Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и анализ повторов геномной ДНК (BRS1, pEWM, pERV) растений трибы TRITICEAE

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и анализ повторов геномной ДНК (BRS1, pEWM, pERV) растений трибы TRITICEAE"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

Р Г Б о л

УДК. 577.21:575.113.1. / 5 щпг]

УРБАНОВИЧ ОКСАНА ЮРЬЕВНА

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ПОВТОРОВ ГЕНОМНОЙ ДНК (ВИБ 1, рЕ\УМ, рЕЯУ) РАСТЕНИЙ ТРИБЫ ТШТ1СЕАЕ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск -1998

Работа выполнена в Институте генетики и цитологии Национальной Академии Наук Беларуси

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Академик HAH Беларус!

Картель Н.А

доктор биологических наук профессор, член-корр. УААЬ Сиволап Ю.М

доктор биологических наук профессо| Палилова А.Н

Оппонирующая организация: Институт молекулярное

биологии и генетик! HAH Украинь

Защита состоится (ШУиизС 1998 в часов на заседании Совета ш защите диссертаций Д 01.31.01 в Институте генетики и цитологи! Национальной Академии наук Беларуси по адресу: 220072, г. Минск, улиц; Академическая, 27.

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа Национальной Академии наук Беларуси

Автореферат разослан / (JJ-Q/{a3L 1998г.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций ^

Кандидат биологических наук Л.А. Тарутина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Повторяющиеся последовательности ДНК представлены в геноме растений в количестве от нескольких десятков до нескольких тысяч копий. Они составляют до 70% генома ячменя и 75 % генома ржи и пшеницы [138, 240]. По структуре их разделяют на тандемные и диспергированные. Диспергированные повторы представляют гетерогенную, сложно организованную фракцию ДНК. В нее входят транскрибируемые и нетранскрибируемые последовательности, последовательности, содержащие различные открытые рамки считывания, а также ретротранспозон-подобные элементы, такие как BIS 1, BARE-1, WIS 2-1 A, RIOvcop [75, 199,212,194].

Более детальное изучение повторяющихся элементов показало, что им отводится важная роль в структуре генома и в процессах видообразования. Они содержат множество регуляторных элементов [34, 47]. Благодаря высокой копийности диспергированных повторов многие участки генома, включая структурные гены, могут находиться в зоне их влияния. Однако значение их для генома по многом остается неясным. В геноме высших растений на молекулярном уровне исследована только небольшая часть диспергированных повторов. Всестороннее изучение этой фрзкьчги ДНК является одним вз приоритетных направлений современной чслехг/.ткрной генетики.

Программы исследования повторяющихся злемептоз включают в себя такче задачи, как выделение и идентификация ловторой, анализ ях иерг.ачной структуры, изучение способов организации е гсг-хме, филогенетических связей и эволюции, Паяной ¿адачей яипяася использование этих последовательностей в практических селекционно-генетических работах, в частности в качестве молекулярно-генетических маркеров генома. Появилась также возможность использования их для построения генетических карт [143].

Выделение и анализ новых повторяющихся последовательностей ДНК из генома ячменя, ржи и пшеницы позволит расширить представления о структурной организации геномов этих видов.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена в Институте генетики и цитологии HAH Беларуси в рамках комплексной республиканской программы фундаментальных исследований "Продуктивность растений" по теме: "Изучение молекулярной структуры геномов злаковых культур на основе молекулярно-генетических маркеров" (1989-1994 гг. № регистрации 01900010212); и теме "Молекулярно-генетическое изучение организации и экспрессии геномов сельскохозяйственных растений с помощью ДНК зондов и генетической трансформации" (1995-1999 гг. № регистрации 1995858).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы были выделение и молекулярно-генетическая характеристика новых

повторяющихся последовательностей ДНК из геномов ячменя, ржи и пшеницы. Непосредственными задачами исследования являлись:

1) Получение и анализ клонотеки повторяющихся последовательностей ДНК ячменя, ржи и пшеницы, отбор диспергированных повторяющихся последовательностей. Определение количества копий последовательностей BRS 1, pEWM, pERV в геноме ячменя, ржи и пшеницы.

2) Анализ первичной структуры последовательностей BRS 1, pEWM, pERV.

3) Исследование уровня генетического полиморфизма BRS 1, pEWM, pERV среди видов Triticeae.

4) Определение мест локализации на хромосомах BRS 1.

5) Исследование транскрипционной активности BRS 1.

Объект и предмет исследования. Основными объектами

исследования служили ячмень Hordeum vulgare L., линия Waxy, рожь Seeale sereale L. сорт Восход 1, мягкая пшеница Triticura aestivum сорт Мироновская. В работе так же использовали другие сорта ячменя, ржи к пшеницы, 10 видов рода Hordeum,., 6 видов и подвидов рода Seeale, 11 видов и подвидов рода Triticum. Выбор объектов исследования обусловлен важностью их для сельского хозяйства. Предметом исследования являлись повторяющиеся последовательности ДНК.

Методологии и методы проведенного исследований. Методологий основана на проведении комплексных экспериментальных исследований с применением современных модгкулярно-генетических методов. Для создания рекомбинантных плазмид были использованы методы клонирования. С помощью блот-гибридизацни определялось количество копий повторяющейся последовательности ДНК в геномах ячменя, ржи и пшеницы. ПДРФ-анализ был применен для изучения организации клонированных последовательностей в геноме ячменя и других представителей семейства злаковых и определения уровня полиморфизма. Метод полимеразной цепной реакции был использован для изучения структуры части последовательности BRS 1 в геномах сортов и видов ячменя. Первичная структура BRS 1, pEWM, pERV определена методом Максама-Гилберта. Для определения локализации на хромосомах последовательности BRS 1 был применен метод гибридизации in situ. Для того чтобы проверить возможность транскрипции BRS 1 в геноме ячменя, была проведена Northern-гибридизация этой последовательности с суммарным препаратом РНК.

Научная новизна и значимость полученных результатов.

Последовательности BRS 1, pEWM, pERV из геномов ячменя, пшеницы и ржи впервые клонированы и исследованы на молекулярном уровне в данной работе.

Выявлены особенности организации и структуры последовательностей BRS 1, pEWM, pERV. Показано, что они имеют консервативную внутреннюю структуру в рамках вида.

Впервые определена первичная структура повторяющейся последовательности ячменя ВЯБ 1, на долю которой приходится 5% генома этого вида и 1% геномов ржи и пшеницы. Установлено, что ВИЗ 1 диспергирована по всем хромосомам ячменя. Последовательность зарегистрирована в ОепВапк, где ей присвоен номер ЗЯБ-] 1176261.

В составе ВЯБ 1 обнаружена открытая рамка считывания для 337 аминокислот. Показана возможность ее транскрипции в геноме ячменя. Выявлена гомология по аминокислотному составу к ретроэлементу арабидопсиса А(Ы1а.

Впервые показано, что повторяющиеся последовательности рЕ\УМ и рЕЯУ являются членами нового семейства повторов, на долю которых приходится 0.5% генома. Дивергенция их в геноме ржи и пшеницы обусловлена единичными нуклеотидными заменами.

Практическая значимость полученных результатов. Показана возможность использования ВИЗ 1, рЕ\УМ, рЕЯУ в качестве молекулярных маркеров для идентификации геномов и уточнения филогенетических отношений внутри трибы ТгШсеае.

Создана библиотека клонов, обогашенная повторяющимися последовательностями ДНК ржи и пшеницы.

Определена первичная последовательность повтора ячменя, на долю которого приходится 5% генома этого вида. Полученное р?зудьшы зарегистрированы в СепВапк и могут широко исиользоватьс? пег: сравнительном анализе геномов, а также для построения генетических карт.

Экономическая значимость полученных результатов. Работа относится к фундаментальным исследованиям, что не позволяет на данном этапе оценить непосредственный экономический эффект.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Последовательности ВЯБ 1, рЕ\¥М, рЕРЛ' являются новыми семействами повторов геномов ячменя, пшеницы и ржи.

2. Повтор В118 1 диспергирован по всей длине всех хромосом ячменя. На его долю приходится около 5% генома ячменя и 1% геномов ржи и пшеницы.

3. В составе В118 1 имеется блок, состоящий из 11 прямых и 7 инвертированных повторов консенсусной последовательности длиной 16 п.н., и открытая рамка считывания длиной 1011 п.н. для 337 аминокислот. В11Б 1 транскрибируется в геноме ячменя.

