Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КОБАЛЬТ И КОРРИНОВДЫ В БИОЛОГИИ PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "КОБАЛЬТ И КОРРИНОВДЫ В БИОЛОГИИ PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII"

дШ?-

На правах рукописи

РЫЖКОВА ЕВГЕНИЯ ПЕТРОВНА

КОБАЛЬТ И КОРРИНОВДЫ В БИОЛОГИИ РИОРІОШВА СТЕЫиМ РИЕІ/ОШНЕІСНІІ

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2003

Работа вы полна мя ил кафедре чич-робиологнії биологического факультета Московского государственного унивсрсіггета им, М,В. Ломоносова

Научный консультант;

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппонен ты: доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

А,И, Истру сое

В Д. Самуилов Е.П. Феофклова Г.Л. Шапошников

Ведущая организация;

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследоватсльсиш институт генетики II селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП ГНЦ РФ «ГосНИИ Генетика»)

Защита лнсссрташт состоится 18 декабря 2003 г. в 15м на иседанин Диссертационного совета Д 501.00] .21 при Московском государственном университете им, М.В. Ломоносова по адресу: 1199У2 Москва, Ленинские горы, д.1, МГУ. корп. 12. биологический факультет, аудитория М1.

С диссертацией можно однако" и :1 *! в библиотеке биологического факультета МГУ им, Ломоносова.

Автореферат разделан _£ - - 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Физиология прокариот — центральное направленна микробиологии, формируют« целостное представление о жизнедеятельности организма Изучение фнзнолою-биохимическнх свойств практически значимые микроорганизмов актуально в план с решения общечеловеческой задачи -улучшения качества жизни. Пропионовокислыс бактерии (ПК Б) имеют разнообразное практическое применение. Достаточно напомнить, что }'гор)оп1Ьис!егп1т /гешкпгекЬИ 5иЬ$р. ьИегтапи (далее - Р. /тикпгск(ш~) -основная и незаменимая культура, используемая в мировом производстве «твердых» сырое, а в России - и в производстве витамина В1;, однако области применения ПКБ этим не ограничены. Поэтому Смол огня ПКБ находится под постоянным «прицелом» специалистов разных профилей. Регулярно проводится международный тематический симпозиум " Р горюп ¡Ьааспз". Научный интерес вызывает нсодно шачкость метаболизма ПКБ, например нх отношение к молекулярному кислороду. Исходя из основного способа получения энергии (пропионовокиелого брожения, ПБ) и способности развиваться при доступе кислорода, - это аэро толерантные анаэробы (Определитель бактерий Берджн, девятое издание, 1997). но их от нося г к микроаэрофильным организмам (Воробьева, 1958; 1976; РгПсНагс! « а1., 1977; Ус с1 а!.. 1999). Актуальным является вопрос, каким образом ПКБ обеспечивают свою аэротолсрантность; и в этом направлении ранее была проделана большая исследовательская работа, однако многое оставалось не выясненным.

Существует проблема метаболического лимитирования экспрессии генов в норме (Головлев, Головлсва, 2000); одновременно расширяется представление о роли альтернативных ферментов в пластичности метаболизма бактерий (Якунин и др., 1999). Выявление естественной модификации (перестройки) метаболизма прокариот под действием факторов внешней (и внутренней) среды наряду с изучением метаболического лимитирования биохимических реакции актуально в связи с активным развитием метаболической инженерии. Главной задачей этого нового направления биотехнологии является «оптимизация экспрессии генов» с использованием целенаправленной переориентации потоков вещества (энергии) гак. что, активно продуцируя целевой метаболит, >17»»^ л^урчна^ гцгцд_

! Ц/й мсха ■ ;

жизнсс пос обнос гъ. Этот подход принципиально отличен от «максимизации экспрессии целевых генов» в метках, погибающих в результат« сверл продукции метаболита или чужеродного белка, в которые заинтересован только человек 1Дебабое. 199!); Маш ко и др.. 20021

В последнее десятилетие waniцельно возросло знание функции корриноидов (соединений группы витамина В,J в биологии прокариот. Являясь древними полнфункциональными (био)ката.-ж!аторачн они вовлечены в центральные метаболические процессы современных прокариот, такие как МБ. мета но гене», гоч оаистогенез, сульфатредукция. бноеннтез четно инка и дезокеирибоз ильных предшественников ДНК и другие. К настоящему времени открыто и изучено более тридцати биохимических реакций, катализируемых коррн ноидсодержаии i м и ферментами. Открытие новых функции корриноидов продолжается 1 Рыжкова (Иордан), 2003]. Проблемам биосинтеза н функций корриноидов посвящают международные конференции (последняя происходила в I996 году в Австрии), но, несмотря на обнаружение всё новых биохимических реакции, протекающих при участии корриноидов, актуален вопрос о физиологическом значении его высокого естественного уровня образования в клетках некоторых бактерий и ар.хеи. Новый взгляд на роль кобальта и корриноидов в жизнедеятельности P. freudenretchii неизбежно ускорил бы изучение этого явления у других прокариотических организмов.

Состишше вопроса. В исследованиях В.Я. Быховского значительное внимание было уделено роли кобальта и кобаламнна {истинного витамина В,;) в биосинтезе корриноидов - соединений группы витамина Bt; (Быховский и др., 1969 a,G; 1У75; Бычовский. 1979; Быковский. Зайцева, 1989; Bykhovsky et al„ 1997). Значение ионов кобальта и корриноидов язя жизнедеятельности бактерш! в целом оставалось вне поля зрения авторов. Вместе с тем потребность в ионах кобальта для роста культур (и образования корриноидов) в свое время отмечали у представителей p. Rhizobiitm (Kliewer, Evans, 1963: Cowles et al., I9f»9) и некоторых цианобактернй (Fogg et al.. 1973; Beck. 1982).

Известно, что среди неполимерных соединений корринонды - сложнейшие молекулы с уникальной кобальт-углеродной связью, обратимое расщеплен не которой определяет их .множественные химические и биохимические функции

(Рыжкова. 2(103). Биосинтез корриноидов требует значительных затрат иентроболктов и энергии, однако некоторые бактерии и археи способны к естес1венночу образованию и внутриклеточной аккумуляции коррлноидов в количествах, в 100 - 1СИЮ pat превышающих обычные уровни их содержания в клетках (единицы - дссятки мкт на грамм ЛСБ). Вопрос о биологическом значении этого явления был впервые поставлен в отношении Л freuJenreichii (Barker et aL 1958; Wcisbach et al„ 1959). Открывали всё новые биохимические (коферментные) функции коррииондов, изучали механизмы их действия, ио на главный вопрос ответа не было.

Неоднозиачность метаболизма иропноновокнелых бактерии, возможность его перестроек, констатирована при изучении влияния молекулярного кислорода на энергетическнн обмен ПКБ, в котором помимо основного процесса - ПБ, включающего в себя электрон-транспортную цепь с нсиолыованием фумарата в качестве конечного акцептора электронов, определённое место занимает дыхание кислородное. Фактором перестройки энергетического обмена ПКБ, в том числе и Г. freudenreich», служит молекулярный кислород При ограниченной аэрации у Р. freudenreichii функционирует дыхательная цепь, которая имеет, прежде всего, предохранительное (от токсического действия кислорода) значение (De Vries et al„ 1У72; Бонарцева, 1973; Брюхачева и др., 1975; Pritchard, 1977; Pritchard, Asmuiuison, 1980, Скулачёв, 1997; Edwards et aL 20(10), Обнаружение ферментов антиокислительной защиты клеток (ФАОЗ): с у пероксидднсмузшы (СОД), каталаш и перокекдазы — позволило подойти к объяснению аэротолерантности Р. fretulenrcichii (Воробьёва, 1976; Краева, Воробьёва, 1981; Воробьёва и др., 1986). однако вопрос о причинах устойчивости бактерии к действию молекулярного кислорода не был исчерпан.

ПКБ обладают эффективным к пластичным конструктивным обменом. Они синтезируют вес необходимые аминокислоты и другие компоненты клетки, развиваясь на минеральных средах с одним из многих Сахаров (или иным источником органического углерода) и некоторыми витаминами (ауксотрофы по пантотеновон кислоте и бнотину). Вместе с тем ПКБ используют для роста аминныи или молекулярный азот (Баранова. Климонтович, 1971; Баранова, Гоготов, 1974),

В поле зрения всегда оставалась удивительная способность Р. frauienrcichn подвидов shermtimi и freudcnreU hu к накоплению в клетках больших количеств корриноидов (соединений группы внтачиша В1;, кобамидов, СЬа), среди которых доля кобаламина (СЫ) - истинного витамина В1;, в молекулу которого входит азотистое основание 5,6-диметилбензимндазол (Kräutler. 199Н а), составляет ~ 10% (Быховсюш. Зайцева, 19X9; Bykhovsky et al., 1997).

Существовало представление о «настройке» метаболита Р. freiuienreichri исключительно на высокий уровень их образования как физиологической особенности бактерии (Воробьева. 1995; Vorobjcva. 1999. 2000). Высказывалось также противоположное мнение о лсрегуляцнл биосинтеза этих соединений, однако для его отрицания появлялись вей новые наблюдения, например постоянство содержания СЫ r клетках экспоненциально расту щей культуры (Воробьёва, 1976), регулируемость биосинтеза корринонлов (БыховскнН. 1979; BykhovsKy el al., 1997). К началу наших исследований в метаболизме Р. freudenreich» были известны две биохимические реакции, катализируемые кобамид-зависимъши ферментами: ключевая реакция ПБ (изомеризация сукциннл-КоА в метнлмалонил-КоА) и биосинтез метионина. Ферменты этих реакций используют кобамиды в качестве коферментов, но проявляют разную специфичность к форме кобамида (Overath et al., 1У62; Skupin et al., 1970; McKie et al., 1990; Chowdhury et al., 2001).

Цель и задачи исследований, Цель диссертационной работы была определена как поиск и раскрытие биологи1! ее кого смысла способности Propionibacterium freudenreich!) subsp. shermami к образованию внутриклеточных коррнноидов в высоких* концентрациях в период активного развития, что свойственно и некоторым другим прокариотам. Поэтому в целом работа была направлена на изучение роли кобальта и корринонлов в жизнедеятельности бактерии. Принципиальный методологи чес кии подход состоял в выявлении различий в физиологическом состоянии бактерии: ei развитии, выживании и метаболическом статусе - при нормальном (физиологическом) уровне образования коррнноидов и при снижении последнего, вплоть до глубокого (1000-кратного) дефицита в клетках.

Основные задачи, на решение которых была направлена работа, заключались в следующем:

I. Исследовать последствия изменения концентрации соли кобальта в среде для

развития Р. /гешкпге/скП в разных условиях культивирования в связи с неменяющимся уровнем эндогенных коррннондов — соединении группы витамина В|: («оба мидов). Установить физиологически значимы и или нормальный (соответствующий наиболее активному развитию бактерии) уровень их образования в клетках.

2. Оценить возможность развития бактерии при свободном доступе воздуха (аэротодерантность) в сравнении с аноксическими условиями на разных средах, а также устойчивость клеток к летальному действию УФ-нзлучения в норме и при лимитировании клеток по содержанию корриноидов.

3. Определить уровни эндогенных кобамидов. необходимые для эффективного пропионовокислого брожения, биосинтеза метноиина и образования нуклеиновых кислот в клетках бактерии.

4. Проанализировать воздействие разных форм корриноидов на образование ДИК в клетках дефшпгтиой по ним бактерии. Доказать прямое специфическое вовлечение кобаламина (истинкого витамина В|<) в процесс и показать его метаболическое лимитирование кобал амином в полноценных по содержанию суммарных корриноидов клетка к.

5. Объяснить участие кобаламина в анаболизме ДНК, с одной стороны, и не прекращающийся биосинтез ДНК при глубоком дефиците корриноидов в клетках, с другой.

6. Исследовать функциональные и некоторые структурные свойства альтернативных (в отношении зависимости от аленози л кобал амина) рибонуклеотидредуктаз (РНРаз, КФ 1,17.4,-), ответственным за формирование пула дсзоксирибозильных предшественников ДНК.

7. На примере системы РНРазы выявить регудяторнос действие кобаламина: показать его функцию как фактора физиологической (метаболической) перестройки бактерии.

Научная ношшш и шачнмость работы. 6 результате обобщения полученных в настоящей работе экспериментальных данных и имеющихся научных предпосылок возникло новое представление о двойственном характере физиологии РтртпЛасгепит/геш/епге/ски, определяемом ионами кобальта в среде и уровнем образования корриноидов в клетках.

Бактерия представляет собой пример прокариота, у которого кобальт не только контролирует (и стимул (фуст) образование корринондов, но в 01фе,д елейных условиях сложит фактором роста, Концентрационную зависимость роста лрокарлогического организма от соли кобальта в среде проследили впервые (Иордан и др., 1984); позже она была нее л словака у Mcfhanosarana barkeri (Кишат ct al., 1987). Нам представляется, что »то должно быть, учтено в отношении других микроорганизмов, обладающих способностью к образованию коррикоидов в значительных количествах.

Установили, что естественный eucoKim уровень образования корринондов, на 2 - 3 порядка превышающий таковой у многих прототрофов по витамину Вц, существен для аэротолерантности и УФ-резнстентностн бактерии, что, видимо, отражает особенность предков ПКЬ, их первичную среду обитания и экологическую нишу в условиях древней Земли. Впервые корриноизы рассматриваются как возможные (дополнительные) факторы зашиты прокариотическон клетки от стрессориого (токсического) действия кислорода.

