Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами

Ясная, Анна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами"

ии3492596

На правах рукописи

/н>

ЯСНАЯ Анна Сергеевна

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В Е.соИ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТНЫХ ФОРМ С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ

03.00.23 - биотехнология 02.00.15 - катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003492596

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и в лаборатории молекулярной инженерии Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН.

Научный руководитель:

профессор, доктор химических наук Тишков Владимир Иванович профессор, доктор химических наук Швядас Витаутас-Юозапас Каятоно

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович профессор, доктор биологических наук Яненко Александр Степанович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится "15" декабря 2009 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан

И.о. ученого секретаря Диссертационного совета, доктор химических наук

_" ноября 2009 г.

А.В.Гусаков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (КФ 3.5.1.11, ПА) относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз и впервые была открыта как катализатор гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда. ПА обнаружены в бактериях, дрожжах и низших грибах. Физиологическая роль фермента до конца не ясна. По-видимому, он служит для утилизации гетероциклических соединений в качестве источника углерода. На практике ПА применяется как для получения 6-аминопенициллановой кислоты - основного синтона для полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда, так и в самих процессах синтеза этих антибиотиков. Кроме того, ПА также применяется для кинетического разделения рацемических смесей с последующим использованием полученных оптически активных веществ в фармацевтической промышленности, для защиты гидроксильных и аминогрупп в пептидном синтезе и тонком органическом синтезе.

ПА изучается уже более 40 лет. По типу гидролизуемого субстрата ПА делят на 3 класса: ферменты класса I осуществляют предпочтительный гидролиз пенициллина V, а классов II и III - пенициллина G и ампициллина соответственно. Класс II, в свою очередь, делится на два подкласса: На и Мб. Относящиеся к ним ПА гидролизуют ароматические и алифатические амиды, соответственно. Для двух пенициллинацилаз G (класс Па) известны трехмерные структуры, в том числе, для фермента из E.coli (ЕсПА"). Исторически так сложилось, что именно ЕсПА является наиболее изученной и широко используемой на практике. Однако данный фермент обладает рядом недостатков. В первую очередь это связано с тем, что фермент в ходе эволюции был оптимизирован под природные субстраты, в то время как для получения полусинтетических антибиотиков необходима высокая активность с неприродными аналогами. В случае кинетического разделения рацематов структура многих перспективных соединений также очень далека от природных. Поэтому для разработки новых процессов биокаталитического получения различных соединений с помощью ПА необходимо «оптимизировать» свойства фермента под каждый конкретный процесс. В первую очередь необходимо улучшение кинетических параметров фермента по отношению к некоторым субстратам, как для синтеза антибиотиков, так и для получения оптически-активных соединений. Наличие трехмерной структуры различных вариантов ЕсПА дикого типа и ее мутантов позволяет использовать для этой цели метод «рационального дизайна», основанный на введении в структуру фермента направленных аминокислотных замен, выбор которых осуществляется именно на основе анализа «рентгеновской» или модельной структуры.

* В работе использовали следующие сокращения: ЕсПА и Л/ПА - пенициллинацилазы из бактерий Е.соН и Д./аеса/й соответственно, ИПТГ - изопропил-р-Р-тиогалактозид, ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид, 1М1РАВ - л-нитро-м-карбоксианилид фенилуксусной кислоты, МРСВ - л-нитро-м-карбоксианилид фенилглицина, МК- миндальная кислота.

Другим очень перспективным ферментом является пенициллинацилаза из грам-отрицательных бактерий Alcaligenes faecalis (ЛЯПА). Она обладает повышенной термостабильностью, и более широким pH-оптимумом активности, смещенным по сравнению с БсПА в щелочную область. AfïlA также имеет некоторые отличия в спектре субстратной специфичности. Из всех известных пенициллинацилаз G данный фермент обладает самой высокой специфичностью по отношению к бензилпенициллину, а его специфичность по отношению к амиду D-фенилглицина на порядок выше, чем у ПА из E.coli. Имеются данные, что пенициллинацилаза из A.faecalis обладает более высокими каталитическими характеристиками при кинетическом разрешении ряда оптических изомеров. Однако, систематических исследований по изучению механизма действия, структуры, стабильности фермента и его белковой инженерии не проводилось. Кроме того, очень актуальной является проблема создания отечественного штамма - продуцента рекомбинантной ПА из A.faecalis, поскольку все три известные на настоящий момент нуклеотидные и аминокислотные последовательности этого фермента запатентованы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было:

1. Клонирование гена ПА из E.coli, создание штамма-продуцента рекомбинантной ЕсПА.

2. Получение мутантных форм рекомбинантной ПА из E.coli с улучшенными каталитическими характеристиками для синтеза ампициллина и получения оптически-активных соединений.

3. Получение рекомбинантной ПА из бактерий Alcaligenes faecalis: клонирование гена, создание штамма-продуцента, оптимизация системы экспрессии, изучение каталитических свойств фермента и его термостабильности.

4. Моделирование структуры фермента m Alcaligenes faecalis.

Научная новизна. Впервые получены 13 мутантных форм E.coli (ЕсПА) с заменами в области субстрат-связывающего кармана и активного центра фермента. Показано, что введенные мутации по-разному влияют на каталитические параметры мутантов в реакциях синтеза ампициллина и реакциях стереоселективного гидролиза амидов.

Клонирован ген новой ПА из A.faecalis VKM-B1518 (Д/ПАЛ/КМ). Показано, что, несмотря на отличия в аминокислотной последовательности, клонированный фермент по своим кинетическим свойствам не отличается от ранее известных ЛЯПА. Нуклеотидная последовательность гена Д/ПА-\/КМ-В1518 аннотирована в базу данных GenBank под номером FJ042491.

Впервые для Л/ПА проведено систематическое исследование механизма термоинактивации. Показан мономолекулярный механизм и определены термодинамические активационные параметры процесса.

Построена компьютерная модель трехмерной структуры пенициллинацилазы из A.faecalis VKM-B1518. На основе полученной модельной структуры предложены варианты сшивок для получения пермутированного фермента.

Практическая значимость работы. Получены мутантные формы ЕсПА с улучшенными каталитическими характеристиками в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина и в реакциях стереоселективного синтеза/гидролиза амидов. Клонированный ген ЛЯПА является патентно чистым. На его основе создан штамм-продуцент рекомбинантного фермента. Оптимизированная система экспрессии рекомбинантной Л/ПА в клетках E.coli позволяет получать до 5000 Ед с литра среды. Построение модельной структуры Л/ПА создало основу для проведения экспериментов по его белковой инженерии.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих Международных и российских конференциях: 8-ой Европейский Симпозиум Белкового Общества (Цюрих, Швейцария, 2009), 4-й и 5-й Московский Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007 и 2009 гг.), Международная конференция «Биокатализ. Фундаментальные основы и применение» (Москва, Санкт-Петербург, 2007 и Архангельск, 2009), Международная конференция «Ломоносов - 2007 и 2009» (Москва, Россия, 2007 и 2009), III Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 1 статья в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, опубликованный на сайте ВАК РФ, и 8 тезисов докладов Международных и Российских конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их

обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на _

страницах печатного текста, содержит 52 рисунка, 24 таблицы и 135 ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Клонирование гена пенициллинацилазы из E.coli

Для проведения работ по белковой инженерии пенициллинацилазы необходимо было клонировать ген ЕсПА и создать эффективную систему экспрессии рекомбинантного фермента. Для клонирования гена ПА дикого типа был использован штамм E.coli (продуцент ПА) из коллекции штаммов Государственного научного центра по антибиотикам. Ген ЕсПА дикого типа получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя следующие праймеры :

PAC_For: 5'-cttccagaggatcatatgaaaaatagaaatcgtatgatc-3'; и

PAC_Rev: 5'-tgccgaattcaagcttatctctgaacgatagatcc-3'.

Жирным шрифтом выделены сайты рестрикции Ndel и EcoRI, введенные для удобства клонирования. Сайт рестрикции Ndel обеспечивает встраивание гена точно под стартовый ATG-кодон. При ПЦР на геномной ДНК с данной парой праймеров был получен продукт длиной около 2550 п.н., что соответствует по размеру гену белка-

предшественника ЕсПА. Полученный продукт был клонирован в экспрессионный вектор под контролем ¿ас-промотора по сайтам рестрикции Ndel и EcoRI. Нукпеотидная последовательность гена была определена секвенированием по обеим цепям. Последовательность клонированного гена полностью совпала с последовательностью ЕсПА из штамма E.coli АТСС 11105.

Гомологичная экспрессия гена пенициллинацилазы из E.coli. Предварительные эксперименты по экспрессии рекомбинантной ЕсПА в клетках E.coli показали, что выход активного фермента очень сильно зависит от температуры культивирования. При 37°С фермент преимущественно образуется в неактивной форме в виде телец включения. Оптимальной оказалась температура в интервале 15-17°С. Снижение температуры с 37°С до 15°С привело к увеличению выхода с 1 до 40 мг активного фермента с литра среды. Таким образом, нами была создана конструкция для получения рекомбинантной ЕсПА в активной и растворимой форме. Очистка фермента проводилась по стандартной методике (Alkema etal., 1999).

2. Получение мутантных форм ЕсПА и изучение их свойств.

Выбор аминокислотных замен был сделан на основе анализа структуры ЕсПА. Компьютерный анализ структуры и моделирование мутаций проводили в сотрудничестве с лабораторией ферментативных модификаций физиологически активных соединений отдела биокинетики НИИ Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова.

Направленный мутагенез проводили с помощью полимеразной цепной реакции. В качестве исходных матриц использовали гены фермента дикого типа ЕсПА-ДГ и двух полученных ранее мутантных форм ЕсПА - М1 и М2. Всего было получено 13 мутантов ЕсПА (Таблица 1).

