Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование генов, специфически экспрессирующихся в дорзальном корневом ганглии новорожденных крыс, модифицированным методом субтрактивной гибридизации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование генов, специфически экспрессирующихся в дорзальном корневом ганглии новорожденных крыс, модифицированным методом субтрактивной гибридизации"

8 ОД

российская академия НАУК институт молекулярной биологии им. в.а. энгельгардта

На правах рукописи УДК 575:595

АКОПЯН Армен Норакович

клонирование генов, специфически экспрессируюшихся в дорзальном корневом ганглии новорожденных крыс. модифицированным методом субтрактивнои гибридизации

Специальность 03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой спепени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии ии. В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители: академик РАН; Г.П. ГЕОРГИЕВ

кандидат'биологических наук В.Л. БУХМАН Офицальные оппоненты: доктор биологических наук C.B. РАЗИН

кандидат биологических наук Н.В ЛЮБОМИРСКАЯ

в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Ведупая организация: Институт биологии развития РАН

Зашита диссертации состоится "Л." 1684

в 1А. часов на заседании диссертационного Совета Д 002. 79.01

.1694 г.

адресу: 117984, Москва В-ЗЭ4, ул. Вавилова, 32

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета Jj

кандидат химических наук Л? "у/— ÂTM. КРИЦЫН

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность задачи.

Сенсорные нейроны, и, в частности, нейроны в составе дорзального корневого ганглия позвоночных," часто рассматриваются как удобные модели для изучения различных свойств нейронов. Вниманиие исследователей было сфокусировано на изучении структуры рецепторов сенсорных нейронов и их функций, механизмов трансдукции сигнала внутри клеток и способов передачи информации от сенсорных леяронов к центральной нервной системе; в то же время все чаше игнорировались индивидуальные характеристики сенсорных нейронов.

Индивидуальность клетки определяется, прежде всего, дифференциальной экспрессией генов. . Более того, ткане-специфическая экспрессия генов определяет будущее клетки и играет критическую роль в функционировании определенного типа' клеток (Wegner et. al. ,16931. На сегоднешний день проведен ряд исследований, показывающих количественное различие в содержаннии структурно-функциональных элементов нейронов: мембранных рецепторов и ионных каналов, нейропептидов, транскрипционных факторов, неярофиламентов и т.д. (Schmidt R.F.,1978). Однако, в последнее время стали появляться работы, где найдены гены, специфически транскрибируювдеся в сенсорных нейронах ПНС и не транскрибирующиеся з нейронах ЦНС (Nlnklna et. al.,1993>.

Одним из классических объектов для изучения сенсорных нейронов и глиальных клеток является дорзальныя корневой ганглий (ДКГ), потому что: 1) ДКГ содержит всего три основных типа клеток - StoaKicsTKii© [«тетки Сглмалътго кл<этки>, А-вФШ«»а СА«-, Л0~ » А5-волокна) и С-волокна (сенсорные нейроны); 2) сенсорные нейроны ДКГ отвечает за передачу информации (боль, чувство температуры, осязание и т. д.) от всех частей тела, кроме головы, в головной мозг через спинной мозг (Koerber et. al.,1988).

Клетки ДКГ отличаются от. сенсорных нейронов и глиальных клеток центральной нервной системы и между собой по биохимическому составу, свойствам цитоплазматической мембраны, зависимости от неяротрофинов и истории развития в эмбриогенеза (Perl E.R.,1992), что определяет роль клеток в сенсорных Функциях

(Kansom et. al.,1977; Dichter et. al.,1977: Matsuda et. al.,1978).Кроме того, в группах А- и С-волокои, в свою очередь, есть вариабельность: по количеству шипиков на сенсорной нейроне, по связи с различными нейронами спинного мозга, по типу передаваемой информации и т. д. (Marper et. al.,1985: Ritter et. al..19881.

В связи с вышеизложенным, клонирование генов, экспрессируюшихся в клетках дорзального корневого ганглия и не экспрессируюшихся в других нейронах и глиалышх клетках, представляет собой актуальную задачу.

Цель работы.

Основная цель настоящей работы состояла в клонировании генов, специфически экспрессирувшихся в дорэальном корневой ганглии, и модификации для этой цели метода конструирования субтрактивной кДНК библиотеки и ее дифференциального скрининга.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Модификация на более простых системах метода конструирования субтрактивной кДНК библиотеки из малых количеств поли(А)+РНХ.

2. ' Модификация на более простых системах метода дифференциального- скрининга субтрактивной кДНК библиотеки, для достижения его высокой чувствительности и исключения артефактов клонирования на этапе скрининга.

3. Применение модифицированного метода конструирования субтрактивной к ДНК библиотеки и дифференциального скрининга для клонирования -генов, специфически экспрессируюшихся в дорзальном корневом ганглии новорожденных крыс.

4. Применение, на примере клонирования капсаицинового рецептора, субтрактивной кДНК библиотеки для клонирования генов согласно свойству их продуктов трансляции (функциональное клонирование).

Научная новизна и практическое значение работы.

В настоящей работе был модифицирован метод конструирования . субтрахтивных кД}!К библиотек, позволяющий обходиться малы^ количествои ткани (100-10000 клеток). Примененыя метод

дифференциального скрининга позволил повысить чувствительность клонирования и исключить артефакты клонирования. При усовершенствовании на простых системах метода, конструирования субтрактивной кДНК библиотеки и ее дифференциального скрининга были выделены новые гены MB, MF, ЗЕ7 и ЗСб, изменяющие транскрипционную активность при постнатальном развитии крыс, новый ген МК, экспрессирующияся в коре головного мозга и не экспрессирующияся в мозжечке взрослых крыс и новый ген 3L4, преимущественно экспрессирующияся в мозжечке взрослых крыс.

Впервые было проклонировано 19 генов, экспрессируюшихся в клетках дорзального корневого ганглия и не регистрирующихся Нозерн гибридизацией в клетках головного мозга , печени и почек новорожденных крыс. Из них 6 генов. (В1, В2, В4, Н7, 14 и G7) строго специфично -транскрибируются в клетках дорзального корневого ганглия.