Выяснили, что для нормальной интесивностн П5 Я, freudenrejehii достаточно ~ 1% синтезируемых ею кобамидов, что объясняется широкой специфичностью ключевого фермента ПБ к разнообразным формам кобамидов. СЫ-зависнмая реакция биосинтеза мстионина сохраняет свою эффективность при снижении общего содержания кобамидов на порядок. Вместе с тем. биосинтез ДНК в клетках P. freudenreichii метаболически лимитирован по СЫ даже при высоком уровне образования корринондов. Стимулирующий эффект СЫ в отношении биосинтеза ДНК показан нами для представителей других вклов ПКБ и некоторых сгрептомииетов. Пришли заключению, что с уровнем СЫ может быть связано непостоянство содержания ДНК в прокариотнческой клетке. Установленное нами прямое и специфическое воздействие СЫ на образование ДНК позволяет прогнозировать его участис в физиологическом контроле репликации (и генетических процессов, которые репликацию включают) у многих прокариот, синтезирующих или требующих витамин Вц (условие необходимое).

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о вовлечении метилкобалам и на (МсСЫ) в качестве донора мет ильных групп в транс метилирование ДНК альтернативно по отношению к S-аденозилмстионину.

Это третья биохимическая реакция в метаболизме P. freutknrvtchii. протекающая при j-частни витамина В!:. Обнаруженное нами зависимое от адено^нлкобаламина (AdoCbl) превращение рибонуклеотида в деюксирибонуклеотид явилось четвертой реакцией, »пвестяоН в настоящее время в метаболизме P. freudcnreichii. в которой участвует кобам ид

Для /'. freutienreichit впервые показано. что РНРаза. катализируя первую специфическую и скорость лимитирующую реакцию анаболизма ДИК, облигатно требует адснозилированнык кобаламин (AdoCbl). при этом естественный уровень кобамидов (кобаламнна) в клетках бактерии в норме ограничивает се активность. Обнаружение этого фермента позволило объяснить прямую и специфическую зависимость образования ДНК от кобаламнна у бактерии и дало возможность преодолевать метаболическое лимитирование процесса по нему. Функционирование AdoCbl-РНРазы в клетках - условие достаточное для того, чтобы стмулнровать биосинтез ДНК у того «ли иного прокариота витамином Bl; (AdoCbl).

Впервые обнаружили, что P. frettdenrcidni, в отличне, например, or Khizobtum miirloli (Cowles ct al., 1969), способна активно развиваться на «бсскобальтовой» среде, практически не синтезируя корриноиды. При этом она испытывает потребность в дополнительных факторах роста, например циетеине, метионнле, восстановленном г.зутатионе или триптоне, и перестраивает метаболизм. При глубоком дефиците корринондов в клетках изменяется характер ПБ; образование ДНК происходит без участия кобаламнна, причём AdoCbl в этом случае подавляет процесс. Установили, что основной «мишенью» служит дублирующая РНРаза. зависимая от ионов марганш и активируемая молекулярным кислородом, активность которой AdoCbl ннгнбирует. Альтернативные РНРазы в клетках одного организма показаны впервые (Иордан и др.. 1975; 1986; 20Ш; Иордан и др., 1986; Иордан, Петухова. 1989; Иордан, 1992). Полученные нами результаты были подтверждены на примерах других бактерий (Barlow, 1988; Fontecave et al., 1989; Jordan etal, 1999; Borovok etal., 2002).

Мы также впервые наблюдали обратимую перестройку метаболизма 1\ frettdenreichii под действием ионов кобальта или кобаламнна. Ионы кобальта, добавленные в среду, на которой активно развивается испытывающая глубокий дефицит коррнноидов (кобаламнна) бактерия, возвращают ей первоначальное

физиологическое состояние: возобновляется биосинтеза коррнноилов и способность бактерии развиваться на минимальной среде в присутствии воздуха, Экзогенный кобаламин (AdoCbl) вызывает перестройку в системе альтернативных РНРаз бактерии, действуя на уровне активности ферментов и биосинтеза белка. Способность P. freudenreichti к альтернативным физиологическим состояниям в зависимости от обеспеченности клеток кобальтом и корриноидами (кобола ми ном), является проявлением сё метаболической пластичности, обусловленной этими факторами, что. видимо, способствует освоению бактерией новых сред обитание.

Практическая кешшетъ. Некоторые установленные в настоящей работе закономерности биологии Р, freudenreichti нашли практическое применение. В зависимости от конкретной задачи рекомендовано либо поддерживать высокий уровень образования коррнноилов в клетках бактерии, либо значительно снижать его.

1) Для получения пропионовой кислоты, используемой в качестве антисептика в пншевой промышленности и сельском хозяйстве, на основе иммобилизованных клеток P. freudenreichti, синтезирующей витамин В«. создан биокатализатор и предложен способ его реактивации (Воробьёва и др., 1978; Иордан и др., 1979).

2) Изобретения способов приготовления теста и защиты хлеба от «картофельной болезни» при использовании в заквасках P. freudenreichti (с заданным уровнем витамина В,;в клетках) внедрены в хлебопекарной промышленности (Богатырева и др., 19X8; 1990),

3) На основе пермеабилизованных клеток P. freudenrcichii, трансформирующих рибонуклеотклы в детоксирибонуклеотиды благодаря активности AdoCbl-РНРазы. разработан способ получения дезоксирибонуклсотндов (Иордан, Прянишникова, 1997).

4) В связи с началом работ по генетической модификации ппаммов бактерии, применяемых в производстве «твердых» сыров типа «Швейцарский», практически значимыми явились рекомендации по культивированию бактерии в условиях активного биосинтеза ДНК, зависимого от обеспеченности клеток кобаламином ¡Ryzhkova (Jordan). 2001).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на республиканских конференциях молодых ученых (Ташкент, 1976, 1978; Рига. 1977);

заседаниях секции и Сьсзлс ВМО (Москва, 1У80, 19Н2: Ллма-Лта. 19X5): всесоюзних конференциях: «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Кобулст, 198С>). «Лимитирование и кнгибп рева пне роста микроорганизмов» (П)щино, 1989); международных конференциях, симпозиумах и конгрессах: FEMS International Symposium "Environmental regulation of miciobial metabolism" (Puschino, USSR. 19K3); 14* International Congress of Microbiology (Manchester, England. 1980); First International Congress on Vitamins and Bio factors in Life Scincc (Kobe. Japan. 1989); International Conference "n<iorcdo\ms and related proteins" (WhiUcnhauscn - Kasscl. Germany. 1995); 5Л International Conference "Thioredoxins and і el a led proteins" (Smolcnicc — Bratislava, Slovak Republic, 200f)); З"1 International Symposium on Prcpi on і bacteria (Zurich, Switzerland, 2001).

Структура it обь^м днссецішти. Дисссргаши состоит из введения, девят глав (обзор литературы, описание объектов и методов исследований, изложение экс пер и менгов с обсуждением и ззключешими. общее заключение), основных пиподоп н списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 2 <*»(*> страницах, содержит 19 таблиц tt 4Н рисунков. Список цнпф)сиои литературы включает 3X5 рабо г.

НуПлккшіші. Опчблн кована 51 работа: статей 33, изобретений (авторских свидетельств и патентов) 4, тезисов и докладов на конференциях и симпозіумах 14.

Место проведении раПотм. В основном работа проведена m кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова при участии студентов, аспирантов и сотрудников кафедры. Ряд совместных работ выполнены: в Отделе функционалы гей биохимии биополимеров и в Отделе хроматографического анализа Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ им. М.В. Ломоносова); ш кафедре микробиологии Братиславе кого университета (Словакия); в Лаборатории основ действия радиации и биолог »чески активных всшсств на клетку Института химической физики им, Н.Н. Семенова (РАН), а также — в ГШ! И Хлебоне кар ной промышленности (РАСХН).

OciiOBiti.ic положения, выносимые па защиту 1. Высокий естественный уровень образования корриноидов. реализуемый в первичном обмене Р. frcudenn'ichrf при достаточной концентрации ионов кобальта в

среде, имеет положительное (фитологии ее кое) значение для бактерии в «жестких» условиях существования, при воздействии стрсссорных факторов среды.

2. Пропноновокислос брожение — основной энергетический процесс бактерии, не снижает интенсивности при значительном уменьшении содержания витамина В,-, но для эффективного биосинтеза ДНК требуется высокий уровень образования корриноидов в клетках бактерии. В анаболизм ДНК прямо и специфически вовлечен кобаламин, который в норме лимитирует процесс иа уровне образования предшествуй н иков.

3. Бактерия, синтезируя на 2-3 порядка меньше корриноидов, чем в норме, способна развиваться; при этом она испытывает новые ростовые потребности и изменяет метаболизм.

4. Синтез ДНК при дефиците корриноидов в клетках бактерии не прекращается и происходит благодаря функционированию альтернативных ферментных систем формирования предшественников ДНК. среди которых ключевой является рнбонуклеотидредуктаза. независимая от кобаламина.

5. Кобаламин участвует в перестройке системы альтернативных рнбонуклеотндредукгаз у I'. /геи&птсНИ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

Р. freudenreich!) subsp. shemanii (ВКМ-103) - главный объект исследований. В сравнительном плане были использованы штаммы ПКБ видов; P. freudenretchii subsp. freudenreichii, P. glotmuim, P, thoenil, P. acidipropionici, P. jensenii, P. acnes 11 P, coccoides (Воробьева, 1976; Воробьёва и др., 1983), а также некоторые срептомицеты u Escherichta coli 113-3. P. coccoides в настоящее время относят к р. I.iitcococcus (Riedel, 1995; Riedel et ai.. 199S).

Культивирование Р. freudenreichit и других ПКБ в экспериментах проводили периодическим способом на жидких синтетических средах нескольких вариантов при свободном доступе воздуха или в анокекчееких условиях.

С целью изменения уровня образования суммарных корриноидов (кобамндов) в клетках ПКВ варьировали концентрацию соли кобальта (СоСЬ.бН-О) в среде (Быховсюш и др., 1969а; Bvbhovsky etal., 1997).

Визуальное наблюдение строения бактериальных клеток проводили с использованием техники электронной (сканирующей н трансмиссионной) микроскопии (микроскопы JSM-35, "JeoP и "Hitachi-It", Япония). Размеры клеток

оценивал» с помощью автоматической (компьютерной) системы анализа »зображенні) KS 300 (Germany).

Для измерения содержания керрнноидов в клетках и идентификации нк форм применяли микробиологический, химический (епектрофотометричесют) it біюдвтографический методы (Канопкайте, 1978; Егоров, 1986).

Интенсивность и характер IIБ исследовали путем анализа основных выделяемых бактерией продуктов: иропноновон и уксусной кислот, в том числе с применением метода газожндкостной хроматографии (Иордан и др., 1979).

Дтя измерения содержания нуклеиновых кислот (НК) в клетках (после их экстракции хлорной кислотой) использовали траашигонкые слектрофото метрические и колориметричсс кие методы, среди них — метод Діпие (содержание ДНК) в модификации (Hatcher, Goldstein, 1969). Образование НК в клетках оценивали по включению меченого (радиоактивного) нуклеинового основания. Образование ДНК регистрировали по радиоактивности, приобретённой в результате іпікубирования суспснзин клеток (или культуры). Контролем служило показаний радиоактивности ДНК в іфнсутствии митамицина С или блсомицнна A3. Радиоактішііость НК (после разделения ДНК н РНК) измеряли на автоматическом ечбгчике фирмы "Pharmacia-LKB", Швеция. Интенсивность образования ДНК и РНК рассчитывали как приобретенную радиоактивность ДНК (РНК): имп.мнн'1 на 1 мг ACS (I мл суспензии клеток или 1 мл культуры) за единицу времени инкубирования.

При исследовании метаболических процессов н биохимических реакций физиологических вариантов P. frcudenreickii клетки подвергали разрушению п экстракции их водорастворимых компонентов в буферные растворы. Разрушение клеток проводили с помощью пресса Хьюза или ультразвукового дезшттегратора (УЗДН-1, Россия). Дтя получения гомогенатов (экстрактов) клеток, свободных от клеточных фрагментов, использовали центрифугирование (центрифута фирмы "ВссЬтпап", США, модель J2-21); для фракционирования гомогенатов, наїфнмер при юучсігии локализации ферментов в клетках, применяли ультранентрифупфоашше (ценірифута фирмы "BecJonan", модель L5-65B).

Измерение уровня сульфгидрильных групп в белках проводили методом с лсктрофотомстрического титрования диэлизовакных экстрактов клеток, в том числе с денатурированными 8 М мочевиной белками, шелочкым раствором ПХМБ в кварцевых кюветах (Торчі(некий. 1971).

Определение активности РНРазы проводили путём инкубирования дизлизоааниых гомогенатов клеток или препаратов выделенных белкой в реакционных смесях, содержащих субстрат (АДФ, ГДФ), восстановит ель (дитнотректол, дигндролшіозт-Na или НЛДФН) и другие компоненты. Об активности фермента судили по скорости образования продукта реакции -дезокс іфнбо і іу клеоіида, концентрацию которого измеряли фдуорн метрическим иди колориметрическим методами (Тогіеу, Knutsen, 1976; Blakley, 1982), последний — в собственно й модификации; раднохроматографически (Koller et aL, 1980) в системе обратно фазо вой ВЭЖХ (HPLC, чВсскшап», США) в собственной модификацию«; а также — по интенсивности специфического ЭПР сигнала (Пулатова и др., 1986), вызванного AdoCbl-зависимым катализом, на радиоспектрометре ER 220D фирмы "Bruker", Германия. Контролями реакции, катализируемой РНРазой (всеми способами определения активности фермента), являлись показания в точке «0-времени»: полная реакционная смесь, инактивированная до качала инкубирования

(lüO'C, 3 мин) к показания после инкубирования реакционной смеси, не содержащей субстрат. Контрольные показания вычитали m опытных.