Таблица 1.

Мутантные формы ЕсПА, полученные в данной работе.

Исходная форма фермента Конечная форма фермента Введенная замена

ЕсПА-ДГ ЕсПА-МЗ точечная замена

ЕсПА-ДГ ЕсПА-М4 точечная замена

ЕсПА-М1 ЕсГМ-М1-01 точечная замена

ЕсПА-Ш ЕсПА-Ш-02 точечная замена

ЕсПА-М1 ЕсПА-М 1-03 точечная замена

ЕсПА-Ш ЕсШ-М1-04 точечная замена

ЕсПА-М1 ЕсПА-Щ-05 точечная замена

ЕсПА-М1 ЕсПА-Ш-05 точечная замена

ЕсПА-Ш ЕсПА-М1-07 точечная замена

ЕсПА- М1-01 ЕсПА-М1-08 точечная замена

ЕСПА-М2 ЕсПА-М2-01 точечная замена

ЕсПА-Ш ЕСГМ-М2-02 точечная замена

ЕсПА-Ш ЕсПА-М2-03 точечная замена

Все введенные аминокислотные замены расположены в области субстрат-связывающего домена активного центра фермента.

Секвенирование полученных плазмид показало, что в гене ЕсПА содержатся только целевые мутации и лишь плазмида ЕсПА-М1-06 содержит побочную замену остатка аргинина Р325 на остаток цистеина.

Индивидуальная оптимизация условий культивирования для мутантов ЕсПА. Данные предварительных экспериментов показали, что методика, оптимизированная для культивирования фермента дикого типа, в случае мутантных ферментов приводит к очень низким выходам по активности. По этой причине пришлось подбирать оптимальные условия культивирования для каждой мутантной Ее ПА отдельно. Оптимизация проводилась по следующим параметрам: состав среды, содержание добавок, тип и концентрация индуктора, общая продолжительность культивирования. Температура, как и в случае фермента дикого типа, поддерживалась на уровне 15-17°С, поскольку ее повышение также приводило к образованию неактивного фермента в виде телец включения.

Время культивирования оказалось одним из важнейших параметров, влияющих на выход фермента. На рис. 1 представлена зависимость выхода активного фермента от времени культивирования при 15°С.

Рис. 1. Зависимость выхода активного фермента от времени культивирования для различных мутантных форм ЕсПА.

Из рисунка 1 хорошо видно, что в случае исходной формы фермента £сПА-М2 наблюдается максимум выхода через 50 часов после индукции и затем после 62 часов - незначительное падение активности. В то же время для новых мутантных ЕсПА наблюдается более резкий максимум в точке, соответствующей 50 часам. Исключение составляет мутант ЕсПА-М1-02, для которого после 40 часов наблюдается стабильный рост выхода фермента с увеличением времени культивирования, однако даже через 62 часа выход активного мутанта ЕсПА-М1-02 был минимум в 2 раза ниже, чем для других вариантов ЕсПА после 52 часов.

Тип и концентрация индуктора. В качестве индуктора ?ас-промотора были использованы изопропил-|3-0-тиогалактозид (ИПТГ) и лактоза (рис. 2).

Рис. 2. Влияние типа индуктора на выход активного фермента для некоторых мутантных форм.

Из графика хорошо видно, что в случае ИПТГ наблюдаются более высокие выходы по сравнению с лактозой. Поэтому он и был выбран в качестве индуктора для дальнейших экспериментов. Варьирование концентрации ИПТГ показало, что концентрация 0,1 мМ является оптимальной и ее повышение не приводит к увеличению уровня экспрессии.

Состав средь! для культивирования. Оказалось, что из трех рассмотренных вариантов наилучшие результаты показала среда YE (дрожжевой экстракт - ЗОг/л, хлорид натрия - 5г/л, рН 7,5). Использование этой среды приводит к 2-кратному увеличению выхода активного фермента по сравнению со средой 2YT (рис. 3).

Влияние добавок. В белковой глобуле пенициллинацилазы содержится ион Са2+. Поэтому наличие ионов Са2+ в среде для культивирования необходимо для получения ЕсПА в активной и растворимой форме. Исследование зависимости выхода активного фермента от концентрации Са2+ показало, что наиболее оптимальной является концентрация 2мМ. Культивирование в таких условиях позволяет стабильно увеличить выход фермента для любой мутантной формы (рис. 3). Однако, для некоторых мутантов даже в таких условиях не удалось получить приемлемое количество активного фермента, поэтому эксперименты по оптимизации условий культивирования были продолжены. Авторы (Y. Xu et at., 2006) указывают, что добавление глицерина в питательную среду может привести к увеличению выхода ЕсПА. Наши опыты показали, что добавление глицерина в концентрации 5 г/л в случае отдельных мутантов (ЕсПА М1-02, М1-03, М1-05) приводит к 2-кратному увеличению выхода активного фермента (рис. 3) по сравнению со средой без глицерина. В случае мутанта ЕсПА-М1-05, используя среду YE с кальцием и глицерином, удалось повысить выход активного фермента с 10 мг до 136 мг с литра среды для культивирования по сравнению с широко используемой средой 2YT. Также в состав среды для культивирования была введена глюкоза, как дополнительный источник питания клеток E.coli. Следует отметить, что добавление глюкозы привело

форм ЕсПА.

к различным эффектам для разных мутантов. Для мутанта ЕсПА-М1-05 культивирование в таких условиях приводит к существенному снижению выхода. В случае мутантов ЕсПА М1-04, М1-07 и М2-01 добавление глюкозы привело к полной потере активности. В то же время для мутантных ЕсПА М1, М1-03 и М2 введение глюкозы в состав среды для культивирования приводит к увеличению выхода активного фермента в 3-5 раз по сравнению со стандартной средой (рис. 3).

На рис. 3 представлены суммарные данные по влиянию различных добавок на выход фермента для всех мутантных форм. Поскольку величины выходов зачастую сильно отличались, данные на графике нормированы на стандартные условия культивирования - среда 2УТ без каких-либо добавок, индуктор - 0,1 мМ ИПТГ. Хорошо видно, что влияние всех добавок на выход каждого мутанта различно, следовательно, для каждой мутантной формы ЕсПА необходимо подбирать индивидуальные условия культивирования, варьируя состав среды, тип и концентрацию добавок. В табл. 2 приведены результаты оптимизации условий культивирования для всех мутантных форм, полученных в данной работе.

Изучение кинетических свойств мутантов. Для всех мутантных форм были определены кинетические параметры гидролиза хромо генного субстрата !\ПРАВ (табл. 3). Для определения ксЛ проводили титрование активных центров фермента с помощью необратимого ингибитора фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Как видно из приведенных данных, введение мутаций в области активного центра оказывает существенное влияние на каталитические свойства фермента: например,

Таблица 2.

Максимальные величины выходов культивирования для всех мутантных форм ЕсПА.

1-I (0 ь § с а С\1 5 с й со 1 < С и ш 1 < С о 1и о ■ т-< С 1Й гм о 1 1 < с а со 0 1 < с а тГ 0 I 1 1 < 1= а ю 0 1 1 1 < с а со 0 1 1 1 < С а 0 1 Г < с а со о ■ < с а о СМ 1 < С а сч о 1 см 1 < с а со о см 1 < с а

X С 91 230 490 356 20 15 250 1,5 136 20 53 515 55 0 110

.0 2

Таблица 3.

Кинетические свойства мутантов по МРАВ.

Фермент ксаи сек1 Кт, мкМ (Аса/Кт)*10-3, мкМ"1секИ (^Я/Кт),пи1 (кса1/ Кт)*

ЕсПА-ДТ 26,0±1,0 26,0±0,7 1000 1

ЕсПА-М1 42,1 ±2,3 3,4±0,1 12350 12,4

ЕсПА-М2 31,3±1,2 24,9±0,6 1250 1,3

ЕсПА-МЗ 13,7±0,6 27,0±0,8 507 0,5

ЕсПА-М4 12,9±0,7 11,2±0,5 1150 1,2

ЕсПА-М1-01 1,8±0,1 42,1 ±0,5 40 0

ЕсПА-М1-02 52,3±2,4 5,4±0,5 9690 9,7

ЕсПА-М1-03 18,4±0,9 7,2±0,6 2560 2,6

ЕсПА-М1-04 37,8±1,9 45,1 ±0,8 840 0,8

ЕСПА-М1-05 40,2±2,1 15,2±0,4 2670 2,7

ЕсПА-М1-06 34,9+1,9 14,8±0,5 2330 2,3

Ее П А-М1-07 40,5±2,4 7,8±0,5 5190 5,2

ЕсПА-М1-08 1,7±0,2 44,0±1,0 39 0

ЕсПА-М2-01 33,1 ±1,8 20,1 ±0,5 1650 1,7

ЕсПА-М2-02 - - - -

ЕсПА-М2-03 23,7±0,9 67,0±1,0 350 0,4

мутант БсПА-М1-01 с 1М1РАВ полностью неактивен. В то же время этот мутант проявляет активность по отношению к другому хромогенному субстрату МРвВ (данные не представлены). В случае остальных мутантных форм снижение каталитических характеристик по сравнению с исходными формами £сПА-М1 и ЕсПА-М2 не так существенно, тем не менее, большинство из них по своим каталитическим характеристикам превосходят фермент дикого типа.

Синтез ампициллина. Более важной характеристикой полученных мутантных форм ЕсПА является их эффективность в реакции синтеза ампициллина. Удобной количественной мерой, характеризующей синтетические свойства фермента в таких реакциях, является соотношение экспериментально измеренных начальных скоростей синтеза и гидролиза Э/Ннач (рис. 4). Другой важной характеристикой фермента в реакциях синтеза антибиотиков является параметр а. Он характеризует специфичность фермента к продукту реакции по сравнению со специфичностью к донору ацильной части. Оба параметра приведены в табл. 4.