Субтрактивная кДНК библиотека из дорзального корневого ганглия была применена для функционального клонирования капсаицинового рецептора.

Практическое значение настоящей работы состоит в возможности создания в будущем, на основе функциональных свойств ДКГ специфических белков, более эффективных антиболевых средств направленного действия и объяснения механизмов трансдукции болевых ощущений, терморецепции и осязания.

Апробация работы.

Материалы работы представлены на IY Всесоюзной школе-семинаре молодых ученных "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии" (г. Рига, 1990г.) и 15th annual meeting of the Europlan Neurosclence Association. Munich 13-17 September 1992.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано и находится в печати 3 работы.

Объем и структура диссертации.

Работа изложэна на 132 страницах машинописного текста. Она

включает: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы (всего 162 названий). Диссертация содержит 16 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Использованный нами ранее скрининг неистощенной кДНК библиотеки субтрактивной пробоя или дифференциальной пробой для клонирования генов, дифференциально зкспрессируюшихся в головном мозге при постнатальном развитии крыс, требовал минимум 3-4 мкг поли<А)*РНК, имел невысокую чувствительность и давал множество артефактов клонирования (Buchman et. al.,19921. Из-за этого иы решили применить дифференциальный скрининг субтрактивной кДЯК библиотеки. Кроме того, при решении задачи клонирования генов, специфически экспрессирующихся в дкг, мы располагали небольшим количеством ткани 1150 мкг ДОГ из 200 новорожденных крыс).' Последнее обстоятельство требовало применения метода построения субтрактивной кДНК библиотеки из малого количества поли(А)+РНК (Bely&vsky et. al.,1992; Vfang, 1991; Lysltsín et. al.,1993 ». К сожалению, в этих работах нет четкого обсуждения следующих вопросов: 1. Какого типа артефакты встречаются при скрининге субтрактивной кДНК библиотеки? 2. Какова чувствительность скрининга библиотеки? 3. Как отражаются искажения, возникающие при ПЦР кДНК, на результате эксперимента? В связи с этим мы сочли целесообразным, прежде чем приступать к решению основной задачи, ответить на данные вопросы в рамках простых задач: клонирование генов, дифференциально зкспрессируюшихся в мозжечке при постнатальном развитии крыс и клонирование- генов, специфически зкспрессируюшихся в коре головног мозга и мозжечке у взрослых крыс,

Клонирование генов, дифференциально зкспрессируюшихся в мозжечке при постнатальном развитии крыс. Обшая схема стратегии клонирования приведена на Рис. 1. кДНК. синтезированная на основе поли(А)+РНК (1 мкг) мозжечка 4-дн крыс <"лйдер") истошали в дза цикла биотинилированной поли(А)+РНК (20 мкг на каждый цикл), выделенной из печени взрослых крыс ("драйвер").Посла истощения (осталось 20S стартового количества) проводили реакцию . G-теилинга,

синтезировали вторую цепь путем достраивания С-праямера с помошыо фрагмента Кленова, создавали EcoRl- и Notl-сайты на концах кДНК, кЛНК фракционировали в 2* JJuSleve агарозе и зону фрагментов, имеющую молекулярную массу более 300 н. п,, элюировали из агарозы, лигировали с соответствующим дефосфорелированнын вектором XZapII и кДНК библиотеку высевали на две чашки Петри (12x12см), с применением хозяйских клеток ВВ4, по 600 рекомбинантных клонов на каждую чашку.

В результате дифференциального скрининга истощенной кДНК библиотеки высокомеченной кДНК. синтезированной на поли(А)+РНК мозжечка 4-дн. крыс, и высокомеченной кДНК, синтезированной на основе поли(А)+РНК мозжечка 20-дн. крыс, было получено 70 сигналов, детектирующихся исключительно или значительно сильнее при гибридизации с зондом высокомеченной кДНК мозжечка 4-дн крыс, чем с высокомеченной кДНК мозжечка 20-дн крыс. 12 сигналов, обнаружились при гибридизации с зондом высокомеченной кДНК мозжэчка 20-дн крыс, но не с высокомеченной кДНК мозжечка 4-дн крыс. Из 62 сигналов только 20 совпадало с фаговыми бляшками, остальные представляли собой артефакты. Из 28 клонов, после перекрестной гибридизации вставок, было отобрано 6 клонов для дальнейшего анализа.

С помощью Нозерн гибридизации определили уровни транскрипции генов при постнзтальном развитии мозжечка. Два клона из шести (ЗД6 и МД> не изменяли уровень экспрессии в мозжечке при постнатальном развитии крыс. Экспрессия гена, соответствующего клону ЗЕ7, незначительно снижается в развитии (Рис. 2). Для клонов MB и MF транскрипции в мозжечке снижается более чем в 20 раз (Рис. 21. Трзнекрипт гена ЗС6 не регистрируется Нозерн гибридизацией в мозжечке до 12 постнатального дня, затеи транскрипция постепенно возрастает (Рис,- 2). Количество детектируемых сигналов при скрининге 10° рекомбинантных клонов не истощенной кДНК библиотеки и данные по изменению уровня транскрипции в развитии позволили оценить представительность транскриптов генов в мозжечке 4-дн. крыс: MB - 0,05*, MF -0,005«, ЗЕ7 - 0,01* и ЗС6 - 0,0005«. Этот уровень чувствительности скрининга был достигнут благодаря йысокоя концентрации высокомеченной кДНК (2,5x10е имп/мл! в гибридизационном растворе.

Мы считаем, что применение редкого рассева фагов на чашке Петри (максимум 1000-1300 бляшек на чашку размером 12x12см), позволяющего однозначно сопоставить большинство сигналов на рентгеновской пленке с определенными бляшками лизиса позволяет определить большинство фальшивых сигналов без применения вторичного скрининга.

