резким снижением ЫК-активности. Это говорит о том, что при СВО нарушено в первую очередь образование иммунологического синапса, тогда как механизмы, отвечающие за перемещения гранул в 1ЧК-клетках, относительно сохранны.

Таблица 7. Процент МК-клеток, дегранулирующих в ходе инкубации с указанными активаторами, по отношению ко всем МК-клеткам. Показаны медианы, в скобках — 10-й и 90-й процентнли.__

Группа Без активаторов К562 ФМА+ИОН ФМА+ИОН+ЦБ

Доноры 0,5 14,1 11,6 65,8

(п=28) (0,2-0,9) (7,1-24,1) (5,1-23,5) (15,3-88,6)

СВО 0,6 1,6 5,8 32,6

(п=15) (0,1-1,0) (1,1-3,4)*** (0,5-10,1)* (5,7-64,6)**

ХГБ 0,7 9,7 24,6 46,0

(п=9) (0,2-1,2) (3,8-15,7) (13,7-32,3) (11,5-59,4)*

*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).

Таблица 8. МК-активность МНК больных СВО и ХГБ по сравнению со здоровыми донорами. Показаны медианы, в скобках— 10-й и 90-й процентили. _

Группа % киллинга мишеней при данном соотношении Э:М ЛЕИ

3,125:1 6,25:1 12,5:1 25:1 50:1 на 10' МНК

Доноры 6,2 (2,1-12,4) 10,9 (4,9-23,9) 19,8 (11,6-49,6) 33,2 (16,9-66,0) 46,5 (26,5-74,11 1,0 (0,3-2,3)

СВО 8,4 5,7 7,2 5,5 5,6 0,0

(0,0-17,4) (0,0-10,2)** (0,0-14,5)** (0,2-17,5)*** (0,0-27,7)*** (0-0,3)***

ХГБ 7,4 6,5 13,9 23,3 36,6 0,7

(1,4-17,7) (0,9-25,4) (4,6-39,2) (11,7-46,5) (19,3-63,91 (0,2-2,5)

*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).

Таблица 9. Коэффициенты корреляции между указанными параметрами ИК-клеток в исследованных группах.___

Параметр 1 Параметр 2 (МК-активность) Группы

Доноры СВО ХГБ

% ЫК-клеток среди МНК % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 0,57* -0,12 0,47

ЛЕ20 на 105 МНК 0,84*** -0,13 0,38

% МК-клеток, дегранул. в ответ на К562, по отношению к МК-клеткам % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 0,51* 0,2 0,51

ЛЕ20 на 105МНК 0,37 -0,1 0,29

% ИК-клеток, дегранул. в ответ на К562, по отношению ко всем МНК % киллинга мишеней при Э:М = 50:1 0,72** -0,1 0,82**

ЛЕ20 на 105 МНК 0,79*** -0,11 0,6

* р < 0,05, **р< 0,01, ***р < 0,001.

Показатели функционального состояния ¡УК-клеток при ХГБ. В

отличие пациентов с СВО, у пациентов с ХГБ проценты дегранулирующих ЫК-клеток, рассчитанные по отношению ко всем ЫК-кгеткам, при стимуляции К562 достоверно не отличались от показателей здоровых доноров (таблица 7, рис. 2). При стимуляции ФМА+ИОН имелась тенденция к повышенной дегрануляции, тогда как при стимуляции ФМА+ИОН+ЦБ ответ был ниже, чем у здоровых доноров. Дегрануляция в ответ на все виды стимуляции не зависела от получения больными ХГБ антимикробной терапии. Процентное содержание ЫК-клеток среди МНК при ХГБ составило 5,4 (2,3-9,7)%, что было достоверно ниже, чем у здоровых доноров (9,4 (5,2— 19,1)%; р < 0,05). МК-активность у больных ХГБ была несколько ниже, чем у доноров, однако достоверных отличий от донорской группы зыявлено не было (таблица 8).

С0Ю7а

Рисунок 2. Экстернализация СИ 107а №С-клетками здорового донора (верхний ряд), больного СВО (средний ряд) и больного ХГБ (нижний ряд) при 4-часовой инкубации МНК в отсутствии активаторов, с клетками К562 (1:1), с ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ. Показаны только СЮЗ"С056+ МК-клетки. Цифры на графиках — проценты КК-клеток, экстернализировавших СБ 107а, по отношению ко всем 1ЧК-клеткам.