Время, мин

Рис.4. Накопление продукта синтеза (Э, А) и гидролиза (Н, ■) для ЕсПА-М1-03. рН 6,3, 25°С, 20 ММ 6-АПК, 50 мМ О-ФГА.

Таблица 4.

Параметры синтеза ампициллина для ЕсПА и ее мутантов (0,05 М 6-АПК, 0,05 М О-ФГА, рН 6,3, 25°С).

а в/Н

ЕсПА-ДТ 3,6±0,9 2,5±0,2

ЕсПА-М 1 1,5±0,4 1,1±0,1

ЕсПА-М2 10,3±2,2 6,0±1,0

ЕсПА-МЗ 6,6±1,4 8,5±1,0

ЕсПА-М4 3,6±0,8 2,6±0,2

ЕсПА-М 1-02 14,9±2,9 2,9±0,3

ЕсПА-М 1-07 1,5±0,3 1,3±0,2

ЕсПА-М2-03 Н.Д. 7,6±0,7

ЕсПА-М2-01 н.Д. 9,0±1,0

ЕсПА-М 1 -03 18,9±4,1 11,2±1,1

Ее ПА-М1-01 0,7±0,2 1,9±0,2

ЕсПА-М1-08 4,0±0,7 н.Д.

Из табл. 4 видно, что все введенные мутации оказали существенное влияние на кинетические характеристики фермента в реакции синтеза ампициллина, за исключением мутанта М4, для которого значения параметров а и S/H совпадают с таковыми для фермента дикого типа. Во всех остальных случаях наблюдается улучшение одного из параметров с одновременным ухудшением другого. Снижение а наблюдалось для мутантных форм ЕсПА М1, М1 -01 и М1-07, что свидетельствует о снижении сродства фермента к продукту реакции. В то же время для мутантов ЕсПА МЗ, М2-03, М2-01, М1-03 наблюдалось значительное увеличение соотношения синтез/гидролиз. Однако одновременного улучшения обоих параметров достичь не удалось.

Поскольку ни мутант ЕсПА-М1-01, ни мутант ЕсПА-М1-08 не проявляли активности с хромогенным субстратом NIPAB, но были активны с другим хромогенным субстратом - NIPGB, мы решили проверить их кинетические характеристики в реакции синтеза другого антибиотика - амоксициллина. Для них также были определены параметры а и S/H, значения которых приведены в табл. 5. Как оказалось, в обоих случаях введение замен привело к значительному улучшению параметра а в 10 и в 7 раз соответственно. Параметр S/H также вырос для обеих мутаций, однако в случае мутантной формы ЕсПА-М1-01 это улучшение невелико, всего в 2 раза, в то же время для мутанта ЕсПА-М1-08 удалось увеличить параметр S/H в реакции синтеза амоксициллина в 19 раз.

Таблица 5.

Параметры синтеза амоксициллина для ЕсПА и ее мутантов (0,015 М 6-АПК, 0,03 М D-OH-ФГМ, pH 6,3, 25°С).

а S/H

ЕсПА-ДТ 15,4±0,9 2,1 ±0,1

ЕсПА-М1-01 1,5±0,3 7,1±0,2

ЕсПА-М1-08 2,3±0,6 40,0±2,0

Изучение стереоселективности мутантов ЕсПА.

Стереоселективность в реакции ацилирования 2-аминобутанола.

Реакцию ацилирования (Я,5)-2-аминобутанола проводили с двумя донорами ацильной части - амидами (/?)- и (З)-миндальной кислоты (рис. 5).

ОН

амид (R,S)-MK

(R,S)-2- (R,S)-MaHflennn-S-2- (R)-2-

аминобутанол аминобутанол аминобутанол

Рис. 5. Схема реакции ацилирования 2-аминобутанола.

Стереоселективность определяли как отношение начальных скоростей синтеза N-манделил-производных, соответствующих (R)- и (З)-формам. Также по отношению суммарных начальных скоростей синтеза N-манделил-производных и гидролиза ацильного донора с образованием миндальной кислоты нами были определены значения параметра S/H (табл. 6).

Таблица 6.

Кинетические параметры реакции ацилирования 2-аминобутанола для Ее ПА и некоторых мутантов (25"С, pH 8,5).

Донор ацильной части: амид (/?)-миндальной кислоты

фемент Vo/Eo, мин"1 S/H е, стереоселективность ее

ЕсПА-ДТ 16,1 ±0,3 0,25±0,01 S 8,0±0,7 77%

ЕсПА-М2 10,0±0,2 0,27±0,01 S 14,5±0,6 87%

ЕсПА-М1-07 17,7±1,7 1,3±0,1 S 25±6 93%

ЕсПА-М1-03 6,6±0,2 4,4±0,2 S 13,3±0,9 86%

Донор ацильной части: амид (SJ-миндальной кислоты

фермент Vo/Eo, мин"1 S/H £, стереоселективность 50% ее

ЕсПА-ДТ 14,8±0,8 0,74±0,05 S 3,4±0,3 54%

ЕсПА-М2 7,2±0,2 0,17±0,01 S 15,0±0,2 88%

ЕсПА-М1-07 2,62±0,04 0,54±0,01 R 1,62±0,05 23%

ЕсПА-М1-03 1,3±0,1 1,2±0,1 R 1,3±0,2 13%

Из представленных данных видно, что для всех рассмотренных мутантов каталитическая активность (Vo/Eo) по сравнению с ферментом дикого типа несколько ухудшилась как по отношению к амиду R-МК, так и к амиду S-MK. Исключением является мутант ЕсПА-М1-07 - в его случае соотношение Vo/Eo для амида R-MK не отличается от такового для фермента дикого типа в пределах ошибки эксперимента. При этом стереоселективность для этого мутанта возросла более чем в 3 раза по сравнению с диким типом, что при 50% конверсии дает на выходе продукт с оптической чистотой (ее) 93%. Также можно отметить увеличение стереоселективности и для остальных мутантов. В случае амида (S)-MK стереоселективность максимальна для ЕсПА-М2, а для мутантов ЕсПА-М1-03 и ЕсПА-М1-07 наблюдается инверсия конформации активного энантиомера. Интересно также отметить значительное улучшение синтетических способностей мутантов ЕсПА-М1-03 и ЕсПА-М1-07 в случае амида (Я)-МК. Для мутанта ЕсПА-М1-03 наблюдается почти двадцатикратное увеличение параметра S/H, что приводит как к меньшим непродуктивным потерям ацильного донора, так и к большим выходам по амидной части.

Стереоселективность в реакции гидролиза М-фенилацетилфенил-аланинола. Стереоселективность в данном случае определяли по отношению начальных скоростей накопления (Я)- и (З)-фенилаланинола.

О ОН ^ рн7.5^ 0 0Н

го

(RSHI-фвнилацвтил- М-фенилацетил-^)- (/?)^енилаланинол

фенилаланинол фенилаланинол 4 ' ^

Рис. 6. Схема реакции гидролиза М-фенилацеталфенилаланинола.

Концентрацию образующихся при гидролизе свободных аминогрупп определяли после предварительной инкубации реакционной смеси с о-фталевым альдегидом и хиральным тиолом Ы-манделил-(5)-цистеином (Spigun O.A. etal., 2007)

Таблица 7.

Кинетические параметры реакции гидролиза N-фенилацетилфенилаланинола (25"С, pH 8,5).

фермент Vo/Eo, мин"1 е, стереоселективность ее5«

ЕсПА-ДТ 46,9±4,4 R3,5±0,5 55%

ЕсПА-М2 15,3±0,7 R 2,9±0,3 48%

ЕсПА-М1-07 8,4+0,1 S 18,5±0,5 90%

ЕсПА-М1-03 1,7±0,1 н.д. н.д.

Результаты, полученные для этой системы (табл.7), также показывают уменьшение каталитической активности полученных мутантов ЕсПА по сравнению с ферментом дикого типа, и в случае мутанта ЕсПА-М1-03 падение активности максимально. Что же касается стереоселективности, то мутант ЕсПА-М1-07 показал более чем пятикратное увеличение этого параметра, при этом, происходит инверсия конформации и более активным является 1\1-фенилацетил-(8)-фенилаланинол. Таким образом, мутант ЕсПА-М1-07, оказавшийся совершенно неэффективным в реакции синтеза ампициллина, стал самым удачным катализатором для разделения энантиомеров аминоспиртов.

Таким образом, в первой части данной работы был клонирован ген ПА из Е.соН и создана эффективная система экспрессии рекомбинантного фермента. Методом направленного мутагенеза получены 13 мутантов, содержащих замены в области активного центра фермента. Для каждого мутанта подобраны оптимальные условия культивирования. Показано, что все выбранные остатки оказывают существенное влияние на кинетические свойства фермента. Наиболее перспективным для синтеза ампициллина оказался мутант ЕсПА-М1-03, а для получения оптически-активных соединений - ЕсПА-М1-07. Наиболее значимые и важные результаты были достигнуты в случае получения биокатализаторов для синтеза другого антибиотика -

амоксициллина. Для двух мутантных форм ЕсПА - М1-01 и М1-08 были улучшены оба параметра - как а, так и соотношение S/H, причем в случае ЕсПА-М1-08 соотношение S/H возросло в 19 раз.

3. Клонирование гена ПА из A.faecalis

Другим очень перспективным ферментом того же класса является ПА из бактерий Alealigenes faecalis (Л/ПА). Она обладает повышенной термостабильностью, и более широким pH-оптимумом активности, смещенным по сравнению с ЕсПА в щелочную область. Для проведения работ по белковой инженерии необходимо было клонировать ген данного фермента. Кроме того, клонирование нового гена было необходимо, чтобы получить патентно-чистый фермент.