Клонирование генов, специфически экспрессируюшихся В. коре головного мозга ц мозжечке взрослых крыс. Общая схема стратегии клонирования приведена на Рис. 3. кДНК, синтезированную на основе поли(А)+РНК (50 нг) коры 20-дн крыс ("лидер"), истощали в два цикла биотинилированной поли(А)+РНК (10 мкг), выделенной из мозжечка 20-дн крысы ("драйвер"). Во втором истощении роль "лидера" выполняла поли(А)+РНК (50 кг) из мозжэчка, а "драйвера" - поли(А)+РНК (10 мкг) из коры. В обоих случаях истощение (в 50-75 раз) и конструирование субтрактивноя к ДНК библиотеки в векторе AZapII проводили так, как было описано в предыдущем параграфе, за исключением этапа синтеза двуцепочечной кДНК, где применялся метод описанный Belyavsky et. al.,1989.

Обе субтрактивные кДНК библиотеки скринировались высокомеченной кДНК, синтезированной на основе поли(А)+РНК коры головного мозга 20-дн. крыс и высокомеченной кДНК, синтезированной на основе поли(А)+РНК мозжечка 20-дн. крыс. После отсева фальшивых сигналов, перекрестной гибридизации и Нозерн гибридизации остались ген МК (представленность транскрипта 0,0005%), экспрессируюшийся в коре головного мозга и не экспрессируюшийся в мозжечке 20-дн. крыс (Рис. 4) и ген 3L4 (представленность транскрипта 0,001X1 преимущественно экспрессируюшийся в мозжечке 20-дн. крыс (Рис. 4).

В предыдущих работах сообщалось о клонировании множества • генов, специфически экспрессируюшихся в коре головного мозга (Travis et. al.,1967» и мозжечке (Hlnklna et. al.,1893; He et. al.,190@). Нам удалось проклонировать только по одному гену, специфически экспрессируюиемуся в коре головного мозга и мозжечке4 соответственно.

'Однако, чувствительность метода к количество высеянных рекомбинанткых клонов истощенной кДНК библиотеки - позволяли выделить большее число генов с заданным уровнем транскрипции.

Поли!А) РНК мозжечка 4-дн. крыс Поли(А) РНК печени 20-дн. крыс

I I

Синтез и очистка оц-кДНК Фотобиотинилирование РНК

} ^

Два цикла истощающей гибридизации

I

С-теялинг и синтез дц-кДНК

Конструрование субтрактивной кДНК библиотеки в А2ар11<№^1-ЕсоЕ1)

( I

Фильтр-1 Фильтр-2

\ 1

Высокомеч. кДНК мозжечка Высокомеч. кДНК мозжечка

4-дн. крыс 20-дн. крыс

Рис. 1. Схема клонирования генов, дифференциально экспрессирующихся в мозжечке при постнатальном развитии крыс.

Мы предполагаем, что причина низкой эффективности клонирования связана с тем, что средний размер пула кДНК. синтезированной с помощью ПЦР, равен 500-700 п. о., а максимальный размер кДНК-вставки в истощенной кДНК библиотеке -1.5 т.п.н., в то время как средний размер транскриптов в тканях млекопитающих 2-2,5т.п.н. Более того, существуют косвенные доказательства, что большинство нейро-специфических генов имеет размер транскрипта 2,5-3,5т.п.н. и более. Поэтому, возможно, подавляющее большинство необходимых транскриптов размером более 1,5 т.п.н. не присутствует в истощенной кДНК библиотеке.

Однако, размер МК и 31.4 транскриптов составляет 3,5 и 5 т.п.н., соответственно. Каким оброзом они, в. отличие от других транскриптов большего размера присутствуют в истощенных кДНК библиотеках? Мы проклонировали геномные и кДНК клоны для генов МК и 314, локализовали участки геномных и кДНК клонов, соответствующие МК и 31.4 вставкам из истощенной кДНК библиотеки и просеквенировали эти участки и области геномных и кДНК клонов, прилегающие к данному участку.

лсч|щ ою

а а о а а а а а

Гл'':г;) п п Ш м р

екз» ча» ^гр -

ЗЕ7

МВ

ЗС6

Рис. 2. Анализ экспрессии генов МВ, МР, ЗЕ7, ЗСв в мозжечке при постнатальном развитии с помощью Козерн-гибридиэации. Аликвоты суммарной РНК (20 мкг на дорояху), соответственно, 1 дневных 1Д1), 5 дневных (Д5), 9 дневных (Д9), 12 дневных (Д12), 15 дневных (Д15),-20 дневных (Д20), 45 дневных (Д45) и взрослых (В) крыс разделяли в. 1,2* агарозе, содержащей 2,2М формальдегида; переносили на мембранный фильтр (НуЪопй N1 и гибридизовали с пробой, откаченной на рисунке.РНК окрашена бромистым зтидием в' агарозном геле, чтобы продемонстрировать количество сумкарной РНК, канесенной' на дорожку. Фильтры экспонировали в течение 2 дней (для клонов !53, МР и ЗЕ71 и 7 дней для клона ЗС6 прк -70°С с использованием усиливавших экранов ЭУИ-5.

>'."",,.■-.' ' '■ " 1.1,11 т Ч I .'■ I

Поли!А)*РИК коры 20-дн. крыс Поли!А)+РНК мозжечка 20-дн. крыс

/ . \ / %

Синтез и Биотинилирование Биотинилирование Синтез и

очистка оц-кДНК РНК--------— РНК . очистка оц-кДНК

Два цикла истощающей Два цикла истошаюпей

гибридизации . гибридизации

^ V

С-тейлинг Сг-теялинг-

Синтез ПЦР дц-кДНК Синтез ПЦР дц-кДНК

Конструирование субтрактивноя Конструирование субтрактивной

библиотеки в \ZapIKNotI-EcoRI > библиотеки в ХгарШНоИ-ЕсоН!)

.. /

Фильтр-1 Фильтр-2 Фильтр-3 Фильтр-4

Высокомеченная кДНК-—' Высокомеченная кДНК

коры 20-дн. крыс мозжечка 20-дн. крыс

Рис. 3. Схема клонирования генов, специфически экспрессируюшихся в коре головного мозга и мозжечке 20-дн. крыс.