4. Последовательности ВЯБ 1, рЕ\УМ, рЕЯУ широко представлены в геноме видов Ногёешп, 8еса1е, ТгШсит. Они показывают консерватизм внутренней структуры в рамках вида и проявляют полиморфизм на межвидовом уровне. ВИЗ 1, рЕ\УМ и рЕЛУ могут служить маркерами для установления родственных связей между видами ТгШсеае.

5. Повторы рЕ^Л и рЕЯУ являются членами одного семейства, общего для пшеницы и ржи. Дивергенция этих последовательностей в геномах ржи и пшеницы обусловлена единичными нуклеотидными заменами.

Личный вклад соискателя. Основные результаты исследований, пред ставленные в диссертации, получены автором работы самостоятельно в лаборатории молекулярной генетики Института генетики и цитологии HAH Беларуси. Результаты гибридизации in situ были получены совместно с J. Fuchs на базе IPK, Германия. Секвенирование Hind Ill-фрагментов BRSi длиной 0.7 и 1.1 т.п.н. было осуществлено автором в Институте генетики и цитологии HAH Беларуси. Часть BRS1 длиной 3.5 т.п.н., включая перекрывающиеся области, была секвенирована в НИИ МБ, НПО «Вектор», Кольцово, Новосибирская область.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации были представлены на: IV всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск, 1990); республиканской конференции «Современные проблемы генетики и селекции» (Минск, 1995); международной конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева (Москва, 1996); VI международной конференции по овсу и VII международном генетическом симпозиуме по ячменю (Канада, 1996); VII съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (Горки, 1997); международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» (Минск, 1998).

Опублшсованность результатов. Основные результаты диссертационной работы были изложены в 6 статьях и 4 тезисах докладов. Общее количество страниц опубликованных материалов - 27.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, перечня условных обозначений, введения, общей характеристики работы, 6 глав, заключения, перечня использованных литературных источников и двух приложений. Полный объем работы - 159 страниц, иллюстраций - 49, таблиц - 3, список использованных источников состоит из 302 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Семена сортов ячменя, ржи, пшеницы, овса и кукурузы были взяты из коллекции ИгиЦ HAH Беларуси. Семена ячменя ортов Blenheivn, Digger, Doublet, Regata, Kimwere получены из коллекции John Innes Centre, Norvich, UK. Семена видов Hordeum, Secale и Triticum получены из коллекции IPK, Gatersleben, Germany.

Ядерную ДНК из различных видов злаков выделяли по отработанной нами методике [13]. Выделение плазмидной ДНК, рестрикцию ДНК, гибридизацию ДНК, электрофорез, клонирование, трансформацию Е. coli осуществляли согласно [20]. Для получения радиоактивной пробы ДНК с высокой удельной активностью использовали метод гексануклеотидного праймера [126, 127]. Секвенирование ДНК проводили методом Максама-

Гилберта в его твердофазной модификации [202]. Выделение РНК проводили с помощью TRIzol.

Реакция амплификации проводилась для праймеров 1 и 2 по схеме: первый цикл - 94° 4 мин., затем 45 циклов - 94° - 1 мин, 56° - 1 мин, 72° - 2 мин., последний цикл - 72° 10 мин. Для праймеров 3 и 4 была использована следующая схема ПЦР: первый цикл - 94 4 мин., затем 45 циклов - 94° - 1 мин, 55° - 2 мин, 72°- 2 мин., последний цикл - 72° 10 мин. Реакционная смесь для PCR анализа содержала в 50 мкл 0,2 мкг ДНК, 0,5 мкг праймеров, 2 мМ каждого dATP, dCTP, dTTP, dGTP, 1ед. Tag-полимеразы (Биотех), буфер (ЮмМ трис-HCl pH 8,0,1,5мМ MgC12 , 50mM KCl).

Гибридизацию in situ проводили в соответствии с [138]. В качестве пробы для гибридизации in situ использовали последовательность ячменя BRS 1. Фотографирование осуществляли, используя Kodak Ertachrome 400 film и Zeiss MC 100 камерную систему (Photometries) и компьютерное обеспечение (Photoshop). Компьютерные фотографии были отпечатаны с помощью Tektronix Phaser IISDX.

Анализ первичной последовательности осуществляли с использованием пакета прикладных программ DNASIS, PC/GENE, DNA-SAN и BLAST Network Service.

Выделение и общая характеристика пог.торяютейея последовательности BRS 1 из tars-2 семейства гхномней ДНК ччме?;::

Повторяющаяся последовательность ДНК ячменя tars-2 семейства бы и: отобрана на основании результатов гибридизация с кДКК, полученной hí: матрице поли(А)-содержашей РНК [24]. Она имеет длину 5 т. п. н. и встроена в плазмиду pBR 322 по EcoR I-сайту. Рекомбинантная плазмпда названа BRS 1 (barley repetitive sequence).

Данная последовательность является высококопийной. Результаты дот-гибридизации показали, что на долю BRS1 приходится около 5% генома ячменя. Она также представлена в геноме ржи и пшеницы, однако количество ее в геноме этих видов меньше и составляет около 1 %. Таким образом, BRS 1 обнаруживает изменчивость по количеству копий в геноме ячменя, ржи и пшеницы. Данный результат предполагает, что расхождение этих видов в процессе эволюции сопровождалось различной скоростью амплификации BRS 1 в геноме.

BRS1 относится к диспергированным, сложно организованным последовательностям генома. Было выявлено, что непосредственно высокоповторяющимися являются Hind Ill-фрагменты BRS 1 длиной 1,1 и 0,7 т.п.н. Фрагменты длиной 1,9 и 1,3 п.н. представлены меньшим количеством копий (рис. 1). Клонированная последовательность ДНК ячменя включает в себя как высокоповторяющуюся фракцию генома, так и фракцию с низкой степенью повторяемости. Высокоповторяющаяся последовательность находится в области от 3 до 5 т.п.н.

12 3 4 5 6 7 8

Рис.1. Рис.3. Рис.4.

Рис. 1. Результаты гибридизации по Саузерну Hind Ill-фрагментов BRS1 с ядерной ДНК ячменя линии Waxy (1, 3, 5, 7) и сорта Minn 90 (2,4, 6, 8) обработанной ферментом Tag I. Длина Hind Ill-фрагментов 1, 2 - 1,9 т.п.н.; 3,4 -1,3 т.п.н.; 5, 6 -1,1 т.п.н.; 7,8 - 0,7 т.п.н.

Рис. 3. Результаты Northern-гибридизации Bgl Ii-фрагмента BRS1 с суммарным препаратом РНК: 1 - из корней, 2,3,4 - проростков. 1,2 -Ячмень линии Waxy; 3. Пшеница сорта Мироновская; 4. Рожь сорта Восход 1. Слева на рисунках указана длина фрагментов в т. п. н.

Рис. 4. Результат гибридизации по Саузерну BRS 1 с геномной ДНК, обработанной ферментом Bgl II. 1 - ячмень линии Waxy, 2- пшеница сорта Мироновская, 3- рожь сорта Восход 1. Справа указана длина в т. п. н.

BRS 1 диспергирована по всему геному ячменя. Гибридизация in situ показала, что BRS 1 распределена по всей длине всех хромосом ячменя. Она не имеет явно выраженных предпочтительных мест локализации, исключая область центормер, в которой сигнал практически отсутствует. Такое распространение не удивительно, принимая во внимание, что на долю BRS1 приходится 5% генома. За время, прошедшее после попадания BRS 1 в геном ячменя, этой последовательности удалось интегрироваться во многие места генома. Этот способ распространения является характерным для ретротранспозон-подобных элементов. Тот факт, что BRS 1 представлена во всех хромосомах, предполагает важность ее для генома ячменя. Многие элементы генома могут находиться в зоне влияния BRS 1.

Анализ первичной структуры BRSI

Последовательность нуклеотидов BRS1 была проанализирована с помощью пакета программ DNASIS, PC/GENE, DNA-SAN (рис. 2). Нуклеотидная последовательность BRS1 была зарегистрирована в GenBank, где ей присвоен номер BRS-1 U76261.

Последовательность BRS 1 характеризуется преобладающим количеством аденина и тимидина. Содержание AT пар - 59.76%, GC пар -40.24%. В среднем в геноме ячменя содержание АТ-пар составляет 59%.

