Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Клинико-иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза"

На правах рукописи

¿¿¡¿а,

Шадривова Ольга Витальевна

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНВАЗИВНОГО АСПЕРГИЛЛЕЗА

03.02.12 — микология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт - Петербург

2014

005559043

005559043

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научные руководители:

Васильева Наталья Всеволодовна - доктор биологических наук, профессор; Климко Николай Николаевич - доктор медицинских наук, профессор. Официальные оппоненты:

Балашов Дмитрий Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д.Рогачева, заведующий отделением трансплантации гемопоэтических стволовых клеток №2.

Бубнова Людмила Николаевна - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агенства России, руководитель лаборатории иммуногемато-логии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «31» марта 2015 года в 13:30 часов на заседании диссертационного совета Д 208.086.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке и на сайте государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47, www.szgrnu.ru.

Автореферат разослан «_»_2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор ____Шевяков Михаил Александрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Инвазивные микозы (ИМ), вызванные грибами Aspergillus spp., являются актуальной проблемой. Развитие новых высокоэффективных медицинских технологий, включая трансплантацию аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), применение высокодозной ци-тостатической химиотерапии, таргетной терапии (моноклональных антител) и новых иммуносупрессивных препаратов (ингибиторы фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а) и др.) приводит к увеличению количества иммуноскомпрометиро-ванных пациентов с высоким риском развития оппортунистических микозов (De Pauw В. et al., 2008). Инвазивный аспергиллез (ИА) - один из наиболее распространенных вариантов ИМ, ежегодно в мире различными формами аспергиллеза заболевает более 200 тысяч человек. Риск возникновения ИА особенно высок у онкогематологических больных в период проведения специфической полихимиотерапии (ПХТ) или после алло-ТГСК; у больных острым миелоидным лейкозом составляет от 5 до 24%, у реципиентов алло-ТГСК - 3-23% и зависит от типа донора и выраженности реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) (Herbrecht R. et al., 2012; Donelly et al., 2014). ИА отличается тяжелым течением, нарушает плановую терапию фонового заболевания и увеличивает стоимость лечения. Летальность остается чрезвычайно высокой (30% до 95%) и зависит от локализации и распространенности инфекционного процесса, особенностей течения фонового заболевания и степени предшествующего иммунодефицита (Brown G.D. et al, 2012).

Степень разработанности темы. Известно, что специфическая полихимиотерапия (ПХТ) и алло-ТГСК сопровождаются значительной иммуносупресси-ей: высокодозная цитостатическая химиотерапия вызывает глубокую аплазию кроветворения и, как следствие, длительные периоды агранулоцитоза; применяемые для профилактики и терапии РТПХ глюкокортикостероиды индуцируют нарушение фагоцитарной и киллерной активности макрофагов (Chai L.Y., et al., 2011). Иммунодефицитные состояния, возникающие вследствие ятрогенной им-муносупрессии и алло-ТГСК, являются предрасполагающими факторами к разви-

тию ИА у гематологических больных. Однако существуют лишь основанные на экспериментальных данных единичные исследования, изучающие особенности иммунного ответа и динамику изменений иммунологических показателен при ИА у гематологических больных. Отсутствует информация о взаимосвязи клинико-иммунологических параметров с особенностями течения аспергиллезной инфекции. Не исследовано влияние иммунологических особенностей ИА у гематологических больных на прогноз заболевания. Методы иммунологического обследования гематологических пациентов с ИА не разработаны.

Оценка юшнико-иммунологических особенностей, определение влияния иммунологических нарушений на течение и прогноз ИА необходимы для разработки новых эффективных стратегий терапии данного заболевания (СагуаШо А., е1 а1., 2012).

Цель исследования: оптимизация диагностики и лечения инвазивного аспергнллеза у гематологических пациентов на основании изучения иммунного статуса.

Задачи исследования:

1. Изучить основные иммунологические изменения у взрослых гематологических пациентов с инвазивным аспергиллезом;

2. Выявить иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза у различных категорий гематологических больных (получающих цитостатиче-скую полихимиотерапию; реципиентов трансплантатов кроветворных стволовых клеток);

3. Изучить динамику иммунологических показателен на разных этапах инвазивного аспергиллеза (начало заболевания, разгар, фаза реконвалесценции);

4. Определить клинические и иммунологические показатели, влияющие на выживаемость больных инвазивным аспергиллезом, получающих цитостатиче-скую полихимиотерапию и реципиентов аллогенных трансплантатов гемопо-этических стволовых клеток;

5. Определить прогностическое значение иммунологических показателей у гематологических больных инвазивным аспергиллезом.

Научная новизна.

Впервые изучены основные иммунологические параметры у гематологических пациентов с инвазивным аспергиллезом, что расширило представления об иммунопатогенезе заболевания.

Впервые получены данные о динамике иммунологических показателей у гематологических больных, получающих цитостатическую полихимнотерашио и реципиентов алло-ТГСК, что позволило оценить взаимосвязь иммуного ответа с особенностями течения инвазивного аспергиллеза.

Впервые определено прогностическое значение иммунологических показателей у гематологических больных инвазивным аспергиллезом.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Разработаны методы иммунологического обследования получающих ПХТ гематологических пациентов и реципиентов алло-ТГСК, что позволяет прогнозировать исход инвазивного аспергиллеза.

Исследование показало, что для эффективной терапии инвазивного аспергиллеза необходимо уменьшение иммуносупрессии (модификация иммуносу-прессивной терапии) и восстановление иммунологических показателей.