Из анализа последовательностей можно заключить: в клонах МК и 314 С-праямер отжегся на С-блоках последовательности транскриптов МК и 314; Т-праймер отжегся на олиго(дТ) последовательности транскрипта МК и на Т-богатом участке транскрипта 31.4.

Синтез кДНК из малых количества поли(А)*РНК. Из всего вышесказанного следует, что для успешного проведения клонирования генов, специфически экспрессируюшихся в ДКГ, необходимо модифицировать метод конструирования кДНК библиотек с помощью ПЦР, позволяющий амплифицировать транскрипты большой и маленькой длины с равным успехом. При совместной ферментативной амплификации фрагментов ДНК маленького и большого размеров, преимущественно накапливаются ДНК-фрагменты маленького размера. В связи с этим, мы решили создать в реакционной смеси

для ПЦР такое соотношение маленьких и больших фрагментов кДНК, чтобы после определенного количества циклов ПЦР получился равный выход этих фрагментов. Варьирование условий ПЦР. ТАСЬполиыераз различных фирм, способов фракционирования кДНК в агарозном геле, количества стадий ПЦР и пары праймеров, используемых в ПЦР позволило найти оптимальный метод амплификации кДНК из малых количеств поли(А)+РНК.

183-г

12345 6 7 8 91011 12

ф-Р

М1С

28э-

П" ^'•ЧЙИ'-рП-?? ' ' • ' V -у- г-

вП м

т

Рис. 4. Анализ экспрессии МК и 31.4 в тканях 20-дневных крыс с помощью Нозерн-гибридизации. На дорожку нанесена тотальная РНК, (20 мкг) выделенная из коры двадцатидневных крыс (11. гиппокампа (2), мозжечка (3). основания мозга (4). печени (5), почки (6), надпочечной железы (7), селезенки (б), тимуса (9), легких (10), сердца (11) и семенников (12). РНК окрашена бромистым этидием в агарозном геле, чтобы продемонстрировать количество суммарной РНК, нанесенной на дорожу. Положения 203 и 183 рРНК показаны стрелками. После гибридизации и отмывки фильтры экспонировали в течение 2. дней при -70°С с использованием усиливающих экранов -ЭУИ-5.

Синтезировали 10~3, 10~4 и 10~5 мхг (кДНК-5) кДНК на матрице поли(А)+РНК с использованием Т-праямера (5* (ЗСССССССССЯ!^ 3'). Половину кДНК лигировали с АпЗрб-праймероы (5' ТТААСССАТАТСАСАСТССАТТТАСССС; 34 с помощью Т4 РНК-лигазы, а к другой половине синтезировали 5' олиго(дГ) с помощью терминальной дезокситрансСеразы. В первом случае использовали в ПЦР Т-праймер и С-праймер (5' ААТТССССА(С)10 3'), а во втором - Т-праймер и Зрб-праЯмер (5' рААТТСССТАТАаТСТСАССТАААТСССС 3') (ввели обозначение, в. зависимости от начального количества кДНК: при применении Т- и С-праймера в ПЦР пробы обозначаются кДНК-3, -4 и -5, при использовании Т- и Зрб-праймера в ПЦР - кДНК-36,-46 и -56). Проводили 3 цикла ПЦР согласно следующему графику: 9^С в течение 1 мин, 5(Р С в течение 1 мин, в течение 5 мин.

Двухцепочечные кДНК фракционировали в 2* »йШеуе агарозе. кДНК размером 0,5-6 т.п.н элюировали из агарозы (1-ый этап). кДНК-3 и' -36 амплифицировали 5 циклов, а кДНК-4, -46, -5 и -56 амплифицировали б циклов. Амплифицированные кДНК фракционировали .в 2% Ш31еуе агарозе (бромфеноловьт синий проходил 5 см) и элюировали кДНК размером 6-6 т.п.н. (2-ой. этап). Для кДНК-5 и -56 проводили дополнительный этап (до третьего этапа) амплификации, аналогичный второму. Злюированную к.ДНК амплифицировали 20, 25 и 25 циклов, соответственно, для кДНК-3 и -36, кДНК-4 и -46, кДН£С-5 и -56 (Рис. 5).

Вышеописанный метод амплификации кДНК имеет три преимущества: во-первых, максимальный размер кДНК, регистрируемый в агарозном геле с помощью бромистого этидия, равен 3-3,5 т.п.н., против 1,5 т.п.н., синтезируемой согласно методу "дифференциальной амплификации" (Ве1уаувку е^ а1.,19б9); во-вторых, количество всех фрагментов кДНК размером до 2 т.п.н., после 25 циклов амплификации приблизительно одинаково, в то время как "дифференциальная амплификация" такой результат дает .для фрагментов кДНК размером до 1 т.п.н.;' в-третьих, использование в ПЦР Т-пралмера и Брб-праямера позволяет избегать отжига одного из праймеров, на С-Согатых участках последовательности кДНК, что увеличивает вероятность синтеза с помощью ПЦР полноразмерной кДНК для большого числа транскрипт'ов (Рис. 5).

1 2345678 91011

м

-I

f\

l ! Л i

Ä.-üöi- ..-3

Рис.5. Электрофоретический анализ амплифицированной кДНК из малого количества поли(А)+РНК. кДНК фракционировали в 1« агарозном геле. На дорожки нанесены следующие кДНК-пробы: 1, 2 и 3 - кДНК-5, -Л и -3, аипли^ииированые с помощью TAQ-полимеразы фирмы Stratagene; 4, 5 и б - кДНК-56, -40 и -36, амплифицироваиные с поыошью TAQ-полииеразы Promega; 7 - все этапы проводили без добавления TAQ-полимеразы и обратной транскриптаэы; 6 - применяли амплификацию поли(А)+РНК без синтеза кДНК с помощью обратной транскриптаэы; 9, 10 ц 11 - кДНК-5, -4 и -3, амплифицироваиные с помощью TAQ-полимеразы Promega. Маркером служил 1 т.п.н.-лидер (BRL>.