Влияние О; из активность РНРазы исследовали путем сравнения акгивност фермента при инкубировании дизлкзованных гомогенатов клеток в атмосфере воиуха или инертного газа (в герметичных флаконах). Поглощение О; измеряли с помощью полярографа с '»крытым электродом (тип Кларка).

Выделение и очистку рнбонуклеотидредуктаз проводили из дналнчованных экстрактов клеток после удаления из них (осаждением стрептомицин-сульфатом) нуклеиновых кислот (Скоуис, 1 '>95; Riera et ai., 1997). Применяли различные подходы, в том числе batch-ироцеду ру с использованием ДЕАЕ-целлю лозы (Whatman J2), ВЭЖХ на колонке Mono Q (FPLC. «Phannaeia-LKB», Швеция) в линейном градиенте KCl и другие. Для измерения молекулярной массы исследуемых ферментов использовали метод гсль-фнльтрацнн на калиброванной колонке Superóse 6 HR 10/30 в системе FPLC при измерении активности фермента во фракциях.

Трансметилнрование ДНК исследовали путём измерения содержания метилированных оснований (молярные %) в ДНК бактерии, оценки ДНК-трансметилазнон активности и уровня радиоактивности минорных оснований при использовании меченых доноров метальных групп.

Статистическую обработку данных проводили используя табличные методы (Ашмарин и др., 1У711. Вычисляли медиану млн среднее арифметическое с доверительным интервалом при уровне значимости Р<0,05. Достоверность различия показании «контроля» и «опыта» устанавливали с помощью критерия Стьюдента ,гз* рядов с малым количеством вариант. Число степеней свободы (f) - ог 4 до 6. Различие считали достоверным при уровне значимости Р<0,05 (Венчиков. Венчиков. 1974].

Результаты исследований и обсуждение

1. Ионы кобальта и койаламми в физиологии Р. fieudenreichU я «жестки!» уело ni mi существования. Впервые проследили концентрашюнную зависимость роста прокариотческого организма, а именно Р. freudenreichií. от кобальта Максимальная скорость роста в присутствии воздуха достигалась при добавлении в глюкозо-минеральную (минимальную) среду СоС1;.6Н;0 в концентрации 1,0 мг.л'1. Как увеличение (возможно токсическое действие избытка ионов металла), так и уменьшение концентрации соли кобальта (далее — кобальта) приводило к снижению скорости роста культуры (рис. 1). При этом обшее содержание корринондов в клетках (в стадии активного роста культуры) имело прямую зависимость от концентрашш кобальта. Отсутствие облнгатного участия кобальта в ферментных системах бактерии обсуждено в диссертации. При субоптимальной его концентрации в среде положительное влияние на рост культуры оказывал экзогенный кобамнд, например СЫ. Поэтому заключили, что

зависимость развития бактерии от концентрации добавленного кобальта в указанных условиях обусловлена именно кобашшши, для биосинтеза которых ионы кобальте необходимы. Несмотря на то, что без добавления соли кобальта среда содержит следы ионов металла (микрограммы на литр), после двух-трёх

Рис. 1. Рост Р. freudenretchii на минимальной среде в присутствии воздуха н содержание корриноидов в клетках в зависимости от концентрации добавленной в среду соли кобальта

Примечание: концентрация СоСЬ 6Н2О всреде(мг,л''); 1) -1,0; 2) - 3,0; 3) - 5.0; 4) - 0,5; 5) - 0,01; 6 - не добавлен. Стрелкой и цифрами показано содержание суммарных корриноидов (мкг.г1 АСБ) в метках бактерии (72 ч).

пересевов на ней рост культуры прекращался, клетки утрачивали способность к делению и выглядели филаментными. В атом случае ни добавленный кобальт, ни СЫ не стимулировали развитие бактерии, что указывало на глубокие, необратимые изменения в состоянии её метаболизма.

Уровень образованна корриноидов {—1000 мкг.г*1 АСБ), которому соответствует максимальная скорость роста на минимальной среде при свободном доступе воздуха, был принят нами как физиологически значимый (нормальный), а вариант бактерии обозначен как Cor* (полноценный по содержанию корриноидов в клетках). Дефицитный по корриноидам вариант (Cor, остаточное содержание в клетках — 10

мкг.г' АС Б) возобновлял свои рост либо в анокеических условиях, например в присутствии аргона (рис, 2). либо на воздухе, ко при дополнении среды одним их соединений с восстановленной формой серы: .тносульфатом-Ка, инстелном, мстноннном, восстановленным глугатноном

Рис. 2. Рост дефицитном по корринондам Р. frendenreichii ( Cor") на минимальной среде в присутствии воздуха или аргона

Примечание; тиосульфат-Ыа или мстиопнн добавлены в концентрации (>/>}%.

Следовательно, высокий уровень образования корриноидов в клетках имеет положительное значение для развития Р. freudenretchii в присутствии О;, которое альтернативно может быть поддержзно соединениями с восстановленной формой серы. Помимо прямой нейтрализации Ол в среде не исключается физиологическое действие этих соединении в акгнокислительнои защите клеток, дефицитных по корриноидам. В Cor* варианте бактерии, растущем в условно аноксических условиях наблюдали усиление потребления ионов сульфата, а также повышенную активность первых ферментов ассимиляционной сульфатредукции и пентозомонофосфзтного

пути, генерирующего НАДФН. Дисснмиляцнонная сульфатрсдукция у ПКБ не покатана (Vorobjeva, 1999; 2000). Предположили, что в условиях дефицита коррииоидов в клетках P. freudenreichii включаются компенсационные механизмы для поалержагтя уровня существенных для каталюов сул ьф гидр ильных групп. В литературе (на примере Е. coli и клеток млекопитающих) имеются сведения о соответствии между обеспеченностью клеток витамином Ви и общим уровнем сульфгндрнлышх групп в них (Dubnoff, Bartran, 1956; Bhai et al., 1968).

Сравнение уровней сул ьфпир ильных групп белков Сог+ и Cor' клеток (вариант культивировали при свободном доступе воздуха на гдюкозо-м и игральной срсдс, дополненной метионшюм) показало, что обшес содержание тиолов в

препаратах белков Cor" клеток на 30 - 35 % снижено по сравнению с таковым Cor"

*

клеток (рис. 3). Это коррелирует с активностью некоторых ферментов, содержащих существенные для катализа сульфгнлрнльныс группы (Торчимений, 1971). Механизмы зашиты тиолов белков не изучены, ко известно, что ал котированные коррнноплы (кобамиды) способны к образованию слабых комплексов с восстановленным глутатноном, маскируя его SH-rpynny от действия кислорода; при этом ПХМБ с ней взаимодействует (DubnofF, Phillips. 1959; Dubnoff, 196t; Wacner, Bemhauer, 1964). Представленные физиолого-биохимические данные, наряду с литературными сведениями, указывают на необходимость более глубоких исследований взаимодействия кобамндов, форм кислорода и SH-сосдннсннЙ. Это область биоорганической и (или) координационной химии.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что для аэротолерантности бактерии, обладающей в норме активным «флавиновым дыханием» к системой ФАОЗ, в определенных, «жестких» условиях существования положительное значение имеют соединения группы витамина В1:, корринонды (кобамиды), образуемые бактерией в значительных количествах. Представляется вероятным, что у Р. freudenreichii я условиях минимальной среды при свободном доступе воздуха ферменты, участвующие в нейтрализации молекулярного кислорода н(или) его токсичных форм, сами нуждаются в защите от инактиенруюшего действия кислорода, и фактором этой защиты могут выступать корринонды. Идея о том, что предел аэротолерантности Р. freudenreichii определён устойчивостью к действию кислорода ферментной системы поддержания аэротолерантности (фдавиновые

оксидазы, шгтохромы, СОД и др.) была высказана в 70-х гадах прошлого века {De Vries et а!., 1972; Schwartz, 1973;Pritchardetal., 1977J, Показано, что в отличие от Р.

0,1 Л

0,12

Cor*

Л Ajso 0J

0,08

ГоК

0,06

0,04 ■

0,02

0 --------- ■■ --------

I

0 20 40 М М Ю 120 140 160 Раствор 0,8 мМ ПХМБ, мкл

Рис. 3. Уровни сульфгндр ильных групп в белках Р. /гешІепгеісЬіі в зависимости от содержания корринондов в клетках

Примечание; анализируемые препараты — растворы диапиэованных экстрактов клеток в іфксутствии 8 М мочевины (содержание белка - по 1 мг в 3 мл 0,5 М фосфатного буфера, рН 7,0), При титровании тиолов использовали щелочной водный растаор ПХМБ (Торчинекий, 1971).

ас»Шргор(опШ (Р, репшасеггт), тяготеющей к аэробиозу и синтезирующей в норме примерно в 20 раз меньше корриноидов, у Р. /геискпгегсЬИ, которая очень медленно растёт в условиях интенсивной аэрации (на богатой среде без добавления соли кобальта), подавлен биосинтез флавинов и шггохромов |Ое Улеэ е! а1, 1972). Индукцию синтеза шгтохрома (/ наблюдали только в условиях ограниченной аэрации |РтсЪа1^ е( а1., 1977].

Устойчивость Р, /геийепге1сШ к легальному действию ультрафиолетовой радиации (УФ, Хщ! 254 им) также коррелировала с высоким внутриклеточным

содержанием коррикоидов в клетках. При 25% их остаточном содержании потеря жизнеспособности клеток, облучённых в суспешки составляла ~ 80% по сравнению с полноценными по корринондам (Cor4). AdoCbl, добавляемый в суспензию облучаемых клеток (за 12 часов до экспозиции УФ), способствовал значительному повышению их выживаемости. Устойчивость бактерии к УФ-юлучению, по-видимому, определяется метаболическим состоянием бактерии, которое обусловлено внутриклеточными корриноидами.

Таким образом, высокий уровень образования коррикоидов в клетках Р. freudenreichii имеет положительное значение для CÖ аэротолерантности и УФ-резистентности в определённых условиях существования, напоминающих токовые на древней Земле в период появления кислорода. Действие некоторых кизкомолекулярных соединений (вне ферментов) в антиокислительной защите клеток известно (Скулачйв, 1997).

2, Изменения в фпзиолопш Р. freudenreichii при лимитировании по ионам кобальта в ерше и дефиците коррикоидов в клетках. Рост P. freudenreichii на глюкозо-минеральной среде с аммонием как единственным источником азота (в присутствии воздуха), когда бактерия самостоятельно синтезирует все метаболиты и полимеры клетки, требуя только бнотин и пантотенат, возможен при условии образования значительных количеств корринондов в клетках.

Дефицит СЫ в клетках неизбежно лимитирует специфически зависимую от него метиоиинсиитазу (СЫ-МСазу), однако нами было установлено, что для нормального биосинтеза метнонина у Р. freudenreichii достаточно 100-200 мкг.г1 суммарных кобамндов в клетках. При 100- и 1000- кратном их дефиците метионкн как незаменимая аминокислота, как соединение с восстановленной формой серы и как компонент S-аденознлметионниа (S-AdoMet), должен быть подучен клеткой либо в результате функционирования альтернативной МСозы, независимой от СЫ (впервые это было показано для Е. coli; Jeter et al., 19X7), либо из среды. Так же могут быть получены аминокислоты, биогенез которых включает перенос Cl фрагментов при участии активных форм тетрагндрофолиевой кислоты (ТГФ), освобождение которой от метальной группы связано с активностью M Сазы (Rodt et al,, 1996).

Дефицитная по корриноидам бактерия при свободном доступе воздуха способна развиваться со скоростью, равной или близкой таковой Cor* варианта (табл. 1). При

этом она испытывает новые ростовые потребности: требует смесь аминокислот и пептидов (трнптон), а её рост уже не зависит от концентрации кобальта в среде и содержания корршюидов в клетках. Обогашёниах тритоном среда содержит аминокислоты с восстановленной формой серы, благодаря чему, видимо, бактерия «решает проблему» аэро протекции при дефиците коррннондов.

Таблица 1. Удельные скорости роста вариантов Р. /геиЛелге/'сИИ, различающихся по содержанию коррннондов в клетках, на минимальной и обо гашенной средах

Вариант культуры Удельная ско ростъ роста, ц

24-48ч 48-72 ч

Cor", минимальная среда + СоСЬ.бНгО, 1 мгд*1, содерж. корриноидов ~ 1000 мкг.г'1 АСБ 0,0510 ± 0,0030 0,0285 ± 0,0027

Сот*. обогащенная тритоном среда + CoCl;.6HiO, 3 мм-1, содерж. корриноидов — 1000 мкг.г'1 АСБ 0,0518 ± 0,0020 0,0288 ± 0,0014

Cor", обогащенная тритоном среда, содерж. корриноидов ~ 10 мкг.г"1 АСБ 0,0520 ± 0,0026 0,0279 ± 0,0018

Cor*, обогащенная тритоном среда, содерж. коррннондов ~ 1 мкг.г"1 ЛСБ 0,0512 ± 0,0023 0,0281 ± 0,0014

Примечание: данные представляют собой медиану (Ме) для б пои-орностей и се довертел ыш И интервал, Триптон добавлен н концентрации 0,0 3%.

Присутствие смеси аминокислот в среде наряду с резким падением уровня образования коррннондов ведйт к определённому снижению затрат энергии клеткой, но происходят ли изменения в основном энергетическом процессе Р. /геи<!епге(сИН - лропноновокислоы брожении, при дефиците коррннондов?