Область последовательности в позиции от 2200 до 2620 нуклеотида содержит блок из И прямых и 7 инвертированных повторяющихся

элементов. Перед ним в позиции от 2176 до 2187 н. расположен короткий обратный повтор. В позиции 2201 н. расположен потенциальный ТАТА-бокс. Распределение блоков носит выраженный неслучайный характер. Основу повторяющегося элемента в этих блоках составляет последовательность: ATACTAATGGCGCACC. Консенсус этой последовательности участвует в формировании трех повторяющихся элементов протяженностью 58 нуклеотидов. В них консенсус расположен в ориентации «прямой-инвертированный-прямой». Консенсус длиной 16 п.н. представлен в блоке дивергированными членами. Вероятно, формирование этой области генома произошло в процессе ряда амплификаций последовательности консенсуса. При этом амплификация сопровождалась дивергенцией 11 блоков консенсусной последовательности.

BRS1 на всем протяжении обогащена прямыми и инвертированными повторами небольшой длины. Кроме области блока повторов BRS1 имеет в составе 28 прямых, 12 обратных и 15 инвертированных повторов длиной не менее 10 нуклеотидов. Они расположены на разном расстоянии друг от друга и могут иметь значение для поддержания вторичной структуры ДНК.

В составе BRS 1 обнаружена открытая рамка считывания (ОРС) в позиции от 3604 до 4613 п.н. Она кодирует последовательность для 337 аминокислот с суммарным молекулярным весом 38126 Д. ОРС находится в той части BRS 1, которая составляет фракцию высоко повторяющейся ДНК.

В открытой рамке считывания так же, как и на всем протяжении BRS 1, наблюдалось преобладание АТ-пар: А - 312, С - 195, G - 192, Т - 312. Непосредственно к открытой рамке считывания прилегает область из 145 н. с явным преобладанием пиримидинов: А - 11, С - 44, G - 21, Т - 69. В позиции от -3 до -10 находится обратный повтор CTGA/AGTC. За ним следует блок коротких повторов CTTG и далее вся область, непосредственно примыкающая к ОРС, состоит из коротких прямых и обратных повторов. За терминирующим кодоном находится полипуриновый тракт AGGAAAAA. Анализ аминокислотного состава ОРС показал, что она содержит все возможные аминокислоты. Количество их разное.

Последовательность BRS1 в позициях до 3603 и с 4618 можно рассматривать как некодирующую ОРС. В составе BRS1 обнаружены различные функциональные сигналы. Она содержит мотив, прилегающий к промоторной области межгенного спейсера рДНК у злаков TATAGTA в положении 1313 и 1407 н. В положении 476, 2874 и 3575 н. расположены потенциальные энхансерные последовательности TGTGTG. Анализ, проведенный с помощью PC/GENE, показал, что BRS1 содержит 28 потенциальных ТАТА-боксов. BRS1 в позиции с 2670 по 3064 нуклеотид обнаруживает высокую степень гомологии к фрагменту геномного клона глиадинового гена пшеницы (порядковый номер в GenBank U08287). Гомологичный фрагмент длиной 281 н.п. и степенью соответствия 82,4% находится за пределами самого глиадинового гена.