Дизайн праймеров. В настоящее время в банке данных известны четыре последовательности пенициплинацилаз из A.faecalis (регистрационные номера в базе данных GeneBank AF455356 (AF_Ch¡), EU449762 (AFJnd), AFU93881 и AFU50186(AF_Nth) - две последние последовательности полностью идентичны). Все эти последовательности запатентованы. Поэтому для получения патентно-чистого гена AfПА нами была использована геномная ДНК штамма A.faecalis VKM В-1518 из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г.Пущино). Для конструирования праймеров за основу взяли три несовпадающие последовательности.

Таблица 8.

Выравнивание нуклеотидных последовательностей известных Л/ПА на 5'- и З'-концах гена.

5'-конец гена З'-конец гена

START AF_Ind ATGCAGAAAGGGCTTGT AF_Chi ATGCAGAAAGGGCTGGT AF_DSM ATGCAGAAAGGGCTTGT ************** ** AF_VKM ATGCAGAAAGGGCTTGT STOP AF_Ind CTGTTGATTCAGCCTCAGCCTTAG AF_Chi CTTTTGATTCAGCCTCAGCCTTAG AF_DSM CTGTTGATTCAGCCTCAGCCTTAA ** ******************** AF_VKM CTTTTGATTCAGCCTCAGCCTTAA

Сравнение нуклеотидных последовательностей на 5'- и З'-концах гена А/ПА (табл. 8) показало, что они практически полностью идентичны, а отличия в некоторых триплетах не отражаются на аминокислотной последовательности фермента. Это позволило избежать использования вырожденных праймеров для клонирования гена А/ПА из A.faecalis VKM В-1518. На основании результатов сравнения были синтезированы прямой и обратный праймеры AF_FOR и AF_REV, в которые для удобства клонирования были введены сайты рестрикции Ndel (праймер AF_FOR) и Hindill и EcoRI (праймер AF_REV). В положениях, где отсутствует абсолютная гомология, использовали основания, которые входят в кодоны, наиболее часто встречающиеся в E.coli. В качестве стоп-кодона был выбран триплет ТАА, как наиболее эффективный в E.coli.

Для препаративной наработки фрагмента ДНК с геном А/ПА нами была проведена оптимизация температуры отжига праймеров. Обычная

Taq ДНК-полимераза давала низкий выход продукта ПЦР. Поэтому вместо нее была использована Pfü-Turbo ДНК-полимераза, что привело к увеличению выхода продукта реакции. Кроме того, этот фермент имеет очень высокую точность, что позволяет при проведении ПЦР максимально снизить вероятность появления ошибок в последовательности амплифицируемого фрагмента. В результате был получен фрагмент ДНК длиной около 2550 п.н., соответствующий длине гена, кодирующего белок-предшественник /AfllA. Этот фрагмент был обработан рестриктазами Ndel и Hindill и клонирован в экспрессионный вектор на основе плазмиды pBR322 под контроль ¿ас-промотора. После трансформации клеток E.coli продуктом лигирования было отобрано шесть клонов, из которых затем были выделены плазмиды. Все они были отсеквенированы по двум цепям для определения нукпеотидной последовательности гена А/ПА-VKM. Из нуклеотидной последовательности с помощью трансляции была получена аминокислотная последовательность белка-предшественника.

Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей AfTlA.

Несмотря на то, что все известные AfT\A были клонированы из близких штаммов A.faecalis, последовательности их генов отличаются друг от друга. Уровень гомологии нуклеотидной последовательности /ША-VKM по сравнению с другими известными Afl1А составляет 91-94%. Нуклеотидная последовательность гена ПА-G кодирует белок-предшественник, состоящий из сигнального пептида, отвечающего за транспорт фермента в периплазму, и двух субъединиц (а и ß), соединенных между собой спейсером из 29 аминокислотных остатков. Такая организация полипептидной цепи является типичной для ПА-G. На рис. 7 представлено сравнение аминокислотных последовательностей AfTlA из различных штаммов. Из рисунка хорошо видно, что в последовательности фермента /ША-VKM обнаруживается довольно большое число отличий, причем 8 из них являются уникальными и не встречаются в других известных AfilA (на рисунке указаны белым цветом на черном фоне). Наблюдаемые в нашем ферменте отличия по сравнению с наиболее изученным ортологом из штамма А./аеса//зфирмы DSM, суммированы в табл. 9.

Таблица 9.

_Отличия в аминокислотных последовательностях AfTIA._

Уникальные мутации Отличия от фермента DSM

Количество 8 38

Сигнальный пептид (Val/Leu)8Gly 5

а-субъединица aGIu 60 Asp, aGIn 203 Arg 4

Межсубъединичный спейсер - 2

ß-субъединица ßAla225Ser, ßThr319Lys ßPro338Ser, ßAla 468Ser ßSer541Thr 27

Е 5

S о

S О

■ х>

AF VKM

AF Chi

AF Ind

A F Nth

AF VKM

AF Chi

AF Ind

AF Nth

AF VKM

AF Chi

AF Ind

AF Nth

AF VKM

AF Chi

AF Ind

AF Nth

AF VKM

AF Chi

AF Ind

AF Nth

AF VKM

AF Chi

AF Ind

AF Nth

AF VKM

AF Chi

AF Ind

AF Nth

AF VKM

AF Chi

AF Ind

AF Nth

AF VKM

AF Chi

A F Ind

AF Nth

MQKGLVRTG

AGLILGLAWAPAHAQVQSVE^/MKDSYGVPHVFADSHYGLYYGYGYAVAQDMjFQMDMARRSFVGTTAAVLGPGTODVYVKYDMQVRQH 100

............................................Т...........H. . .S.........И............................100

......................................................................1............................100

¡V.......К.G. .Т.........................................................S- .А......................100

FTPASIQRQIAALSKDERDIFRGYAI^YKAYLEQVRRRPELLPIŒYVDFDFQPEPLTDFDVVMIWVGSMANRFSDTNLEVTALA^IRQSLEKQHGPERGRA 200

...........................................................................................Е................200

........................................................................................................................................................................................................200

LFDELLWINDTrAPTTVPAPAAEHKPQA0AGTQNlAHVSSQVLÎ^ELERQDKHWGGRGPDFAPKASNLMSTRPERVQTCSTVLIHGPQFGWYHPAYTYGI 300

.........................Ж .К............................................................................................................300

.......................R. . . .й..............................................................................................................................................300

............................й. . . -D......Р. . .Т................................Е............................................300

GLHGAGFDVVGNTPFAYPXVLFGTNSEIAWGATAGPQDVVDMYQEKLNPARADQYWFNKAWRTMEQRKERXQVRGQADREt^TIVÎRT^/HGPVMQFDYEQGA

............................................R..................................................D. .Т

...................................................................................................Т

.........................................I.......S..............................................D. . .

AYSKKF:SWDGYEVQSLLAWLNVAKAPJ^WTEFLDQÄS^lAISXNWYyADKHGIOGYVSPAFLPQRPÄD0DIRVPAKGDGSMEWQGXKSFDHlPKAYNPPQG

.................................................Y.....................M..........L......I..........

................................................................................L......§

YLVNWmKPAPDKTNTDTYYWTYGDRMNELTSQYQDKDVHSVQEIWEFNKKASYSDVNWRYFRPHLEKIAQSLPMDAGQWU^LIAWMMEmQAGQS ..............................V....Q... F......T..............................GS....B.........R..D.H.

..............................V. . . ,Q. .LF.........Q.....................Q. . .D.SSK. ,.@M........Q..G...

AC^J^VLFKTWLEEMYKQVLMPVVPESHKAMYSQTGFATQQGPNPGSIKLSMGrKVLLRALALEAHPDpraVNVFGERSSQEIMHTALQilÄQARLSQEQG V g..........................A..............................N.......I.....P...................

400 400 400 400

500 500 500 500

600 600 600 600

700 700 700 700

AQMERvJTMPTSVHRFSPKNFTGTPQTTSGNTF] ...........................L . . . .1 FTGYQNRGTENNRWFDAKGVEFCDAMPPGQSGFTDRNGVRSPHYEDQLKbYENPECKTMDVTHTDI 8 00

.............A. ... S.............................................. 800

. . .A......................MP. . . J il ................................................................A. . 800

RRNAQgSTMLLXQPQP 816

.....1.......... 816

Анализ модельной структуры AfflA-VKM (ее получение см. ниже) показал, что все аминокислотные остатки, являющиеся уникальными для данного фермента, расположены на поверхности белковой глобулы вдали от активного центра. На основе этих данных можно предположить, что найденные отличия в аминокислотной последовательности нашего фермента не должны приводить к существенным изменениям в его каталитических свойствах по сравнению с другими ЛА1А.

Создание рекомбинантного штамма E.coli - продуцента Л/ПА-VKM. После клонирования гена фермента мы приступили к экспериментам по его экспрессии в клетках E.coli. В качестве сигнального пептида был использован собственный сигнальный пептид ПА из A.faecalis. Возможность использования собственного сигнального пептида Л/ПА для транспорта белка-предшественника в периплаз-матическое пространство в клетках E.coli была показана в работе (Verhaert et ai, 1997). В первых экспериментах по экспрессии Л/ПАЛ/КМ в клетках E.coli было получено всего 30-40 Ед . с литра среды. Поэтому была проведена оптимизация условий культивирования. Оказалось, что при 30 °С как и в случае фермента из E.coli рекомбинантный ЛАПА преимущественно образуется в неактивной форме в виде телец включения. Снижение температуры культивирования с 22 до 15 °С приводит к увеличению выхода активного фермента более чем в 3 раза (рис. 8).