Корреляции между дегрануляцией ЫК-клеток и ЫК-активностью у пациентов с ХГБ были сохранены (таблица 9). Таким образом, нарушений дегрануляции ЫК-клеток при ХГБ выявлено не было.

Показатели функционального состояния КК-клеток при ЧРГ. У

пациентов с ЧРГ и в стадии обострения, и в стадии ремиссии наблюдалось умеренное снижение процентов ИК-клеток, дегранулирующих в ответ как на рецепторный стимул (К562), так и на нерецепторные стимулы (ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ) (таблица 10). При парном сравнении показателей

дегрануляции, полученных у одних и тех же пациентов в динамике (в обострении и в ремиссии), достоверных различий выявлено не было.

Таблица 10. Проценты КК-клеток, дегранулирующих при инкубации с указанными активаторами, по отношению ко всем ЫК-клеткам. Показаны медианы, в скобках — 10-й—90-й проценти ли. ___

Группа Без К562 ФМА+ИОН ФМА+ ИОН+ЦБ

активаторов

Доноры 0,4 11,2 11,8 66,8

(п=40) (0,1-0,8) (5,1-21,8) (5,2-23,9) (32,5-88,5)

ЧРГ, обострение 0,5 7,7 4,3 49,4

(п=33) (0,1-1,2) (3,0-15,7)* (1,3-12,5)*** (16,9-68,0)**

ЧРГ, ремиссия 0,3 8,2 5,5 39,1

(п=24) (0,1-0,7) (4,8-14,5)* (1,7-11,0)*** (25,4-68,6)**

*р < 0,05, **р < 0,01, ***р< 0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).

Таблица 11. МК-активность МНК у больных ЧРГ и доноров. Показаны медианы, в скобках - 10-й—90-й процента ли.__

Группа % киллинга мишеней п ри данном Э:М Кол-во ЛЕго на 105 МНК

3,125:1 6,25:1 12,5:1 25:1 50:1

Доноры (п=51) 4,6 (1,3-10,1) 9,6 (4,0-22,3) 19,3 (10,1-39,6) 29,9 (15,7-61,6) 41,5 (26,4-72,7) 0,93 (0,36-2,6)

ЧРГ, обострение (п=28) 4,2 (0,1-12,5) 9,2 (0,0-32,8) 18,2 (2,8-39,1) 29,8 (7,0-51,1) 35,3 (12,6-56,2) 0,77 (0-2,73)

ЧРГ, ремиссия (п=23) 2,3 (0,0-14,2) 5,2 (1,1-29,7) 13,9 (3,7-46,1) 20,8 (9,8-60,4) 32,5 (17,5-72,8)* 0,41 (0-2,46)*

*р < 0,05 при сравнении с группой здоровых доноров (тест Манна-Уитни).

Таблица 12. Коэффициенты корреляции между указанными параметрами 1ЧК-клеток в трех нсследованных группах.___

Параметр 1 Параметр 2 (МК-активность) Группы

Доноры Ч?Г (обостр.) ЧРГ (рем.)

% №С-клеток среди МНК % убитых мишеней при Э:М = 50:1 0,64*** 0,59** 0,64**

ЛЕ20 на 105МНК 0,76*** 0,52** 0,74***

% Ж-клеток, дегранулирующих в ответ на К562, по отношению к ЫК-клеткам % убитых мишеней при Э:М = 50:1 0,42* 0,42* 0,70***

ЛЕ20 на 105 МНК 0,42* 0,49* 0,66***

% МК-клеток, дегранулирующих в ответ на К562, по отношению ко всем МНК % убитых мишеней при Э:М = 50:1 0,72*** 0,53* 0,79***

ЛЕ20 на 105 МНК 0,81*** 0,56* 0,92***

Значения достоверностей для коэффициентов корреляции: *р < 0,05, **р < 0,01, ***р< 0,001.

Несмотря на снижение дегрануляции и в обострении, и в ремиссии, NK-активность МНК (по сравнению с донорами) была достоверно снижена только в стадию ремиссии. В стадию обострения заболевания показатели NK-активности не отличалась от таковых у доноров (таблица 11).

Внутриклеточные уровни маркеров литических гранул (CD 107а и перфорина) в NK-клетках, а также процентное содержание NK-клеток среди МНК, у пациентов с ЧРГ не были изменены по сравнению со здоровыми донорами.