Результаты сравнительного анализа основных продуктов ПБ показали, что при 100-кратном дефиците коррннондов в клетках бактерии, растущей на обогащенной (тритоном) среде, характер брожения не изменяется: количество и соотношение (2:1) выделяемых в среду пропноновой и уксусной кислот сохраняются,

свидетельствует о нормальном функционировании мстилмалонил-КоА-мутазы (ММКоЛМазы) - ключевого фермента ГШ, использующего в качестве кофермента не только СЫ, но и любой другой кобамид, вкючая кобинамид (Overath et al., 1962; Chowdhury et al., 2001). Кобинамид (Cbi) или Оезнуклеотидный фактор В -преобладающий корриноид в клетках бактерии, причём более 80% Cbi находится в адснознлнрованиой форме, AdoCbi (Быховскнй, Зайцева, 1989; Kräutler, 1998). Интенсивность потоков вещества в брожении меняется только при глубоком, 1000-кратном, дефиците корриноидов (остаточное содержание 0,1% или -1 мкг.г"1 АСБ, вариант обозначили как Сог"). Усиливается образование уксусной и снижено образование про пионовой кислоты, но и это (теоретически) ие является критичным ли энергообеспечения клеток, что подтверждается близостью скоростей роста на обогащенной среде всех трёх вариантов бактерии (Cor", Cor", Cor").

Таким образом, установлено, что высокий уровень образования корриноидов ис является необходимым для ПБ. Вместе с тем при 1000-кратном снижении уровня образования корриноидов (Cor" вариант) бактерия, видимо, действ)ггсльно перестраивает обмен, о чём судили по временному замедлению роста культур «а обо гашенной трнптоиом среде под влиянием экзогенного СЫ.

Какой же из процессов специфически зависит от СЫ, но может протекать альтернативно, без его участия? Учитывая собственные наблюдения повышенной чувствительности к УФ-излученюо лимитированных по содержанию корриноидов клеток P. freudenreichii (основной мишенью воздействия является ДНК) и принимая во внимание предшествующие работы, показывающие связь между присутствием в среде витамина В)2 (или ионов кобальта) и содержанием ДНК (но не РНК), в клетках Lactobacillus leichmanti [Wacker et al., 1957; Beck et al., 1962), Rhizobium meliloli JCowles et al., 1969) н Euglena gracilis {Johnston, Carell, 1973; Christopher et a)., 1974), внимание направили на исследование анаболизма ДНК P. freudenreichii в связи с разными уровнями образования кобамндов в клетках.

Установили, что полноценные (Cor ) и дефицитные (Сот", 100-кратныЙ дефицит) по содержанию кобамидов клетки почти двукратно различаются по содержанию ДНК, но не РНК (Иордан и др., 1983), причём тогда, когда скорости роста физиологических вариантов бактерии близки. Снижение содержания ДНК на 40% в расчёте на клетку) наблюдали также в бактероидах клубеньков люпина,

выращенного при недостатке ионов кобальта, и имеющих пониженное содержание кобол амина [ОНлогЛ, В)£5е1ю§. 1У84|,

Следовательно, показанная выше корреляция, имеет определённое распространение среди м и крооргзнтмов. Она подтверждает непостоянство

зооот

"<|V1 ,

- 0,01 0,05 0,5 1,0 3.0 4.0

C0CI1.6H1O, мг.л'

10 100 200 600 900 1100 1250

Эндогенные коррлпонды (но CN-Cbl), мьз.г1

Pite. 4. Влияние ионов кобальта на интенсивность образования ДНК в клетках Р. freudenreichii. Корреляция с содержанием эндогенных кобамидов

Примечание: отмытые клетки ijam активного роста культуры суспендировали М гокцешрировали (5 мг.мл'1 но АСЕ) я солевом фойе среды с добавлением 0,5% глюкозы цри Суспензии вариантов уравнивали по

Вводили ['Щадспии, 74 М!>к.мл"' (уд. радиоактивность - 592 МБк.ммоль*') и немеченый адении, 5 мкг.мл"'. Инкубирование—40 мин при 37*С.

Контроль «0-еремени» - радиоактивность ДНК через 5 мин инкубирования. I [редстаклеиы результаты тишпного из 4-х опытов; позиции диаграммы — средине значения (Ме) для 5 повторных измерений. Отклонения - в предела* 10%,

содержания ДНК в прокарнотической клетке и затрагивает вопрос о его биологическом смысле, обсуждение которого приведено в диссертации (глава 4).

От концентрации соли кобальта в среде зависела интенсивность образования ДНК (тотальный синтез ДНК, определяемый как скоростью элонгации репликации, так и числом репянкативных видок). В клетках экспоненциально растущих вариантов (при практически равных скоростях роста) она коррелировала с содержанием коррнноидов; значительное снижение интенсивности процесса происходило при небольшом его уменьшении (рис. 4).

Таблица 2. Действие аденозилкобаламина на образование ДНК в клетках Р. freudenreichii (Cor* вариант) в условиях подавления синтеза РНК и белка

Вариант Интенсивность образования ДНК, имамии1 (ДНК). мг'1 (АСБ), 10 мин"1 Показатель стимулирующего эффекта (N)

Контроль (Cor") 1500

2,16

тоже + AdoCbl 3240

Cor"+рифам пицин 470

2,00

то же AdoCbl 1034

Cor" +хлорамфе никоя 615

2,20

то же + AdoCbl 1230

Примечание: суспензия клеток (5 мг.л'1, по АСБ) - отмытые ог среды клетки б5-ч культуры в инкубационном растворе (солевой фон среды + 0,5% глюкоза). Инкубирование - 90 мин, ЗТС, AdoCbl - 3 Mir.мл'1. Рифам пицин (200 мкгдш"1) и хлорамфеникол (100 мю\мл"') вводили в суспензию за 10 мин до AdoCbl. В соответствии с критерием Стъюдента для рядов с малым числом вариант различия сравниваемых показаний достоверны (Р<0,05, f= 4).

Впервые в серии экспериментов с Р, freudenreichii было доказано прямое и специфическое участие кобаламяна в анаболизме ДНК. Так, показана интенсификация образования ДНК в суспензии Cor* клеток под действием AdoCbl и МеСЫ, причём в результате введения СЫ процесс протекал даже более интенсивно, чем в Cor* клетках (рис. 5). Последнее указывает на его метаболическое лимитирование эндогенным СЫ даже при физиологически нормальном уровне

суммарных коррикоидов & клетках бактерии (производные СЫ взаимопреврашае.чи in v/w). Введение СЫ (рис. 6) нлн 5,6-ДМБ (Иордан и др., 1994) в суспензию Cor* клеток также приводило к ускорению пронесся. Это объясняется энзнматическим

Cor" + AtloCbl Cor+ МсСЫ

* Cor*, Контроль i

Cor",

КЙН||ЮДЬ t

Время, мни

Рис, 5. Интенсификация образования ДНК в Сот" клетках Р. /геи&пгекИИ под действием адекозил- или метилкобаламика

Обозначение*. вариант Сот*;

Примечание; в охлажденные суспензии скопце! прирова иных клеток (фаза активного роста) внедёц |8-иС1адспин - 74 КБг.мл"' (удельная радиоаетимюстъ - 10,2 ГЕк-г1) и аденин - 5 мкг.мл . Иреинкубврошшне с корриноидам и 15-20 мин при 37"С. Коцценрация корринокдов - 3 мг.л . 0-точ ка-радиоактивность ДНК через 5 мин инкубиронания при 371 С (вычтена из показаний опыта).

превращением кобамидов в кобаламин в клетках после поступления в них 5,6-ДМБ (Быковский. Зайцева. 1989)/ Наконец, мы оценили эффект А(1оСЫ на образование ДНК в суспензии клеток («острый опыт») при подавлении биосинтеза РНК и белка. Несмотря на снижение интенсивности процесса в присутствии рифампнцнна или хлорамфеникола, вероятно, из-за подавления инициации репликации, показатель

интенсификации образования ДНК под действием AdoCbl в суспсЮ1ш Cor* клеток сохранялся (табл. 2).

80

Время, мня

Рис. б. Интенсификация образования ДНК в Сог+ клетках под действием аденозилкобал амина

Обозначения: 1 - Саг*", контроль (без добавления А<ЗоСЫ);

2,3 - добавлен А<кнСЫ: 3,0 и 9,0 мг.л"1 соответственно. Примечание: условия постановки опыта см. ш рис. 5. Здесь удельная радиоактивность меченого адешша - 12,7 ГБк.г"1.

Следовательно, на биосинтез ДНК кобаламик действует специфически, по-видимому, - на уровне элонгации репликации. Стимулирующее влияние AdoCbl на интенсивность образования ДНК в клетках выявлено для представителей других видов классических ПКБ и кожной бактерии Р, acnes> а также для некоторых стрептомнцетов, синтезирующих в норме СЫ в значительных количествах. AdoCbl не оказывал влияния на образование ДНК у Е. coli. Интенсивность образования РНК

в клетках всех анализируемых штаммов ПК Б не зависела от AdoCbl (Иордан и др., 1990).

Удивительным оказался тот факт, что P. freudenrekhii не прекращала образования ДНК, например в отличие от Rhizobtum meliloti {Cowles ct al., 1969), при самом тщательном освобождении среды от ионов кобальта. Мы соприкоснулись с «аномальным явлением»: с одной стороны, зависимостью процесса от кобаламнна. а с другой, — его осуществлением практически в отсутствие коррішоидов, причём экзогенный AdoCbl действовал а последнем случае как ингибитор (рис. 7), Следовательно, при глубоком дефиците корриноидов происходит изменение характера биосинтеза ДНК,

Действительно, только в Cor* клетках образование ДНК происходило интенсивнее, если культура росла в присутствии воздуха; гидроксимочевина (ГМ, специфический ингибитор мспаллосодержащих, активируемых 0¡ РНРаз, см. далее) подавляла процесс. Ионы Мя'* (в суспензии клеток культуры Сот", выращенной на среде, предварительно освобожденной от ионов Мп*') стимулировали его (рис. 8). Внимание именно к ионам марганца обусловлено имеющимися в литературе сведениями об их значении для процесса у некоторых корннеформных бактерий (Auling et al., 1980; Auling, Follmann, 1994), к которым относятся и ПКБ.

Удаление из «бескобальтовоіі >» среды ионов марганца приводило к снижению скорости роста культуры; клетки становились примерно в 5 раз длиннее исходных, После добавления маргшша состояние бактерии нормализовалось. Удлинение клеток и снижение скорости роста Сот" культуры при нормальной концентрации хлористого марганца в среде происходило и под влиянием ГМ. Ранее значение ионов Мп2' было показано для Mocardia opaca, С, atnmoniagenes и Arthrobacter spp., которые r отсутствие марганца также прекращали синтез ДНК и переходили к филаментному росту (Aiding et ol„ 1980; Plonzig, Aiding, 1987).

Таким образом, бактерия способна синтезировать ДНК как с участием, так и без участия кобаламнна, используя, по-видимому, марганец; причём в последнем случае кобаламин подавляет процесс. В физиологии микроорганизмов двойственность процесса описана впервые.

Л

в £

<

£ (I

ей

21

16 8 О

24 16 8 О

-1000

-100

10 4-2 ~ 1

Коррмонилы (по С 4-СЫ), мчт.г

+ АЛоСЫ

I'

+ АЛоСЫ /

! /

[Ж

I 2

1 2

Рис. 7. Интенсивность образования ДНК в клетках Р. /геи&пгекНМ в зависимости от содержатся корринондов (А) и под влиянием аденознлкобаламина (Б)

Обозначения;

- скорость включения меченого «денин« в ДНК суспензии клеток бе-> экзогенного кобаламииа

- то же с добавлением А<!оСЫ (1,-0.3 мгл'1; 2.-3,0 мгл'1)

Примечание: условия опыта см. примечание к рис. 5.

14000 Л М^ЛНЛХмкМ

12000 ■ 1>3

10000 • а /

мм / / недобмлш / / Р (контроль)

«ооо д «оо • // --ну»

1 »0» ■

3 ф

^ 14000 . 11 м 41 «0 Б МпС1,.4Н,0. мкМ

1 шм ■

§ 10000 . / Ж КЛ МИ

п. юо • / КС ДООМДП / „ (ковтршп.)

«ооо 4000 // / А А «+• ГМ(МмМ) / б+ ГМ(тоже)

n00

л

и м со . Врем, ■■■ Рис. 8. Образование ДНК в клетках Р. /Ышкпге1сЬН при 1000-кратном дефиците корриноидов к лимитировании по марганцу под влиянием иоиой марганца (Л) и/или шдроксимочевины (Б)

Обозначения: контроль—без добавления соли марганца или пшрокюючевины (ГМ). Примечание: условия постановки опытов (но без СЫ) см. на ряс. 5 и 6. Различие между включениями в ДНК (за 60 мин) в позициях «а» и «б» достоверны при уровне значимости Р£ 0,05(^4).

3. Изучение процесса образованна ДНК, происходите! u и клетках Р. freudenreich!} при участии кобаламина. В литературе отсутствуют сведения об участии кобаламина в ферментных системах собственно репликации хромосомы. Для выявления точек его приложения к процессу образования ДНК у Р. freudertreichil, исследовали возможность его вовлечения в формирование предшественников ДНК, а также в её метилирование.