g

1 GAATTCAGAA GAGGGATGGT TCGCATAACT CAATATGGAC GTGCACCTTT GTTAGGATAA

61 TATAAATGTT CATCTAGTTC TCTATAGCAT TGCATCTCAA ACTTTCAAGA ATGCACGTGA

121 GATCATTTTG TCGTTTTACC TTTGTAGTGG CAATTCGATG GTGCTAAGAT TTATAAGGCA

181 CCTTTGGGAT GGTGGCAAAT CATAGCTTTT AAATTAGCCT CATATTTAAA CAATTCAGAA

241 TCAGATGGAA GACTACTTGA CTCAGACTTT CAACGACGCA CTATATTGAT GAATGATGTG

301 CACTTGTTTA TCTTGTTCTT CTAGGCGACC TGGTGAGATG CATAACGGGT GGTGGTGTCT

361 TTTGCGGATG CTGATGCATG GTGACTCAAG CTCTATGTTC TTTGAAGATT GAAATCCTTA

421 TGTCCTACTT GTTGTGGTTA TGTÎGAGAGC TTCATGTTTA TCTGAATGTG TCTTTTGTGT

481 GTGCAGTATT CTGGAATTTG TGACCTACTT GAACCTTAGT TGTCGATTGC TTGTCATTTA

541 ATATGGTTAA TGGTCAGGTT ATACATCATG TTAATTCGAA GTTGACACTA ATATGCCTAG

601 TCTTATTTCC TTGTAGCTGC TGGTTTGGTG CATTTTGGAT TGCCCGGTTG GTACTAATAT

661 GCCTAGTCTT ATTGCTGCTA GCTATTTCTT CTTTAAGATT TGCTTTGCCA ACGATCTGCA

721 TGGATCTTGT GGTTATTTTG TCGGCTGCTT TGCTGATGCC TTCCATCCTC AGCCTTGCTA

781 ATCAATGGAG CAACAGGCTG AGCCTGAGTC TTGTATTGTG TAGCACACTA TCAAGCAGAG

841 CTAGTCTGTT TCAACTCAAA TCTACCCTTC GGTGAGTGTG TCCTCCGAAT ATGGTGCACC

901 TACGAATGTT GAATGCAATG АТТТТАСЛАТ GCAGTTCATA TGATAGGTAT GTTTGTTGGC

961 TTATCGCAAT GATCTCAATA TCATGATCTA AGTATTCTTT TCGAAAGTGT TCAGTTCAGT

1021 AACTTTATAG AACATTTAGT TGCATGGGTC AACGGCAGGA GCCTGAAATG CCTCGTTGAC

1081 CATCCTTGAT GTATATCTAC TTATGTACTC ACTCCGTCTC AAAATAAGTG ACCCAAAAAT

1141 GACTCAGCTT TGTATTAATT TTGGGATGGA GGGAGTACTA TAACACTAAA AAGGTATAGA

1201 GTAACATTGT TAGTTTGCTA CAGATTATCT TTACTAGTTC GAGAAAAATG GAGTTTAAAT

12 61 TTGTTGTGGC TTGGTGAACA CAACTTTGTA AAGAAACAAA TGTGCTCAGA CATATAGTAG

1321 ATAATTCAAT ACAGAGAAGT GTGTACTTAT AGTGTGAACA AAGAAGTCCA TAATTCACTT

1381 AATACTTCAG AGAGAAAATG TGTAGTTATA GTAGATAGCA ACAGACATAT AGCGGGTAAC

14 41 CTATACTAGT TGAAATTCAA ATCGTAGTGA ACCAACAGAG CAACCGCTGC TAGTAGTGCG

1501 TGTCTGTGGC TGACCTGGAG GCACCTTGGT TTTTCAGTTC TCCTTAATTG TTATTTGATT

1561 TTCAGAATTT TACATGTATT TTACATGTTG A1CTTACAGG ACCATGTCAG TGTCTTCTAG

1621 AGATTAAATT CÄTGTTTAGT TAATGCTTGT GTTGCTGCTT AGATGGTGCA ACATTGAAAG

1681 TATCATGGTA CAATCTATTC ATGTTTAGTT AATGCTTGTG ATGGACAGAA TGGCCTGTTG

1741 AGGAACAGTG CAGTTCCTGT TGAGGATAGT GTTGTTGTTG CAAGTAGCAT GGTCCTTACA

1801 CAACCTGAGG TAGAAGGCAA GGAAGATTTG CÄACAGACAA GTAGTGATGA TAATTCTGTG

пр. 1

18 61 AGTCAAAAGC TTTCTGATGG ACAGAGTACA AAGGGTACAC CACAAGGGAG GAGGCGGAAG

1921 TTAGATATCG ACTTGTAATG TGATGGTAGT TTAGATGATC GATATCGACT TGTAATGTGA

1981 AGACAAACTC GCTACTCGCG GTCTCGAGAC TTGTAATGTT CTAACTTTGT TCGGTATTTT

2041 AAATTCAGAG ACTAATATGA TGAATTGTAT TCGGAGACTA ATCTTCTATT CTACTCGATA

2101 AATCTGTTGT TTATATGTTG TGCTCTCTAT ATTCTGTGCA ATAATATGTT TTGTAATCTG

2161 TGCAAATATC AGAAAÍAATA AAATAAATAC CTAATATTCA TACTAGTGGC CCACC&CTGA

2221 GCAGrTTAST GCCGCAcfec AAAAGCACAC TAGTSGCGCA T<?STCAAC$A GTGCGCCATT

2281 AGKIAGCCAG AGCACATGGG TAAATATGGC CCTGGGAGGC ATACTAATGG CGCACCATAA

2341 GCTATATTAA TGSCGCACCA GGAGGTGCTC CATTAGTATh CCAGATACTA ATGGCGCACC

2401 AGGAGCTATA CTAATGSCGC ACTTCTTGGT OCCGCATTAQ TAERCTAGAT ACTAATGGCG -► - -►

24 61 CACCGTGAGC AATACTAATG GCGCACTGCC TGGTOCGCCA ТТАвТЛТАСС AGATACTAAT

2 521 GGCGCACTTG TGGTGCGCCA ТТАвТАМЛА AATATAATGG CATGATGCTA GTGGCGCACC

2581 TACAGTGCGT CATTAGTAGC СААААДАССГ GCGTCATTAG CAAGCCITTT CCTAGTAGTG

пр. 2

2641 TATGATTCTT GCAATGGGAT AAGTGCTTTO TTTTGGCTTC ATACCGTGAA GTGACCTCAC 2701 CCAGTGACAG AAGGAATAGC GAGGCACGCA TCATGTTGTT GCCATCAGGG GTAAAAAGAT

2761 GGGGTTTTCA TCATTGGTTT GAGATTATCC CTCTACATCA TGTCATCTTT CTTAAAGCGT

2821 TACTCTGTTC GTCATGAACT CAATACACTA GATGCATGCT GGATAGCGGT CGATGTGTGG

2881 AGTAATAGTA GTAGATGTAG AAAGTATCGG TCTACTTGTC TCGGACGTGA TGCCTATATG

2941 TATGATCATT GCCTTAGATA TCGTCATGAC TTTGCGCAGT TCTATCAATT GCTCGACAGT

3001 AATTTGTTCA CCCACCGTGA TACTTGCTAT TTTGAGAGAA GCCTGTAGTG AACACTATGG

3061 ACCCGAGGGT CTACTACACA CCATATITTC AGCCTTACAC TTTTTACTTC GTTGCACTTT 3121 CCGCCTTCAG ATCTCACTTT ACAAACAATC TTGAAGGGAT TGAAAACCCC TTTGAAGCGT 3181 TGGGTGCAAG CTTGTTTGTG TTTGCGCAGG TACTCTGGAC TCGACGAGAC CCTCCTTCTG 3241 GATCGATACC TTGCTTCTCA AACTCAGGGA AATACTTACT GCTCCCGTGC TGCATCACCC

3301 TTTCCTCTTC TAGGGAAAAA CCAATGCAAG CCCAGCCTCT GTCAACGTGT CAATTTCTGG

3361 CGCTGTTGTC TGTGGGATAG CAGAAGGATT TCTCGCGCCG TTGCCGGGGA GGAAGATCAA

3421 GTCAAGAACT CATCCAAGTA GGTGTCGCAA ACTCATCTCT TGCATTTACT TTGTTTGCGA

3481 GTTGCCTCTC GTTTTCCTCT CCCCCACTTC ACCAATTTGi? CTTTTTTCAT TCtltcTTTTC

3541 GTTCGCCCTT TTTCTCGT?T*GCTCTTTGTT TGCTpGTGTGj CTltecrfccT EGC^AA&TC

3601 ACCATGAATG AAAACACCAA ACTTTGTGAC TTCTCGAATA CTAATAATAA TGATTTTATT

M—N—E --N--T--K--L--C—D-- F--S—N--T —N—N--N--D--F--I--

3661 AGTACTCCGA TTGCTCCCGC CACTAATGCG GAGTCATACG AAATCAATGC CGCTTTGCTG S—T--P--I —A—P--A- -Г—N--A-- E—S—Y—E — I—N—A- -A—L—b— 3721 AATCTTGTTA TGAAAGAGCA ATTCTCTGGC CTTCCTAGTG AAGATGTCGC ATCCCATCTC N--L--V--M — К—E—Q- -F~S—G— L—P—S—E —D—V—A- -S—H—I— Пр.З

37 81 AATACCTTCA TTSACCTTTS CGATATGCAA AAGAAAAAAG ATGTGGATAA TGACGTGATT

N--T--F--I — E—L--C--D—M—Q— K--K--K--D --V—D—N--D--V--I--

3841 AAATTGAAGC TTTTTCCTTT CTCGTTGCGA GACCGCGCAA AAACTTGGTT TTCTTCTTTG

K—L—K--L — F— P—F- -S--L--R-- D—R—А—К —T~W—F--S—S--L--

3901 CCCAAAAGTA GTATTGATTC TTGGGATAAG TGCAAAGATG CTTATATATC CAAGTATTTT P—K—S —S —I —D—S- -W—D--K— C--K--D--A — Y--I — S- -K--Y--F--3961 CCGCCGGCTA AGATCATCTC TCTCCGTAAT GATATCATGA ATTTCAAGCA ACTTGATCAT

P--P--A—К —I —I—S--L--R--N-- D—I--M--N — F--K--<2- -L--D--H--

4 021 GAACATGTTG CACAAGCTTG GGAGAGAATG AAATTAATGA TTAGAAATTG TCCCGCTAAT E—H—V--A --Q--A--W- -E--P.--M-- K--L--M--I —R—N—С- -P—A—N— 4081 GGCTTGAGTC TTTGGATGAT TATTCAAATC TTTTACGCTG GCTTGAATTT CGCTTCTAGA G--L—S—L --W--M—X- -I—Q—I— F--Y--A—G —L--N--F- -A—S —R~

Пр.4

4141 AATATCTTGG ACTCC3CCAC AGGTGGAACG TTCATGGAAA TCACATTAGG GGSASCCACA N — I--L—D —S—A—T- -G—G--T— F—M—E—I --T--L--G- -E--A--T--4201 AAGCTCTTAS ACAACATCAT GACAAACTAC TCTCAATGGC ACACTGAAAG GTCACCTACT K~L--L--D —N~I— M- -W—I4--Y— S—Q—W—H — T--E--R- -S--P--T--4261 AGTAAGAAGG TACACGTTAT AGAAGAAATT AACTCGTTGA GTTCTAAGAT GGACGAGTTA S--K—К—V --H—V—I- -E--E--I— N--S—L--S — S--K--M- -D—E--L— 4321 ATGAATTTGG TTGCTAGTAG AAGTGCTCCT TTGGATCCTA ATGATATGCC TTTGTCTTCT fl—M—L--V --A--S—R- -S--A--P-- L—D--P--N —D--M--P- -L—S—S— 4 381 TTGATTGAGA GTAGCAACGC TAGCTTGGAA GTTAATTTTG TTGGTAGGAA TAATTTTGGC L—I—E—S —S—N—A- -S--L--E— V—N--F—V --G—R—N- -N--F—G--44 41 AACAACAATG CCTTTAGAGG AAACTATGTT CCTAGGCCTT TTCCTAGTAA CTCCTCTAAT N--N--N—A --F--R--G- -N--Y—V— P—R— P--F --P--S--N- -S--S--N--4501 AACTTTGGCA ACTCCTACAA CAATACTCAT GGAAATTACA ATAGATTACC CTCXGATCTA N—F~G--N — S—Y~N- -N--T--H-- G—N—Y—N --R--L—P- -S—D--L--4561 GAGAGTAATA TCAAAAAGAG TTCATCAACG CTCAAAAGAT TTTCAATGCG TCCATAGAGG E—S—N—I --K--K--S--S — S--T-- L—K--R—F —S—M—R- -P-

4 621 AAAAACTACT CAAAATTGAC GATTTGGCTA AGAGCATGGA TATAATTTCT TGTGATGTTG 4681 ATGCTTTGAA AGTTAGATGT GCTCCTCCCA AAATCAACAT GGATGAAACT TTGAAAGCTA 4 741 TGCGTGTTTC CATGATAGAG AGCCAAGAAA GAACTGCCGA AATTCGTGCT AGACATGAAT 4801 GGCTTAAAAA GGCGTGTTCT CGTGATGAGA ATCACGAAGA TCTTAAAGTG CTTGGTGTGA 4861 ATCCCATTGA ATCTTTGTTT TCTTGTGTCA AACCCAATGA TTATGGGGCT ATATATGAAT 4921 CCACTTTGGT TGAAAAGTGC CCCAATGATT CGGAGTCCAT CTATCTTGAT GCTAAAAGCA 4981 TTAAAGTGGA GTAGAAGACT TTAAAACTTT GAGTAGTAAT GAAATTACTA CAGTGGATTT 5041 CAAGGAATTC

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность клона ячменя BRS 1. Подчеркнута область, включающая блок повторов. Курсивом с подчеркиванием выделена область, гомологичная фрагменту клона пшеницы (номер в GenBank U08287). Жирным шрифтом обозначены праймеры для ПЦР. Стрелками выделены короткие повторы. Рамкой ограничен энхансерный элемент. Открытая рамка считывания находится в положении от 3604 до 4615 н.