Клонирование генов, специфически экспрессируюшихся в дорэальном корневом ганглии новорожденных крыс.

Общая схема стратегии клонирования генов, специфически экспрессируюшихся в ДКГ, приведена на Рис. 6.

кДНК синтезировали на основе 50 нг поли(А)+РНК ДКГ 1-дн... крыс ("лидер"!. Ее последовательно истощали смесью (по Юмкг) биотинилированноя поли(А)+РНК, выделенной из. печени и почки 1-дн. крыс (1-ый цикл истончения!, и смесью (по 5 ыкг) биотинилированноя полиШ+РНК мозяоэчка и коры головного мозга 1-дн. крыс !2-ой цикл истощения!. Одноцепочечная кДНК, оставшаяся после дзух циклов истощения, составляла 1* (после 1-ого цикла 15*) от стартового количества кДНК (15нг), . построенной на основе поли(А)+РНК ДКГ. После реакции С-теилинга вторую цепь кДНК синтезировали согласно методу "многостадийной амплификации" для 10""3 ыкг кДНК (кДНК-4),

описанному в предыдущем параграфе. Истощенные кДНК библиотеки конструировали в соответствующем дефосфорелированном векторе А2арП отдельно для кДНК разгром 0,4-1,4 т.п.о. и 1,4-5 т.п.о. Полученные истощенные кДНК библиотеки смешивали в равных количествах (равное количество рекомбинантных клонов) и высевали на четыре чашки Петри (12x12см) по 1000 рекомбинантных клонов на чашку.

Б качестве зондов для дифференциального скрининга использовали: высокомеченную кДНК, синтезированную на основе 2мкг поли(А)+РНК ОНО 1-дн. крыс (кДНК-зонд-1); высокомеченную кДНК, синтезированную на основе эквимолярной смеси 4мкг поли(А)+РНК можечка и коры 1-дн. крыс (кДНК-зонд-2): высокомеченную к ДНК, синтезированную на основе эквимолярной смен 4мкг поли(А)+РНК печени и почки 1-дн. крыс (кДНК-зонд-3! и высокомеченную истощенную кДНК (1,5 мкг), которая использовалась для - конструирования' истощенной кДНК библиотеки ДКГ (кДНК-зонд-4), синтезированную с помощью случайной затравки и фрагмента Кленова. В результате дифференциального скрининга, отсева фальшивых сигналов и перекрестной гибридизации было выделено 40 клонов для дальнейшего анализа. Результаты Нозерн гибридизации этих 40 клонов и их гибридизация с различными к ДНК-зондаыи суммировании в Таблице 1.

Проанализированные клоны, согласно уровню их транскрипции в тканях, можно отнести к одной из трех групп: 1-ая группа - гены, транскрипты которых регистрируются Нозерн гибридизацией в ДКГ и не обнаруживаются в коре, мозжечке, печени, почке и сердце 1-дн. крыс (С2, С1, Н4, В4, В2, В8, 1)8, ЕО, ИЗ. Е8, 14, Е2, 15, АО, С7, Н7, ВКодин из двух транскриптсв)); 2-ая группа - гены, транскрипты которых регистрируются Нозерн гибридизацией в ДКГ и сердце и не обнаруживаются в коре, мозжечке, печени и почке 1-дн. крыс (13 и РО): 3-ья группа - гены, транскрипты которых активнее транскрибируются в ДКГ и присутствуют в одной или нескольких тканях, поли(А)+РНК из которых выполняла роль "драйвера" при субтрактивной гибридизации.

1-ая и 2-ая группа генов удовлетворяют критерию эксперимента. Анализ данных Таблицы 1 показывает, что если отбирать клоны, гибридизуюшиеся с высокомеченной истощенной кДНК (кДНК-зонд-4) и не гибридизуюшиеся с кДНК, синтезированной на основе эквимолярной

смеси поли (А)"* РНК коры и мозжечка (кДНК-эонд-2) ■ а также кДНК, синтезированной на основе эквимолярной смеси поли(А)+РНК печени и почки (кДНК-зонд-3), тогда клон будет удовлетворять критерию эксперимента. Исключение составляет клон ЙЗ, возможно потому, что разница между уровнем транскрипции в ДКГ и в тканях, поли(А1+РНК из которых, использовали в качестве "драйвера", составляет 50 раз. Кроме того, из данных Таблицы 1, следует, что некоторые ДКГ-специфические клоны (Бб, Еб, ЕО, В1) не регистрируются при дифференциальном скрининге кДНК-зондом-4, -3 и -2. Клон В1 имеет два тран^крипта: ДКГ-специфически и транскрипт меньше размером, экспресируюшияся во всех тканях.

ДКГ

Поли(А)+РНК

ПЕЧЕНЬ ПОЧКИ Поли(А) РНК

МОЗЖЕЧОК КОРА

V ^

Поли(А) РНК

Синтез и очистка оц-кДНК

Биотинилирование РНК

Два цикла истощающей гибридизации

Биотинилирование РНК

С-теялинг и много-стадийный ПЦР кДНК

Конструирование субтрактивноя библиотеки в \ZapII

/

Фильтры

X

Высокомеченная кДНК ДКГ

Высокомеченная кДНК моэжечка+коры

Высокомеченная истощенная дц-кДНК

Высокомеченная кДНК печени+почки

Рис. 6. Схема клонирования генов, специфически зкспрессируюшихся в дорзальном корневом ганглии новорожденных крыс.

ТАБЛИЦА 1

N Раэм. Разм." кДНК кДНК кДНК ист. РНК РНК РНК РНК РНК РНК,

кл. тран. вст. Шв М03.+ ПРЧ.+ кДНК ОЕй кор моэ печ поч серд

(т.п .0. ) кор. поч.