Данные проведённых экспериментов показали, что Cor* клетки (100-кратный дефицит корриноидов) Р. freudenreiche лимитированы по тиминовому предшественнику ДНК. Так, при попытке использования [5Н)тимина в качестве азотистого основания, метящего ДНК, наблюдали больший прирост ее удельной радиоактивности в растущей Cor* культуре по сравнению о Сог\ Известно, что голодающие по тимину клетки, используя запасный путь для формирования луда дТТФ, включают экзогенный тимин в ДНК интенсивнее, чем полноценные по нему (Mollgaard, Neuhard, 1983; Maihews, 1985). В таком случае тимин не является нейтральной меткой, адекватно регистрирую шей синтез ДНК, Поэтому для наблюдения за процессом в качестве метки использовали аденин. Положительное влияние экзогенного ткмкна на образование ДНК в дефицитных по коррииоидам клетках проявлялось. Не исключен побочный эффект дефицита СЫ, который, непосредственно участвуя в СЫ-зависимой реакции синтеза метнонина. косвенным образом влияет на активность там иди лаге интазы (возможно, она лимнтарована по ТГФ, освобождаемой от СНз-группы в МСаздои реакции). Однако введение тимкна не устраняло различие Сот" и Cor* клеток в интенсивности образования ДНК. Поэтому заключили, что возможное опосредованное влияние кобаламина на синтез тимиднлата - не единственная и не критическая точка его приложения к процессу,

РНРаза ответственна за сбалансированное превращение 4-х р ибонуклеотндов в соответствую цше деэоксирибонуклеоткды. Это первая специфическая и скоростьлимиттфуюшая ступень в анаболизме ДНК у всех организмов. Фермент как контролирующий репликацию относят к генетическим (Hu et al„ 1984; Cory, 1988; Chiu et a]., 1992; Rei chard, 1993; Licht et а)., 1996). PH Разу обнаруживают в ДНК-мембранных комплексах, сё синтез приурочен к началу репликации ДНК (cell cycle regulated enzyme), а подавление биосинтеза ДНК любым способом вызывает дерепресскю синтеза фермента (Sun, Fuchs, 1992). Незначительные изменения

акпгеностн фермента немедленно отражаются на интенсивности образования ДНК (Sinha, Snustad, 1972; Brischwein et al., 1997), поэтому РНРазу используют как мишень в противораковой терапии (Chiu et al., 1992; Fan et al., 1996).

Известно несколько типов РНРаз, различающихся по строению кофермекгаой части молекул и способу образования свободных радикалов в активных центрах (Licht et al„ 1999; Oehimann, Auling, 1999; Reichard, 1993; 2001). У прокариот наиболее широко распространена AdoCbl-зависішая РНРаза (Рыжкова, 2003), которая к началу наших исследований (1972 г.) была открыта и частично изучена у L, kichmanii (Blakley, Barker, 1964; Blakley et al., 1965; Panagou et al., 1972), Я. mehioti (Cowles, Evans, 1968; Cowles et al., 1969) н gracilis (Hamilton, Blakley, 1969), Кроме того, с помощью специального тоста AdoCbl-РНРаза была предсказана (Gleason, Hogenkamp, 1972) для некоторых других бактерий разных родов (но не Propionibacterium).

В бес клеточных системах P. freudenreichii, в норме синтезирующей корриноиды (вариант Cor*), мы выявили активность РНРазы (Иордан и др. 1975), которую стимулировал AdoCbl. Она требовала Гл-SH, не зависела от ионов Mg**', не сопровождалась потреблением молекулярного кислорода, не подвергалась ннгибнрованию ГМ. Активность подавляя «внутренний фактор» (ВФ, intrinsic factor) - специфический ингнбитор СЫ-зависнмых ферментов (Hexe, 1998). В экстрактах Cor* клеток активность абсолютно зависела от AdoCbl (рис. 9), функциональные свойства РНРазы р, freudenreichii (табл. 3) соответствовали таковым других, известных, AdoCbl-зависимых РНРаз (Blakley, 1982; Иордан, 1990; Harder, 1993, Рыжкова, 2003). Наличие РНРазы, зависимой от AdoCbl. в клетках Р. freudenreichii показано также методом ЭПР-спектрометрии по возрастанию интенсивности сигнала, характерного для AdoCbl-зависимых ферментов, прямо пропорционально активности РНРазы. Присутствие AdoCbl в составе РНРазы подтверждено реконструкцией холоферыента с помощью AdoCbl, о чём судили по восстановлению активности, теряемой в процессе выделения и очистки фермента Получены данные, свидетельствующие об участии глутаредоксина в качестве естественного восстановителя в AdoCbl-PHP-системе Сог^ клеток; восстановленный глутатион, ио не НАДФН, обеспечивал активность фермента.

2t>

AdoCbl, мкМ

Рис 9. Зависимость начальной скорости PHP-реакции, катализируемой АОоСЫ-зависимой РНРазой Р. freudenreich!i, полноценной (Cor*) и дефицитной (Сот*) по корринондам, от концентрации AdoCbl

Примечание: варианты бактерии кульпширотлп 72 ч на 1лкжи»о-мшеральной среде, обгнощсшюй трцпгоном (0.05%), с доГивлеинем CoCIj 6H;0, 1 мгл'1 (Cm41) и без кобальте (Cor), остаточное содержание корриноидои —10 мкг.г1 АСБ,

Реакционная смесь содержала: 70 мМ трис-ИС1 буфер (pH 7,0); АДФ -0,7 мМ; ДТТ— 30 мМ; днализовашшИ экстракт клеток (800 мкг, ио белку). Объем - 200 мил. Инкубирование - 30 мин ири 37"С.

Таблица i. Кклетическнс параметры реакции, катализируемой А^оСЫ-завнсимой РНРаюй в ли алию ванных

экстрактах клеток Р. freudenretchíí (Cor* и *Сог" вариантов) в оптимизированной реакционной смеси

Вариант MtKCtlULnVnt* NIIUUII (WpOfTl, PHP-пешиш IVroii)*' Км K, (1«АДФ(ДТП Коипоапли реяирюмной (несм, мМ Вариант 0|амвеане к вягвбяюрм ([ й*,) Oí кошение .0! Ktf, иЧ Д» к'к, ■tM

«й.иг'.ч*1 ■M.i' *M ч1 АЛ* дтт TiSH НЦФП Ml" ГМ ВФ Д1Г сГа-SH ДМ AítfM

Cor* Íe) AJcCM SO (сДТТ) 60 <t Гл-SH) 0,32 0,20 <nw за 8,0 Я if i Cor* Cor* + AdaCbl, MOVKM Ht Havtxfjej Ht MTHfWtpjeT 2¿ мг.Ht1 BntpT. Ив« pi. 7fl 0,5 7,5

Примечание. Cor1; в кчепах содержится корринондоа-1 ООО им-, г' АСБ;

Cot"; в клетах содержи re» коррикондоа ~ Юмкг. г'АСБ (* в реакционной смеси присутствует AdoCWX pII-onrnM)m 7,0

Ш-шдрокскиочевина- специфический ингибитор гетеродимеркич металтаагфжащнх Г11Ра%акпсмф>емих мол. кислородом

11Ф - «внутренние фактор* (ВФ, IF, intrinsic factor) - вдеоюоепецифичиый СЫ-свлзимюшиЙ белок в составе белкового комплекса

желудочного сока, нехонкуренпшй ингибитор СЫ-иаисмммх ферментов. Любезно предосгаыен лроф. Е, Nexfl, Дали* {Nexo, lW8j.

ЮмгпрешрвтасыэывмтО.внматейкобаламина;

Гл-SH - восстановленный гл)татиои; ДТТ- ди тиотрси гол.

Кг- кол cram скорости реакции;

• (прочет*)- itiwepeime не проводил».

"IIpH ввдетжи дПФ в ршщнониую смесь активность возрастала 50%.

Данные (in v/rro), представленные на рис. 9, н повышение удельной активности AdoCbl-РНРазы в результате введения в суспензию Cor* клеток СЫ или 5,6-ДМБ (Иордан и др., 1994) свидетельствуют О том, что Л(1оСЫ-РНРаза метаболически лимитирована по СЫ даже в норме (при высоком уровне образования коррнноидов). Причинами этого, по-видимому, являются строгая специфичность РНРачы к СЫ (Schnöder, Stroinski. 1987; Lawrence eta)., 1999) и низкое содержание СЫ в клетках в норме как особенность регуляции биосинтеза коррнноидов (Еыховскии, 1979; Bykhovsky et al., 1997), Вышесказанное объясняет необходимость высокого уровня образования коррнноидов в клетках P. freudenreichii для эффективного биосинтеза ДНК н еггнмулнруюшее влияние экзогенного СЫ на процесс при нормальном (физиологическом) содержании коррнноидов.

Предположение о том, что в природе помимо универсального механизма метилирования макромолекул, действующего через S-AdoMet, существует обособленный путь транс метил нрава ния при участии МеСЫ, высказывалось давно. Предпосылки обобщены в монографии (Канопкайте, Рачкус, 1991). Стимулирование витамином Вц включения СН^-группы из метюыетионина (витамина U) в ДНК было известно для £ gracilis (Bertaux, Valencia, 1975). Среди изученных бактерий в ысокоы етшшрованную по шггозину ДНК содержат Р. freudenreichii и Alealt genes faecalis при том, что обычно у бактерий 5-метилшгтозин (м'С) в ДНК встречается значительно реже (Ванюшин, 1968), чем 6-метнладении (мбА). Имеются сведения о значении метилирован)« ДНК именно по аденину для контроля репликации в бактериальной клетке; метилирование ДНК по шггозину существенно для других процессов, таких как экспрессия генов, зашита генома от действия рестриктаз, репарация ДНК и другие (Кнрнос и др., 1993; Lengeier et al., 1999) Р. freudenreichii содержит МеСЫ (Skupin et al., 1970),

Мы наблюдали двукратное различие в уровнях м5С ДНК Сот* и Cor' вариантов Р. freudenreichii. В бесклеточных системах Cor* варианта выявлена активность фермента, катализирующего тран смети лированне цитознна ДНК, который специфически использовал МеСЫ в качестве донора метильной труппы (табл. 4). В Сот' препарате была активна дублирующая ыетнлтрансфераза (МТР) цитозина, требующая S-AdoMet, но не МеСЫ в качестве донора метильной группы. Работами

французских исследователей с эукариотными клетками получены данные, подтверждающие возможность метилирования ДНК по цитозину не только посредством S-AdoMct, но н МсСЫ (Pfohl-Lcs^kowiez et al., 1991).

Таблица 4. Мет и л коболами« в энзимашческом метилировании ДНК (по цитозину) Р. freudenreichii

Реакционная смесь содержит: м'С в ДНК , М%

препарат МТР коррионнды Сот * (контроль) Cor"

— — 0,59 ± 0,05 0,28 ± 0,04

У МеСЫ 0,62 ± 0,06 0,60 ± 0,05

— МеСЫ 0,61 ± 0,04 0,35 + 0,03

Т — 0,59 ± 0,04 0.29 ± 0,03

т AdoCbl 0,58 ± 0,03 0,27 ± 0,05

т Фактор В 0,60 ± 0,06 0,26 ± 0,04

T+CFjCl-Cbl МеСЫ 0,61 ± 0,07 0,35 ± 0,05

Y+ S-аденоз илі омої щетеин МеСЫ; 0,57 ±0,05 0.39 + 0,06

Обозначения: Т добавле и; не доСа влей

Примечание: Сот* вариант выращен на минимальной среде; Сох"—при добавлении п ней тиосульфата-Na, Реакционна» смесь (10 мл) содержала: 50 мМ трис-HCI буфер, pH 7,0; препарат МТР (экстракт Сот4 клеток после ультрацешрифуїированші.105000g (7 мг по белку); корриаоиды - по 5 мкмолей; акцепторную ДНК из Сет" «деток, 10 мг. Инкубирование — 90 мии при ЗУС. CFjCl-Cbl — неконкурентный ингибитор МТР от МеСЫ (5мкм); 5-&денозшігомоі(истеин — конкурентный ингибитор МТР от S-AdoMet (5 мкм),

У обоих вариантов Р. freudenreichii S-AdoMct служил донором CHi-группы группы при трансыетиаировании аденнна ДНК (табл. 5). Образование метилированного адеюжа, существенного для контроля репликации у бактерий, не требует МеСЫ, поэтому для биосинтеза ДНК в клетках изучаемой бактерии выявленный эффект МеСЫ не должен иметь значения.

Таким образом, впервые показано трансметилированне ДНК, зависимое от ыетнлкобаламнка как донора метельных група В клетках Р. freudenreichii оно происходит по цитозину ДНК, причём альтернативно, в отсутствие ыегшпкобаламина, используется S-AdoMet

Таблица 5. Метилирование гетерологичной ДНК от МеСЫ или S-AdoMet препаратами метилаз Cor* и Cor клеток P. freudenretchii

Препарат МІР Радиоактивность оснований ДНК по метнльной группе, имп .мин"1 (в 50 мкг ДНК)

м"А м'С

от AdoMet от МеСЫ от AdoMet от МеСЫ

Cor4 5100 150 100 640

Сот* 7800 200 8050 120

Примечание: препараты МТР - двал изо ванные ivmoie нага клеток бактерии. Субстрат -гетсрологичная ДНК, метилированная в последовательностях, отличных ог бактериальных. Исподьэовавы меченые тритием по CHi-группс S-AdoMet (коммерческий) и МеСЫ (сшггезирован в лаборатории к обладал невысокой удельной радиоактивность»)

4. Альтернативная рибонуклеотлдредуктаза Р. freudenrelchü, функционирующая в процессе образовании ДНК без участим к об ал амина. Способность бактерии синтезировать ДНК в отсутствие СЫ могла быть обусловлена функционированием в клетках альтернативной, независимой от AdoCbl, РНРазы наряду с другими ферментами анаболизма ДНК, действующими вне связи с коррннондамн. До наших исследований уже была известна Fe-содсржашая и активируемая Oj РНРаза Е. coli (Reichard, 1962; 1967; Eliasson et al., 1986). Это был новый, впервые открытый фермент. Позже в клетках Е. coli, растущей анаэробно, обнаружили другую РНРазу, чувствительную к кислороду и требукицую S-AdoMet (Barlow, 1988; Fomecave et al., 1989; Reichard, 1993). Затем сообщили о чувствительной к Oj («анаэробной») РНРазе M thermoaulotrvphicumt ингибируемои S-AdoMet (Hogenkamp et al„ 1987; Sze et al., 1992), и о Mn-содержащей РНРазе, активируемой Oj, в клетках Corynebaciemtm ammoniagenes и других корннеформных бактерий (Schirapff-Weiland, Follmann, 1981; Plonzig, Aiding, 1987; Aiding, Follmann, 1994; Oehlman, Aiding, 1999), а также Bacillus subiilis (Mohamed et al., 1998).

В настоящее время все известные РНРазы относят к 3-м (или 4-м) классам. AdoCbl-зависимый фермент (класс II) наиболее просто устроен: содержит одну каталитическую субьединнцу (R) и коферментную часть - AdoCbl, однако

некоторым AdoCbl-РНРазам свойственна гомодимсрная структура, Эш ферменты не вовлекают кислород в катализ, но активны в сто при су тствии. Метадлосодержашис РНРазы (классов I и IV) гетероднмерны (R1-R2). причем легко днссо пирующую с)бьедипнцу R2, несущую металл (Fe или Мл), условно, по функции, аналогичной AdoCbl, рассматривают как кофермент PH Разы (R tic hard, 1993; 2001; Aul і пр. Follntann, 1994; Stubbe, Van der Donk, 1995; Oehlman. Auling. 1999). Молекулярный кислород, активируемый двухядерньш кластером металла, участвует в геиерашш органического радикала (тирошла) в активном центре фермента (в литераrjpe эш РНРазы называют «аэробными»), что сопровождается образованием О/, которые удаляет СОД (Eliasson et al„ 1986). ГМ действует как тушитель свободного радикала тирозила (Rosenkranz et al., 1966; Reichard, 1993; Harder, 1993; Auling, Foil mann, 1994), который в цепи свободнорадшсальных превращений в активном центре фермента предшествует каталитически активному (тиловому) радикалу, непосредственно вступающему во взаимодействие с рибозоК нуклеотида. Долгое время считали, что один организм обладает РНРазой одного типа, и ставился вопрос, не является ли тип РНРазы у того или иного оргашпма его филогенетическим признаком (Auling, Foil mann, 1994). Первые данные о функционировании в клетках P. freiutenrelchii независимой от кобаламина РНРазы, наряду с AdoCbl-РНРазой, были опубликованы нами в 1975 году. Максимальная начальная скорость реакции in vitro требовала новых у словий (табл. 6) в отношении pH-оптимума, потребности в ионах Mg1*, Н-доноре и других. НАДФН, но не Гл-SH, обеспечивал активность альтернативной (дублирующей) РНРазы. ГМ её подавляла, ко активность была устойчива к действию ВФ. По мере освобождения клеток от коррииоидов активность альтернативного фермента (а-РНРазы) возрастала; в днализованных гомогенатах она была наибольшей, когда остаточное содержание коррииоидов в них составляло порядка 1 мкг.г"1 ACE (Cor" вариант). Это соответствовало наибольшей интенсивности образования ДНК в условиях глубокого дефицита коррииоидов. AdoCbl ингнбировал активность а-РНРазы (рис. 10). Данные об ннгибируюшем действии СЫ в отношении активности какой-либо РНРазы получены впервые, а в настоящем контексте они служат объяснению причины подавляющего действия СЫ на синтез ДНК ж Сот' клетках Р. freudenreichii.

Таблица 6. Кинетические параметры РНРаэы диалнзованных гомогенаток Cor" клеток freudenreich і в оптимизированной реакционной смеси

Вариант Максимальней начальная скорость (,vi* ЛЛФ) Кч Kv Компоненты реакционной смеси, мМ

РНР-р^акгши, НМ-МТ *,ч1 чМ.ч1 (іДТГ) tiM ч1 АДФ дтт Гл-SH НАДФН м«е*

Cor* 45 0,18 0,64 «,13 2,5-3,0 27-30 - J.0 2,5

Тркс-HCl буфер (70 м М), рИ-tn і пгчум -7,9-Н.О; белок = 4 мг.мя'і ЇТ'С; время инкубирования 40 мин

Примечание: Сот' - остаточное wuv-ржаиие корриноияов составляет ~10 мкг.г'1 АСВ,

Присутствие воздуха в реакционной смеси требовалось для активности альтернативного фермента: в атмосфере инертного газа его активность составляла менее 4%. в то время как AdoCbl-зависимая РНРаза не изменяла уровень активности. Ке исключено, что в процессе реакции происходит специфическое поглощение О;, которое можно зарегистрировать. Эти результаты показали, что независимая от СЫ (альтернативная) РНРаза f. Jreudenreichti относится к классу «аэробных» ріібонуклеотидреду ктаз. н послужили объяснению положительного влияния кислорода (воздуха) на синтез ДНК в Cor" клетках. Проявление активности а-РНРазы с НАДФН и ей отсутствие с Гл-SH (в диалнзованных экстрактах Cor" клеток) указывало на функционирование тиоредоксина в качестве естественного восстановителя системе.

Установили, что а-РНРаза, как и AdoCbI-зависимый фермент Cor* варианта, является растворимым в цитоплазме белком, но ~ 20% ее активности ассоиировано с ЦПМ. Связь с мембраной непрочная, по-видимому, временная пространствснно-фуюсцнональная, возникаюигая во время репликашш.

Фермент был выделен и частично очищен (в 826 раз по белку и в 36 раз по активности). Выделение и очистка а-РНРаш включала обработку экстрактов клеток сульфатом стрептомицина, фра кшгон крова нне белкового препарата с помощью

неколоночной хроматографии (batch-процедура) и хроматографию в линейном градиенте КС1 на колонке Mono Q в системе FPLC. На последнем этапе очистки терялась ббльшая часть активности, что происходило и с другими известными гетеродимерньшн РНРазамн. В процессе гель-фильтрашш, применяемой для оценки молекулярной массы в частично очищенном препарате, наблюдали диссоциацию фермента на субъединицы, близкие по размеру (90 - 100 кДа), но, предположительно, разные по строению.

AdoCbL мкМ

Рис 10, Зависимость начальной скорости реакции, катализируемой альтернативной РНРазой в бес клеточкой системе Р. freudenreichii, дефицитной по корриноидам (вариант С от"), от концентрации AdoCbl

Примечание: культура росла 72 ч на очищенной от ионов кобальта глюкозо-минеральной среде, обогащенной тритоном (0,05%). Остаточное содержание горриноидов — 1 мхгг1 ЛСБ. Реакционная смесь содержала: 70 мМ трис-НС1 буфер (рН 8,0); АДФ - 2,5 мМ; ДІ Ї - 30 мМ; диализованный экстракт клеток (800 мкг, по белку). Объем - 200 мкл. Инкубирование - 40 мин при 37°С.

Двухкоыпонекткое строение n-РНРазы подтверждено целенаправленным разделением фермента с помощью ступенчатой хроматографии на колонке Mono Q

її реконструкцией холофер мента в результате соединения двух белковых частей, которые порознь активны не были. В результате исследования влияния ионов металлов: Мп1*, Ре**, Гс'4 и Со;\ на активность РНРазы в частично очищенном препарате, который был предварительно мягко, путём диализа, обработан 1 мМ ЭДТА, показали, что специфическим металлом, абсолютно необходимым для активности а-РНРазы является марганец (рис. 11). Ионы магния, в меньшей степени активируя фермент, участвуют, по-видимому, в ассоциации субъсдиннц.

р.

Рис. 11. Отдельное и совместное влияние ионов марганца и магния на активность альтернативной РНРаш из Сог" клеток !'■ /ггшкппчсіііі

Обозначение. (1) - контриль (до ін'раОоїки Г>ДТЛ). (2 - 7) - после обработки ЭДТА; (3) + Мц. 0.4 мМ; (4) + М(£. 2,0 мМ, (5) + Мп, 0,2 мМ; (Г>) + Мп, 0,2 мМ + М(!, 0,4 мМ; (7) ->-Мп,0,2 мМ + 2,0 мМ.

Примечание; условия опыт см, табл. 6. Здесь восстановитель - ДГГ; концентрацию маиіия пзрьнровалп.

В 200 мкл реакционной смеси - 120 місі ігреіираіа і|*грмекта (СО мм)

Представленные результаты, в их совокупности, свидетельствуют о функішонировании в клетках Р. /гешкпгеїсЬіі, практически не синтезирую шей кобаламин, альтернативной (независимой от него) РНРазы, представляющей собой металл »содержащий (по данным ингибиторного анализа с ГМ>. зависимый от Мп и

Ог гетеродимсрныи фермент. Принимая во внимание биологическую роль РНРазы, заключили, что это и является основной причиной продолжающегося синтеза ДНК при дефнціпе корриноидов. Присутствие в клетках одного и того же организма двух и более типов РНРаз било подтверждено на примерах Е. соїі (Ропієсзус сі аі., 1989; КсісЬагі 1993). Рісшіотопж $рр. (.Іопіап « аі, 1999) и других бактерий (Ма$а1Ііа еі аі, 2001; Вогоуок сі 8І., 2002).

5, Регуляция ь-обал амином системы рибоиуюеогкаредуктазы Р. /геиііепгеіскй. Потенциальная способность бактерии, которая неходко практически не еннтезіфует коррннощы (вариант Сог") и развивается на обогащенной среде, к биосинтезу и использованию в метаболизме корриноидов в больших количествах сохраняется. Она реализуется в присутствии соли кобальта (1—3 мг.л'') за период (12 -16 часов), что не превышает времени удвоения массы клеток. Вероятно, под действием кобальта, вызывающего биосинтез корринондов в клетках, происходит обратная перестройка метаболизма бактерии на уровне экспрессии генов.

В клетках бактерии, практически не содержащих СЫ (вариант Сог"), отсутствует активность ЛйоСЬІ-завнснмоіі РНРазы, нспользуюшей восстановленный глуташон в бес клеточной системе. Введение Л<1оСЫ в растущую (на обогащенной тритоном среде) культуру приводило к появлению в клетках (за период, примерно в 4 раза меньший времени удвоения биомассы) активности АйоСЫ-зависимой РНРазы со всеми, присущими ей функциональными свойствами Хлорамфеникол препятствовал этому (рис. 12), что указывает на ей формирование пол действием ЛйоСЫ на уровне биосинтеза белка.

Таким образом, СЫ выступает в роли регулятора (фактора перестройки) системы рибонуклеошдредуктаз. Он оказывает регуляторное воздействие и на активность альтернативных ферментов (поеттранедшионная регуляция). Возможные состояния альтернативных РНРаз в клетках Р. /гешкпгеісШі обсуждены в диссертации,

6. Практически значимые аспекты работы. Среди классических (молочных) ПКБ Р. /геиііепгеісШі наиболее значима. Две главные области сС применения — производство витамина Ві2 и производство сыров «твёрдых» сортов.

Рекомендовано (Иу£кко%3, 2001) при еоідатш рскомбинантных штаммов Р. /геиііепгеІсМ культивировать бактерию, добиваясь высокого уровня образования

120

А Б

Рис. 12. Появление активности AdoCbI-зависимоіі рнбонуклеотилредукташ в Cor" клетках под действием аденознякобаламииа

ООоэначешы: | j Cor" (содержание коррішонлок < 2 мкг.г'1 ЛСБ)

Ц^Ц Счг " + AdoCbl, 10 місМ (пнелен т vitro)

f.""'"} Cor" + AdoCbl (поеден т wo, Л - 0.3; 11 - 3.0 мг. л"')

Примечание: AdoCb] іш AdoCbl + хлорам^нимм доГмшсш^ и 68 ч культуру, Аналіп проведе її через 5 ч пролил * ак>шеі культивирования. Ус,іі>шія реакции см n tiifvi З, Здесь в качестве иоестз новії геля использован восстj ношенный і,туга t ион.

коррнноидов или дополняя культуру кобаламином, что обусловливает эффективный синтез и высокое содержание ДНК в клетках Р. /тиЖпгекки Впервые была предложена (совместная работа с сотрудниками ГНИ И Хлебопекарной промышленности РАСХН) для применения в хлебопечении в составе закваски для теста с целью улучшения органолептнческлч свойств хлеба, обо гашения его

биологически активными веществами и шипы от «карательной болешн« (авторски г свидетельства ю изобретения; S: 1439766, приоритет от 5 s и вар ¡i 1УН7 г. и 1МШ4У, приоритет 01 29 сентября 19SS г.). В современных ппшевыл и сельскохозяйственных био1С\нология\ актуально и перспективно причеигние r качестве аншеелтика иропионсвой кислоты микроб ною происхождеиия Основным действующим началом является аннон кнелош (Glat/. 1992).

Рис. 13. Микрофотография поверхности гранулы 1с.и, в порд\ которого локализованы им мобилизованные клетки /'. frcttdenriichn

Ск.1![|г,1\ю[:1иЙтлектрс>нныЯмикроскоп Увеличение 12000\

Препятствиями для повышения вц\ода иропноната в любом из способов, основанных но периодическом культивировании ПКБ, являлось ингибнрование ферментации конечными продуктами (пропионовой и уксусной киглотамн) и неэкономичность выделения кислот из разбавленных растворов Предложенное нами изобретение (авторское с в идет ел ьС1 в о. Л"» 052214, приоритет oi 2 августа 1977 г.) отличалось принципиальной новизной и повышенной эффективностью. впервые применили биокага.ишюр на основе иммобилизованных клеток (ИК) /'. freuJcnrachtK что было одним m первых примеров чноюстали иного (нолиферчешною) прочее са. осуществляемою бактериальными клезкачи в

иммобилизованном состоянии (рис. !3) в протоке или в реакторе с заменой раствора. Впервые была применена периодическая экспозиция ИК в питательной среде для стабилизации работы биокатализатора во времени (Иордан и др„ 1979). ИК ПКБ были предложены для получения свободных нуклеотндоа (Иконников и др.. 1982), улучшающих вкусовые свойства пищевых продуктов, которые активно выделяются голодающими клетками бактерий. Разработан способ получения индивидуальных 2-дезоксирнбонуклеознд-5-лифосфатов путем одностадийной трансформации соответствующих р ибо нуклеотндоа. Биокатализатор представляет собой AdoCbl-зависимую РНРазу, которая локализована в псрмсабнлизованных (тритоном Х-100) клетках Р. freudenreichti и функционирует в соответствую шей реакционной смеси (патент РФ, № 2077589, приоритет от 9 апреля 1993 г.).

Заключение

В результате проведённой работы сформировалось новое представление о роли кобальта и коррннондов в жизнедеятельности Р. frcudenrcichii, представляющей научный интерес (прежде всего как организм, образующий в норме большие количества эндогенных коррннондов) и имеющей практическое значение.

Кобальт - редкий элемент, встречающийся в земной коре примерно в ИНЮ раз реже, чем железо. В живой природе кобальт действует преимущественно как центральный атом комплексных соединений группы витамина В1; (коррннондов), древнейших полифункцнональных бно катализаторов и метаболитов. Мы установим*, что ионы кобальта существенны для развития Р. frci/Jenrcichii; причем концентрационная зависимость роста микроорганизма прослежена впервые. Показано, что физиологические функции ионов кобальта реализуются через корринокоы, которые в определённых, «жестких» условиях существования необходимы бактерии в больших количествах. Прокариоты с повышенной потребностью в ионах кобальта известны; они являются анаэробами пли мнкроаэрофнлами. (Klicwet, Evans, 1963; Cowlcs et al., 1969; Fogg et al., 1973; Beck. 1982; Кшпаг et al., 1987; Florencio et al,, 1994). Способность Р. fretuienretchtí к интенсивному образованию соединений группы витамина Ви не является уникальной; значительно более продуктивны по кобамидам (гомо)анетогенные бактерии и архен-метаногены. В силу множественности метаболических функций

коррннондов у прокариот (Рыжкова, 2003) невозможно, видимо, дать универсальное объяснение этому, однако настоящая работа на примере пропноновокнелой бактерии акцентирует внимание на значении нскоферментных функций вшам к на В,; в активном (первичном) метаболизме.

Научные предпосылки и полученные экспериментальные данные позволили впервые рассматривать корриноиды как факторы, способствующие аэротолерантности P. freudcnreichii и требующиеся для этой функции в высоких внутриклеточных концентрациях. Высокому естественному уровню образования коррннондов сопутствует также устойчивость бактерии к летальному действию ультрафиолетового излучения, что в целом отражает эффективность метаболизма Р. fretuienrcichii, активно синтезирующем кобам иды. Вместе с тем известные ранее кобамндные ферменты Р, fretidenreichti сохраняют свою активность при снижении уровня коррннондов в клетках на порядок (четноннненнтазная реакции) или на два порядка (изомеризация сукцнннл-КоА в метилмалонил-КоА - ключевая реакгои ПКБ). В метаболизме P. freudenreichii нами открыты две неизвестные ранее биохимические реакции, протекающие при участии кобам!иов. Впервые показано трансметклированис ДНК, зависимое от МеСЫ как донора мстильных групп (Tordan ct al., 1979; Антошкина и др., 1979), что подтверждено позже на препаратах из клеток животных (Ph ohl-LeSiko wicz a al.. 1991), Обнаружено требую шее AdoCbl превращение рибонуклеотида в дезокенрнбонуклеотид (Иордан и др.. 1975; Иордан, Пстухова, 1989) - реакция, описанная ранее для L. Uichmanii, Л. mehlori и F.utfenct gracilis (Blaklcy. Barker, 1964; Blakley ct al„ 1965; Cowles, Evans, 1968; Hamilton, Blaklcy, 1969). Изучение свойств AdoCbl* зависимой РНРазы P. freudcnreichii показало, что AdoCbl действует как кофермент, но при этом регулирует активность фермента.

Впервые установлено, что кобаламин может быть прямо и специфически вовлечен в процесс образования ДНК у прокариот (Иордан и др., 1987; Иордан. 1992; Иордан, Прянишникова. 1994), Представлены экспериментальные данные и предложено объяснение необходимости высокого содержания коррннондов в клетках Р, freudcnreichii для эффективного образования ДНК. Основной «мишенью» служ!гг AdoCbl-шв не и мая РНРаза. которая имеет слабую связь с AdoCbl и, видимо, подобно другой AdoCbl-зависимой элиминазе (диолдегидратазе) нуждается в пуле

AdoCb) в клетках лая реконструкции холофермента. Активные центры этих і{>ерментов имею г генленцию к самок пакти виро ванн ю в процессе катализа (Mori ct al„ 1997; Licht ct а!.. 19%: Stubbe ct al., 1998; 2001). Нами покатано, что фермент лаже в норме (при высоком уровне образования корринондов) метаболически лимитирован по кобаламину, вероятно, вследствие особенностей регуляшш биосинтеза корринондов у бактерии (Быховскни, 1979; Bykhovsky et al., 1997). Вместе с тем мы пришли к заключению, что метаболизм бактерии не «настроен» исключительно на высокий уровень образования кобамидов, ибо P. fremlenreichii способна активно развиваться при их 100- и 1000-кратном дефиците в клетках, но 'при этом изменяются её ростовые потребности н другие физиологические свойства.

Впервые было показано, что в клетках одного организма могу г функционировать рибонукдеотидредуктазы разных типов (Иордан и др., 1975; Иордан и др.. 1986; Иордан, Пстухова. 1989; Jordan. 1995; Ionian, Petukhova, 1995; Иордан и лр„ 2000; Ryzhkova (Ionian), 2001], поэтому тип РНРазы, определяемый природой кофермекта и строением активного центра, не может быть использован в качестве филогенетического признака, как полагали ранее (Auling, Foil тали. 1994)

В результате идентификации генов двух и даже трех типов РНРаз в геноме одного н того же микроорганизма ранее установленный нами факт был подтвержден другими исследователями (Jordan ct al„ 1999; Masalha a al„ 2001; Borovok ct al., 2002). но первое подтверждение появилось в конце 80-х годов, когда обнаружили вторую («анаэробную») РНРазу у Я coh (Barlow, 1988; Foniecavc ct al., 1989).

Исходя кз известкой критической роли РНРазы в анаболизме ДНК функционированием альтернативной РНРазы, зависимой от марганца и молекулярного кислорода, мы объяснили способность P. freiuknreichii осуществлять биосинтез ДНК и развиваться практически в отсутствие коболами на в клетках (Иордан и др.. 2000). По нашим предварительным данным у бактерии, практически не синтезирующей кобаламин, функционируют и другие ферменты, альтернативные кобам и деодежа шлм, например, независимая от СЫ метнонинсинтаза, обеспечивающая тимидилатсинтазную реакцию свободным ТГФ, и метилтрансфераза, катализирующая метилирование ДНК от S-AdoMct как субстрата.

Обусловленные нонами кобальта (кобалзмнном) обратимые физиологические состояния бактерии, перестройка системы РНРаз, изменения характера пропионовокнслого брожения и анаболизма ДНК позволяют рассматривать витамин Bi: как фактор, определяющий пластичность обмена веществ (адзитивиость) Р. freudenreiche.

Некоторые из особенностей физиологии (метаболизма) бактерии, выявленные в настоящей работе, имеют практическое значение, например, ф изиологический контроль интенсивности репликации и содержания ДНК в клетках бактерии С помоигью кобаламина или возможность поддержания заданного содержания (витамина В1;) в пищевом продукте. Предложены изобретения, в которых препараты клеток и ферментов Р. freudenreichii представляют собой оригинальные бнокаталнзаторы для получения практически значимых метаболитов.

Выводы

1). Впервые наблюдали, что Р. freudenreichii использует ионы кобальта для развития и выживания в «жестких» условиях, а именно при воздействии стрессорны\ факторов среды. Высокое содержание внутриклеточных корриноидов. уровень образования которых определяет концентрация ионов кобальта в среде, существенно для поддержания аэроталерантностн бактерии и ей устойчивости к летальному действию ультрафиолетовой радиации.

2). В метаболизме /'. freudenreichii обнаружили две биохимические реакции, протекающие при участии кобаламина: трансм етн лирован не ДНК (от метилкобаламина как донора метальных групп) и превращение рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды. Эти реакции происходят в полноценных по содержанию корриноидов клетках бактерии. Основной энергетический процесс — пропноновокислое брожение, сохраняет свою интенсивность при 1 ОИ-кратном дефиците корриноидов в клетках; для нормального биосинтеза метнонина достаточно десятой доли суммарных корриноидов,

3). На примере Р. freudenreichii впервые показано, что прокариотическнн организм может синтезировать ДНК альтернативно* с участием и без участия кобаламина. Наиболее эффективно образование ДНК происходит в полноценных по содержанию

витамина Bi; клетках. При его дефиците ноны марганца н кислород стимулируют процесс, а экшгснный кобаламнк действует как ингибитор,

4). Выяснили, что первой и основной -«мишенью» положительного воздействия кобаламина на биосинтез ДНК является зависимая от аде нози л кобаламина рнбонуклеотидредуктаза, которая в норме (при высоком уровне образованна корринондов) метаболически лимитирована по кобаламину.

5). Впервые показали функшюнированне двух типов рибонуклеотилредуктаз у одного организма: зависимом и независимой ог аденозид кобалам и на. Независимый от кобаламина фермент обеспечивает Олосинтсз ДНК Р. frcv<knre>chii при дефиците корринондов в клетках.

6). Констатировали, что Р. freudenreiche способна активно развиваться без добавления в среду ионов кобальта, когда уровень образования витамина В]; снижен (по сравнению с исходным, физиологически значимым) на два порядка и более, при этом она испытывает новые ростовые потребности и перестраивает метаболизм. Перестройка ноент обратимый характер.

7). Результаты, полученные в работе, реализованы в предложенных способах получения прогшонатов и дезокскрибону клеотидов, а также внедрены в хлебопекарной промышленности в виде новой закваски для приготовления теста (на основе P.freuJenreichn), улучшающей качество хлеба.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ и ИЗОБРЕТЕНИЙ Обзорные статьи:

1. Иордан Е,И. Рибону клеотидредуктаза микроорганизмов и участие витамина Bt; в образовании дсзоксирибонуклеотидов. Уеп. микробиол. 19X2, № 17. С. 20-41.

2. Иордан Е.П. Витамин В|: в синтезе ДНК у микроорганизмов. Усп, совр.биол, 1990. Т. 110. № 1(4). С. 79-90.

3. Рыжкова (Иордан) Е.П. Множественные функции корринондов в биологии прокариотических организмов. Прикл. биох. и микробиол. 2003. Т.39, № 2. С. 133159.

Экспериментальные работы;

4. Машур В.А., Иордан Е.П., Воробьева Л И. Брожение, вызываемое мутантом прогаюновокислых бактерий, не образующих кофермент В1;. Прикл. биох. и микробиол. 1971. Т. 7. Кг 5. С. 552-555.

5. Машур В.А.. Иордан Е.П. О роли витамина В1; в обмене вешеего пропноновокислых бактерий. Вестник Московского университета. (Биология, Почвоведение), 1972. „Vi 2. С. 107-109,

6. Воробьева Л.И,, Иордан Е.П. Роль витамина Вц в обмене веществ пропионовокислых бактерий. Научн, докл. высш. шк. Биол, h.ivkii. 1973. Л">> 7, С, 9499.

7. Иордан Е.П., Воробьева Л.И,, Гайтан В.И. О влиянии витамина В^ на уровень сульфтнлрильных групп и активность некоторых легндрогеназ в клетках Propiombactenum shemanil. Микробиология, 1974. Т. 43. №4. С. 596-599,

8. Иордан Е.П., Воробьева Л.И., Ґаігган В. И. Рибону клеотлдреду ктаза Propiombactenum shermanit. Микробиология. 1975. Т, 44. №4, С. 609-614,

9. Иордан Б.П., Лнтошкина Н,В. О роли витамина В]; в обмене веществ пропионовокислых бактерий. Труды 1-й Республиканской конференции молодых ученых. 1976. Ташкент: Узб. АН, 1976.

10. Иордан Е.И. О роли витамина В1: в обмене веществ Propiombactenum shermanit. Автореферат диссертации на соиеканнс ученой степени кандидата биологических наук. М.: МГУ, 1976,

П. Воробьева Л.И., Иордан Е.П. Функции кобамндных кофер ментон в метаболизме пропионовокислых бактерий (обзорная статья). Респ. межведомств. сб. «Витамины», Киев: Наукова Ду мка, АН УССР, 1976. У* 9. С. 16-20. 11 Воробьева Л,И., Иордан Е.П., Гайтан В.И. Способ полученіи пропионовой кислоты. Авторское свидетельство №652214 от 21 ноября 1978 г. Приоритет от 2 августа 1977 г,

13. Антош кипа Н.В., Иордан Є.П. О возможной роли корриноидов в метилировании ДНК пропионовокислых бактерий. Труды 7-й Республиканской конференции молодых ученых. 1977. Рига: АН Лате, ССР, 1977,

14. Лнтошкина Н.В, Иордан Е.П. Об участии метнлкобаламнна в метилировании ДНК пропноновокнелой бактерии. Труды 2-й Республиканской конференции молодых ученых, 1978. Ташкент: АН Уз.ССР, 1978.

15. Лнтошкина Н.В., Иордан Е.П., Воробьева Л.И, Определение активности рибонуклеоіилредуктазы методом тонкослойной хроматографии на ЭКТЕОЛА-иеллюлозс. Прнкл. биох. и микробиол. 1978. Т, 14. Хї 2. С. 295-299.

16. Лнтошкина Н.В., Воробьева Л.И., Иордан Е.П. Участие метнлкобаламнна в метилировании ДНК Propiombactemtm ihermanti. Микробиология. 1979. Т.48. № 2. С. 217-220.

17. Jordan Е.Р., Antoshkina N,V„ Vorobjcva L I. The participation of coca/yme Bi: in ihe synthesis of DNA by Propiombactenum ihermanti. Proceedings of the Third European Symposium on Vitamin Bi2 and Intritvsie factor. 1979, Zurich (Switzerland), In: "Vitamin B);", B. Zagalak and W. Fricdrich (cds). Berlin - N.Y.: Walter dc Gruytcr and Co., 1979. P. 1(195-1099,

18. Jordan E.P., Antoshkina N.V., Vorobjcva L.I. The participation of coenzyme Bi- in the synthesis of DNA by Propiombactenum shermanii. Abstracts. The Program of Third European Symposium on Vitamin Bt> and Intrinsic factor. 1979. Zurich: Chemisette Rundschau. 1979. №9. S 3.

19. Иордан Е.П.. Иконников Н.П., Коврижных B.A., Воробьева Л.И. Образование органических кислот иммобилизованными пропионовокислымн бактериями в проточной системе н возможность стабилизации процесса. Прнкл. биохим, и микробиол. 1979. Т. 15. №4. С. 515-521.

20. Иордан Е.П., Воробьева Л.И. О локализации витамин Вц-іависнмой рибонукдеотидредуктазы в клетках Propiombactenum shermanit. Микробиология, 1981. Т. 50. № 4. С, 736-738.

11. Иконников Н.П,, Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Выделение нуклеотндов и нч производных иммобилизованными клетками Propiombuctcrtum shermitnu. Прнкл. био.ч. и микроб иол, 19К2. Т. 18. № 1. С. 34-40.

22. Jordan Е.Р., Vorobjeva L.I. Vitamin Bl; as a regulatory' factor in some anabolic reactions in the propionic acid bactcria. Abstracts. EEMS International Symposium 'Environmental regulation of microbial metabolism". 1983, Puschino (USSR). Nviuhho: ОНТИ НЦБИ, 1983,

13ч Иордан Е.П., Новожилова Т.Ю., Воробьева Jl.И. Синтез ДНК в связи с различным содержанием витамина В1: в клетка.ч Propionibacterium shermanii. Микробиология. 1983. Т. 52. Л1> 4. С. 591-596.

24. Иордан Е.П.. Новожилова Т. К).. Воробьева Л.И. Влияние уровня образования витамина BtI в клетках на рост и некоторые стороны конструктивного метаболизма Propionibactcnum freuJenreichii subsp. shermartii. Прнкл. биох. и мнкробиол. 1984. Т. 20. «V» 6. С, 763-772.

25. Иордан Е.П.. Воробьева Л.И. Новые данные о роли коррнноидов в анаболических реакциях прол ионов окислы х бактерии. Труды 7-го Съезда Всссоюзн, мнкробиол. общества. 1985. Алма-ата: АН Казах. ССР. 1985.

26. Vorobjeva L.I., Jordan (lordan) Е.Р., Petukhova N.I. Regulation of DNA synthesis and of B];-dependcnt ribonucleotide reductase in propionic acid bactcria. Proceedings of the Sixth International Symposium on Actinomvcctes Biology. Debrecen (Hungarv), 1985, P. 429.

27. Vorobjeva L.I., Jordan (lordan) E.P. Vitamin B^ in the integration of the metabolic functions of the propionic acid bactcria. Proceedings of the 14-th International Congress оГ Microbiology, September 7-13. 1986, Manchester (G. В.). Manchester: International Union of Microbiological Societies, 1986,

2Я. Иордан Е.П.. Петухова Н,И„ Воробьева Л.И. Регулятор кое воздействие витамина Вц на р ибонуклеотнлредукгазную систему лропионовокислых бактерии. Микробиология. 1986, Т. 55. С, 533-538.

29. Петухова Н.И., Иордан E.I1., Воробьева Л.И. Прои и он овоки сл ые бактерии как источник р ибону клеотнлреду ктазы, активируемой витамином Вц. Труды 3-й Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами". 1986. Кобулети. Пушино: ОНТИ. НЦБИ, 1986. С. 169.

3D. Иордан Е.П., Петухова Н.И.. Воробьева Л. И. Влияние производных кобаламина на синтез ДНК в клетках Proptonubactcrmm freudenrciclut subip. bhermami. Научн, докл. высш. шк. Биол, науки, 1987, .4? 1. С. 5-10,

31. Воробьева Л.И., Наумова Е.С., Бурдыгина Г.И., Иордан Е.П.. Симоновская Л.С. Антисептическая защита фильмовых материалов при хранении. Биотехнология.

1987. № 5. С. 74-76.

32. Воробьева Л.И., Наумова Е.С.. Иордан Е.П.. Бурдыгина Г, И. Микроорганизмы, вызывающие коррозию фильмовых материалов. Биотехнология.

1988. № 4. С. 73-76.

33. Богатырёва Т.Г.. Иордан Е.П.. Сафроиова Л.В., Воробьева Л.И. Полакдова РД„ Быстрова АН,. Ольсинская Н,Л. Способ производства хлеба. Авт. евнд, № 1439766 от 22 июля 1988 г. ДСП. Приоритет от 5 января 1987 г.

34. Богатырева Т.Г., Иордан Е.П, Инструкция по применению пропионовокислой закваски. Для предприятий хлебопекарной отрасли. М„ 1988. С. 1-5.

35. Норлан Е.П., Петухова Н.И. Перестройка рибонухлеотилредуктазной системы гтропноновокнслых бактерий при подавлении образования витамина В1г. Микробиология. 1989. Т. 5».»С. 533-538.

36. Иордан Е.П., Овчинников Л.Ю. Витамин В]; лимитирует синтез ДНК у пропионовокислых бактерий. Труды Всесоюзной конференции «Лимитирование и ингнбирование роста микроорганизмов. 1989. Пущкно: ОНТИ, НЦБИ, 1989, С. 39.

37. Иордан Е.П., Бриллиантова P.O., Колмакова Н.Г., Овчинников Л.Ю., Петухов» Н.И. Зависимость синтеза ДНК от витамина В]2 у бактерий рода Propiombactenum. Вестник Московского Университета. Сер. 16. Биология, 1990. ЛV 4. С. 47-52.

38. Богатырёва Т.Г., Иордан Е.П., Быстрова ЛИ.. Воробьёва Л.И., Поландова Р.Д., Дик Э.С., Нефёдова В.М, Способ предотвращения заболевания хлеба картофельной болезнью. Авт. свид. Hi 160ЙК49 от 22 июня 1990 г. Приор, от 29 сентября 1988 г.

39. Vorobjeva L.I., Jordan Е.Р., Petukhova NM, New functions of vitamin Bt;. Proceedings of the First Internationa] Congress on Vitamins and Biofactors in Life Science. 1CVB Symposium: Vitamin Bl: challenges for the future. 1991. Kobe (Japan): International Conference Center* 1991.2P-72,

40. Иордан E.II. Модуляция в образовании ДНК Proptontbacteritim freudenreichii subsp. shcrmami при лимитировании по коррииоидам. МикроСиология, 1992. Т. 61, №3, С. 341-346.

41. Иордан Е.П., Прянишникова Н.И. Способ получения дезоксирибонуклеотидов. Патент .Ms 2077589 РФ. Зарегистрирован 20 апреля 1997 г. Приоритет изобретения 9 апреля 1993 г.

42. Богатырева Т. Г., Прянишникова Н,И, Иордан Е.П. Исследование протсоднтической активности молочнокислых, пропионовокнелых бактерий и дрожжей, применяемых в хлебопечении. Биотехнология и vправление. 1994. № 1(4), С. 40-43.

43. Иордан Е.П., Прянишникова Н.И. Интенсификация синтеза ДНК в клетках Propionibocierium freudenreichii subsp, s hermanii под действием 5,6-диметилбекзимидазолл. Прикл. биок. и микробиол. 1994. Т. 30. J6 1. С. 137-142,

44. Иордан Е.П., Прянишникова Н.И. Превращение рибонуклеотида в 2-дезокенрнбонуклеотнд пермеабилизова иными клетка»! и пропионовокислых бактерий. Прикл. биох. и микробиол. 1994. Т. 30. Jfo 3, С. 396-402.

45. lordan Е.Р. Different hydrogen donors in alternative ribonucleotide reductase systems of Pmpionibactenum freudenreichii. Proceedings of the 4-th International Conference "Thioredoxins and related proteins". 1995. Whitzcnhauscn-Kassel (Germany); Univ. Kassel, 1995. P. 42.

44. lordan E.P., Petukhova N.I. Presence of oxygen-consunung ribonucleotide reductase in corrinoid-deficicnt Propionibactenum freudenreihii. Arch. Microbiol. 1995. V. 164. P. 377-381.

47. Прянишникова Н.И., Иордан Е.П. Зависимый от витамина В!: синтез ДИК у стреггтомниетов. Микробиология. 1998. Т. 67. „V® 1. С, 26-29,

48. Иордан Е.П., Брюханов А.Л., Дунаевский Я.Е., Прянишникова Н.И., Данилова И. В. Зависимая от марганца рибонуклеотндредукпш Propiontbucierium freudenreichii subsp. shermanii: частичная очистка, характеристика и роль в биосинтезе ДНК. Микробиология. 2000. Т. 69. №4. С. 471-477.

49. Jordan tP„ Danilova I.V. Ribonucleotide reductases of I'rupiomhacterium freudenretchit and of some streptomycctcs, Proceedings of the 5-th International Confcrcncc "Thioredoxins and related proteins". 2000, Smolenicc - Bratislava (Slovak Republic): Univ. Bratislava. 2000. P. 36.

50. Ry/Jikova (lordatt) H P. Alternative of physiological and metabolic states of the strain ¡'ropiombaclenum freudenretchit ssp shermtmu (VKM-103) in connection with corrinoid fonri at ion. Proceedings of the 3-rd International Symposium on Propionibacteria. 2001, Zurich: Swiss Federal Institute of Technologv Zurich (ETH). 2001. P, 14,

51. Данилова И.В. Доронина Н.В., Троиенко Ю.А., Нетрусов А.И.. Рыжкова (Иордан) Е.П, Участие витамина В!; в биоеннтезе ДНК Methvlobactenvm dicltloromethantcum, зависимое от интенсивности аэрации. Микробиология, 2003 (в печати)

Список сокращений

АСБ - абамкгшо сухая биомасса БЛ = блеомкиин

ВФ = «внутренний ф>кт«рт (IF, intrinsic factor)

ВЭЖХ = высокоэффективна« жил Костная хроматографии

5,6-ДМБ - 5,б-лимегалбсти мидам. i

ДТТ =■ ДНГИОТреи ПЫ

ДФА - дифениламин

Гл-SH = восста ноплеи и ы ft глутатион

ГМ = гидроксн мочевин а

И К ™ п «мобилизованные mi ni

МСаза и четной и шеи it i~a:*a

МТР * четилтрансфераза

НК= нуклеиновые кислоты

ПБ - ||р»||НП||ОПОК>1СЛое брожение

ПК - нроннононая кислота

ПКБ4 пропноношншелые бактерии

ПХМБ - парахлормеркурннбензоа i

РНРаэа " рнбоиу^оеотидредуктам

СОД - суперокендлисмуташ

ТГФ - теграгидрофолиевая кислота (Tprpai идрофа |ат) УФ- ультрафщинишк излучение

Факюр В = кобпнамнл (кчЛамилбм а-.ш га та атма коПшьп)

ФА ОЗ = фе рмогты, участвующие п антяок-пелитльной защнге клетки

ЦПМ = нитоплазмятпческаи мембрана

ЭПРа амкциишый napiMimitrnuil peimiatic

ЭТЦ = элск-трон-фа нспоргная пень

AdoCha ааснознлкобамкд

AdoCN =■ аленлзил кобола мни

СЬ" кобамнды (амнлнроваявые корриноиды, соединении группы нищий па Бц) СЫ-кобннамил, фактор В

СЫ ■ кобаламнп (кч^имнд с основанием 5,6-ДМl>, ucniiinuit itirritMiiti Bit)

CN-СЫ - una вокобал амин

Cr\= гдутаредокси н

MeChl*- метил кобала чин

м*А = б-мстлладеннн

м'С - S-MriMjiitifrotiiH

МеТГФ » М'-чет илтетрагнлрнфнла г

Тп - гноредоксин

$-AdoMet " S-а.тнии. imp i ипини • • •

iff 1 б 3 2 О

Подписано в печать 06.10.2003 г. Автореферат содержит не более двух печатных листов. Отпечатано в копиценгре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: 2akaz@stprint.ru. тел 939-3338 Заказ Кг 399 тираж 6S экз.