В большей степени родственных либо подобных последовательностей в базе данных GenBank и EMBL не обнаружено. Следовательно, нами клонирован и охарактеризован новый тип повторяющейся последовательности ДНК ячменя.

BRS 1 транскрибируется в геноме ячменя. Это показано с помощью Northem-гибридизаци BRS 1 с суммарным препаратом РНК (рис. 3). Гомологичный BRS 1 фрагмент присутствует во фракции РНК, выделенной из корней ячменя. Во фракции РНК из проростков транскрипция BRS 1 не обнаружена. РНК, гомологичная BRS 1, имеет длину 1 т. п. н., что соответствует длине ОРС. Наблюдаемая транскрипция BRS 1 является тканеспецифичной. У ржи и пшеницы не обнаружено гомологичной РНК.

В результате сравнительного анализа с базой данных NCBI с помощью BLAST Network Service было обнаружено, что BRS 1 в открытой рамке считывания имеет достоверно значимую гомологию по 289 аминокислотам к ретротранспозон-подобному элементу Arabidopsis thaliana (L.), названному авторами Athila [69]. В BRS 1 присутствуют такие характерные для подвижных элементов структуры, как PBS (праймер-связывающий сайт, область, гомологичная клеточной тРНК):

АТТТ—GGCGCCGTTGCCAG - PB S Athila в положении от 1539 н.

Mil IIIIIIIIII I I

ATTTCTGGCGCTGTTGTCTG - гомологичная структура BRS1 в

| | | | | | | | | | | | | | | | | | положении от 3358 н.

ATTTCTCGCGCCGTTGCCGG - и в положении от 3393 н.

Эта структура в BRS1 расположена перед ОРС.

Athila не имеет гомологии к другим ретроэлементам. Две ОРС Athila кодируют последовательность аминокислот с неизвестными функциями. Сведений об BRS 1 и Athila недостаточно, чтобы считать клонированную последовательность ячменя ретроэлементом, но вполне вероятно, что они принимали участие в ее формировании.

Более значимой гомологии к аминокислотным последовательностям в базе данных NCBI выявлено не было. Таким образом, ОРС BRS 1 кодирует аминокислотную последовательность, значение которой не удается выяснить сравнительным анализом ее первичной структуры.

Анализ внутри- и межвидового полиморфизма BRS 1

Внутри вида BRS 1 показывает консервативность структурной организации. Различные сорта ячменя не обнаруживают полиморфизма при использовании BRS 1 в качестве зонда (рис. 5). Расположение в геноме разных сортов ржи и пшеницы последовательностей, гомологичных BRS 1, оказалось практически таким же консервативным, как и у ячменя. Полученные результаты согласуются с литературными данными о низком уровне внутривидового полиморфизма диспергированных повторов. В тоже время расхождение видов ржи, пшеницы и ячменя в процессе эволюции сопровождалось изменением структуры и организации в геноме

последовательностей, гомологичных ВЯБ 1 (рис. 4). В геноме кукурузы и овса ВЯБ 1 представлена в значительной степени дивергированными членами.

Изменения в структурной организации ВИЗ 1 наблюдаются также среди видов Ногёеит. В работе было исследовано 10 видов ячменя. ВЫ8 1 представлена в геноме всех этих видов.

П2345вге»10

Рис. 5. Рис. 6. Рис. 7.

Рис. 5. Результаты гибридизации по Саузерну BRS 1 с ядерной ДНК ячменя, обработанной ферментом Hind III. Сорта: 1 - Brachytic; 2 -Эректум; 3 - Chlorina; 4 - Роланд; 5 - Свитязь; 6 -Minn 90; 7 -Фуркатный; 8 -Жодинский 5; 9 - линия Waxy.

Рис. 6. Результаты гибридизации по Саузерну BRS 1 с геномной ДНК видов Hordeum, обработанной ферментом BspR 1.1- Hordeum patodii; 2 - Н. secalinum; 3 - Н. jubatum; 4 - Н. flexuosum; 5 - Н. chilense; 6 - Н. marinum ssp. marinum; 7 - H. murinum ssp. leporinum; 8 - H. bulbosum ssp. bulbosum; 9 - H. vulgare линия Waxy; 10 - H. spontaneum ssp. spontaneum.

Рис. 7. Результаты гибридизации по Саузерну BRS 1 с геномной ДНК видов Hordeum, обработанной ферментом Tag I. 1 - Hordeum patodii; 2 - Н. secalinum; 3 - Н. jubatum; 4 - Н. flexuosum; 5 - Н. chilense; 6 - Н. marinum ssp. marinum; 7 - H. murinum ssp. leporinum; 8 - H. bulbosum ssp. bulbosum; 9 -H. spontaneum ssp. spontaneum; 10 - H. vulgare.

Слева на рисунках указана длина фрагментов в т. п. н.

К группе, содержащей I геном, относятся Я. vulgare, Я. spontaneum и Я. bulbosum [108]. Результаты ПДРФ-анализа показывают, что между Я. vulgare и Я. spontaneum не наблюдается различий в структурной организации BRS 1 (рис. 6,7). В тоже время распределение BRS 1 в геноме предполагает, что Я. bulbosum дивергировал от видов Я. vulgare и Я. spontaneum раньше, чем они друг от друга. При этом Я. bulbosum ближе к видам Я. vulgare и Я. spontaneum, чем к видам с Н, X и Y геномами. Я. bulbosum был выделен в одну группу с видами, содержащими I геном, на основании цитогенетических данных [77, 108]. Более поздние исследования на молекулярном уровне показывают, что Я. bulbosum генетически отличается от видов с I геном [45, 230]. Предполагается, что предок Я.

sponîaneum и Я. bulbosum вначале отделился от других видов Hordeum, а затем эти два вида разделились на самостоятельные. Полученные нами результаты согласуются с данным предложением о происхождении видов Я. spontaneum и Я. bulbosum. Близость генома Я. bulbosum к геномам Я. vulgare и Я. spontaneum по сравнению с другими видами хорошо видна при применении рестриктазы Tag I. Характер распределения BRS 1 в геноме предполагает, что виды с I геномом отделились в процессе эволюции от видов с Y, X и H геномами раньше.

Виды с X геномом (Я. marinum) и Y геномом (Я. murinum) отличаются друг от друга и от видов с I и H геномами. При этом Я. murinum ближе к видам с H геном. Я. patodii, Я. secaiinum, Я. jubatum, Я. flexuosum, Я. chilense относятся к видам, содержащим H геном. Между собой они показывают низкий уровень полиморфизма. При рестрикции Tag I разница между видами с H геномом и видами с I,Y и X геномами отчетливо заметна. У видов с H геномом гомологичные BRS 1 фрагменты расположены преимущественно в области 5 т. п. н. У видов с I геномом они представлены в области от 5 до 0.5 т.п.н. Полученные результаты хорошо согласуются с современной классификацией рода Hordeum [77]. Они так же согласуются с результатами, полученными при филогенетическом анализе рода Hordeum с помощью повторяющейся ДНК [230].

BRS 1 представлена в геноме 9 видов Triticum. Гомологичные фрагменты длиной от 2 до 0.5 т.п.н. показывают низкий уровень полиморфизма (рис. 8). У видов Secale cereale, S. vavilovii, S. sylvestre, S. strictum обнаружены различия в структурной организации BRS 1 в их геном (рис. 9,10). Наблюдаемые различия могут быть вызваны как дивергенцией нуклеотидного состава BRS 1, так и транслокацией участков хромосом, вклучающих блоки BRS 1.