С2 1,6 1.3 ** + ** - + Г+ о"+ 0 0 0 0

С1 2.0 1.$ + - - + 1 0 0 0 0 0

Н4 2,2 0,9 + - - + 1 0 0 0 0 0

СИ 1.4 1,4 + - - V-" 1 0 0 1/5 ,+1 0

ИЗ 1 1 - - + 1 1/50 1/50 1/50 1/50 0

В4 4 2,5 + - - + 1 о , 0 0 0 0

С4 1 1 + - - + 1 0 0 0 0 0

Е4 0.8 0,6 + - - + 1 0 0 1/20 0 0

В2 1.3 1,2 • + - - + 1 0 0 0 0 0

И7 1.1 1 + - - - 1 1/20 1/5 1/10 1/10 1/10

В8 0.8 0.8" + - - * 4- 1 0 0 0 0 0

13 6 1.5 - - 1 0 0 0 0 1

17 2.5 1.1 + - - 1 1/10 1/5 1/10 1/10 1/10

А4 2,7 0.6 + */- - - 1 1/5 1/5 0 0 1/10

ГО 1.4 0.7 + - - + 1 0 0 0 0 1

РЗ 1.4 0.6 - - 1 0 0 0 0 0

1.6 1.4 + - + - 1 0 0 .1/2 0 0

1)7 10 0.4 + - - - 1 1/20 1/20 1/5 1/10 0

Р5 1.0 0.6 + +/- - - 1 1/10 1/5 0 0 1/20

А2 5 0.5 + +/- - - 1 1/10 1/10 1/10 1 1

ЕО 4.5 1.5 + - - - 1 0 0 0 0 0

Е1 1 1 + - + 1 6 0 1/5 1/10 0

РЗ 1.1 0.7 + - - * 1 0 0 0 0 . 0

Е5 3,5 1.6 + +/- - 1 1/5 1/5 0 0 0 '

С6 1.0 0.3 ♦ - - 1 1/10 1/10 1/10 1/10 1/8

В7 4.8 0.4 + - - 1 0 0 0 1 1

11 1 1 + - - - 1 1 1 1 1 1

С2 1.1 0,4 + - - - 1. 1/20 1/20 1/20 1/20 1/5

НО 1.1 0.4 + - - 1 1 1 1 1 1

Е7 2.1 0.6 + 1 1/10 1/10 1/5 1/5 1/2

Е8 2.0 0.9 + - - - 1 0 0 0 0 0

41" +3.2 1.2 ♦ - - - 1 С 0 0 0 0

1.2 X X X X X 1 1 1 1 1 1

м Разм. Разм.* кДНК кДНК кДНК ист. РНК РНК РНК РНК РНК РНК

кл. тран. вст. М03.+ печ.+ к ДНК ШС кор моз печ поч серд

(т.п .0. ) кор. поч.

14 0.7 0.7 + - - + 1 0 0 0 0 0

0,9 X X X X X 1 0 0 0 0 0

С5 7 1 + */- - - 1 1/5 1/6 1 1 1

9 X X X X X 1 1/5 1/5 1 1 1

Е2 О.в 0.6 + - - + 1 0 0 0 . 0 0

2.7 X X X X X 1 0 0 0 0 0

15 1.5 0,9 + - - */- 1 X) 0 0 0 0

2,6 X X X X X 1 0 0 0 0 0

АО 4 1,5 + - - + 1 0 0 0 0 0

7 X X X X X 1 0 0 0 0 0

НЗ 0,7 0.7 4- - - - 1 0 0 1 0 0

6 X X X X X 1 0 0 1 1 0

Н7 0.6 0,8 + - - + 1 0 0 0 0 0

2,6 X X X X X 1 0 0 0 0 0

07 3 2,5 + - - + 1 0 0 0 0 0

7 X X X X X 1 0 0 0 0 0

10 X X X X X 1 0 0 0 0 0

» - -в таблице указан .максимальней размер ©ставки .кДНК из перекрестно гибридизующихся клонов кЛНК.

»» - знак "+" указывает на наличие сигнала при гибридизации .с ДНК-зондом, указанным в колонке таблицы; "-" указывает на отсутствие сигнала на фильтре; "+/-" вопросительно наличие или отсутствие сигнала на фильтре.

«+ - знак "1" показывает на максимальную силу гибридизации с суммарной РНК, указанной в данной колонке, при гибридизации с ДНК-зондом, указанном в данном ряду; знак "О" указывает на отсутствие гибридизации с суммарной РНК; знак 'Ч/Ы" указывает, что сила гибридизации с данной (указано в колонке) суммарной РНК в N раз слабее, чем максимальная сила гибридизации некой суммарной РНК (на том-же РНК-фильтре) с тем же зондом, х - знак пропуска.

некоторые ДНК-зонды гибридизуются с двумя и более мРНК.

В таблице даны размеры мРНК и сила гибридизации зонда с этой иРНК в различных тканях.

ТАБЛИЦА 2

клон РНК РНК РНК клон РНК РНК РНК клон РНК РНК РНК

шгс сп.м. сп.м. ВНй сп.м. сп.м. ВИЙ сп.м. сп.м.

1дн 1дн 4 Эдн 1дн 1дн 45дн 1дн 1дн 45дн

ЕО 1 1 1 БЗ 1/3 1 0 15" 1 1/5 1/20

Н4 1 1/20 0 С7 1 0 0 С2 1 1 1

Е2" 1 1 0 . л *« АО 1 1 0 В1* 1 0 0

ВЗ 1/10 1 0 ЕЗ 1 1 0 14" 1 0 0

РЗ 1/10 1 0 В2 1 1/20 0 В4 1 0 0

С1 1 1/10 1/10 Н7*" 1 0 0 Н7*+ 1 1/20 0

» - в. таблица указаны, талька данные для транс крипта большего размера.

»» - оба транскрипта одинаково представлены в тканях, •*» - активность транскрипции для 2,6 т.п. Н7-мРНК. «+ - активность транскрипции для 0,8 т.п. Н7-мРНК.