Во всех трех группах (здоровые доноры, ЧРГ в обострении, ЧРГ в ремиссии) имела место достоверная корреляция между NK-активностью МНК и процентным содержанием NK-клеток среди МНК, а также между NK-активностью и процентами NK-клеток, дегранулирующих в ответ на клетки К562 (таблица 12). Однако при обострении ЧРГ коэффициенты корреляции между NK-активностью и процентом всех NK-клеток среди МНК были ниже, чем у доноров и у пациентов с ЧРГ в стадии ремиссии. То же касалось и корреляции между NK-активностью и процентами дегранулирующих NK-клеток. Эти данные показывают, что NK-активность МНК при обострении ЧРГ в меньшей степени зависит от дегрануляции NK-клеток. Одной из причин этого может быть активация других, не связанных с дегрануляцией, механизмов цитотоксичности NK-клеток при обострении ЧРГ. Пониженная дегрануляция NK-клеток и обусловленное этим снижение NK-активности, наблюдаемые в ремиссии, могут создавать благоприятные условия для нового обострения ЧРГ.

Гетерогенность NK-клеток в тесте на дегрануляцию. Тест на экстернализацию CD 107а позволил установить, что лишь меньшая часть NK-клеток (в частности, меньшая часть высокоцитотоксичной субпопуляции CD56d,m NK-клеток) дегранулирует при взаимодействии с клетками К562. Эти данные сходны с данными других групп (Alter et al., 2004; Bryceson et al., 2005; Anfossi et al., 2006). «Недегранулирующие» NK-клетки, тем не менее,

тоже активируются, о чем свидетельствует падение на них поверхностной экспрессии СБ16 и СБЗ14 (рис. 3).

-К562 +К562

-К562 1-К562

О

С0107а~ С0107а- СОЮ7а'

О -I--

С0107а- С0107а' СОЮ7а*

Рисунок 3. Снижение уровня поверхностного СИ16 и СОЗ14 при активации и дегрануляции 1ЧК-клеток здоровых доноров. СИФ СБ 16 (4 донора; А) и СБ314 (7 доноров; Б) на ИК-клетках, инкубированных 4 ч без активаторов и на СО 107а- и СОЮ7а+ Ж-клетках, инкубированных с К562. *р<0,05, **р<0,01: Б — тест Уилкоксона, А — парный 1-тест (различия в тесте Уилкоксона недостоверны из-за малого И). Горизонтальные линии на А и Б — медианы.

Можно предположить, что среди циркулирующих ЫК-клеток (СГ)56']"" ЫК-клеток) присутствует субпопуляция с немедленными эффекторными свойствами, и именно эта «эффекторная» субпопуляция дегран>лирует при кратковременной (до 4 ч) инкубации с клетками-мишенями. Репаск е1 а1. (2005) показали, что только СВЮ7а+, но не СБ 107а" ЫК-клетки, отсортированные после 4-часовой коинкубации с мишенями, обладают 1ЧК-активностью при повторном взаимодействии с мишенями. Если «эффекторная» субпопуляция ЫК-клеток существует, то она, вероятно, должна обладать характерным набором маркеров, который отличал бы ее от остальных ЫК-клеток.

Окраска на дополнительные поверхностные маркеры показала, что при инкубации с клетками К562 процент дегранулирующих ИК-клегок выше в субпопуляциях СВ94Ьг'8Н' и СО!59а+ по сравнению с СБ94'*т и СБ 159а", а

также в субпопуляции СБ335<)™ по сравнению с С0335Ьг'8Ы (таблица 13). С08+/СБ8~ и С057+/С057' ЫК-клетки не различались по дегрануляционному ответу. Более того, сочетание маркеров С094 и СБ335 позволило выявить СВ94Ьг'®,1'С0335с1т субпопуляцию, обладающую особенно высоким дегрануляционным ответом на клетки К562 — 18,9 (13,0-27,7)%.

Таблица 13. Процентное содержание дегранулирующих (СШ07а+) клеток в указанных субпопуляциях СР56с|'т ЫК-клеток. Медианы (10-й—90-й процентили).

Маркер (кол-во опытов) Субпопуляция % дегранулирующих NK-клеток

Без активаторов K562

CD 8 CD8+ 0,2 (0,0-0,4) 7,2 (3,6-16,8)

(п=8) CD8" 0,5 (0,1-0,7) 7,7 (3,6-13,6)

CD57 CD57+ 0,2 (0,0-0,6) 6,6 (2,5-16,7)

(п=8) CD57" 0,6 (0,2-1,0) 9,0 (3,6-15,4)

CD94 CD94br'gnl 0,2 (0,1-0,6) 9,6 (3,3-18,6)*

(п=8) CD94d,m 0,6 (0,2-0,9) 5,1 (3,0-13,4)

CD159a CD159a+ 0,3 (0,1-0,5) 6,9(4,8-15,9)*

(п=5) CD159a" 0,3 (0,2-0,5) 5,2 (3,2-7,7)

CD335 CD335Br'enl 0,2 (0,0-0,4) 2,9 (2,4-6,3)*

(п=5) CD335a,m .ЬГІЕПІ 0,4 (0,3-0,5) 7,7 (5,4-15,2) -mtn- mil!»1!»