Рис.8. Рис.9. Рис.10.

Рис. 8. Результаты гибридизации геномной ДНК видов Triticum, обработанной ферментом Bgl II, с BRS 1. 1 - Triticum dicoccoides ssp. spontaneovillosum; 2 - Т. turgidum ssp. salomonis; 3 - T. turanicum; 4 - T. polonicum ssp. levissimum.; 5 - T. durum ssp. melanopus.; 6 - T. carthlicum ssp. julignosum; 7 - T. aestivum ssp. aestivum; 8 - T. aestivum ssp. icerinum; 9 - T. timopheevi ssp. timopheevi; Пшеница сортов 10 -Золотая нива; 11 -Мироновская; 12 -Купалинка; 13 -Ячмень сорта Жодинский.

Рис. 9. Результаты гибридизации по Саузерну BRS 1 с геномной ДНК видов Secale, обработанной ферментом Bgl II. 1- Secale cereale ssp. cereale; 2 - S. vavilovii; 3 - S. sylvestre; 4 - S. strictum ssp. strictum; 5 - S. strictum ssp.kuprijanovii; 6 - S. strictum ssp. anatolicum; 7 -. strictum ssp. afrikanum. Рожь сортов: 8 - Крона; 9 - Восход 1; 10 - Чулпан; 11 - Калинка; 12 -Верасень 5; 13 - Литовская 3; 14 - Харьковская 60; 15 -Харьковская 60 (ДНК выделена из корней).

Слева на рисунках указана длина фрагментов в т. п. н.

Рис. 10. Результаты гибридизации по Саузерну плазмиды BRS 1 с геномной ДНК ржи, обработаной ферментом Tag I. Справа указана длина фрагментов в т.п.н. 1 - Рожь сорта Крона; 2 - S. cereale ssp. cereale; 3 - S. strictum ssp. kuprijanovii; 4. - S. strictum ssp. anatolicum; 5 - S. strictum ssp. afrikanum; 6 - S. sylvestre.; 7 - S. vavilovii.

Часть BRS 1 исследована с помощью ПЦР с целью более детального анализа ее структуры.

Рис.11 Рис.12 Рис. 13

Рис. 11. Электрофорез в 2% агарозном геле продуктов ПЦР. 1 - ДНК фага лямда, обработанная рестриктазой Pst I; Пшеница сортов: 2 -Chinespring, 3 - SQI; 4 - картофель линии 27; Ячмень сортов: 5 - Blenheivn, 6 - Digger, 7 - Doublet, 8 - Regata, 9 - Kum, 10 - Beresinskii, 11 - линии Waxy.

Рис. 12. Электрофорез в 1.5 % агарозном геле продуктов ПЦР с пр. 1 и 2. 1 - ДНК фага лямда, рестриктированная Pst I; Ячмень сортов: 2 - Тибет, 3 - Свитязь, 4 - Фуркатный, 5 - Achermans, 6 - Minn 90, 7 - Hiproly, 8 -Жодинский 5, 9 - Зазерскиий 85, 10 - Роланд, 11 - Эректум, 12 - Brachitic, 13 - Chlorina, 14 ~ Chlorina (ДНК выделена из корней), 15 - линии Waxy.

Рис. 13. Электрофорез в 1.5% агарозном геле продуктов ПЦР с пр. 1 и 2. 1 - Hordeum bulbosum ssp. bulbosum, 2 - H. flexuosum, 3 - H. murinum ssp. leporinum, 4 - H. marinum. ssp. marinum, 5 - H. secalinum, 6 - H. patodii, 7 - H. jubatum, 8 -. H. spontaneum ssp. spontaneum, 9 - ДНК фага лямда, обработанная рестриктазой Pst I.

Слева на рисунках указана длина фрагментов ДНК в п.н.

Праймеры 3 и 4 ограничивают область в ОРС в положении от 3786 до 4211 н. этот участок BRS 1 имеет длину 426 п.н. и включает в себя область, имеющую гомологию по аминокислотному составу к ретроэлементу Athila. Результаты ПЦР показывают, что амплифицированный фрагмент в геноме разных сортов ячменя не претерпел изменений типа протяженных инсерций или делеций. Он стабильно наследуется в геноме сортов ячменя разной

селекции. Таким образом, результаты амплификации подтверждают, что BR.S 1 имеет консервативную внутреннюю структуру в области ОРС. Вероятно, она находится под действием естественного отбора.

Праймеры 1 и 2 ограничивают область от 1908 до 2681 н. длиной 774 п.н. В эту область входит блок повторов. В геноме сортов ячменя продукты амплификации кроме основной области длиной 774 п.н. имеют длину 1.3; 1.0; 0.5 т.п.н. У некоторых сортов обнаружены дополнительные фрагменты. Таким образом область, включающая блок повторов, оказывается более полиморфной, чем область ОРС. Полиморфизм области, ограниченной праймерами 1 и 2, наблюдается так же между видами Hordeum.

Выделение и анализ диспергированных повторяющихся последовательностей ДНК из геномов ржи и пшеницы

Из геномов ржи и пшеницы клонированы повторяющиеся последовательности ДНК длиной 1,7 т.п.н. Полученная клонотека содержала более 1000 рекомбинантных плазмид с фрагментами ДНК генома ржи и пшеницы. Из нее были отобраны диспергированные повторы. Полученные плазмиды с последовательностью ДНК пшеницы сорта Мироновская и ржи сорта Восход 1 получили название pEWM и pERV для пшеницы и ржи соответственно. Последовательности были клонированы по Bgl II сайту и встроены в плазмиду pUC 18.

На долю клонированных последовательностей приходится около 0.5% генома ячменя, ржи и пшеницы. В геноме ячменя, ржи и пшеницы плазмиды pEWM и pERV представлены меньшим количеством копий, чем BRS 1.

Сходная картина гибридизации плазмид pEWM и pERV с рестриктированной геномной ДНК трех видов злаков указывала на то, что клонированные повторяющиеся последовательности ДНК могут являться членами одного семейства. Это было подтверждено сравнением нуклеотидного состава двух фрагментов плазмид pERV и pEWM. Как видно из рис. 14, фр.2. пшеницы и ржи показывают высокий уровень гомологии равный 93.4%. Уровень гомологии фр. 1 - 92.4%. Дивергенция первичных последовательностей ржи и пшеницы вызвана простыми делециями и заменами отдельных нуклеотидов. Протяженных инсерций или делеций не выявлено. Дивергенция нуклеотидного состава является важным фактором в эволюции видов и сопровождает процессы видообразования. По различиям в нуклеотидном составе повторов один вид можно отличить от другого. Так, пшеница и рожь отличаются друг от друга по составу нуклеотидных последовательностей pEWM и pERV. Предполагается, что дивергенция повторяющихся последовательностей может играть существенную роль в изоляции возникающих видов.

Нуклеотидная последовательность фрагментов плазмид pEWM и pERV сравнивалась с помощью BLAST service с базами данных Gen-Bank+EMBL+DDBJ+PDB. В результате сравнения обнаружена гомология

на уровне 64% на участке длиной 125 п.н. между фр.2 и повторяющейся последовательностью в. сегеа1е 11173-1 (номер в ОепВапк Х64100:8СШ731). Степень дивергенции фр.2 и повтора Б. сегеа1е Ш73-1 выше, чем у

клонированных последовательностей относительно друг друга. -►

1

рЕи'М ТТАТССАСТТ БАТСАТСАТА ТТСССТСТАТ СТСТТАТАСС АСААТетТСС ОАСАССААТА

I I I I I I IIII I I I I I I ! I I I 1111 11111 II I I 11111 I I I I ! I I I II I I рЕИУ ТТАТССАСТТ САТСАТСАТА ТТССТТСТАТ СТСТвАТАСС АСААТСТТСб АСАвСААТАТ Я-►

рЕ\УМ ТТСАТСАТСА ТТТТСТТАСС ССТАТЮСТТ СТТСТСАТвА ТТАТААТТСв СААБАТААТС I 11111111 IIIIIIIII М I I I ! I I I I 1111 I II II I I I I I I II IIIIII I I I I рЕКУ Т-САТСАТвА ТТТТСТТАСС ССТАТТССТТ СТТСССТАСА ТТАТААТТСС СААСАТААТС 121