Возможно, присутствие второго транскрипта повлияло на ход истощения кДНК-В1 и после амплификации кДНК содержание в нем КДНК-В1 оказалось не достаточно для регистрации клона В1 при гибридизации с кДНК-зондом-4. Неясна причина, по которой не регистрируются клоны В8, Ев и ЕО при дифференциальном скрининге. Возможно, слабый уровень транскрипции генов-1)6, Е6 и ЕО, а так же присутствие фона при скрининге кдНК-зондои-4 не позволило зарегистрировать сигнал от этих клонов.

Скрининг с помощью кДНК-зондов-4, -3 и -2 имеет два существенных преимущества перед классическим дифференциальным скринингом с помощью кДНК-зонда-1, -2 и -3: во-первых, скрининг кДНК-зондом-4, -3 и -2 не чувствителен к артефактам, то есть клонируются гены, уровень транскрипции которых в 50 и более раз больше в "ткане-лидере" (поли!А)+РНК, выделенная из данной ткани играет роль "лидера"), чем в "ткане-драйвере" (поли(А)+РНК, выделенная из данной ткани играет роль "драйвера"); во-вторых.

скрининг кДНК-зондом-4, -3 и -2 можно провести, используя 5-50нг поли(А)'РНК для "лидера".

Присутствие транскрипта гена в ДКГ и отсутствие экспрессии в коре, мозжечке, печени и почках не является, в строгом смысле, показателем ДКГ-специфичности гена. Необходимо, чтобы транскрипт гена был представлен только в ДКГ (допускается слабый уровень транскрипции в коже, мышцах,легких и спинном мозге 1-дн. крыс (в 10 и более раз меньше, чем в ДКГ), при условии, что in situ гибридизация локализует данный транскрипт в аксонах и дендритах сенсорных нейронов ДКГ). Гены, транскрибирующиеся в ДКГ, но не экспрессируюшиеся в коре, мозжечке, печени и почках 1-дн. крыс, были отобраны для дальнейшего анализа. Результаты дот-гибридизации этих генов с тотальной РНК выделенной из ДКГ и спинного мозга 1-дн. и 45-дн. крыс суммированны в Таблице 2. Гены В1, В2, В4, С1, Н4, Н7, G7 и 14 гибридизовали с РНК-фильтром, содержащим более широкий набор суммарных РНК, выделенных из различных тканей. Ген Н4 экспрессируется в нижних отделах ЦНС (в спинном мозге и очень слабо в мозжечке), ПНС и надпочечной железе. Транскрипты генов 14 (Рис. 7), G7 и большой транскрипт гена Н7 присутствуют только в ДКГ (при длительном экспонировании РНК-фильтра, гибридизовавшегося с клоном 14, регистрируется слабый сигнал в когкз). Гены CI, В2 и В4 зкспрессируются в ДКГ и в 5-20 раз слабее в спинном мозге (при длительном экспонировании РНК-фильтра, гибридизовавшегося с С1, регистрируется слабый сигнал в коже и мышцах). Большой транскрипт В1 экспрессируется в ДКГ и слабее в коже (Рис.7), in situ гибридизация коронального среза 16-дн. эмбриона с DIG кРНК-пробами генов В2, В4, CI, G7 и 14 подтвердила ДКГ-специфичность этих клонов (кроме С1, который проявлял слабую транскрипцию в спинном мозге) (Рис. 8). Из-за гибридизации Н7 - и В1 зондов с двумя транскриптами невозможно синтезировать DIG кРНК-зонд, специфичный для больших транскриптов, без проведения предварительного исследования первичных структур двух мРНК.

Применение субтрактивной кДНК библиотеки для функционального клонирования.

Для того, чтобы клонировать гены на основе свойств продукта трансляции этого гена (функциональное клонирование) необходимо:

во-первых, сконструировать субтрактивную библиотеку в экспрессируюшэм векторе; во-вторых, дифференциальный скрининг заменить на селекцию клона, основанную на определенном свойстве продукта данного гена; в-третьих, процент полноразмерных кДНК клонов в библиотеки должен быть достаточно высок.

1 23 4 5136 8 912.

а " л

14131211109 8 7 6 5 4 3 2 1

©ааааооооаи*

Рис. 7. Анализ экспрессии Н7, В1, 14 и С7 в тканях 1-дн. крыс с помощью Нозерн-гибридизации. На дорожу нанесена тотальная РНК 120 мкг), выделенная из коры головного мозга (1), мозжечка (2), спинного мозга (3), ДКГ (4), надпочечной железы (5), почки (б), кожи 17), сердца «8), легких (В), селезенке (101. тимуса (И), мышц (12). печени (13) и основания мозга (14). Нозерн блот ре-гибридизовали с зондом, содержащим ген рибосомного белка 1-27, чтобы продемонстрировать, что равное количество РНК нанесено на дорожи. .Фильтры экспонировали 2-5 дней при -70°С с использованием усиливающих экранов ЭУИ-5.

Рис. 8. Экспрессия G7, 14 и В2 в ДКГ и спином мозге 18-дн. эмбрионе крыс. Корональные секции (10 дт) были прогибридизованы In situ с антисмысловой (Б, Г и Е) и смысловой (А, В и Д1 DIG-РНК пробами В2 (А и Б), 14(ВиГ)иС7(ДиЕ). Специфическая гибридизация наблюдается в дорзальном корневом ганглии (DEG) и отсутствует в спином мозге (SC>.