Эксперименты по индукции различными количествами ИПТГ показали, что в исследованном диапазоне концентраций 0,05-0,50 мМ концентрация индуктора не оказывает существенного влияния на выход фермента. В качестве оптимальной была выбрана концентрация ИПТГ 0,1 мМ. Очень критичным параметром оказались условия индукции. Наиболее высокий выход активного фермента наблюдался, когда ИПТГ добавляли в среду для культивирования при концентрации клеток, соответствующей 0,1-0,2 ед. поглощения на 600 нм. Индукция при значении Абоо 0,6-0,7 приводит к снижению выхода активного фермента почти в три раза.

В результате оптимизации условий культивирования выход активной AfT\f\ был увеличен с 40 до 5000 Ед. с литра среды.

ü I-

Выход, ^q/л

1000

800

300

100 0

■

- и

15 22 30 т, "с

5000 -

4500 -

« 4000 -

5 3500 -

1.3000 -(1)

•g.2500 -

«2000 -О

* 1500 -Ш №00 500 -0 -

1 1

ИЕд/л □ Ед/л/ое

0,02

1 р

--1

0,09 0,49

А600 до индукции

Рис. 8. Зависимость величины выхода активного фермента от температуры культивирования.

Рис. 9. Влияние величины поглощения клеток А6оо в начальный момент культивирования на выход фермента.

4. Изучение свойств рекомбинантной А1 ПАЛ/КМ.

В работе (ЗуесЗаэ е/ а/., 1997) была показана возможность использования необратимого ингибитора сериновых протеаз ФМСФ в качестве эффективного титранта активных центров Л/ПА.

Рис. 10. Титрование активных центров Л/ГМ с помощью фенилметилсульфонилфторида 0,05 М фосфатный буфер, рН 6,5.

Наши эксперименты показали, что в случае AfflA-VKM инактивация фермента ФМСФ также происходит за несколько минут и является необратимой. Это позволяет определить концентрацию активных центров фермента, анализируя зависимость остаточной активности А/ПА (А/АО на рис. 10) от концентрации ингибитора.

Кинетические параметры AfflA-VKM в реакции гидролиза хромогенного субстрата NIPAB. Поскольку А/ПА-VKM отличается своей аминокислотной последовательности от аналогичных ПА из других штаммов A.faecalis, было интересно изучить возможное влияние этих замен на кинетические свойства фермента.

Зависимость скорости реакции гидролиза цветного субстрата NIPAB описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Значения t и Кт, рассчитанные из этой зависимости, составили 75±4 сек"1 и 5,7±0,6 цМ соответственно. Полученные значения ксat и Кт совпадают с таковыми для ПА из A.faecalis АТСС 19018 (Vertiaert et al., 1997), т.е. отличия в аминокислотной последовательности нашего фермента не приводят к существенному изменению его каталитических свойств. Величины ксat и отношения /Сса/Кщ с NIPAB для /Ч/ПА-VKM в 3 и в 13 раз выше по сравнению с таковыми для ЕсПА.

На рис. 11 представлена зависимость активности Л/ПА-VKM от рН. Из рисунка хорошо видно, что фермент обладает довольно широким рН-оптимумом активности, смещенным в щелочную область. Например, при рН 11,0 активность фермента составляет 50% от максимальной. В то же время ЕсПА полностью неактивна уже при рН 10,0.

Время, мин

Рис. 12. Ацилирование 3-фенилпропиламина (ФПА, 0,05 мМ) амидом Р-фенилглицина (Э-ФГА, 0,05 мМ), с использованием М1АЛ/КМ, рН 10,3. ■ - продует, А - ФПА, • - 0-ФГА, ♦ - ФГ.

Кинетические параметры АОТАЛ/КМ в реакциях ацилирования аминов.

Нами были изучены свойства рекомбинантной ДА1А-\/КМ с целью сравнения полученного фермента с ранее исследованными /4Я~1А в реакции ферментативного ацилирования. На рис. 12 приведены зависимости концентраций исходных веществ и продуктов реакции ацилирования 3-фенилпропиламина. Как видно из этого рисунка,

полученный нами фермент является эффективным катализатором в реакции переноса ацильной группы на первичный амин в водной среде и практически не отличается от ранее изученной /1/ПА (Сигапс1а е1 а1, 2001). Также была изучена эффективность А/ПАА/КМ в реакции ацилирования рацемата фенилэтиламина амидом Э-фенилглицина (рН 10,3, 25 °С). Оказалось, что в случае нашего фермента наблюдается высокая стереоселективность по отношению к амину и эффективный перенос ацильного остатка на фенилэтиламин (соотношение скоростей синтеза/гидролиза 2,4, см. табл. 10), при этом полученный фермент по своей способности катализировать ацильный перенос не уступает ранее описанной А/ПА (см. табл.10).

Таблица 10.

Параметры реакции стереоселективного ацилирования для А/ПА (25 "С, рН 10,3).

Фермент Стереоселективность Бо/Но \/о/Ео, сек"1

А/ПА (вигапаа е1а1, 2004) >680 2,0 99

А/ПАЛ/КМ >771 2,4 88

Кинетика термоинактивации рекомбинантной Л/ПА. Литературные данные по определению периода полуинактивации А/ПА при 50 °С свидетельствуют, что этот фермент является одной из самых стабильных бактериальных пенициллинацилаз (УегЬаей: е\. а1., 1997). Однако детально термоинактивацию А/ПА не изучали и в литературе отсутствуют систематические данные о его термостабильности.

Термостабильность А/ПАЛ/КМ была исследована в диапазоне температур от 49 до 57 °С (рис.13). Термоинактивация была необратимой, описывалась кинетикой реакции первого порядка и наблюдаемая константа скорости инактивации не зависела от концентрации фермента. Совокупность этих данных свидетельствует о том, что инактивация А/ПАЛ/КМ при повышенных температурах является мономолекулярным процессом и разворачивание белковой глобулы происходит без предварительной диссоциации димерной молекулы на отдельные субъединицы.

Для определения активационных параметров процесса термоденатурации была использована теория активированного комплекса (ТАК). Из зависимости констант скорости инактивации от температуры были определены величины дН*= 555 ± 21 кДж/моль и ДЭ^ 2003 ± 64 Дж/(моль*К). Столь высокие значения активационных параметров характерны для процесса инактивации за счет денатурации белковой глобулы.

Рис. 13. Зависимости остаточной активности рекомбинантной Я/ПА-УКМ от времени пр различных температурах 0,01 М КФБ, рН 7,5.

0,00302 0,00304 0,00306 0,00308 l/T.K-1

Рис. 14. Зависимость константы скорости инактивации от температуры 0,01 М КФБ, pH 7,5.

5. Моделирование структуры Aft\А

Эксперименты по белковой инженерии фермента методом направленного мутагенеза невозможны без знания трехмерной структуры белка. В случае, когда данные рентгеноструктурного анализа для данного фермента отсутствуют, используют модельную структуру.

Моделирование структуры нативного фермента*. На сегодняшний день известны структуры двух ПА-G из бактерий Е.coli и P.rettgeri. Более высокая гомология

Моделирование проводилось в сотрудничестве с кандидатом физ.-мат. наук Угаровым И.В.

наблюдалась между аминокислотными последовательностями -4/ПА и ЕсПА. Поэтому моделирование структуры /ША-VKM проводилось на основе известной структуры ПА из E.coli PDB1E3A с помощью пакета программ Insight II (Accelrys Inc., San Diego, CA, USA). На рис. 15 приведено наложение структуры ЕсПА, полученной экспериментально, и структуры Л/ПА, построенной с помощью компьютерного моделирования. Как видно из рисунка, существенных отличий в пространственном расположении структурных элементов не наблюдается.

Моделирование структуры пермутированного фермента, дизайн сшивок. Как уже отмечалось ранее, пенициллинацилаза G обладает довольно сложной системой посттрансляционной модификации. На первой стадии в цитоплазме синтезируется неактивный белок-предшественник, состоящий из сигнального пептида, а-субъединицы, межсубъединичного спейсера и ß-субъединицы. Затем происходит транспорт этого белка в периплазму с одновременным отщеплением сигнального пептида. На заключительном этапе в периплазматическом пространстве клетки происходит автокаталитическое отщепление межсубъединичного спейсера с образованием активного фермента в виде гетеродимера. Наличие такой системы усложняет задачу экспрессии фермента в активной и растворимой форме. Можно полагать, что создание системы экспрессии, в которой отсутствуют стадии транспорта и выщепления спейсера, позволит существенно упростить процесс получения активного фермента. Это может быть достигнуто за счет конструирования «пермутированного» фермента. В структуре нативной /4Я~1А N-конец а-субъединицы и

Рис. 15. Наложение исходной структуры ЕсПА (показана зеленым цветом) и построенной модельной структуры АЮА-\/КМ (показана синим цветом). Красным цветом в центре выделен каталитический остаток серина.

Рис. 16. Модельные структуры нативного (А) и пермутированного (Б) фермента. Каталитический остаток серина на обоих рисунках выделен красным цветом. А - Синим цветом выделена а-субъединица, зеленым - Р-субъединица. Лиловым -N и С концы а и (3-субъединиц соответственно. Б - лиловым цветом выделена введенная сшивка.

С-конец (3-субъединицы пространственно сближены (рис. 16а). Идея состоит в том, чтобы получить фермент в виде единой полипептидной цепи, соединив N и С-концы коротким пептидом и сформировав новые N и С-концы. В результате каталитический остаток серина окажется на Ы-конце новой полипептидной цели (рис.166). Такая конструкция позволит получить фермент в цитоплазме в виде единой полипептидной 1 цепи со свободным каталитическим остатком серина на Ы-конце за одну стадию.