*р < 0,05 при сравнении CD94Dngnl и CD94alm, CD159a' и CD 159", CD335°"S"1 и

СЕ)335аіт Субпопуляций, при стимуляции К562 (тест Уилкоксона).

Результаты по СБ94 и СЭ159а согласуются с данными АиК^і ^ а1. (2006) и могут рассматриваться как свидетельство «обучения» ЫК-клеток: согласно концепции обучения, цитотоксический потенциал приобретают только те ЫК-клетки, которые экспрессируют хотя бы один ингибиторный рецептор, способный распознать собственный антиген МНС (например, С094/С0159а). Результаты по СЭ335 являются новыми. Пока не ясно, почему №С-клетки, экспрессирующие более высокие уровни активационного рецептора СБ335 (ЫКр46), дегранулируют менее интенсивно. Однако следует отметить, что дегрануляция той или иной степени выраженности отмечалась во всех исследованных субпопуляциях ИК-клеток (таблица 13); другими словами, ни один из исследованных маркеров не является «абсолютным» маркером «эффекторных» Ж-клеток.

выводы

1. Разработан комплекс методов, позволяющим оценивать основные показатели МК-клеток: процентное содержание ЫК-клеток среди МНК, субпопуляционный состав ЫК-клеток, ЫК-активность МНК, дегрануляцию ЫК-клеток и их субпопуляций по экстернализации СО 107а при рецепторной и нерецепторной стимуляции, определение внутриклеточного содержания СБ107а и перфорина в МК-клетках. Методологической основой комплекса является проточная цитометрия.

2. Подтверждено значение СО 107а как маркера дегрануляции ЫК-клеток.

3. СОЮ7а является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции ЫК-клеток, чем С063.

4. Лишь небольшая часть циркулирующих ЫК-клеток и их С05б*т субпопуляцин дегранулирует при взаимодействии с ЫК-чувствительными клетками-мишенями К562. При этом значительная часть ЫК-клеток активируется, но не дегранулирует.

5. Более высокий процент дегранулирующих клеток наблюдается в субпопуляциях С056Лт ЫК-клеток, экспрессирующих С0159а (СЭ159а+), высокий уровень С094 (С094Ьпв'") и низкий уровень СОЭ35 (СВ335*т).

6. У здоровых доноров в возрасте до 50 лет ЫК-активность МНК коррелирует с процентным содержанием ЫК-клеток среди МНК и с процентом ЫК-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с клетками К562. ЫК-активность МНК не коррелирует с внутриклеточным содержанием перфорина в ЫК-клетках и с количеством гранул, выбрасываемых в среднем одной ЫК-клеткой при взаимодействии с клетками К562.

7. У лиц пожилого возраста (старше 65 лет) снижена дегрануляция ЫК-клеток в ответ на различные виды стимуляции при неизмененной ЫК-

активности МНК; нарушена корреляция-между Ж-активностью и процентом N К-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с К562.

8. При синдроме Вискотга-Олдрича резко снижена дегрануляция Ж-клеток в'ответ на рецепторный стимул (К.562), в меньшей степени на нерецепторные стимулы, что сопровождается резким снижением Ж-активности у этих больных; корреляция между показателями дегрануляции ЫК-клеток и Ж-активностью МНК отсутствует.

9. При хронической гранулематозной болезни функциональные показатели Ж^-клеток существенно не изменены.

10. У пациентов с часто рецидивирующим герпесом как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии умеренно снижена дегрануляция Ж-клеток в ответ как на рецепторную, так и на нерецепторную стимуляцию. Достоверное снижение Ж.-активности имеется только в стадии ремиссии. В стадию обострения, но не в стадию ремиссии, нарушена корреляция между Ж.-активностью и процентом ЫК-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с К562.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Муругин В.В., Муругина Н.Е., Продеус А.П., Зимин С.Б., Кондратенко И.В., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Дегрануляция Ж-клеток у больных синдромом Вискотта-Олдрича и хронической гранулематозной болезнью. Иммунология, 2009, т.30(6), стр.376-382.