После истощения кДНК, синтезированной на основе поли(А)+РНК, выделенной из ДКГ, и лигирования кДНК с АпЭрб-праямером ее амплифицировали по схеме, примененой для кДНК-46, как описано в предыдущем параграфе (т.е. применяли Sp6- и Т-праймеры). Для определения полноразмерности кДНК клонов в библиотеке, мы сконструировали ее в векторе AZapII и проскринировали 6000 рекомбиналтных клонов последовательно В1, В2, В4, Н4, Н7, С1 и С7-зондами. Анализ размера вставок показал, что они несут полноразмерные кДНК клоны: В1 - З.Эт.п.н., В2 - 1,3 т.п.н., Н4 и С1 - 1,9т.п.н., В4 - 4т.п.н., G7 - Зт.п.н. и Н7 - 2,5т.п.н. Чтобы выяснить, есть ли в субтрактивной кДНК библиотеке, которая будет применена для функционального скрининга, другие ДКГ-специфические клоны помимо клонированных, мы скринировали субтрактивную кДНК

библиотеку в векторе \ZapII (6000 рекоибинаитных клонов), следующими зондами: високомеченная кДНК. синтезированная случайной затравкой и $ агнентом Кленова на матрице, амплифицированной ПЦР кДНК, которую применяли для конструирования скринируемой субтрактивной кДНК библиотеки: високомеченная кДНК, синтезированная на основе эквимолярного соотношения поли(А)+РНК мозжэчка и коры; и смесью вставок 13, РО, С2, С1. Н4, Б4. В2, В8, 00, ЕО, РЗ, Е0, 14, Е2, 15, АО, в7, Н7 и В1. Анализ результатов скрининга показал, что других ДКГ-специфических клонов в субтрактивной кДНК библиотеки помимо проклонированных - нет. Однако, существует одно ва.чное различие данного скрининга от описанного в предыдущем параграфе; клоны Р.О, Е8 и 08 были зарегистрированы в этом скрининге. Возможно, применение для скрининга библиотеки высокомеченного кДНК-зонда, синтезиробанного на матрице более полноразмерноа амплифицированной ПЦР кДНК, повышает чувствительность скрининга.

А

'УЧ.'

г* «у.*; А

; у*. •>' ••

"V " . '*■■ "Л .»'*•'

»ж

** - -а» ' -

v;« '5.*?'о*.

, -vi.....£ *• -V.

ГП - V

'

Рис. 9. Фазово-контрастная микрофотография культуры C0S-7 клеток. Стрелкой указанны клетки, чувствительные к кобальту. Клетки на чашке А транслировались истощенной кДНК библиотекой и обрабатывались капсаицином; клетки на чашке Б трансфецировали истощенной кДНК библиотекой и ие обрабатывали капсаицином; клетки на чашке В трансфецировали кДНК библиотекой ДКГ и обрабатывали капсаицином.

Изучение воздействия калсаицина (6-ыетил н-ванилил 6-нонамид) на сенсорные нейроны ЦНС и ПНС дало основание предположить, что существует на цитоплазматической мембране С-волокон, расположенных' в ДКГ, рецептор, который при взаимодействии с капсаицином пропускает внутрь клетки ионы Са2+. Свойство капсаицинового рецептора было взято за основу при скрининге субтрактивной к ДНК библиотеки, построенной в челночном векторе pcDNA I/Amp и примененной для трансфекции СОЗ-7. В результате скрининга на наличие капсаицинового рецептора удалось зарегистрировать группу клеток (4шт), которые пропускали ионы кобальта только при обработке СОЗ-7 капсаицином (Рис. 9). Применение. неистощенной кДНК библиотеки для клонирования капсаицинового рецептора не привело к результату (Рис. 9), это позволяет надеяться, что один из проклонированных ДКГ-специфических клонов является геном капсаицинового рецептора.

ВЫВОДЫ

1. Проклонированы гены MB, MF, ЗЕ7 и ЗС6, которые дифференциально экспрессируются в мозжечке при постнатальном развитии крыс.

2. Проклонированы: ген МК, экспрессируюшийся в коре головного мозга и не регистрирующийся Нозерн гибридизацией в мозжечке взрослых крыс, и ген 3L4, экспрессируюшийся значительно больше в мозжечке, чем в коре головного мозга взрослых крыс.

3. Модифицирован метод конструирования субтрактивной кДНК библиотеки и ее дифференциального скрининга, что позволило: сконструировать субтрактивную кДНК библиотеку из 5 нг поли(А)+РНК, использовавшейся в качестве "лидера", определять не ткане-специфические гены (артефакты клонирования) на этапе дифференциального скрининга

4. Проклонировано 19 генов, экспрессирующихся в дорзальном корневом ганглии и не регистрирующихся Ноэерн гибридизацией в коре головного мозга, мозжечке, почках и печени новорожденных крыс. Транскрипты генов 14, G7, В2, В4 и один из транскриптов генов Н7 и В1 специфически представлены в клетках дорзального корневого ганглия новорожденных крыс.

5. Модифицирован метод синтеза кДНК из минимального количества поли(А)+РНК, что позволило применить субтрактивную

кДНК библиотеку, сконструированную из синтезированной кДНК, для функционального клонирования капсаицинового рецептора.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Y.L. Buchman, N.N. Ninkina, Yu.D. Bogdanov, H.N. Akoplan, O.Yu. Krylova, K.V. Anokhin, 3.L. Klselev. A developmentally regulated gene with expression restricted to the nervous system codes for a novel type of zinc-finger protein. Abstracts of the 15th annual rceeting of the europlan neuroscience association. Munich 13-17 September 1992, p. 162.

2. V.L. Buchman, N.N. Ninkina, Yu.D. Bogdanov, A.I. Bortvirr, H.N. Akoplan, S.L. Klselev, O.Yu. Krylova, K.V. Anokhin and G.P. Georgiev. Differential splicing creates a diversity of transcripts from a neurospecific developmentally regulated gene encoding a protein with new zing-finger raotlfs. Nucleic Acids Research., 1992, Y. 20, N. 21, pp. 5579-55S5.

3. Акопян A.H., Бака И.Д., Честков А.В., Бухыан В.Л., Георгиев Г.П. Клонирование генов, дифференциально экспрессируюшихся в мозжечке при постнатальном развитии крысы. Генетика, 1994, Т. 30,

АЛО

4. Акопян А.К., Честков А.В., Бака И.Д., Бухыан В.Л.\ Георгиев Г.П. Клонирование генов, специфически экспрессируюшихся в коре головного мозга и мозжечке взрослых крыс. Генетика, 1994, Т. 30,

VW

МОСКОВСКИЙ ИНСТИТУТ СТАЛИ И СПЛАВОВ

Заказ Объем /Тираж /Va-

Типография МИСиС, ул. Орджоникидзе, 8/9