Анализ модельной структуры АЯ1А-\/КМ свидетельствует, что остатки а1-5 и Р546-551 на концах цепей расходятся в разные стороны. Чтобы получить I пермутированный фермент необходимо удалить расходящиеся остатки из структуры | фермента, а оставшиеся участки цепей соединить межсубъединичной сшивкой. Такая сшивка будет представлять из себя р-поворот первого или второго рода. Нами были рассмотрены варианты сшивок состоящие из трех, четырех и пяти аминокислотных I остатков. Согласно результатам моделирования оптимальным является вариант | сшивки из четырех аминокислот с остатком глицина во втором положении.

Как показали результаты компьютерного моделирования, сшивка из трех аминокислот: ЗЭК, также может быть использована для получения пермутированного , фермента.

Таким образом, нами была построена модельная структура новой АЮА, что создает основу для дальнейших экспериментов по белковой инженерии фермента. Одним из направлений таких экспериментов является получение пермутированной

односубъединичной формы фермента, для которой также была рассчитана

модельная структура и предложены различные варианты межсубъединичных сшивок.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован ген пенициллинацилазы G из E.coli и создан собственный штамм-продуцент рекомбинантного фермента. Проведена оптимизация условий культивирования как для получения фермента дикого типа, так и его мутантных форм.

2. Получены 13 мутантов ПА-G из E.coli и изучены их свойства. Показано, что введенные мутации по-разному влияют на каталитические характеристики фермента в реакциях синтеза антибиотиков и стереоспецифическом синтезе/гидролизе. Получены мутанты с повышенной стереоселективностью в процессах получения оптически-активных соединений и с повышенной эффективностью в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина. В последнем случае параметры а и S/H одновременно улучшены более чем в 6 и 19 раз, соответственно.

3. Клонирован ген пенициллинацилазы G из бактерий Alcaligeries faecalisVКМ-В1518 и создан штамм E.coli-продуцент рекомбинантного фермента. Показано, что нуклеотидная и аминокислотная последовательности клонированной А/ПА отличаются от таковых из других штаммов A.faecalis, что обеспечивает патентную чистоту полученного фермента. Проведена оптимизация условий культивирования, что позволило повысить выход рекомбинантной А/ПА в 10 раз.

4. Изучение свойств клонированного фермента показало, что, несмотря на отличия в аминокислотной последовательности, полученный в данной работе фермент близок к ранее исследованным А/ПА как по стабильности, так и по каталитическим свойствам.

5. Изучена термостабильность клонированного фермента при рН 7,5 в диапазоне температур от 49 до 57 °С. Показано, что инактивация полученной Л/ПА является мономолекулярным процессом. Определены активационные параметры процесса термоденатурации, которые составили ДН#= 555 ± 21 кДж/моль, &5*= 2003 ± 64 Дж/(моль*К). Полученные значения характерны для инактивации фермента за счет денатурации белковой глобулы.

6. Проведено компьютерное моделирование и построена трехмерная модель структуры пенициллинацилазы G из A.faecalis. На основании анализа полученной структуры предложены варианты получения пермутированного фермента, состоящего из одной полипептидной цепи.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ясная A.C., Ямскова О.В., Гуранда Д.Ф., Щербакова Т.А., Тишков В.И., Швядас В.К. Клонирование пенициллинацилазы из Escherichia coli. Каталитические свойства рекомбинантных ферментов. Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2 Химия, 2008, т.49, №2, с. 127-133.

2. Yamskova O.V., Khoronenkova S.V., Guranda D.F., Yasnaya A.S., Study of kinetic properties of different mutants of penicillin acylase from Escherichia coli. Proceedings of the 4-th Intern. Congress "Biotechnology - State of the Art & Prospects of Development", Moscow, Russia, March 12-16, 2007, p.314-315.

3. Ясная A.C., Ямскова О.В., Хороненкова C.B. Изучение свойств мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli. «Ломоносов - 2007». Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам, Москва, 11-14 апреля 2007, с.502.

4. Yasnaya A.S., Yamskova O.V., Khoronenkova S.V., Guranda D.F., Tishkov V.l., Svedas V., Protein engineering of penicillin acylase G from Escherichia coli. Abstracts of international conference "BIOCATALYSIS - 2007. Structure, functions, applications", Moscow - St.-Petersburg, Russia, June, 17-22, 2007, p. 142.

5. Yasnaya A.S., Yamskova O.V., Khoronenkova S.V., Guranda D.F., Tishkov V.l., Svedas V., Properties of mutant forms of penicillin acylase G from Escherichia coli. Abstracts of Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kiev, Ukraine, September 25-27,2007, p.204.

6. Yasnaya A.S., Khoronenkova S.V., Cherskova N.V., Fedorchuk V.V., Fedorchuk E.A., Panin N.V., Svedas V., Tishkov V.l., New biocatalysts for antibiotics synthesis. Proceedings of the 5-th Intern. Congress "Biotechnology - State of the Art & Prospects of Development", Moscow, Russia, March 16-20, 2009, p.286-287.

7. Ясная A.C., Березин B.A., Панин H.B., Пенициллинацилаза из A.faecalis: клонирование и экспрессия в E.coli, свойства рекомбинантного фермента. «Ломоносов - 2009». Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам, Москва, 13-18 апреля 2009, подсекция «Науки о живом», с.48.

8. Yasnaya A.S., Panin N.V., Svedas V.K., Tishkov V.l., Penicillin acylase from Alcaligenes faecalis: cloning, expression, characterization. VIII European Symposium of Protein Society, Zurich, Switzerland, June 14-18, 2009, p.102.

9. Yasnaya A.S., Berezin A.I., Uporov I.V., Panin N.V., Svedas V.K., Tishkov V.l., Recombinant penicillin acylase from Alcaligenes faecalis VKM-B1518. Abstracts of international conference "BIOCATALYSIS - 2009. Fundamentals and applications", Arkhangelsk, Russia, June, 19-24, 2009, p.49.

Подписано в печать 9 ноября 2009 г. Объем 1,0 п. л. Тираж 130 экз. Заказ № 1066 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д. 37

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Ясная, Анна Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Основные свойства пенициллинацилаз.

2.1.1. Распространенность и физиологическая роль.

2.1.2. Молекулярные свойства.

2.1.3. Структура пенициллинацилазы-G.

2.1.4. Молекулярный механизм (каталитический механизм).

2.1.5. Физико-химические свойства.

2.2. Экспрессия пенициллинацилазы G.

2.2.1. Экспрессия рекомбинантных ПА в E.coli.

2.3. Применение пенициллинацилазы.

2.3.1. Гидролиз пенициллинов для производства 6-АПК.

2.3.2. Синтез (3-лактамных антибиотиков.

2.3.3. Биокаталитическое разделение энаитиомеров аминосоединений.

2.3.4. Пептидный синтез.

2.3.5. Разделение смеси рацематов.

2.4. Белковая инженерия.

2.4.1. Гибридные ферменты.

2.4.2. Ненаправленный мутагенез.

2.4.3. Направленный мутагенез.

2.4.4. Пермутированные ферменты.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Проведение полимеразной цепной реакции.

3.2.2. Очистка ПЦР-продуктов.

3.2.3. Рестрикция фрагментов ДНК.

3.2.4. Рестрикция плазмидной ДНК.

3.2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.6. Выделение рестрикционных фрагментов.

3.2.7. Лигирование фрагментов ДНК.

3.2.8. Трансформация клетокcoli.

3.2.9. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.10. Секвенирование ДНК.

3.2.11. Препаративная наработка биомассы.

3.2.12. Выделение пенициллинацилазы G.

3.2.13. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-электрофорез).

3.2.14. Титрование активных центров фермента.

3.2.15. Измерение активности фермента.

3.2.16. Определение рН растворов.

3.2.17. Изучение рН зависимости активности ферментов.

3.2.18. Изучение термостабильности фермента.

3.2.19. Реакция синтеза ампициллина.

3.2.20. Определение соотношения начальных скоростей синтеза и гидролиза S/H ri параметра относительной специфичности а.

3.2.21. Ферментативное ацилирование рацемата 2-амипобутанола амидами R- и S-миндальной кислоты.

3.2.22. Ферментативный гидролиз рацемата N-фепилацетил-фенилаланинола.

3.2.23. ВЭЖХ анализ.

3.2.24. Компьютерное моделирование.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Получение мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli и изучение их свойств.

4.1.1. Клонирование гена пенициллинацилазы из E.coli.

4.1.2. Экспрессия рекомбинантного фермента в клетках E.coli TG-1.

4.1.3. Получение мутантных форм ЕсПА из E.coli.

4.1.4. Оптимизация условий экспрессии мутантных ЕсПА.

4.1.5. Изучение свойств мутантных ЕсПА.

4.2. Клонирование ПА из A.faecalis и изучение ее свойств.

4.2.1. Клонирование в E.coli гена пенициллинацилазы из A.faecalis.

4.2.2. Экспрессия гена ПА из A.faecalis в клетках E.coli.

4.2.3. Свойства пенициллинацилазы из A.faecalis.

4.3. Моделирование структуры нативного и пермутированного фермента

ПА из A.faecalis.

4.3.1. Компьютерное моделирование структуры ПА из A.faecalis.

4.3.2. Компьютерное моделирование структуры пермутированного фермента. Дизайн сшивок.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами"

Пенициллинацилаза (ПА, КФ 3.5.1.11) была открыта, как катализатор гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда. Этот фермент относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз и является представителем семейства, так называемых N-концевых нуклеофильных гидролаз. ПА была найдена в бактериях, дрожжах и низших грибах. Физиологическая роль фермента до конца не ясна. По-видимому, он служит для утилизации гетероциклических соединений в качестве источника углерода.