2. Пащенков М.В., Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пинегин Б.В. Выявление и характеризация цитолитических СБ8+ и СБ4+ Т-клеток. Иммунология, 2010, т.31(1), стр.4-12.

3. Муругин В.В., Зуйкова И.Н., Муругина Н.Е., Шульженко А.Е., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дефицит дегрануляции Ж-клеток у больных хронической рецидивирующей герпесвирусной инфекцией. Иммунология, 2010, т.31(6),стр.284-289.

4. Murugin V.V., Zuikova I.N., Murugina N.E., Shulzhenko A.E., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Reduced degranulation of NK cells in patients with frequently recurring herpes. Clin. Vaccine Immunol., 2011, v.18, p.1410-1415.

5. Муругин B.B., Муругина H.E., Пащенков M.B., Пинегин Б.В. Дегрануляция NK- и Т-клеток у лиц пожилого возраста. Иммунология, 2011, т.32(5), стр.239-243.

6. Муругин В.В., Муругина Н.Е., Продеус А.П., Зимин С.Б., Кондратенко И.В., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дегрануляция NK-клеток и CD8+ Т-клеток у больных синдромом Вискотга-Олдрича и хронической гранулематозной болезнью. Российский Аллергологический Журнал, 2009, т.З, стр.142.

7. Муругина Н.Е., Муругин В.В., Чирвон Е.А., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Применение многоканальной проточной цитометрии для изучения цитотоксических CD8+ и CD4+ Т-клеток. Российский Аллергологический Журнал, 2009, т.З, стр.158.

8. Пащенков М.В., Симонова A.B., Аршинова С.С., Мартынов А.И., Ярилин A.A., Пинегин Б.В, Кулаков В.В.,Климова С.В, Никонова М.Ф, Шарова Н.И, Донецкова А.Д., Литвина М.М, Муругин В.В. Оценка клеточного иммунитета. Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики, Москва, 2009, стр. 18-21.

9. Муругин В.В, Муругина Н.Е, Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дегрануляция Т- и NK-клеток у лиц пожилого возраста. Российский Аллергологический Журнал, 2011, т.4, стр.246-247.

10. Пащенков М.В, Муругин В.В, Пинегин Б.В. Применение мультипараметрической проточной цитометрии для одновременной оценки функции и фенотипа NK-клеток. Российский Аллергологический Журнал, 2011, т.4, стр.283-284.

Подписано в печать 11. 09 .12 Формат 60><84/1б.

Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 87 9 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Муругин, Владимир Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика >1К-клеток.

1.2. Литические гранулы.

1.3. Рецепторы 1ЧК-клеток.

1.4. Дифференцировка и обучение 1ЧК-клеток.

1.5. Активация 1МК-клеток и иммунологический синапс (ИС).

1.6. Механизмы цитолитического действия 1ЧК-клеток.

1.7. Первичные иммунодефицита, сопровождающиеся нарушением активации и дегрануляции ИК-клеток.

1.8. Хроническая гранулематозная болезнь.

1.9. Инфекция, вызываемая вирусами простого герпеса.

1.10. Методы исследования дегрануляции >1К-клеток.

1.11. Резюме по обзору литературы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика обследованных групп.

2.2. Реактивы, расходные материалы и оборудование.

2.3. Забор крови и выделение мононуклеарных клеток.

2.4. Культивирование клеток К562.

2.5. Определение дегрануляции ЫК-клеток по экстернализации СЭ107а.

2.6. Определение КК-активности МНК.

2.7. Внутриклеточная окраска на СЭ107а и перфорин.

2.8. Сочетанный анализ дегрануляции и внутриклеточной экспрессии перфорина и гранзима А.

2.9. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Отработка условий теста на экстернализацию СО 107а.

3.2. Валидация СБ107а как маркера дегрануляции ИК-клеток.

3.3. СЭ63 как маркер дегрануляции ЫК-клеток.

3.4. Определение совокупности методов для исследования МС-клеток. Нормативные показатели.

3.5. Показатели функционального состояния МК-клеток у лиц пожилого возраста.

3.6. Показатели функционального состояния 1МК-клеток при первичных иммунодефицитах.

3.7. Показатели функционального состояния NK-клеток при часто рецидивирующем герпесе.

3.8. Фенотип дегранулирующих NK-клеток.

3.9. Сопоставление дегрануляции с другими признаками активации NK-клеток.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Методологические аспекты.

4.2. Гетерогенность NK-клеток в тесте на дегрануляцию.

4.3. Изменения функциональных показателей NK-клеток при исследованных заболеваниях и состояниях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплекс методов исследования NK-клеток в норме и при патологии"

Актуальность работы

МК-клетки играют важнейшую роль в противовирусном и противоопухолевом иммунитете. Определение их функциональной активности важно при диагностике первичных и вторичных иммунодефицитов, ассоциированных с часто рецидивирующими или хроническими вирусными инфекциями, а также с онкологическими заболеваниями.

В настоящее время в лабораторной практике широко применяется только один метод оценки функциональной активности МК-клеток, а именно тест на ЫК-активность мононуклеарных клеток (МНК). Под МК-активностью понимают способность МНК, выделенных из крови обследуемого, без какой-либо предварительной активации убивать опухолевые клетки-мишени, лишенные экспрессии МНС I класса. Эта активность МНК опосредуется практически только МК-клетками. Исследование МК-активности МНК позволяет оценить киллерную функцию МК-клеток, но не дает возможности более точно охарактеризовать дефект в системе МК-клеток, если таковой имеется. Очевидно, что на МС-активность может влиять целый ряд параметров, в частности процентное содержание МК-клеток в образце МНК, содержание биологически активных перфорина и гранзимов в литических гранулах МК-клеток, способность МК-клеток дегранулировать (т.е. выбрасывать перфорин и гранзимы из литических гранул на поверхность инфицированных или опухолевых клеток-мишеней), способность МК-клеток убивать мишени с помощью механизмов, не связанных с дегрануляцией. С развитием иммунотерапии и генотерапии возрастают возможности избирательно воздействовать на нарушения в каждом из перечисленных аспектов функционирования МК-клеток. Следовательно, необходим комплекс методов оценки МК-клеток, который позволил бы — у лиц с нарушением МК-активности — более точно установить уровень локализации функционального дефекта, с тем чтобы более целенаправленно проводить дальнейшую диагностику и терапию.

Сравнительно недавно был предложен новый способ оценки киллерной активности МК-клеток — тест на дегрануляцию. На внутренней стороне мембраны литических гранул находится антиген СО 107а, который в результате дегрануляции оказывается на поверхности НК-клетки, где может быть выявлен с помощью иммунофлюоресцентной окраски. Хотя этот тест получил широкое распространение как вспомогательный метод исследования ЫК-клеток, специфичность СО 107а как маркера именно дегрануляции, а не активации ИК-клеток не была достаточно хорошо обоснована. Неизвестно, существуют ли более информативные маркеры дегрануляции ЫК-клеток, чем СБ 107а.

Основной функциональный параметр №С-клеток — №С-активность — обычно оценивают с помощью радиоизотопного метода. Клетки-мишени линии К562, лишенные экспрессии МНС I класса, метят радиоизотопами (51Сг, 3Н) и инкубируют с выделенными МНК пациента, после чего оценивают либо выход изотопа в супернатант, либо остаточную радиоактивность клеток-мишеней после периода инкубации. Однако этот подход требует специального оборудования (гамма- или бета-счетчик), а также разрешения на работу с радиоизотопами и особо осторожного обращения с ними. В то же время большинство крупных лабораторий клинической иммунологии в настоящее время располагают лазерными проточными цитометрами. Проточная цитометрия позволяет оценивать МК-активность без применения радиоактивных меток и, кроме того, дает возможность исследовать более тонкие параметры системы МК-клеток, в частности их процентное содержание, субпопуляционный состав, дегрануляцию, экспрессию цитотоксических белков и цитокинов.

Таким образом, разработка комплексного подхода к исследованию ИК-клеток и применение этого подхода для исследования пациентов с первичными иммунодефицитами и инфекционными заболеваниями является актуальной задачей. Актуальным является также использование проточной цитометрии в качестве методологической основы для исследования ЫК-клеток.

Цель работы

Разработка и применение комплекса методов исследования №С-клеток у здоровых лиц, при вирусных инфекциях и первичных иммунодефицитах.

Задачи исследования

1. Отработать методики оценки МК-активности, процентного содержания МК-клеток среди МНК, содержания литических гранул и внутриклеточного перфорина в МК-клетках, дегрануляции МК-клеток по экстернализации СБ 107а с помощью проточной цитометрии.

2. Уточнить значимость СЭ107а как маркера дегрануляции МК-клсток.

3. Оценить применимость маркера СБ63 для оценки дегрануляции МК-клеток.

4. Применить комплекс методов, перечисленных в п.1, для исследования функций МК-клеток у здоровых лиц. Получить нормативные показатели. Проанализировать корреляционные связи между отдельными параметрами системы МК-клеток.

5. Используя разработанный комплекс методов, оценить состояние системы МК-клеток при первичных иммунодефицитах (синдром Вискотта-Олдрича, хроническая гранулематозная болезнь), часто рецидивирующем герпесе, а также у лиц пожилого возраста.

6. Провести фенотипический анализ дегранулирующей субпопуляции МК-клеток.

Научная новизна

Впервые показано, что СБ 107а является более специфичным маркером дегрануляции МК-клеток, чем СЭбЗ. Впервые прямо показан дефект дегрануляции МК-клеток у детей с синдромом Вискотта—Олдрича и отсутствие значимых нарушений дегрануляции у детей с хронической гранулематозной болезнью. Впервые обнаружен дефект дегрануляции МК-клеток у больных с часто рецидивирующим герпесом. Впервые обнаружено снижение дегрануляции МК-клеток у лиц пожилого возраста, которое не сопровождается снижением 1МК-активности.

Практическая значимость

Разработанный комплекс методов исследования МК-клеток может применяться в лабораториях клинической иммунологии для выявления функциональных дефектов в системе ЫК-клсток при первичных и вторичных иммунодефицитах. При первичных иммунодефицитах результаты такого обследования позволят установить уровень локализации генетического дефекта и, таким образом, определить направление генотипирования. При вторичных иммунодефицитах результаты обследования могут учитываться при выборе терапии. Методологическая база, примененная в данной работе, может служить основой для дальнейшего расширения комплекса методов исследования клеток, в который может быть включено исследование экспрессии цитокинов при активации ИК-клеток, а также исследование более широкого спектра цитотоксических белков.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Иммунология", Муругин, Владимир Владимирович

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан комплекс методов, позволяющий оценивать основные показатели ЫК-клеток: процентное содержание МК-клеток среди МНК, субпопуляционный состав МК-клеток, МК-активность МНК, дегрануляцию МК-клеток и их субпопуляций по экстернализации СО 107а при рецепторной и нерецепторной стимуляции, определение внутриклеточного содержания СБ 107а и перфорина в МК-клетках. Методологической основой комплекса является проточная цитометрия.

2. Подтверждено значение СО 107а как маркера дегрануляции МК-клеток.

3. СОЮ7а является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции МК-клеток, чем С063.

4. Лишь небольшая часть циркулирующих МК-клеток и их С056а'т субпопуляции дегранулирует при взаимодействии с МК-чувствительными клетками-мишенями К562. При этом значительная часть МК-клеток активируется, но не дегранулирует.

5. Более высокий процент дегранулирующих клеток наблюдается в субпопуляциях С056с1'т МК-клеток, экспрессирующих СБ 159а (С0159а+), высокий уровень СБ94 (С094Ьп£Ы) и низкий уровень СБ335 (С0335<Ит).

6. У здоровых доноров в возрасте до 50 лет МК-активность МНК коррелирует с процентным содержанием МК-клеток среди МНК и с процентом МК-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с клетками К562. МК-активность МНК не коррелирует с внутриклеточным содержанием перфорина в МК-клетках и с количеством гранул, выбрасываемых в среднем одной МК-клеткой при взаимодействии с клетками К562.

7. У лиц пожилого возраста (старше 65 лет) снижена дегрануляция МК-клеток в ответ на различные виды стимуляции при неизмененной МК-активности МНК; нарушена корреляция между МК-активностью и процентом МК-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с К562.

8. При синдроме Вискотта—Олдрича резко снижена дегрануляция МК-клеток в ответ на рецепторный стимул (К562), в меньшей степени на нерецепторные стимулы, что сопровождается резким снижением 1ЧК-акгивности у этих больных; корреляция между показателями дегрануляции 1\К-клеток и №С-активностью МНК отсутствует.

9. При хронической гранулематозной болезни функциональные показатели КК-клеток существенно не изменены.

10. У пациентов с часто рецидивирующим герпесом как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии умеренно снижена дегрануляция КК-клеток в ответ как на рецепторную, так и на нерецепторную стимуляцию. Достоверное снижение №С-активности имеется только в стадии ремиссии. В стадию обострения, но не в стадию ремиссии, нарушена корреляция между МК-активностью и процентом ЫК-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с К562.

6. БЛАГОДАРНОСТЬ

Работа выполнена при частичной поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований (РФФИ), грант 10-04-01370.

4.4. Заключение

Комплекс методов, примененный в данной работе, позволяет оценить наиболее важные аспекты функционирования КК-клеток. Основным показателем, характеризующим функцию ТМК-к леток, следует все же считать ТЖ-активность, т.е. способность КК-клеток убивать МНС-1-негативные клетки-мишени. Если у пациента снижена ЫК-активность, то остальные методы, входящие в комплекс, дают возможность установить причину этого нарушения (снижение процентного содержания ЫК-клеток среди МНК, снижение способности 1МК-клеток дегранулировать, снижение экспрессии цитотоксических белков ЫК-клетками). В зависимости от результатов исследования, может проводиться целенаправленная молекулярная диагностика, а также лечение, направленное на коррекцию выявленных нарушений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Муругин, Владимир Владимирович, Москва

1. Бажап С.И., Белова О.Е. Молекулярно-генетические аспекты индукции и противовирусного действия интерферона // Вестник Российской АМН. 1998. -№3. - с. 18-24

2. Глинскгих Н.П. Герпссвирусы человека (патогенез, диагностика, клиника, лечение). В кн.: Неизвестная эпидемия: герпес. // Смоленск: Фармаграфикс. -1997. -с.6-19.

3. Коротяев А.К, Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология // СПб: Специальная литература. 1998. - с.294-297.

4. Муругин В.В., Муруггша Н.Е., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дегрануляция Т- и NK-клеток у лиц пожилого возраста // Российский Аллергологический Журнал. 2011. - №4. - с. 246-247.

5. Ордэюоникидзе Н.В., Тюииошшк B.JI., Марченко Л.А. Генитальный герпес (этиология, патогенез, клиника, диагностика, планирование беременности) // Акушерство и гинекология. 2001. - №3. - с.22-24.

6. Пинегин Б.В., Ярилин А. А., Симонова А.В., Климова С.В., Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Бахус Г.О. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. Пособие для врачей-лаборантов. М.: 2001.

7. Самгин М.А., Халдин А.А. Простой герпес (дерматологические аспекты) // М.: МЕДпресс-информ, 2002. 160 с.

8. Трофимова Е.И. Использование полимеразной цепной реакции для выявления герпес-вирусов у пациентов с иммунодефицитными состояниями. Дисс. канд. мед. наук // М.: 1998. 127 с.

9. Хаитов P.M., Ярилин А.А., Пинегин Б.В. Иммунология (атлас) // М.: Гэотар-Медиа, 2010.-624 с.

10. Ярилин А.А. Иммунология (учебник) // М.: Гэотар-Медиа, 2010. 752 с.

11. Adler II, Belaud J. L., Del-Pan N. С. et al. In the absence of T cells, natural killer cells protect from mortality due to IlSV-1 encephalitis // J Neuroimmunol. 1999. -Vol. 93. - P. 208-213.

12. Agerberth В., Chaw J., Werr J. et al. The human antimicrobial and chemotactic peptides LL-37 and alpha-defensins are expressed by specific lymphocyte and monocyte populations // Blood. 2000. - Vol. 96. - P. 3086-3093.

13. Alter G., Malenfant J. M., Altfeld M. CD 107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity // J Immunol Methods. 2004. - Vol. 294. -P. 15-22.

14. Andersson S., Fauriat C., Malmberg J. A. et al. KIR acquisition probabilities are independent of self-HLA class I ligands and increase with cellular KIR expression // Blood. 2009. - Vol. 114. - P. 95-104.

15. Andzelm M. M., Chen X., Krzewski K. et al. Myosin IIA is required for cytolytic granule exocytosis in human NK cells // J Exp Med. 2007. - Vol. 204. - P. 22852291.

16. Anfossi N. Andre P., Guia S. et al. Human NK cell education by inhibitory receptors for MIIC class I // Immunity. 2006. - Vol. 25. - P. 331-342.

17. Arase II., Mocarski E. S., Campbell A. E. et al. Direct recognition of cytomegalovirus by activating and inhibitory NK cell receptors // Science. 2002. - Vol. 296. - P. 13231326.

18. Arneson L. N., Segovis С. M., Gomez T. S. et al. Dynamin 2 regulates granule exocytosis during NK cell-mediated cytotoxicity // J Immunol. 2008. - Vol. 181. - P. 6995-7001.19