рЕЧУМ АТАСТААТАА ТСТТССАААТ СТТТТТСССА ССАвСТТССС АААТТАТвАТ САТАвТААТТ I II I ! I I III 11111 II I I I И I I I I I I I I I I I II II I I II I I I II I I I I I I I II I I рЕЯУ АТАСТААТАА ТСТТСААААТ СТТТТТСССА ССАССТТССС АААТТАТвАТ вАТАвТААТТ 181

рЕ^/М вТТАТАССвТ ТваТвСТАТТ САТАСТТТТА АТвАТвАвАв ТвАТТАТЗТТ ГЛТСАГАТСС 1111111111 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III I I I I I I I I I I I I I I I I I I I рЕЛУ СТТАТАСССТ ТСвТвСТАТТ САТАСТТТТА АТвАТвТСАв ТОАТТАТвТС ТАТСАТАТСС

241 -►

рЕ\УМ СМвССАСЛА вСТТвввСАТ вСТАТСТТТЗ АТОАСААТвА САТвТТТСАа ААТТТАТТТС III III I I I 1111111111 11111 II <I III I I I I I I 1111111111 III I I И I I I рЕКУ СААСССАСАА ССТТСвавАТ вСТАТСТТТв АТвТвААТвА САТСТТТвАС ААТТТАТТТС

301 _

рЕАУМ СТТСААТТАА ТОТТТСТССС ААССТТСССС АТСАТАТССТ ТААТСААСС I I 111111 I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I рЕЯУ ССТТААТТАА тсттгетссс аасстгсссс атсататсст таатсласс

Рис. 14. Нуклеотидная последовательность фр.2 пшеницы рЕАУМ и ржи рЕЮ/. Стрелками обозначены прямые повторы. Курсивом выделена область гомологии к фрагменту повторяющейся последовательности Б. сегеа1е Я173-1 (номер в ОепВапк Х64100:8СШ731).

Более значимой гомологии обнаружено не было. Следовательно, нами клонирована новая семья диспергированных повторяющихся последовательностей из генома ржи и пшеницы.

В рамках вида рЕЛУ и рЕ\УМ проявляют консерватизм внутренней организации. Изменение структуры последовательностей рЕЛУ и рЕ\УМ наблюдается между видами ячменя, ржи и пшеницы. В геноме 10 видов ТгШсит они отличаются низким уровнем полиморфизма. Клонированные повторы ржи и пшеницы могут служить молекулярно-генетическими маркерами для видов Ногёеиш. При этом Н. Ьи1Ьозит также отличается от видов с I геномом. Результаты, основанные на анализе изменений структуры последовательностей рЕЛУ и рЕ^УМ в геномах видов НогсЗеит, совпадают с результатами, полученными при исследовании ВИЗ 1, а так же с современной классификацией рода Ног(1еит и анализом других повторяющихся последовательностей. Таким образом, расхождение видов в процессе эволюции сопровождается изменениями структуры и организации последовательностей ВИЗ 1, рЕАУМ и рЕЛУ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Комплексное исследование повторяющихся последовательностей ДНК из генома ячменя, ржи и пшеницы позволило сделать следующие выводы.

1. Последовательность из генома ячменя BRS 1 является членом нового семейства повторяющихся последовательностей ДНК, на долю которого приходится около 5% генома этого вида, 1% генома ржи и пшеницы. Установлено методом гибридизации in situ, что BRS 1 диспергирована по всей длине всех хромосом ячменя. Последовательность зарегистрирована в GenBank, где ей присвоен номер BRS-1 U76261 [1, 2, 5, 6, 7, 8].

2. В результате анализа первичной структуры BRS 1 определено, что она содержит открытую рамку считывания, кодирующую последовательность для 337 аминокислот и блок из 11 прямых и 7 инвертированных повторов, основу которых составляет последовательность длиной 16 п.н., а также потенциальные ТАТА-боксы и 2 фрагмента, гомологичных праймер-связывающему сайту. Показана возможность транскрипции BRS 1 в геноме ячменя [3, 5, 9].

3. Установлено, что BRS 1 содержит фрагмент длиной 281 н., гомологичный по нуклеотидному составу области, прилегающей к альфа-глиадиновому гену пшеницы (номер ь GenBank U08287). BRS 1 показывает гомологию по аминокислотному составу к ретроэлементу Atkila из генома Arabidopsis tkaliana [3, 5].

4. Методами ПДРФ и ПЦР-анализа показано, что BRS 1 имеет консервативную внутреннюю структуру в рамках вида. Последовательность представлена в геноме видов Hordeum, Secale, Triticum, Avena, Zea. Расхождение видов трибы Triticeae в процессе эволюции сопровождалось изменением структуры BRS 1, что позволяет использовать данную последовательность в качестве молекулярно-генетического маркера на межвидовом уровне. Показано, что Н. bulbosum генетически отличается от видов с 1 геномами [2, 5].

5. Клонированы повторяющиеся последовательности из генома ржи pERV и пшеницы pEWM длиной 1.7 т.п.н., которые являются членами нового семейства повторов. На долю этих последовательностей приходится 0.5% генома ржи, пшеницы и ячменя. Они представлены в геноме 11 изученных видов Triticum и 8 видов Hordeum. Показано, что расхождение видов трибы Triticeae в процессе эволюции сопровождалось изменением структуры последовательностей pERV и pEWM. Последовательности pERV и pEWM могут служить молекулярно-генетическими маркерами на межвидовом уровне [4,10].

6. Последовательности pERV и pEWM проявляют высокий уровень гомологии по нуклеотидному составу друг к другу, равный 92%, что позволяет считать их членами одного семейства. Дивергенция pERV и pEWM в геноме ржи и пшеницы произошла за счет единичных нуклеотидных замен [4,10].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Ермак Г.З., Урбанович О.Ю., Просняк М.И. Упрощенный метод выделения растительной ДНК, пригодной для молекулярно-генешческих исследований // Becui АН БССР. Сер. б1ял. навук. - 1989. -N 1. - С. 98-100.

2. Урбанович О.Ю., Просняк М.И., Картель H.A. Полиморфизм повторяющейся последовательности ДНК ячменя из tars-2 семейства // Becui АН БССР. Сер. б ¡ял. навук. - 1990. - N 6. - С. 21-24.

3. Urbanovich O.Yu., Kartei N.A. The actively transcribed barley DNA repeat similar to the Arabidopsis thaliana (L.) retrotransposon-like element // V International Oat Conference & VII International barley Genetics Symposium. -1996. - P. 394-396.

4. Урбанович О.Ю., Картель H.A. Клонирование и анализ новых повторяющихся последовательностей ДНК из геномов ржи и пшеницы // Becui HAH Беларуси. Сер. б{ял. навук. - 1998. - N 2. - С. 42-46.

5. Урбанович О.Ю., Картель H.A. Анализ структуры повтора BRS1 ;-:ч геномной ДНК ячменя (Hordeum vulgare L.) // Цитология и генетика. -1998.-Jfe4.-C. 25-31.

6. Урбанович О.Ю. Хромосомная локализация и характеристик,» диспергированной повторяющейся последовательности яч?.«ил PRS I >У Молекулярная генетика и биотехнология: Материалы Международной кокф,-Минск, 1998.-С. 118.

Тезисы докладов.

7. Урбанович О.Ю., Просняк М. И Молекулярно-генетическая характеристика последовательности ДНК ячменя, обладающей межвидовым полиморфизмом // IV всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки: Тез. докл. науч. конф., Минск, 15- 20 апреля 1990 г.- Москва, 1990. - С 7.

8. Урбанович О.Ю. Организация и первичная структура EcoR I-фрагмента высокоповторяющейся ДНК Hordeum vulgare // Современные проблемы генетики и селекции: Тез. докл. респ. конф., Минск, 4-6 июля 1995 г.-Минск, 1995.- С.76.

9. Урбанович О.Ю., Картель H.A. Изучение транскрипционно-активного повтора ДНК ячменя, имеющего сходство с ретротранспозоном арабидопсиса // Международная конференция, посвященная памяти акад. А.А.Баева: Тез. докд. мсждунар. конф., Москва, 20-22 мая 1996 г.- Москва, 1996.-С. 26.

10. Урбанович О.Ю. Клонирование и анализ повторяющихся последовательностей ДНК из геномов ржи и пшеницы // VII съезд Белорусского общества генетиков и селекционеров: Тез. докл. нуач. конф., Горки, 16-19 июля 1997 г.-Минск, 1997. - С. 128.

РЭЗЮМЭ

Урбанов1ч Аксана Юр'еуна.

Клашраванне i анал1з пауторау геномнай ДНК (BRS 1, pEVVM, pERV) раслш трыбы Triticeae.

Ключавыя словы: ДНК, якая паутараецца, ПДРФ, ПЦР, пбрыдызацыя in situ, геномная аргашзацыя, трыба Triticeae, фьчагенетычныс сувяз1

Пры дапамозе сучасных метадау малекулярнай генетык1 праведзена даследаванне асабл1васцей аргашзацьн i структуры трох новых дысперправаных паслядоунасцей, яюя паутараюцца, з генома ячменю, жыта i пшашцы, яюя састауляюць значную частку геномау гэтых вщау. Гэтыя паслядоунасщ у першыню был i клашраваны i даследаваны у дадзенай працы.

На долю паслядоунасщ ячменю BRS 1 даводзщца каля 5% геному гэтага в!ду i 1% геному жыта i пшашцы. Яна мае даужыню 5050 п.н. BRS 1 размеркавана па усей даужыш ycix храмасом ячменю. Анал!з першаснай паслядоунасщ BRS 1 паказау, што яна багата icapoTKÍMÍ прамыми адваротны>.п i швгртаваным! лауторамь

BRS 1 утрымлшае рад рэгуляторных элемента^ - патэнцыяльныя 'ГАТА-боксы, энхансеры, ьобласщ, гамалапчныя праймер-звязваючаму сайт>'. У саставе BRS 1 знойдзен блок каротк1х пауторау, kk¡ прадстаулен 11 прамым! i 7 iimepTaBEHbiMi паслядоунасцям! кансэнсусу ATACTAATGGCGCCACC. У саставе BRS 1 выяулена адкрктая рамка счытвання, якая кадз1руе паслядоунасць 337 амшакчслот. Паслядоунасць BRS 1 у пазщыях да 3603 i з 4618 н. не кадзфуе АРС. 3 данамогай Northern-пбрыдызацн з сумарным нрэпаратам РНК установлена, hito АРС транскрь;б!руениа у геноме ячменю. BRS 1 мае некаторыя рысы, як ¡я адпавядаюць рэтраэлементам, уключаючы гамалогно да рэтраэлемента Athila з генома A. thaliana. BRS 1 прысутшчае у геноме вщау Hordeum, Secale, Triticum, Avena, Zea. Паказана, што BRS 1 можа служыць малекулярна-генетычным маркерам на м^жвщавым узро$лп. Паслядоунасць зарэпстравана у GenBank, дзе ёй дадзен нумар BRS-1 U76261.

Паслядоунасщ pERV i pEWM састауляюць 0,5% геномау ячменю, жыта i пшашцы. Наз1ралася адрозненне у аргашзацьн гэтых паслядоунасцей у геномах ячменю, жыта i пшашцы. Клашраваныя паслядоунасщ можна выкарыстаць у якасщ маркёра^ дзля вщау Hordeum. Пры анал1зе першаснай паслядоунасщ жыта pERV i пшашцы pEWM установлена, што яны паказваюць высок! узровень гамалогй адзш да аднаго, не меншы за 92%. Дывергенцыя гэтых паслядоунасцей адна ад адной адбылася дзякуючы адзшкавым нуклеатыдным заменам. HÍ3KÍ узровень дывергенцьп pERV i pEWM дазваляе лныць ix членам! аднаго сямейства.

PE3J0iME

Урбанович Оксана Юрьевна

Клонирование и анализ повторов геномной ДНК (BRS 1, pEWM, pERV) растений трибы Triticeae.

Ключевые слова: повторяющаяся ДНК, ПДРФ, гибридизация in situ, геномная организация, триба Triticeae.

При помощи современных методов молекулярной генетики проведено исследование особенностей организации и структуры трех новых диспергированных повторяющихся последовательностей из генома ячменя, ржи и пшеницы, которые составляют значительную часть геномов этих видов. Эти последовательности впервые были клонированны и исследованы в данной работе.

На долю последовательности ячменя BRS 1 приходится около 5% генома этого вида и 1% генома ржи и пшеницы. Она имеет длину 5050 п.н. BRS 1 распределена по всей длине всех хромосом ячменя. Анализ первичной последовательности BRS 1 показал, что сна обогащена короткими прямыми, обратными и инвертированными по?тср£мч. BRS 1 содержит ряд регуляторных элементов, а именно - пс:?'щиал:.пь.:е Т4ТА-боксы, энхансеры, области, гомологичные прайме^-садзываюте^у саГгл. В составе BRS 1 обнаружен блок коротких повторов, предстивлениый i I прямыми и 7 инвертированными псследоиательнистам? консенсуса АТАСТАATCGCGCCACC. В составе BRS 1 обнаружена открытая рамка ечнтьтяйия, кодирующая последовательность для 337 аминокислот. Последовательность BRS 1 в позициях до 3603 и с 46 i 8 можно рассматривать как некодирующуго ОРС. С помощью Northern-гибридизации с суммарным препаратом РЖ установлено, что ОРС транскрибируется в геноме ячменя. BRS 1 имеет некоторые черты, свойственные ретроэлементам, включая гомологию к ретроэлементу Athila из генома А. thaliana. BRS 1 присутствует в геноме видов Hordeum, Secale, Triticum, Avena, Zea. Показано, что BRS 1 может служить молекулярно-генетическим маркером на межвидовом уровне. Последовательность зарегистрирована в GenBank, где ей присвоен номер BRS-1 U76261.

Последовательности pERV и pEWM составляют 0.5% геномов ячменя, ржи и пшеницы. Наблюдалась четко выраженная разница в организации этих последовательностей в геномах ячменя, ржи и пшеницы. Клонированые последовательности можно использовать в качестве маркеров для видов Hordeum. При анализе первичной последовательности ржи pERV и пшеницы pEWM установлено, что они показывают высокий уровень гомологии друг к другу, не менее 92%. Дивергенция этих последовательностей друг от друга произошла благодаря единичным нуклеотидным заменам. Низкий уровень дивергенции pERV и pEWM позволяет считать их членами одного семейства.

SUMMARY

Urbanovich Oksana Jurievna

Cloning and Analysis of Genomic DNA Repeats (BRS 1, pEWM, pERV) of Triticeae Tribe Plants

Key words: repetitive DNA, RFLP, PCR, in situ hybridization, genome organization, Triticeae tribe, phylogenetic relationships

The study on organization and structure peculiarities of three new dispersed repetitive sequences from genome of barley, rye and wheat, which form a major portion of these species genomes, was conducted by advanced methods of molecular genetics. These sequences were first cloned and investigated in the given research work.

The portion of barley sequence BRS 1 makes up about 5% of this species genome and 1% of rye and wheat genome. It is 5050 b.p. in length. BRS 1 is distributed along the full length of all barley chromosomes. The analysis of BRS 1 primary sequence has shown that it is enriched with short direct, inverse and inverted repeats. BRS 1 contains a series of regulatory elements, namely potential TATA-boxes, enhancers, region homologous to primer-binding site. A block of short repeats represented by 11 direct and 7 inverted sequences of consensus ATACTAATGGCGCCACC was revealed in BRS 1. An open reading frame encoding sequence for 337 amino acids was also detected in BRS 1. BRS 1 sequence in the positions up to 3603 and from 4618 b.p. can be considered as norsrodinf: ORF. Northern-hybridization with the total RNA preparation has revealed that ORF is transcribed in barley genome. BRS 1 has some features peculiar to iciruelemems including homology to Athila reiroelemsat from A. thaiiana genome. There is BRS 1 in shown to be a molecular-genetic marker at the interspecific level. The sequence lias been filed in GenBank where it was coded as BRS-1 U 76261.

The sequences pERV and pEWM make up 0,5% of barley, rue and wheat genomes. Particularly pronounced difference in organization of these sequences was observed in genomes of barley, rye and wheat. Cloned sequences can be used as markers for Hordeum species. When analyzing the primary sequences of rye pERV and wheat pEWM, it was revealed that they showed a high homology level to each other, no less than 92%. Divergence of these sequences from each other took place owing to single nucleotide substitutions. A low level of pERV and pEWM divergence makes it possible to consider them members of one family.