Установлены улучшающие показатели выживаемости больных ИА факторы: ранняя диагностика с использованием фибробронхоскопии, применение во-риконазола для стартовой терапии и вторичная антимикотическая профилактика.

Результаты научно-исследовательской работы внедрены в педагогический процесс кафедры клинической микологии, аллергологии и иммунологии и кафедры медицинской микробиологии и используются при проведении практических занятий, а также в лечебно-диагностическую работу микологической клиники НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России, отделения трансплантации костного мозга НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой ГБОУ ВПО ПСПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова МЗ РФ и Ленинградской областной клинической больницы.

Методология и методы исследования. Диссертация выполнена на кафедре клинической микологии, аллергологии и иммунологии (заведующий кафедрой -д.м.н. профессор H.H. Климко) и на базе микологической клиники НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина (директор - д.б.н. профессор Н.В. Васильева) ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России.

Настоящее исследование - проспективное (по времени сбора данных и формированию выборки), многоцентровое, динамическое (по временным параметрам), обсервационное (по отсутствию или наличию вмешательства), выполнено в течение трех лет (с октября 2011 по сентябрь 2014 г.). Объект исследования -гематологические пациенты с инвазивным аспергиллезом. Использовали клинические, лабораторные (серологические, микробиологические, патоморфологиче-ские, молекулярные), инструментальные методы диагностики. Проводили статистическую обработку результатов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Инвазнвный аспергиллез у гематологических пациентов развивается на фоне достоверных нарушений (р<0,05) всех звеньев иммунного ответа: снижения абсолютного числа субпопуляций лимфоцитов Т-хелперов (CD4~f), естественных киллеров (CD16+), B-лимфоцитов (CD20+) и уровня иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA), снижения микробицидной активности нейтрофилов и нарушения их киллерной способности, угнетения продукции ключевых цитокинов, участвующих в иммунном ответе (ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17 и Г-КСФ). Наиболее выраженные нарушения установлены у реципиентов алло-ТГСК.

2. Достижение ремиссии инвазивного аспергиллеза возможно при восстановлении иммунологических показателей:

- у получающих цитостатическую полихимиотерапию пациентов — увеличение продукции ФНО-а и уровня Г-КСФ;

- у реципиентов алло-ТГСК — увеличение абсолютного числа всех субпопуляций лимфоцитов, в частности CD4+, а также повышение способности лейкоцитов к продукции цитокинов ИЛ-10, ИЛ-6, ФНО-а и Г-КСФ;

3. Факторами, достоверно улучшающими показатели общей 12-недельной выживаемости всех гематологических больных, являются: проведение фиброб-ронхоскопии для ранней диагностики инвазивного аспергиллеза, использование вориконазола в качестве стартовой терапии и вторичная антифунгальная профилактика.

4. Для эффективного лечения инвазивного аспергиллеза необходимо уменьшение иммуносупрессии и восстановление иммунологических показателей. Прогностически благоприятными маркерами являются: количество CD4+ лимфоцитов в периферической крови более 0,177x10% и уровень индуцированнои продукции ФНО-а более 215 пг/мл.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов обусловлена репрезентативностью выборки обследованных больных, применением современных методик статистической обработки информации и выбором адекватных критериев для статистического анализа. Для проведения исследования применяли стандартные методики, описанные в соответствующей литературе. Достоверность работы подтверждается публикацией её результатов в рецензируемых научных изданиях.

Результаты работы были представлены и обсуждены на международных конференциях 23rd European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases - 2013, 28th International Congress of Chemotherapy and Infection - 2013, 53rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy - 2013, 6th Trends in Medical Mycology - 2013, 6th Advances Against Aspergillosis - 2014; на ежегодных Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микробиологии и клинической микологии XV - XVII Кашкинские чтения (Санкт-Петербург - 2012, 2013, 2014) и на 1-й отчетной сессии научных подразделений СЗГМУ им. И.И. Мечникова «Фундаментальные исследования в современной медицине: достижения и перспективы», 2013.

По материалам диссертации опубликовано 23 научных работы, в том числе 9 статей в рецензируемых изданиях.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Автор самостоятельно осуществлял обследование и лечение больных инвазивным аспергиллезом, динамическое наблюдение за пациентами. Автор провел аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, выполнил статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, содержащего 35 отечественных и 137 иностранных источников. Текст диссертации иллюстрирован 18 таблицами и 16 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Для решения поставленных задач использовали регистр больных ИА в Санкт-Петербурге, который включает 510 пациентов с «доказанным» или «вероятным» ИА, находившихся на лечении в различных отделениях 14 многопрофильных стационаров Санкт-Петербурга в период с 1998 по 2014 г. Гематологические пациенты составили 88% (п=450).

В исследование включили 367 гематологических пациентов с ИА в возрасте от 18 до 78 лет, медиана - 41,8 (28+55); мужчин - 56%, женщин - 44%. Больных разделили на две группы. Группа I - 255 (69%) больных, у которых ИА развился после цитостатической ПХТ, возрастом от 18 до 78 лет, медиана - 48 (33+58); мужчин - 141 (55%), женщин - 114 (45%). Группа II - 112 (31%) реципиентов алло-ТГСК, возраст - 18-60 лет, медиана - 29 (21^-44); мужчин - 66 (59%), женщин - 46 (41%). Контрольная группа включала 32 практически здоровых человека, из них мужчин - 17, женщин - 15; возраст - 18-49 лет, медиана - 29 (21,0+32,0).

Для выявления очагов поражения проводили компьютерную томографию (КТ) органов грудной клетки в режиме высокого разрешения, по показаниям - КТ

придаточных пазух носа и брюшной полости, магнитную резонансную томографию головного мозга и ультразвуковое исследование органов брюшной полости. Для получения материала для лабораторных исследований выполняли фибробронхоскопию с забором бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), по показаниям - плевральную и люмбальную пункции, пункцию придаточных пазух носа (ППН) и биопсию тканей.

Лабораторная диагностика ИА вклкЗчала микроскопию, посев биосубстратов (мокрота, БАЛ, отделяемое из ППН и др.), гистологическое, серологическое исследование. Из образцов биосубстратов готовили препараты, которые просматривали в люминесцентном микроскопе, отмечая наличие септированного мицелия, ветвящегося под углом 45°. Посев патологического материала выполняли на специализированные среды и инкубировали при +37°С и +28°С в течение 10 дней. Идентификацию кулыур Aspergillus spp. проводили по морфологическим и физиологическим свойствам в соответствии с определителями грибов (De Hoog G.S. et al., 2000). В случаях, когда идентификация грибов по морфологическим свойствам была затруднена, использовали метод MALDI-TOF (матрично-активированная лазерная десорбционно/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия) с помощью прибора «Autoflex Speed» (Bruker, Германия) и ДНК-секвенирование.

Из операционного, биопсийного и секционного материала готовили гистологические препараты, для выявления элементов гриба окрашивали срезы гематоксилином-эозином, по методу PAS и Гомори-Грокотта.

Галактоманнан в сыворотке крови, БАЛ и спинно-мозговой жидкости (СМЖ) определяли иммуноферментным методом с использованием диагностической тест-системы PLATELIA® Aspergillus (BIO-RAD Laboratories, США). Диагностически значимым считали индекс выше «0,5» в сыворотке крови и СМЖ, выше «1,0» - в БАЛ [ECIL-3, 2009].

Постановку диагноза ИА и оценку эффективности лечения проводили в соответствии с критериями EORTC/MSG, 2008 (European Organization for Research and Treatment of Cancer, and Mycoses Study Group).

Иммунологическое исследование проводили через 1-4 недели от установления диагноза ИА, динамику показателей оценивали через 2-3 месяца и на момент ремиссии ИА (перед отменой антимикотической терапии). Значимой лимфоцито-пенией считали снижение абсолютного количества лимфоцитов крови менее 1,0x10%, нейтропенией - менее 0,5x109/л. Субпопуляционный состав лимфоцитов определяли иммуноцитохимическим методом CD-типирования с использованием моноклональных антител «DAK.O». Кислородзависимую бактерицидность нейтрофилов оценивали в НСТ-тесте, киллерную активность - с использованием референтного штамма С. albicans. Продукцию ИФН-у, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ФНО-а, Г-КСФ определяли коммерческими иммуноферментными тест-системами («Цитокин», «Вектор-Бест», Россия). Уровни иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови оценивали нефелометрическим методом на анализаторе белков «Turbox plus».

Полученные медико-биологические данные обрабатывали с использованием программной системы STATISTICA for Windows (версия 10,0; лиц. BXXR310F964808FA-V). Соответствие закону нормального распределения оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова, значимость различий количественных показателей - по U-критерию Манна-Уитни, степень зависимости между параметрами внутри исследуемых групп - с помощью ранговой корреляции Спир-мана. Для анализа данных, содержащих цензурированные наблюдения, использовали F-критерий Кокса и критерий Кокса-Ментела. Диагностическую значимость показателей определяли, используя ROC-анализ (receiver-operator characteristic) с расчётом площади под характеристической кривой (Area Under Curve, AUC). Анализ выживаемости провели по методу Каплана-Мейера. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицинской статистике величину р<0,05. (Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2005).

Результаты собственных исследований. Установлено, что ИА развивается преимущественно у пациентов с острым мнелоидным лейкозом, который составил 33% в обеих группах (рисунок 1).

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%

Острый миелоидный лейкоз щшшшшшшшшшш Острый лимфобластный лейкоз

Неходжкниская лимфома 'щш Лимфома Ходжкина s Хронический миелоидный лейкоз Хронический лимфоцитарный Миелодиспластический синдром

Множественная миелома ааав Апластическая анемия Щт Другие гемобластозы j|

*m

в Алло-ТГСК

ПХТ

Рисунок 1- Структура фоновых заболеваний гематологических пациентов

с инвазивным аспергиллезом

* - достоверность различий показателей между группами (р < 0,05).

У реципиентов алло-ТГСК чаще встречался острый лимфобластный лейкоз

- 29%, миелодиспластический синдром - 10% и хронический миелоидный лейкоз

— 9%. а среди получающих ПХТ было больше больных лимфомами и множественной миеломой. В единичных случаях фоновыми состояниями были апластическая анемия и прочие гемобластозы.

Пациенты I группы получали цитостатическую ПХТ по различным протоколам (Hyper-CVAD+R, COALL-92, ALL 2009, HAD, 7+3, FLAG и пр.). Интервал после последнего курса ПХТ до развития ИА составил от 5 до 56 дней (медиана -23,5). Пациентам II группы проводили алло-ТГСК: неродственную - 59%, родственную - 26% и гаплоидентичную - 15%. В данной группе больных ИА развился в более поздний период (медиана - 51,0; р=0,002). Интервал после трансплантации до возникновения ИА варьировал от 4 до 300 дней. В раннем посттрансплантационном периоде (до 100-го дня) ИА возник у 67% реципиентов алло-ТГСК. РТПХ развилась у 86% больных, гипофункция трансплантата - 6%. У пациентов после алло-ТГСК ИА развивался на фоне более выраженной иммуносупрессии: чаще выявляли длительный (>10 суток) агранулоцитоз (84%) и лимфоцитопению (62%) (таблица 1).

Таблица 1 - Факторы риска пациентов с инвазивным аспергиллезом

Факторы риска ПХТ (п=255) Алло-ТГСК (п=112) Р-уровень

Нейтропения < 0,5х 10% 79% 84% 0,03

медиана (длительность) 14(11-20) 17(14-21,5) 0,02

Лимфоцитопения < 1,0х109/л 56% 62% 0,01

медиана (длительность) 14(12-21) 15 (12+21) 0,006

РТПХ - 86% 0,00

предшествующее применение ГКС 49% 57% 0,04

Инфекционные осложнения чаще возникали у реципиентов алло-ТГСК: сопутствующую или недавно перенесенную лабораторно подтвержденную бактериальную (сепсис) и/или вирусную (цитомегаловирус) инфекцию выявили у 45% vs 37% пациентов (р=0,02).

Тест на галактоманнан в сыворотке крови и/или БАЛ, СМЖ был положителен у 80% и 82% обследуемых, соответственно. При посеве БАЛ и/или промывных вод ППН Aspergillus spp. были выделены в 34% и 32% случаев (таблица 2).

Таблица 2 - Серологическое и микологическое исследование

Исследование ПХТ (п=255) алло-ТГСК (п=112)

% %

Положительный тест на галактоманнан

сыворотка крови 50 43

БАЛ 32 42

СМЖ 2 2

Обнаружение мицелия при микроскопии 20 16

Высев возбудителя 34 32

Гистологическое подтверждение 5 2

Аутопсия 1 6

Наиболее частым возбудителем в обеих группах были А. fumigatus - 49% и 38%, А. niger - 32% и 35%, реже - А.Астт - 18% и 23%, соответственно. В единичных случаях (1% и 4%) выделяли редкие виды: А.уетсоЬг, А. шШ и А. саН-с1от1ж.

Согласно критериям ЕОЯТС/МБО 2008, в ПХТ-группе «вероятный» ИА диагностировали в 94% случаев, «доказанный» - 6%. В алло-ТГСК - группе «веро-

ятный» ИА - 92%, «доказанный» - 8%, из них в 6% случаев диагноз был подтвержден при аутопсии.

Клинические варианты ИА не отличались у больных обеих групп. Основной локализацией патологического процесса были легкие (изолированное поражение или в сочетании с другими локализациями) - 97% и 98%. Экстрапульмональный аспергиллез с вовлечением центральной нервной системы (ЦНС) диагностировали в 3% и 5% случаев, соответственно; поражение придаточных пазух носа (ППН) наблюдали у 5% пациентов обеих групп. Изолированное поражение кишечника было у одного пациента, получающего ПХТ. Поражение двух и более органов было выявлено у 6% и 10% больных. Основными клиническими проявлениями были рефрактерная к антибиотикам широкого спектра действия лихорадка (74 и 71%), и кашель (58 и 56%), в редких случаях — кровохарканье (8%).

Все больные ИА получали антимикотическую терапию: вориконазол (59%), каспофунгин (14%) и итраконазол (13%), реже - амфотерицина В деоксихолат (8%) и позаконазол (6%), липидный амфотерицин В (2,5%) и изавуконазол (0,5%). Комбинированную терапию получали 12% больных. Хирургическое лечение применили у 3% пациентов. Вторичную антифунгальную профилактику проводили у 28% пациентов.

Общая выживаемость в течение 12 недель составила 80,6%. Несмотря на сходную антимикотическую терапию, более высокую летальность отмечали у реципиентов алло-ТГСК (рисунок 2).

О I 2 3 4 5 6

Рисунок 2 - Анализ общей 12-недельной выживаемости у гематологических пациентов с ИА

Наше исследование показало, что достоверно улучшают показатели общей

12-недельной выживаемости использование фибробронхоскопии для ранней диагностики ИА (р=0,003), применение вориконазола в качестве антимикотической терапии (р=0,003) и вторичная антифунгальная профилактика (р=0,0001). Отрицательными прогностическими факторами были рецидив основного заболевания на момент развития микотической инфекции (р=0,01) и наличие сопутствующей тяжелой бактериальной и/или вирусной инфекции (р=0,002).

В ходе исследования динамику иммунологических показателей изучили у 83 пациентов (48 больных из ПХТ группы и 35 - из алло-ТГСК). Установлено, что у гематологических пациентов ИА развивается на фоне выраженного нарушения всех звеньев иммунного ответа. В обеих группах выявлены сходные изменения иммунологических показателей: достоверное снижение общего количества лейкоцитов за счет лимфоцитов, снижение абсолютного числа всех субпопуляций лимфоцитов кроме цитотоксических Т-лимфоцитов (С08+), их процентное содержание было повышено по сравнению с контрольной группой (таблица 3).

Таблица 3 - Количественные показатели лейкоцитов и субпопуляционного состава лимфоцитов взрослых гематологических пациентов на ранней стадии развития ИА

Показатели ПХТ группа (п=48) Алло-ТГСК группа (п=35) Контрольная фуппа (п=32)

Медиана (25%-75%)

Лейкоциты (х109/л) 4,35 (1,55-5,65) 4,0 (2,0+5,2) 5,9 (5,2-6,4)

»0,0002 *0,0002 |

Лимфоциты абс. (хЮ'/л) 0,98 (0,5-1,85) 0,38(0,13-1,84) 2,19(1,94-2,4)

»0,000 »0,00001 **0,01

Нейтрофилы абс. (х109/л) 1,78 (0,93-3,75) 1,84(1,47-3,6) 3,05 (2,53-3,47)

*0,0005 »0,004 |

СБЗ+ абс. (х109/л) 0,67 (0,47-1,42) 0,36(0,08-1,65) 1,4(1,27-1,66)

»0,001 »0,0007 |

СБ4+ абс.(х109/л) 0,40 (0,22-Ю,72) 0,14 (0,04-0,56) 0,87 (0,72-0,99)

»0,0001 ♦0,0001 | **0,01

С08+(%) 39,5 (31,0-49,0) 44,0 (37,0-54,0) 26,5 (24,5-29,0)

♦0,0001 »0,0001 |

СБ8-абс.(х107л) 0,46 (0,25-Ю,75) 0,29 (0,05-0,94) 0,58 (0,52-0,67)

*0,05 |

С020+ абс.(х109/л) 0,09 (0,04-Ю, 16) 0,03 (0,01-0,17) 0,32 (0,27-0,38)

»0,000 »0,000 |

продолжение таблицы 3

С025+ абс.(х107л) 0,1 (0,04+0,19) 0,03 (0,009+0,17) 0,26 (0,22+0,31)

*0,000 »0,000 | **0,04

СО 16+ абс.(х109/л) 0,12(0,07+0,24) 0,09 (0,01+0,24) 0,22(0,19+0,28) '

»0,0008 »0,0006 | **0,000

Иммунорегуляторный индекс (С04+/С08+) 0,91 (0,56+1,1) 0,69 (0,45+1,0) 1,5 (1,38+1,69)

»0,000 »0,000 |

Представлены медианные значения с интерквартильным размахом (25%+75%); * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (р< 0,05); ** - достоверность различий показателей между исследуемыми группами (р< 0,05).

Установлено изменение способности предшественников лимфоцитов к дифференцировке в различные субпопуляции, что привело к достоверному снижению абсолютного числа Т-хелперов (С 04+). Особенностью реципиентов алло-ТГСК явилось более выраженное снижение абсолютного количества лимфоцитов за счет Т-хелперов СБ4+ (р=0,01), естественных киллеров СБ16+ (р=0,000) и лимфоцитов с активационными маркерами (рецепторами к ИЛ-2) СЭ25+ (р=0,04).

При анализе показателей гуморального иммунного ответа на ранней стадии развития ИА выявлено снижение абсолютного количества В-лимфоцитов (С020+) (таблица 3) и уровней иммуноглобулинов всех исследованных классов по сравнению с контрольными значениями (таблица 4).

Таблица 4 - Показатели гуморального иммунного ответа и функциональной активности ней-трофилов у гематологических больных на ранней стадии развития ИА

Показатели ПХТ группа (п=48) Алло-ТГСК группа (п=35) Контрольная группа (п=32)

Медиана (25%+75%)

^А (г/л) 1,2 (0,61+2,7) 0,46(0,27+0,71) 1,8(1,7+2,02)

»0,006 »0,000 | **0,0003

^М (г/л) 0,64 (0,34+0,92) 0,57 (0,34+0,94) 1,16(1,06+1,17)

»0,000 »0,000 |

1ёО (г/л) 10,6 (5,5+16,7) 5,4 (3,7+9,6) 13,5(12,9+14,7)

»0,01 »0,000 | **0,007

НСТ спонтанный (%) 31,0 (21,0+42,0) 49,0 (27,0+69,0) 21,0(18,5+25,5)

»0,0007 »0,00001 | **0,006

НСТ активированный (%) 63,0 (54,0+77,0) 79,0 (56,0+90,0) 56,5 (51,0+60,0)

»0,005 »0,0001 | **0,01

Коэффициент киллинга (%) 10,0 (7,0+17,0) 10,5 (9,0+13,0) 24,0 (22,0+26,5)

»0,000 »0,000

Представлены медианные значения с интерквартильным размахом (25% -75%); * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (р< 0,05); »» - достоверность различии показателей между исследуемыми группами (р< 0,05).

Несмотря на то, что количество В-лимфоцитов достоверно не отличалось в исследуемых группах, у реципиентов алло-ТГСК установлена достоверно более низкая продукция ^О и ^А по сравнению с получающими цитостатическую ПХТ больными ИА (р=0,007 и р=0,0003), соответственно. Эти данные свидетельствуют о выраженном нарушении функциональной активности В-лимфоцитов у реципиентов алло-ТГСК.

При оценке функционального состояния нейтрофильного звена иммунитета установлено снижение киллерной активности нейтрофилов на фоне компенсаторно повышенной микробицидной активности нейтрофилов у гематологических больных ИА в обеих группах (таблица 4).

При изучении функциональной активности лейкоцитов периферической крови у гематологических больных выявлено достоверное снижение продукции провоспалительных цитокинов ИФН-у и ФНО-а, обеспечивающих антифунгаль-ную активность фагоцитирующих клеток (таблица 5).

Таблица 5 - Уровень цитокинов у гематологических больных на ранней стадии развития ИА

Показатели (пг/мл) ПХТ группа (п=48) Алло-ТГСК группа (п=35) Контрольная группа (п=32)

Медиана (25%+75%)

ИФН-у индуцированный 418,0 (99,5-700,0) 133,0 (38,0-604,0) 768,0 (576,0+1258,0)

»0,00003 *0,0002 |

ФНО-а 348,5 (87,0-440,0) 114,0 (25,0-381,0) 468,0 (391,0+550,0)

»0,00002 »0,000 |

ИЛ-6 352,0 (54,0+616,0) 104,0 (24,0+545,0) 430,0 (354,0+602,0)

*0,004 |

ИЛ-10 62,5 (24,0-223,0) 23,0 (8,0+74,0) 403,5 (279,5+489,5)

»0,000 *0,000 | **0,02

ИЛ-17 39,0 (15,0+166,0) 5,0 (2,0+18,0) 166,0(156,0+191,0)

»0,0001 »0,000 | **0,0001

Г-КСФ 145,0(14,0+340,0) 40,0 (5,0+115,0) 299,0(178,5+408,5)

»0,03 »0,00002 | **0,025

Представлены медианные значения с интерквартильным размахом (25% +75%); * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (р< 0,05); ** - достоверность различий показателей между исследуемыми группами (р< 0,05).

У всех обследованных больных установлено снижение уровней ИЛ-17, Г-КСФ и противовоспалительного цитокина ИЛ-10, но наиболее низкая их продукция вы-

явлена у реципиентов алло-ТГСК. Таким образом, исследованные группы больных различались как по количественным показателям лимфоцитов, так и по их функциональной активности, что подтверждается данными корреляционного анализа. Установлена положительная корреляционная связь абсолютного числа лимфоцитов с их способностью к продукции ИФН-у, ФНО-а и ИЛ-17 (г=0,75; г=0,6; г=0,59 соответственно, при р<0,05).

На следующем этапе исследования провели сравнение иммунологических показателей на ранней стадии ИА в зависимости от исхода заболевания. Установлено, что у больных с благоприятным течением ИА в ПХТ и алло-ТГСК группах по сравнению с данными пациентов с неблагоприятным исходом достоверно выше абсолютное число лимфоцитов СБЗ+ (р=0,03 и р=0,02), естественных киллеров СБ 16+ (р=0,01 и р=0,04, соответственно), а также количество Т-хелперов СБ4+ у реципиентов алло-ТГСК (р=0,01). При исследовании цитокин-продуцирующей способности лейкоцитов у больных с неблагоприятным исходом в обеих группах наблюдали достоверное снижение выработки провоспалительных цитокинов ИФН-у (р=0,003 и р=0,0001), ФНО-а (р=0,001 и р=0,01) и ИЛ-17 (р=0,03 и р=0,02) по сравнению с пациентами с благоприятным исходом. Уровни иммуноглобулинов и показатели, характеризующие количество и киллерную активность нейтрофилов, достоверно не отличались.

Исследование показало, что для благополучного исхода ИА необходимо восстановление иммунологических показателей: у достигших ремиссии пациентов в ПХТ-группе отмечали достоверное увеличение продукции ФНО-а (р=0,02) и уровня Г-КСФ (р=0,001), а также нарастание уровня индуцированного ИФН-у (р=0,09), однако достоверного различия для этого показателя получено не было. У реципиентов алло-ТГСК - достоверное повышение абсолютного числа всех субпопуляций лимфоцитов, включая Т-хелперы С04+ (р=0,03), а также повышение способности лейкоцитов к продукции цитокинов ФНО-а (0,04), Г-КСФ (р=0,02), ИЛ-10 (р=0,03) и ИЛ-6 (р=0,04).

Построение ЯОС-кривых показало высокую информативность определения абсолютного числа С04+ лимфоцитов и способности клеток крови к продукции

ФНО-а для прогнозирования ИА. При оценке прогностического значения количества CD4+ и способности клеток крови к продукции ФНО-а у всех обследованных гематологических пациентов площадь под кривой ROC составила 0,752 и 0,774 при р<0,05 (рисунки 3 и 4).

ROC Curve / AUC-Ü.7S2

False positive rate (1 - Specificity)

p < 0,05

Точка отсечения 0,177х 10'/л Чувствительность 83,3% Специфичность 61,5%

Рисунок 3 - ROC-анализ прогностического значения абсолютного значения Т-хелперов (CD4+)

р < 0,05

Точка отсечения 215 пг/мл Чувствительность 77,6% Специфичность 80,6%

Рисунок 4 - ROC-анализ прогностического значения способности клеток крови гематологических больных ИА к продукции ФНО-а

На основании кривых ROC для показателей CD4+ и ФНО-а определили соответствующие максимальным значениям чувствительности и специфичности точки разделения: количество CD4+ лимфоцитов - 0,177х109/л (специфичность 61,5%, чувствительность 83,3%) и уровень ФНО-а - 215 пг/мл (специфичность 80,6%, чувствительность 77,6%). При анализе влияния этих показателей на общую выживаемость больных ИА установлены положительные прогностические факторы 12-недельной выживаемости для больных обеих групп: абсолютное ко-

личество Т-хелперов CD4+ > 0,177х109/л, р=0,002 (рисунок 5) и уровень ФНО-а > 215 пг/мл, р=0,0001 (рисунок 6).

Рисунок 5 - Зависимость выживаемости гематологических больных с ИА от количества СЭ4+ лимфоцитов

Рисунок 6 - Зависимость выживаемости гематологических больных с ИА от уровня ФНО-а

Наши результаты подтверждают, что у получающих цитостатическую терапию гематологических больных и реципиентов алло-ТГСК определение количества СВ4+ лимфоцитов и способности клеток крови к продукции ФНО-а на ранней стадии ИА можно эффективно использовать для оценки прогноза заболевания.

ВЫВОДЫ:

1. Инвазивный аспергиллез у получающих цитостатическую полихимиотерапию гематологических пациентов и реципиентов аллогенных трансплантатов ге-мопоэтических стволовых клеток развивается на фоне выраженного нарушения всех звеньев иммунного ответа:

- достоверного снижения абсолютного числа Т-хелперов (С04+), естественных киллеров (СБ 16+) и усиления способности Т-лимфоцитов к дифференцировке в цитотоксическую субпопуляцию (СБ8+), (р<0,05);

- снижения активности гуморального иммунного ответа — уменьшения числа В-лимфоцитов (СО20+) и уровней иммуноглобулинов (^в, и ^А), (р<0,05);

- снижения функциональной активности нейтрофилов — угнетения их киллерной способности (р<0,05);

- угнетения продукции ключевых цитокинов иммунного ответа ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-10, ИЛ-17 и Г-КСФ, (р<0,05).

2. Для реципиентов аллогенных трансплантатов гемопоэтических стволовых клеток характерны более выраженные иммунологические нарушения по сравнению с получающими цитостатическую полихимиотерапию пациентами:

- снижение абсолютного числа лимфоцитов за счет Т-хелперов С04+ (р=0,01);

- угнетение продукции иммуноглобулинов 1§0 (р=0,007) и ^А (р=0,0003);

- снижение способности клеток крови к продукции цитокинов ИЛ-10 (р=0,02), ИЛ-17 (р=0,0001) и Г-КСФ (р=0,025).

3. Для благополучного исхода инвазивного аспергиллеза у гематологических больных необходимо восстановление иммунологических показателей:

- у получающих цитостатическую полихимиотерапию пациентов — увеличение продукции ФНО-а (р=0,02) и нарастание уровня Г-КСФ (р=0,001);

- у реципиентов аллогенных трансплантатов гемопоэтических стволовых клеток — увеличение абсолютного числа всех субпопуляций лимфоцитов и, в частности СБ4+ субпопуляции (р=0,03); повышение способности лейкоцитов к продукции цитокинов ИЛ-10 (р=0,03), ИЛ-6 (р=0,04), ФНО-а (р=0,04) и Г-КСФ (р=0,02);

4. Общая выживаемость гематологических пациентов с инвазивным аспергил-лезом в течение 12 недель составила 80,6%. Ранняя диагностика с использованием фибробронхоскопии (р=0,003), применение вориконазола в качестве антимикоти-ческой терапии (р=0,003) и вторичная антифунгальная профилактика (р=0,0001) достоверно улучшают показатели выживаемости. Для эффективного лечения ин-вазивного аспергиллеза необходимо уменьшение иммуносупрессии и контроль основного заболевания (р=0,01).

5. Абсолютное количество лимфоцитов СВ4+ > 0,177х109/л и способность клеток крови к продукции ФНО-а >215 пг/мл являются прогностически значимыми показателями, позволяющими с высокой вероятностью прогнозировать благоприятный исход инвазивного аспергиллеза.

Практические рекомендации:

1. Гематологическим пациентам показано проведение фибробронхоскопии для ранней диагностики инвазивного аспергиллеза (серологическое и микологическое исследование БАЛ), использование вориконазола для стартовой терапии, а также применение вторичной антимикотической профилактики.

2. Для прогнозирования исхода и решения вопроса об отмене антимикотической терапии всем пациентам показано иммунологическое обследование с определением количества С04+ в периферической крови и уровней индуцированной продукции ФНО-а и Г-КСФ.

3. В ходе лечения инвазивного аспергиллеза необходимо уменьшение иммуносупрессии (активное лечение основного заболевания, снижение дозы или отмена глюкокортикостероидов, модификация иммуносупрессивной терапии).

Список работ, опубликованных по теме исследования:

1. Случай успешного лечения изолированного инвазивного микоза толстой кишки у больной острым лимфобластным лейкозом / О.В. Шадривова, С.Н. Хос-телиди, И.С. Зюзгин и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т.14, № 1. - С. 25-30.

2. Иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза у гематологических пациентов после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых

клеток / E.B. Фролова, O.B. Шадривова, JI.В. Филиппова и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14, № 3. - С.27-31.

3. Состояние иммунного статуса у гематологических пациентов с инвазивным аспергиллезом / Е.В. Фролова, О.В. Шадривова, Л.В. Филиппова и др. // Журнал инфектологии. - 2012. - Т. 4, № 4. - С. 59-64.

4. Клинико-иммунологическая характеристика инвазивного аспергиллеза у гематологических пациентов / О.В. Шадривова, Е.В. Фролова, Л.В. Филиппова и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2013. -Т.15, №2. - С.28-33.

5. Особенности определения галактоманнана в сыворотке крови и бронхоаль-веолярном лаваже онкогематологических больных с инвазивным аспергиллезом. Собственные данные и обзор литературы / С.М. Игнатьева, В.А. Спиридонова, Т.С. Богомолова, О.В. Шадривова и др. // Проблемы медицинской микологии. -2013.-Т. 15,№4.-С. 45-51.

6. Распространенность тяжелых и хронических микотических заболеваний в Российской Федерации по модели Life Program / H.H. Климко, Я.И. Козлова, С.Н. Хостелиди, О.В. Шадривова и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т. 16, № 1.-С. 1-8.

7. Инвазивный аспергиллез: результаты многоцентрового исследования / H.H. Климко, О.В. Шадривова, С.Н. Хостелиди и др. // Онкогематология. - 2014. -№.2.-С. 13-19.

8. Клинико-иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза у пациентов с лимфомой Ходжкина / О.В. Шадривова, Е.В. Фролова, Л.В. Филиппова и др. // Клиническая онкогематология. - 2014. - Т.7, №2 - С.233-238.

9. Прогностическое значение иммунологических показателей у гематологических больных инвазивным аспергиллезом / Е.В. Фролова, О.В. Шадривова, Л.В. Филиппова и др. // Проблемы медицинской микологии. — 2014. — Т. 16, № 3. — С. 37-43.

10. Изолированный инвазивный микоз толстой кишки у больной острым лим-фобластным лейкозом / О.В. Шадривова, С.Н. Хостелиди, И.С. Зюзгин и др. // Вестник гематологии. - 2012. - Vol. 18, № 1. - С. 92-93.

11. Клинико-иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза у гематологических больных / О.В. Шадривова, Е.В. Фролова, JI.B. Филиппова и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14, № 2. - С. 137.

12. Особенности иммунного статуса у гематологических пациентов с инвазив-ным аспергиллезом после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток / Е.В. Фролова, О.В. Шадривова, JI.B. Филиппова и др. // Российский аллергологический журнал. — 2013. — № 2, ч.2. — С. 300-301.

13. Характер изменений иммунологических показателей на раннем этапе инвазивного аспергиллеза у гематологических больных / Е.В. Фролова, О.В. Шадривова, JI.B. Филиппова и др. // Сборник материалов 1-й отчетной сессии научных подразделений СЗГМУ им. И.И. Мечникова «Фундаментальные исследования в современной медицине: достижения и перспективы» — 2013. - С. 32-33.

14. Immunological features of invasive aspergillosis in hematological patients after cytostatic chemotherapy / N. Klimko, O. Shadrivova, E. Frolova et al. // International Journal of Antimicrobial Agents. - 2013. - Vol. 42, Suppl. 2. - P.259.

15. Иммунологические особенности раннего этапа инвазивного аспергиллеза у гематологических больных / О.В. Шадривова, Е.В. Фролова, JI.B. Филиппова // Сборник материалов 86-й конференции студенческого научного общества «Меч-никовские чтения - 2013». - 2013. - С. 89.

16. Клинико-иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза легких у пациентов с лимфомой Ходжкина / Е.В. Фролова, О.В. Шадривова, JI.B. Филиппова и др. // Проблемы медицинской микологии — 2013. — Vol.15, JVs2. — С. 131-132.

17. Особенности инвазивного аспергиллеза у детей в Санкт-Петербурге / С.Н. Хостелиди, О.В. Шадривова, Е.А. Десятик и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15, № 2. - С. 134.

18. Invasive aspergillosis in Saint Petersburg, Russia: analysis of 445 proven and probable cases / N.N. Klimko, O.V. Shadrivova, S.N. Khostelidi et al. // Mycoses: Diagnosis. Therapy and prophylaxis of fungal disease. - 2013. - Vol. 56. - S.3. - P.l 13.

19. Immunological features of invasive aspergillosis in hematological patients / O. Shadrivova, E. Frolova, L. Filippova et al. // Mycoses: Diagnosis. Therapy and prophy-

laxis of fungal disease. - 2013. - Vol. 56. - S.3. - P. 115.

20. Immunological parameters in adult and non-adult patients with acute lymphoblastic leukemia and invasive aspergillosis / N. Klimko, O. Shadrivova, E. Frolova et al. // Mycology: Fungal infections. - 2014. - R 548.

21. Динамика иммунологических показателей при инвазивном аспергиллезе у реципиентов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток / Е.В. Фролова, О.В. Шадривова, Л.В. Филиппова и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2014. -Т. 16, №2.-С. 140-141.

22. Инвазивный аспергиллез у гематологических пациентов / О.В. Шадривова, Е.А. Десятик, С.Н. Хостелиди и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2014. -Т. 16, №2.-С. 148.

23. Оценка цитокинового профиля у гематологических больных с инвазивным аспергиллезом / Е.В. Фролова, О.В. Шадривова, Л.В. Филиппова и др. // Цитоки-ны и воспаление. - 2014. - Т. 13, № 1. - С.127.

Список сокращений, принятых в автореферате

алло-ТГСК - аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж ГКС - глюкокортикостероиды

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ИА - инвазивный аспергиллез

ИЛ - интерлейкин

ИФН-у - интерферон-г амма

КТ — компьютерная томография

НСТ — нитросиний тетразолий

ППН - придаточные пазухи носа

ПХТ - полихимиотерапия

РТПХ - реакция «трансплантат против хозяина» СМЖ - спинномозговая жидкость ФНО-а — фактор некроза опухоли-альфа ЦНС — центральная нервная система

Шадривова, О.В. Клинико-иммунологические особенности инвазивного аспергиллеза. ... автореф. дис. ...канд. мед. наук: 03.02.12 - микология; 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология / Шадривова Ольга Витальевна. -СПб., 2014, 24 с.

Подписано в печать 22.01.2015 Формат 60x84 '/]6 Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ № 14/01 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)