ПА изучается уже более 40 лет. По типу гидролизуемого субстрата ПА делят на 3 класса. Ферменты класса I осуществляют предпочтительный гидролиз пенициллина V, а классов II и III - пенициллина G и ампициллина соответственно. Класс II, в свою очередь, делится на два подкласса: Па и 116. Относящиеся к ним ПА гидролизуют ароматические и алифатические амиды, соответственно. Для двух пенициллинацилаз G (класс Па) известны трехмерные структуры, в том числе, для фермента из E.coli (£сПА).

На практике этот фермент нашел широкое применение в производстве 6-аминопенициллановой кислоты - основного сиитона для получения Р-лактамных антибиотиков. Также ПА применяется непосредственно для синтеза различных полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда. Такие свойства этого фермента, как широкая субстратная специфичность, высокие регио-, хемо- и стереоселективность позволяют использовать его для получения оптически-чистых соединений (они все больше используются в фармацевтической промышленности), а также для защиты гидроксильных и аминогрупп в пептидном и тонком органическом синтезе.

Наиболее широко на практике применяется пенициллинацилаза из E.coli. Среди других пенициллинацилаз этот фермент изучен лучше всего, однако эффективность катализируемого ЕсПА ацильного переноса на (3-лактамные ядра не достаточна для того, чтобы полностью вытеснить уже устаревшие методы химического синтеза антибиотиков. Кроме того, сейчас очень остро стоит проблема распространения антибиотико-резистентности у патогенных штаммов, в связи с чем возникает задача получения новых антибиотиков из неприродных субстратов. Поэтому задача получения новых мутантных форм фермента с улучшенными синтетическими характеристиками по отношению к неприродным субстратам имеет большое практическое и фундаментальное значение. Другой, не менее важной и актуальной задачей является повышение стереоселективности ПА в реакциях ацилирования аминоспиртов или гидролиза их N-ацильных производных, так как значение стереоселективности для аминоспиртов на порядок ниже, чем для аминокислот, что недостаточно для практических задач.

Для решения подобных задач могут быть использованы различые подходы, например, изменение свойств ферментов методами неупорядоченного (направленная эволюция, генная мозаика и т.д.) или направленного мутагенеза. В настоящее время все более широко используется последний подход, однако он требует наличия трехмерной структуры фермента, которая может быть получена экспериментально (реитгеноструктурный анализ, ЯМР) или с помщью компьютерного моделирования. Другой подход - это поиск аналогичных ферментов с нужными свойствами. Наилучшие результаты дает комбинация обоих подходов для решения одной и той же задачи.

Целью данной работы было получение мутантных форм пенициллинацилазы из E.coli с улучшенными каталитическими характеристиками в реакциях синтеза антибиотиков и с повышенной стереоселективностью по отношению к аминоспиртам. Наличие трехмерной структуры различных вариантов ЕсПА дикого типа и ее мутантов позволяет использовать для этой цели метод «рационального дизайна», основанный на введении в структуру фермента направленных аминокислотных замен, выбор которых осуществляется именно на основе анализа структуры фермента.

Другим интересным и перспективным ферментом того же класса является ПА из грам-отрицательных бактерий Alcaligenes faecalis. Она является одной из самых термостабильных из всех известных бактериальных ПА, обладает более широким рН-оптимумом активности, который смещен в щелочную область. Также этот фермент имеет некоторые отличия в спектре субстратной специфичности. Из всех известных пенициллинацилаз G он обладает самой высокой специфичностью по отношению к бензилпенициллину, а его специфичность по отношению к амиду D-фенилглицина на порядок выше, чем у фермента из E.coli. Имеются данные, что пенициллинацилаза из A.faecalis обладает более высокими каталитическими характеристиками при кинетическом разрешении рацемических смейсей ряда оптических изомеров. Однако, систематических исследований по изучению механизма действия, структуры, стабильности фермента и его белковой инженерии не проводилось. Кроме того, очень актуальной является проблема создания отечественного штамма — продуцента рекомбинантной ПА из A.faecalis, поскольку все три известные на настоящий момент нуклеотидные и аминокислотные последовательности этого фермента запатентованы. Поэтому еще одной задачей стало клонирование патентно-чистого гена ПА из A.faecalis и изучение свойств рекомбинантного фермента.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ясная, Анна Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

3. Клонирован ген пенициллинацилазы G из бактерий Alcaligenes faecalis VKM-B1518 и создан штамм Е. coli -продуцент рекомбинантного фермента. Показано, что нуклеотидная и аминокислотная последовательности клонированной 4/ПА отличаются от таковых из других штаммов A.faecalis, что обеспечивает патентную чистоту полученного фермента. Проведена оптимизация условий культивирования, что позволило повысить выход рекомбинантной 4/ПА в 10 раз.

4. Изучение свойств клонированного фермента показало, что, несмотря на отличия в аминокислотной последовательности, полученный в данной работе фермент близок к ранее исследованным AfYlA как по стабильности, так и по каталитическим свойствам.

5. Изучена термостабильность клонированного фермента при рН 7,5 в диапазоне температур от 49 до 57 °С. Показано, что инактивация полученной AfilA является мономолекулярным процессом. Определены активационные параметры процесса термоденатурации, которые составили ДН#= 555 ±21 кДж/моль, AS#=

2003 ± 64 Дж/(моль*К). Полученные значения характерны для инактивации фермента за счет денатурации белковой глобулы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Ясная, Анна Сергеевна, Москва

1. Sakaguchi К, and Murao, S.: A new enzyme, penicillin-amidase. Preliminaries. J Agr Chem Soc Japan 1950, 23(41):l-3.

2. Murao S: Penicillin-amidase. III. Mechanism of penicillin-amidase on sodim penicillin G. J Agr Chem Soc Japan 1955, 29(13):404-407.

3. Batchelor FR, F. P. Doyle, J. H. C. Nayler, and G. N. Rolinson.: Synthesis of penicillin: б-aminopenicillanic acid in penicillin fermentations. Nature 1959,183:257-259.

4. Vanderhaeghe H: Penicillin acylase (fungal). Methods Enzymol 1975, 43:721-728.

5. Shewale JG, Deshpande, B.S., Sudhakaran, V.K., and Ambedkar, S.S. : Penicillin acylases: applications and potentials. Process Biochemlnt 1990, 25:97-103.

6. Shewale JG, Sudhakaran, V.K.: Penicillin V acylase: its potential in the production of 6-aminopenicilIanic acid. Enzyme Microb Technol 1997, 20:402-410.

7. Bruggink A, Roos, E.C., and De Vroom, E.: Penicillin acylase in the industrial production of B-lactam antibiotics. Org Process Res Dev 1998, 2:128-133.

8. Shviadas VK, Klesov AA, Nys PS, Savitskaia EM, Berezin IV: Study of penicillin amidase from E. coli. Kinetics of enzymatic hydrolysis of 7-phenylacetamidodeacetoxycephalosporanic acid. Antibiotiki 1976, 21(8):698-704.

9. Hamilton-Miller JM: Penicillinacylase. Bacteriol Rev 1966, 30(4):761-771.

10. Pundle A, SivaRaman H: Bacillus sphaericus penicillin V acylase: purification, substrate specificity, and active-site characterization. Curr Microbiol 1997, 34(3):144-148.

11. Sudhakaran VK, Shewale JG: Purification and characterization of extracellular penicillin V acylase from Fusarium sp. SKF 235. Hindustan Antibiot Bull 1995, 37(1-4):9-15.

12. Savidge ТА, Cole M: Penicillin acylase (bacterial). Methods Enzymol 1975, 43:705721.

13. Verhaert RM, Riemens AM, van der Laan JM, van Duin J, Quax WJ: Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis. Appl Environ Microbiol 1997, 63(9):3412-3418.

14. Kim DJ, Byun SM: Purification and properties of ampicillin acylase from Pseuilomonas melanogenum. Biochim Biophys Acta 1990,1040(1):12-18.

15. Claridge CA, Luttinger JR, Lein J: Specificity of Penicillin Amidases. Proc Soc Exp Biol Med 1963,113:1008-1012.

16. Valle F, Balbas P, Merino E, Bolivar F: The role of penicillin amidases in nature and in industry. Trends Biochem Sci 1991,16(l):36-40.

17. Arroyo M, de la Mata I, Acebal C, Castillon MP: Biotechnological applications of penicillin acylases: state-of-the-art. Appl Microbiol Вiotechnol 2003, 60(5):507-514.

18. Rajendhran J, Gunasekaran P: Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases. JBiosci Bioeng 2004, 97(1): 1-13.

19. Polderman-Tijmes JJ: Biochemical characterization of a-amino acid ester hydrolases. Groningen: University of Groningen; 2004.

20. Deshpande BS, Ambedkar, S.S., Sudhakaran, V.K., Shewale, J.G.: Molecular biology of P-lactam acylases. World J Microbiol Biotechnol 1994,10:129-138.

21. Cole M, Savidge T, Vanderhaeghe H: Penicillin acylase (assay). Methods Enzymol 1975,43:698-705.

22. Oliver G, Valle F, Rosetti F, Gomez-Pedrozo M, Santamaria P, Gosset G, Bolivar F: A common precursor for the two subunits of the penicillin acylase from Escherichia coli ATCC11105. Gene 1985, 40(1):9-14.

23. Barbero JL, Buesa JM, Gonzalez de Buitrago G, Mendez E, Pez-Aranda A, Garcia JL: Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila. Gene 1986, 49(l):69-80.

24. Daumy GO, Williams JA, McColl AS, Zuzel TJ, Danley D: Expression and regulation of the penicillin G acylase gene from Proteus rettgeri cloned in Escherichia coli. J Bacteriol 1986,168(1):431-433.

25. Oh SJ, Kim YC, Park YW, Min SY, Kim IS, Kang HS: Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in Escherichia coli. Gene 1987, 56(l):87-97.

26. Ohashi H, Katsuta Y, Hashizume T, Abe SN, Kajiura H, Hattori H, Kamei T, Yano M: Molecular cloning of the penicillin G acylase gene from Arthrobacter viscosus. Appl Environ Microbiol 1988, 54(ll):2603-2607.

27. Schumacher G, Sizmann D, Haug H, Buckel P, Bock A: Penicillin acylase from E. coli: unique gene-protein relation. Nucleic Acids Res 1986,14(14):5713-5727.

28. Duggleby HJ, Tolley SP, Hill CP, Dodson EJ, Dodson G, Moody PC: Penicillin acylase has a siugle-amino-acid catalytic centre. Nature 1995, 373(65ll):264-268.

29. Kasche V, Lummer K, Nurk A, Piotraschke E, Rieks A, Stoeva S, Voelter W: Intramolecular autoproteolysis initiates the maturation of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1999,1433(l-2):76-86.

30. Lindsay CD, Pain RH: The folding and solution conformation of penicillin G acylase. Eur J Biochem 1990,192(1):133-141.

31. Economou A: Bacterial protein translocase: a unique molecular machine with an army of substrates. FEBSLett 2000, 476(1-2):18-21.

32. Chou CP, Tseng JH, Kuo BY, Lai KM, Lin MI, Lin HK: Effect of SecB chaperone on production of periplasmic penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol Prog 1999,15(3):439-445.

33. Berks ВС: A common export pathway for proteins binding complex redox cofactors?

34. MolMicrobiol 1996, 22(3):393-404.

35. Ignatova Z, Hornle C, Nurk A, Kasche V: Unusual signal peptide directs penicillin amidase from Escherichia coli to the Tat translocation machinery. Biochem Biophys Res Commim 2002, 291(1):146-149.

36. Chou CP, Yu CC, Tseng JH, Lin MI, Lin HK: Genetic manipulation to identify limiting steps and develop strategies for high-level expression of penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng 1999, 63(3):263-272.

37. Chou CP, Tseng JH, Lin MI, Lin HK, Yu CC: Manipulation of carbon assimilation with respect to expression of the рас gene for improving production of penicillin acylase in Escherichia coli. J Biotechnol 1999, 69(l):27-38.

38. Kasche V, Haufler U, Markowsky D, Melnyk S, Zcich A, Galunsky B: Penicillin amidase fromii. coli. Enzyme heterogeneity and stability. Ann NY Acad Sci 1987, 501:97-102.

39. Ignatova Z, S. Stoeva, B. Galunsky, C. Hornle, A. Nurk, E. Piotraschke, W. Voelter and V. Kasche Proteolytic processing of penicillin amidase from Alcaligenes faecalis cloned in E. coli yields several active forms. Biotechnol Lett 1998, 20(10):977-982.

40. Margolin AL, Svedas VK, Berezin IV: Substrate specificity of penicillin amidase from E. coli. Biochim Biophys Acta 1980, 616(2):283-289.

41. Niersbach H, Kuhne A, Tischer W, Weber M, Wedekind F, Plapp R: Improvement of the catalytic properties of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105 by selection of a new substrate specificity. Appl Microbiol Biotechnol 1995, 43(4):679-684.

42. Galunsky B, Lummer K., Kasche V.: Comparative study of substrate- and stereospecificity of penicillin G amidases from different sources and hybrid isoenzymes. Monat fur Chemie 2000,131:623-632.

43. Oinonen C, Rouvinen J: Structural comparison of Ntn-hydrolases. Protein Sci 2000, 9(12):2329-2337.

44. Швядас BK, Марголин A.JI., Шерстюк С.Ф., Березин И.В.: Инактивация растворимой и иммобилизованной пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонилфторида: кинетический анализ и титрование активных центров. БиооргХимия 1977, 3:546-554.

45. Brannigan JA, Dodson G, Duggleby HJ, Moody PC, Smith JL, Tomchick DR, Murzin AG: A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature 1995, 378(6555):416-419.

46. Alkema WB, Hensgens CM, Snijder HJ, Keizer E, Dijkstra BW, Janssen DB: Structural and kinetic studies on ligand binding in wild-type and active-site mutants of penicillin acylase. Protein EngDes Sel 2004,17(5):473-480.

47. Alkema WB, Prins AK, dc Vries E, Janssen DB: Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem J 2002, 365(Pt l):303-309. i

48. McVey СЕ, Walsh MA, Dodson GG, Wilson KS, Brannigan JA: Crystal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism. JMol Biol 2001, 313(1):139-150.

49. Done SH, Brannigan JA, Moody PC, Hubbard RE: Ligand-induced conformational change in penicillin acylase. JMol Biol 1998, 284(2):463-475.

50. Janssen MHA, Sheldon, R.A.: Properties of Immobilised Penicillin G Acylase in p-Lactam Antibiotic Synthesis. Delft: Delft University; 2006.

51. Svedas V, Guranda D, van Langen L, van Rantwijk F, Sheldon R: Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEB S Lett 1997, 417(3):414-418.

52. Dineva MA, Gatunsky В., Kasche V., Petkov D.D.: Phenylacetyl group as enzyme-cleavable aminoprotection of purine nucleosides. Bioorg Med Chem Lett 1993, 3:2781-2784.

53. Piotraschke E. NA, Galunsky В., Kasche V.: Genetic construction of catalytically active cross-species heterodimer penicillin G amidase. Biotechnol Lett 1994,16:119124.

54. Gabor EM, de Vries E.J., Janssen D.B.: A novel penicillin acylase from the environmental gene pool with improved synthetic properties. Enzyme Microb Technol 2005, 36:182-190.

55. Kasche V, Galunsky B, Ignatova Z: Fragments of pro-peptide activate mature penicillin amidase of Alcaligenesfaecalis. EurJBiochem 2003, 270(23):4721-4728.

56. Kumar RS, Suresh CG, Pundle A, Prabhune A: Evidence for the involvement of arginyl residue at the active site of penicillin G acylase from Kluyvera ciirophila. Biotechnol Lett 2004, 26(20): 1601 -1606.

57. Piotraschke E, Nurk A., Galunsky В., Kasche V.: Genetic construction of catalytically active cross-species heterodimer penicillin G amidase. Biotechnol Lett 1994,16:119124.

58. Kumar RS, Prabhune A.A., Pundle A.V., Karthikeyan M., Suresh C.G.: A tryptophan residue is identified in the substrate binding of penicillin G acylase from Kluyvera с it гор hi la. Enzyme Microb Technol 2007, 40:1389-1397.

59. Chiang C, Bennett RE: Purification and properties of penicillin amidase from Bacillus megaterium. JBacteriol 1967, 93(l):302-308.

60. Kang JH, Hwang Y, Yoo OJ: Expression of penicillin G acylase gene from Bacillus megaterium ATCC 14945 in Escherichia coli and Bacillus subtilis. J Biotechnol 1991, 17(2):99-108.

61. Zhang LF, Li ZW, Zhang QJ: Cloning and expression of penicillin G acylase gene in Bacillus megaterium. Chin J Biotechnol 1991, 7(l):63-72.

62. Martin L, Prieto MA, Cortes E, Garcia JL: Cloning and sequencing of the рас gene encoding the penicillin G acylase of Bacillus megaterium ATCC 14945. FEMS Microbiol Lett 1995,125(2-3):287-292.

63. Kang HK, Park JY, Ahn JS, Kim SH, Kim D: Cloning of a gene encoding dextranase from Lipomyces starkeyi and its expression in Pichia pastoris. J Microbiol Biotechnol 2009,19(2):172-177.

64. Lu Y, Chi X, Yang Q, Li Z, Liu S, Gan Q, Qin S: Molecular cloning and stress-dependent expression of a gene encoding Delta(12)-fatty acid desaturase in the Antarctic microalga Chlorella vulgaris NJ-7. Extremophiles 2009.

65. Lu Y, Zhao H, Zhang C, Lai Q, Wu X, Xing XH: Expression of NAD+-dependent formate dehydrogenase in Enterobacter aerogenes and its involvement in anaerobic metabolism and H2 production. Biotechnol Lett 2009, 31(10):1525-1530.

66. Karimi M, De Meyer B, Hilson P: Modular cloning in plant cells. Trends Plant Sci 2005,10(3):103-105.

67. Karimi M, Depicker A, Hilson P: Recombinational cloning with plant gateway vectors. Plant Physiol 2007,145(4): 1144-1154.

68. Cao Y, Lu Z, Sun P, Sun J, Liu Z: Cloning and expression of 3C protease gene from foot-and-mouth disease virus in insect cell. Wei Sheng Wu Xue Bao 2008, 48(3):312-316.

69. Khodabandehloo M, Shamsi Shahrabadi M, Keyvani H, Bambai B: Cloning and expression of simian rotavirus spike protein (VP4) in insect cells by baculovirus expression system. Iran BiomedJ2009,13(1):9-18.

70. Liu Z, Yang G, Li B, Chi C, Wu X: Cloning, co-expression with an amidating enzyme, and activity of the scorpion toxin BmK ITal cDNA in insect cells. Mol Biotechnol 2003, 24(l):21-26.

71. Liu Z, Yang GZ, Chi CW, Wu XF: Cloning and high-level expression of scorpion toxin BmKITal in Escherichia coli and insect cells. Protein Pept Lett 2002, 9(5):419-426.

72. Farrokhi N, Hrmova M, Burton RA, Fincher GB: Heterologous and cell free protein expression systems. Methods Mol Biol 2009, 513:175-198.

73. Schvvarz D, Dotsch V, Bernhard F: Production of membrane proteins using cell-free expression systems. Proteomics 2008, 8(19):3933-3946.81.

Информация о работе

Ясная, Анна Сергеевна
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы