Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные механизмы формирования "перекрестнойтермотолерантности" к химическому экологическиопасному фактору (акриламиду)

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы формирования "перекрестнойтермотолерантности" к химическому экологическиопасному фактору (акриламиду)"

п ~

! >

2Г-!ЛЧ г г-,'

^¡ип 1'Л

На правах рукописи

Романова Татьяна Алексеевна

Клеточные механизмы формирования "перекрестной термотолерантностн" к химическому экологически опасному фактору (акриламиду)

специальность 03. 00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Красноярск-1998

Рабата выполнена в Красноярском государственном аграрном университете

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В. П. Нефедов кандидат медицинских наук, доцент А. Б. Егорова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. Н. Меняйло доктор биологических наук, В. А. Кратасюк

Ведущая организация:

Красноярский государственный университет

Защита состоится " Ш&кМ 1998 г. в ч. на заседании специализированного совета Д 120. 45. 01 при Красноярском государственном аграрном университете по адресу: 66049, Красноярск, проспект Мира 88.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Красноярского государственного аграрного университета

Автореферат разослан "_" _ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук

Р. М. Бабинцева

Актуальность проблемы. Обоснованную тревогу вызывает динамика экологических изменений происходящих на планете в течение относительно короткого периода времени - нескольких последних десятилетий. Среда обитания человека, в широком смысле слова, все больше пополняется вредными факторами физической, химической и биологической природы.

В настоящее время в прикладной экологии особую актуальность приобретают проблемы научного обоснования общих принципов и подходов к комплексу мероприятий (экономических, социальных, инженерных и др.) по защите природной среды от возможного негативного влияния на нее производственной деятельности человека, а также к комплексу медицинских, ветеринарно-медицииских требований, обеспечивающих охрану здоровья человека и животных и условий их существования (Волошин Л. И. и др., 1987, Кустов В. В. и др., 1992). В рамках этого направления особое место занимает изучение общих закономерностей взаимоотношений организма с факторами окружающей среды.

Реальная угроза жизни и здоровью населения, в связи со все чаще возникающими чрезвычайными ситуациями^ требует разработки новых подходов в выборе путей коррекции последствий действия на организм повреждающих агентов. Ключевым моментом данного направления является изучение интимных механизмов формирования устойчивости клеток к действию различных экстремальных факторов окружающей среды (в том числе промышленных ксенобиотиков).

Реализация так называемого стресс-ответа клетки подразумевает активацию ряда метаболических процессов, имеющих своим результатом оптимальное приспособление к действию экзогенных стимулов или развитие сублетальных и летальных повреждений. Особый интерес представляет изучение роли повреждения макромолекул клеток в формировании адаптивно-приспособительных реакций. Для описания характера и интенсивности этого

процесса при действии факторов окружающей среды используют термин "протсотоксичность"( Hightower L. Е., 1991).

Повреждение клеточных белков является одним из ведущих этапов токсического действия химических агентов внешней среды на организм и имеет своим результатом окислительную модификацию функциональных групп, увеличение степени гидрофобности белковых молекул обратимую или необратимую их агрегацию. Накопление модифицированных в структурном плане протеинов способно индуцировать комплекс реакций, направленных на ликвидацию или восстановление нарушенных структур. В процессе эволюции биологических систем, в условиях изменяющейся среды был выработан и наследственно закреплен ряд механизмов, позволяющих системам приспосабливаться к этим изменениям в целях сохранения своего существования (Воложин Л. И. и др., 1987).

Индукция синтеза так называемых белков теплового шока (heat shock proteins, IlSPj^ представляет собой один из универсальных механизмов клеточного ответа при стрессорных воздействиях и лежит в основе феномена "перекрестной термотолерантности" (O.Bensaude, 1996), т.е. устойчивости клеток с предварительно синтезированными HSP к последующему повреждающему действию экзогенных стимулов различной природы.

Процессы формирования цитоадаптивных реакций в условиях действия индукторов синтеза HSP и последующем поступлении в организм химических агентов из окружающей среды в настоящее время остается малоизученным, особенно с позиции токсикокинетических и токсикодинамических параметров действия ксенобиотиков.

Данная работа является частью комплексных исследований, проводимых на базе Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН и кафедры химии Красноярского государственного аграрного университета.

Целью настоящей работы явилось исследование механизмов формирования "перекрестной термотолерантности" при действии на организм химического фактора внешней среды - промышленного ксенобиотика акриламида.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние теплового шока на активность системы биотрансформации ксенобиотиков in vivo.

2. Оценить активность ФБ- и 3-МХ-индуцируемых изоформ цитохрома Р-450 в постгипертермическом периоде in vivo.

3. Исследовать токсические эффекты промышленного ксенобиотика акриламида in vivo при его поступлении в организм в восстановительный период теплового шока.

4. Дать оценку функционально-метаболическому статусу гепатоцитов при изолированом и комбинированном действии на организм физического фактора - гипертермии и химического - акриламида.

5. Выявить возможные механизмы формирования "перекрестной термотолерантности" при действии на организм протеотоксических факторов окружающей среды.

Научная новизна исследования состоит в следующем:

1. Впервые выявлена возможность достижения "перекрестной термотолерантности" к токсическим эффектам ксенобиотика акриламида in vivo путем предварительного гипертермического воздействия на организм животных.

2. Установлено, что снижение нейро- и гепатотоксического эффектов акриламида достигается при его поступлении в организм на 24 часе восстановительного периода теплового шока.

3. Впервые обнаружено защитное действие теплового шока в отношении хромосом клеток костного мозга при последующем поступлении акриламида в организм животных.

4.Обнаружен эффект "отмены" тепловым шоком предварительной индукции ФБ-, но не 3-МХ- зависимого цитохрома Р-450 in vivo.

5.Выявлена минимизация функционально-метаболических возможностей гепатоцитов на 24 часе восстановительного периода теплового шока in vivo.

6. Установлено, что к 4 часу после поступления акриламида в организм, в гепатодитах значительно снижена гликолитическая активность и окислительное фосфорилирование, в то время как на 24 часе после воздействия отмечается высокая мощностью данных процессов.

7. Экспериментально доказано, что процесс эвакуации ферментов за пределы гепатоцитов на 24 часе после поступления в организм акриламида носит энергозависимый характер.

Научно-нрактичсская значимость работы.

Данная работа является фрагментом темы "Исследование гомеостаза организма при экстремальных воздействиях: механизм, пути коррекции при нарушениях" (номер государственной регистрации - 01970007696), выполняемой в Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН.

Научно-теоретическая значимость работы состоит в том, что в ней исследованы клеточные механизмы адаптации при действии протеотоксичсских экологически опасных факторов.

Продемонстрирована роль умеренной гипертермии, индуцирующей синтез белков теплового шока, в снижении цитотоксических эффектов промышленного ксенобиотика акриламида.

Изучен ряд механизмов формирования "перекрестной термотолерантности" при действии на организм факторов окружающей среды, что имеет значение для разработки методов коррекции токсических эффектов ксенобиотиков, метаболизирующихся с участием фенобарбитал-индуцируемой системы биотрансформации.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на: VII Всероссийском симпозиуме "Коррекция гомеостаза", Красноярск, март 1996 г.; VIII Всероссийском симпозиуме "Гомеостаз и окружающая среда", Красноярск, март 1997 г.; Конференции - конкурсе молодых ученых Красноярского научного центра СО РАН, Красноярск, март 1997 г. Присуждено звание Лауреат конкурса; Конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ "Технологии неистощительного землепользования", Красноярск, март 1997 г; XXXV Международной студенческой конференции "Студент и научно - технический прогресс", Новосибирск, апрель 1997 г.; Студенческой международной научно - практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. И.И. Гительзона. Красноярск, апрель 1997 г.; Всероссийской конференции "Проблемы защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций ", Красноярск, сентябрь 1997 г.; III Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, сентябрь 1997 г.; Городской научно -практической конференции "Достижения науки и техники развитию г. Красноярска", октябрь, 1997 г.; IX Всероссийском симпозиуме "Реконструкция гомеостаза", март, 1998 г.

Положения, выносимые на защиту

1. Действие физического (гипертермия) и химического (ксенобиотик акриламид) протеотоксических факторов окружающей среды, а также их комбинированное воздействие на организм изменяет активность системы бпотрансформации ксенобиотиков.

2. Тепловой шок в поздний восстановительный период (24 часа) "отменяет" эффект индукции ФБ-, но не 3-МХ зависимой системы биотрансформации ксенобиотиков.

3. Выраженное снижение нейро- и гепатотоксических эффектов акриламида достигается при его поступлении в организм на 24 часе восстановительного периода теплового шока.

4. Формирование "перекрестной термотолерантности" к действию протеотоксических агентов сопровождается минимизацией функционально-метаболических возможностей гепатоцитов, а также изменением белок- и рРНК-синтетических процессов, сопряженных с реструктурированием ядрышкового аппарата этих клеток.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них одна в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, списка литературы и приложения. Работа содержит 9 таблиц, 18 рисунков, 3 схемы, библиографический указатель включает 186 литературных источника, из них 106 иностранных. Автор выражает благодарность В.А. Чихачеву (к.ф.-м.н., зав.каф. химии КГАУ); Н.А. Сеткову (д.б.н., с.н.с., ИБФ СО РАН); Г. В. Пушному (к.м.н., с.н.с.), А.П. Рупенко (н.с.), И.И. Моргуднс (с.н.с.), О.В. Круглпк (стажер-исслед., МНЦИЭСО при Президиуме КНЦ СО РАН); А.П. Винокурову (КрасГМА).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом проводимых исследований служили белые беспородные крысы обоего пола массой 150-200 г, содержащиеся в стандартных условиях вивария Института биофизики СО РАН. В работе было использовано 300 животных, ранжированных но половым и возрастным характеристикам.

Состояние теплового шока (ТШ) в условиях ¡n vivo моделировали помещая животных в индивидуальных клетках в водяную баню с температурой воды + 42,0°С на 25 минут. Ректальная температура тела повышалась до + 41,0+0,3 °С (DeMaio В. et al., 1993). Предварительно крысам внутрибрюшинно вводили 0,25% раствор дроперидола (0,1 мл/ 100г веса) с целью исключения побочных стрессорных реакций. Контрольной группе животных создавали подобные условия, но температура воды в водяной бане

составляла + 37,0 °С (ректальная - + 38,0±0,4°С). Все последующие манипуляции осуществляли спустя 6, 24,48 часов восстановительного периода.

Оценку детоксикационной активности печени и функционального состояния центральной нервной системы проводили с помощью гексеналового теста (Сперанский С. В., 1980). Гексобарбитал, в виде 5% раствора, вводили внутрибрюшинно спустя 4 или 24 часа после прекращения экспериментального воздействия. Функциональную активность центральной нервной системы оценивали по времени засыпания животного, а детоксикационную активность печени - по продолжительности периода сна.

В качестве .модельного ксенобиотика использовали акриламид (АА). Вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 75 и 100 мг/кг массы (Котловский Ю.В., 1990) в виде 5% раствора (на бидисгиллированной воде), спустя 6, 24 и 48 часов (в разных сериях) после развития состояния ТШ. Индукцию ФБ-зависимых азоформ ipc Р-450 осуществляли двукратным (1 раз в сутки) внутрибрюшинным введением 5% раствора гексобарбитала (80 мг/кг), а подфракцию цх Р-448 - подкожно раствором 3-метилхолантрена (MX) на растительном масле (40 мг/кг) (Котловский Ю. В., 1990, J. Baron et al., 1982).

Никотинамид (IIA) вводили в виде 2,5% раствора (по 150 мг/кг, двукратно за 4 и спустя 4 часа относительно теплового шока) с г/елью увеличения внутриклеточного пула NAD (Сорока В.Р. и др., 1989).

В качестве ингибиторов транскрипции (Ашмарин И.П., Ключарев JI.A., 1975) в отношении митохондриальных рибосом использовался 30% раствор линкомицина гидрохлорида (80 мг/кг, внутрибрюшинно однократно), а цитоплазматических - циклогексимид (ЦТ) (100 мкг/100 г, внутрибрюшинно, однократно) за 2 часа до гипертермического воздействия, для предотвращения синтеза HSP de novo (R. В. Widelitz et al., 1986).

Исследование функционально-метаболического состояния печени животных, в период адаптации к действию экстремальных факторов, проводили истодом нсрецнркулиционной бсзгемоглобиновон перфузии

печени in situ no Hems R. H. et al. (1966) с проведением нагрузочной пробы 10 мМ раствором D-фруктозы (Ф) (D.G.Clark et al., 1979). Экспериментальные животные перед перфузией выдерживались на голодной диете в течение 18 часов со свободным доступом к воде.

Перфузионный раствор Использовался раствор Крсбса-Хензелейта на бикарбонатном буфере с добавлением 5мМ D-глюкозы (Masuda Y., et al., 1993).

Поступающий перфузат насыщали карбогеном (95% 02 и 5% С02) в оксигенаторе пузырькового типа и подавали через v.portae в печень со скоростью 25-30 мл в минуту перистальтическим насосом. Температура входящего раствора - +37,5±0,2°С; рН 7,10±0,03; парциальное давление кислорода (регистрировали полярографическим методом) - 720 мм рт.ст. Перфузия органа продолжалась 60 минут, первые 30 минут составлял адаптационный период. Раствор (Ф) подавали в перфузат в конечной концентрации 10 мМ с 30 по 40 минуту перфузии. Забор проб из выходящего перфузата и регистрацию показателей осуществляли каждые 10 минут, а в период нагрузки - с интервалом в 1 минуту.

В отобранных пробах определяли концентрацию глюкозы с помощью глюкозоанализатора "EKSAN-g" (Литва). Скорость продукции лактата, пирувата определяли по изменению концентраций NAD(H) (при длине волны 340 нм) в ходе прямой и обратной лактатдегидрогеназеой реакции (метод Цока и Лампрехта, 1970; метод Хохорста, 1970). По уровню соотношения лактата и пирувату в исследуемых пробах перфузата судили об отношении NADH/NAD т.е оредокс - потенциале гепатоцитов (Singh S.P. et al., 1982).

Способность гепатоцитов при повреждении терять растворимые энзимы - один из важных критериев оценки состояния их плазматических мембран и клеточных репаративных систем. Об активности цитоплазматических (лактатдегидрогеназа, ЛДГ) и митохондриальных (глутаматдегидрогеназа, ГДГ) энзимов в перфузате судили по изменению количества NADH (при длине

волны 340 им), которое эквимолярно количеству субстрата, использованного в реакции (Бергман, 1971; Клюева, 1974).

Степень активности процессов ПОЛ мембра71 гепатоцитов оценивали измерением концентрации в перфузате малонового диальдегида (МДА) в реакции с 1% тиобарбитуровой кислотой (СиПепс1§е 1М.С. е1 а1., 1990). Измерение оптической плотности падосалочной жидкости производили при длине волны 535 нм.

Все спектрофотомстрические измерения проводили на электронном спектрофотометре '\Spekol - 122" (Германия).

Скорости продукции лактата, пирувата, образования МДА, выделения/поглощения глюкозы, с учетом скорости перфузии органа, выражали в мкМ в минуту/орган, скорости выхода ЛДГ, ГДГ - в мкМ NADH в минуту/орган, а скорость желчепродукции - в мкл в мин/орган.

Исследование мутагенных эффектов производили методом анализа мнтотнческих метафазиых хромосом клеток костного мозга крыс по стандартной методике (МакГрегор Т, 1986) в модификации (Федюкович Л.В., Егорова А.Б., АС 1732222, 1992). Анализировали по 50 пластинок метафазных хромосом под световым микроскопом (ок. х7, об. х90), среди которых отмечали наличие хромосомных и хроматидных аберраций.

Морфофункциональнуго характеристику состояния ядрышкового аппарата гепатоцитов, объективно отражающую особенности клеточного метаболизма, в частности белок и рРНК синтезирующую активность, осуществляли методом окраскн гистологических срезов 50% раствором нитрата серебра (Коржевский Д.Э., 1990). На окрашенных препаратах производили морфологическую дифференцировку и подсчет числа ядрышек на 100 перинортальных и перицентральных гепатоцитов под световым микроскопом (ок. хЮ, об. х90).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием I - критерия Стыодента (Автандилов Г. 1"., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Применение гексеналового теста в нашей работе позволило отследить ряд изменений в процессе биотрансформации ксенобиотиков с участием цх Р-450-зависимой системы в организме животных, перенесших состояние теплового шока.

Однократное введение АА в дозе 75 мг/кг массы за 24 часа до проведения гексеналового теста не изменяло его параметров относительно уровня контрольной группы животных. Увеличение дозы ксенобиотика до 100 мг/кг массы характеризовалось, к 24 часу с момента введения ксенобиотика, снижением продолжительности сна и тенденцией к удлинению времени засыпания. Воздействие на организм животного такой дозы АА, на фоне индукции ФБ-зависимых изоформ цх Р-450, имело результатом на 24 часе после токсического воздействия сокращение времени засыпания крыс (1,6±0,21) и увеличение продолжительности сна (33,5+3,69) в 1,9 раза относительно контрольного уровня (Р<0,001) и более чем в 2,5 раза по сравнению с этим показателем в группе с предварительной индукцией цхР-450.

Кратковременное повышение температуры тела животных до +41,0°С приводило к изменению терморегуляторных реакций, восстановление которых происходило спустя 4-6 часов, что характерно для состояния ТШ (БеМаю В., 1993). Такое действие на организм изменяло параметры гексеналового теста. Моделирование состояния теплового шока как за 24, так и спустя 24 часа относительно индукции цх Р-450 возвращало показатели теста к контрольному уровню (время сна 16,3±2,70; 16,5+3,09; в контроле - 17,7+1,67). Полученные данные позволили считать, что ТШ, будучи примененным до и после индукции ФБ-зависимых изоформ цх Р-450, в наших условиях "отменял" эффект этой индукции.

Метаболизм ксенобиотика, тарифицирующегося преимущественно с участием этой подфракции цигохромов, значительно изменялся в организме животных, перенесших ТШ. При поступлении АА в дозе 100 мг/кг веса на 6

часе восстановительного периода параметры гексеналового теста практически не отличались от таковых в группе с изолированным введением АА на фоне индукции цх Р-450 (2,05±0,14 и 1,6+0,21 - время засыпания, 31,3±1,20 и 33,5±3,69 - время сна в каждой группе соответственно (Р<0,001). Удлинение восстановительного периода до 24 часов с момента TIJI позволило выявить снижение степени нейро- и гепатотоксичности АА - показатели времени засыпания (2.73±0,10) и гексеналового сна (20,25±2,46) возвращались к значениям данных параметров в контрольной группе.

По имеющимся в литературе данным, вклад подфракшш цх Р-448 в метаболизм АА незначителен (Котловский Ю.В.,1990). Действительно, воздействие умеренной гипертермией или/и АА при индукции цх Р-448 не изменяло параметров гексеналового теста, что свидетельствует в пользу селективного влияния ТШ на ФБ-индуцируемую подфракцию цх Р-450.

Применение ингибитора белкового синтеза - циклогексимида за 2 часа до ТШ, приводило к пшериндукции ФБ-зависимого цитохрома Р-450 (время сна 9,0±1,04 мин, Р<0,01) . Эти результаты подтвердили необходимость синтеза HSP для проявления эффекта отмены предварителной индукции цх Р-450.

Следовательно, предварительное повышение температуры тела животного (до состояния ТШ), имеет своим результатом значительное изменение активность ФБ-зависимой системы биотрансформации ксенобиотиков (гексобарбитала и АА) лишь в позднем восстановительном периоде (на 24 часе), что обеспечивает значительное снижение нейро- и гепатотоксичиеских эффектов модельного ксенобиотика АА.

Дополнительным подтверждением выявленной способности ТШ "отменять" эффект индукции ФБ-зависимой подфракшш цх Р-450 явились результаты оценки мутагенной активности АА в клетках костного мозга крыс in vivo. Известно, что метаболиты АА менее генотоксичны, чем исходное вещество (Barfknecht Т. R. et al., 1988). Уровень хромосомных аберраций при поступлении в организм этого ксенобиотика (в дозе 100 мг/кт, однократно) на

фоне ТШ в условиях индукции цх Р-450 соответствовал таковому при изолированном воздействии АЛ (Р<0,001). Иными словами, "отмена" эффекта индукции цх Р-450, по-видимому, снижала скорость биотрансформации АА до менее генотоксичных его метаболитов. Выявлен также протекторный эффект предварительного ТШ в отношении хромосомного аппарата клеток костного мозга животных, подвергнутых однократному воздействию АА in vivo, что может быть обусловлено не только его влиянием на процессы биотрансформации ксенобиотиков, но и модуляцией активности клеточных репарационных систем.

Учитывая ведущую роль активации синтеза HSP в развитии ранее указанных явлений, актуальным явилось выяснение закономерностей изменения энергетического и метаболического статуса клеток в условиях действия на организм повреждающих факторов внешней среды. В качестве экспериментальной модели для исследования клеточных механизмов адаптации была выбрана печень, перфузируемая in situ по Hems R et al. (1966) с проведением функциональной нагрузочной пробы 10 мМ раствором фруктозы, что позволило выявить ряд изменений параметров, отражающих функционально-метаболическую активность гепатоцитов и способность к мобилизации приспособительных систем в условиях поступления нефизиологических концентраций нагрузочного субстрата.

Спустя 4 часа с момента поступления АА в организм, значительно снижалась интенсивность процессов гликолиза и окислительного фосфорилирования в клетках печени. Увеличение потребности в АТФ в момент подачи Ф (Ныосхолм Э., 1977) способствовало довольно медленной активизации исследуемых метаболических процессов. К окончанию периода функциональной нагрузки увеличивалась скорость продукции пирувата (Р<0,05), лактата, возрастало соотношение NADH/NAD, но скорость потребления кислорода значимо не изменялась, что позволяет судить о более выраженных изменениях на участке электронтранспортной цепи.

Искусственное создание дефицита энергии в гепатоцитах (посредством нагрузки раствором фруктозы) стимулировало выделение МДА в перфузат (Рис. 1).

К 24 часу после поступления АА в гепатоцитах наблюдались биохимические сдвиги, характерные для периода активации процессов репарации. Увеличение потребности в А'ГФ, а также перегрузка терминального звена гликолиза (в момент поступления Ф) приводило к возрастанию скорости образования лактата, пирувата, активировало потребления кислорода (Р<0,02) и желчеотделения, увеличивалась скорость образования глюкозы (Р<0,05) при неизменном соотношении NADH/NAD, что отражает высокие потенциальные возможности гликолиза и ЦТК и существования некоего "резерва" в напряжении клеточных функций при поступлении альтернативного энергетического субстрата (Рис.2,3). Подобная картина характеризует гиперкатаболическую калоригенную стратегию адаптации биологической системы (резистентность) в ответ на действие неблагоприятных факторов внешней среды (Кулинский В. И. и др. 1992).

Выделение за пределы клетки цитоплазматических и мембраносвязанных ферментов (ЛДГ и ГДГ), спустя 24 часа после введения АА (Рис. 1), можно рассматривать как адаптивную реакцию, способствующую удалению конформационно измененных и окисленных белковых молекул. Процесс этот энергозависимый, поскольку подача фруктозы снижала скорость выхода энзимов. Достаточно высокая скорость продукции МДА можно объяснить дефицитом GSH в клетках перицеитралыюй зоны печеночной дольки -основном месте активной токсификации АА, в связи с содержанием в них преимущественно цх Р-450 (Щербаков В.М. и др., 1995).

"Подчинением" условиям внешней среды и минимизацией функциональных возможностей (толерантность) (Кулинский В. И. и др. 1992) можно охарактеризовать метаболическое состояние гепатоцитов печени крыс, перенесших состояние ТШ за 24 часа до проведения функциональной нагрузки.

1-1

А В

Рнс.1. Динамика продукции малонового днальдсгида (МДА) (А) и скорость выделения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и глутаматдегидрогеназы (ГДГ) (В) генатоцитами при перфузии печени in situ в постгипсртермическом периоде и при действии акриламида (100 мг/кг)

Обозначения: К - контроль, HS-тепловой шок, АА - акрипамид по оси абсцисс - время перфузии, мин; по оси ординат - скорость выхода МДА в перфузат.мкМ в мин/орган (А);- скорость выделения ЛДГ и ГДГ в перфузат, мкМ NADH в мин/орган (В)

Низкая скорость потребления кислорода при полном отсутствии реакции на функциональную нагрузку (Рис. 2) (Р<0,01) и достаточно резкое возрастание отношения NADH/NAD в этот период (Рис. 3) (Р<0,02), а также прогрессирующее снижение скорости выделения глюкозы (Р<0,02) в динамике перфузии органа, дают право сделать заключение о нарушении сопряжения между гликолитическими процессами и окислительным фосфорилированием. Это может быть связано, в первую очередь, со снижением концентрации АТФ в клетках, с учетом литературных данных о выраженной АТФ-азной активности HSP (Ciechanover A. et al. 1994), а также с изменением чаперонной активности и внутриклеточной локализации конститутивных HSP, которые обеспечивают транслокацию полипеп гидов в мембраны митохондрий (Imamoto N., Tachibana Т. et al., 1994). В постгипертермическом периоде это вполне может сказываться на активности ряда митохондриальных ферментов. Кроме того, возрастание

концентрации Са2+ в цитоплазме при тепловом шоке (МаоНс I. М., ег а1., 1989) способно инактивировать митохондриальный ферментный комплекс, т.е.

оказывать влияние непосредственно на (Лукьянова Л. Д., 1997).

■К

Ш

-АА(24) -*— ШАА(24)

25 п

электронтранспортную цепь

Рис. 2. Скорость потребления кислорода печеныо крыс

Обозначения: по оси абцисс -время, мни, по оси ординат -скорость потребления кислорода органом (мкМ в мин/орган), К - контроль, НБ -тепловой шок, АА - акриламид (24 часа после введения)

-1-г-

0 10 20 30 31 32 33 34 35 36 37 39 50

период введения фруктозы Низкая скорость потребления кислорода в постгипертермическом периоде может представлять собой проявление охранительной реакции, направленной на повышение пассивной устойчивости (т.е. толерантности) и обеспечивает возможность сосуществовать с внешним раздражителем (Кондрашова М.Н. и др., 1985). Подобная минимизация функционально-метаболической активности стрессированных клеток на 24 часе восстановительного периода теплового шока обеспечивает им невосприимчивость к последующему воздействию повреждающих факторов. Действительно, комбинация ТШ и введения АА на 24 часе восстановительного периода характеризовалась тенденцией сближения практически всех исследуемых показателей с таковыми в контроле. Исключением явилось чрезвычайно высокое соотношение НАОН/ЫАБ на 4 часе после воздействия АА на фоне ТИТ (Р<0,02). Лишь функциональная нагрузка была способна снизить данную величину. Эти результаты дополнительно подтверждают

ведущую роль редокс-состояшш и фосфорилнровапия адепиловой системы в формировании "перекрестной термотолерантности".

-♦-К -в—HS —-АА(24) -г-HSAA(24)

10 20 30 31 32 33 34 35 36 37 39 50

^ период введения фруктозы ^ Блокада синтеза HSP никотинамидом (Huang L.E. et al., 1994) с последующим введением ксенобиотика приводила (как и в серии с ЦГ) к гипериндукции цх Р-450 (продолжительность сна - 6, 42 ± 1,45, при Р< 0,02).

Известно, что увеличение содержания гипертрофированных форм ядрышек характеризует активацию репаративного синтеза в процессе регенерации поврежденных клеточных структур (Челидзе П.В.,1988). Подобная картина имела место на 8 сутках после поступления в организм животных АА на фоне индукции цх Р-450, а также при введении этого амида на 6 часе восстановительного периода ТШ. Гипертрофия ядрышкового аппарата к 24 и 48 часу после ТШ явилась результатом миграции в него HSP (W. R. Vander et al., 1995) и восстановления интенсивности общего белкового синтеза.

Одним из проявлений состояния толерантности к перекрестному действию факторов внешней среды является минимизация функциональной активности клеток, в том числе и торможение синтеза рРНК. При этом возрастает количество микроядрышек в ядрах клеток как это происходило при действия ТШ с последующей индукцией цх Р-450. Интересно, что поступление

о

Рис. 3. Динамика соотношения лактат/пируват при перфузии нечени крыс in situ

Обозначения: по оси абцисс -время, мин, по оси ординат -отношение метаболитов (усл. ед.), К - контроль, HS -тепловой шок, АА - акриламид (24 часа после введения)

гексобарбитала до ТШ приводило к противоположному эффекту - т.е. к активации белкового синтеза.

Соотношение мнкро и макроядрышек в перицентральпых и перипортальных гепатоцитах печеночной дольки при действии ТШ и АЛ

на организм крыс

Серия Псрицентральные гепатоцнты. микро/макроядрышки Перипортальпые гепатоцнты, микро/макроядрышки

Контроль 0,83 0,85

ТШ (24 ч) 0,67 0,75

ТШ (48 ч) 0,30 0,34

цхР-450*+АА (24 ч) — —

цхР-450*+АА (8 сут) 0,59 0,50

цхР-450*+ТШ (48 ч) 0,82 0,49

ТШ+цхР-450* (48 ч) 0,94 1,06

ТШ+цхР-450*+АА (24 ч) 1,51 1,01

цхР-450* ТШ (6 ч)+АА(24 ч) 0,52 0,40

цхР-450*+ТШ(6ч)+АА(8 сут) 0,43 0,50

Примечание: ipc Р-450* - индукция ФБ-зависимого щ Р-450, ТШ (6ч) -продолжительность восстановительного периода до введения ЛА, (24 ч, 48 ч, 8 сут) - период времени с момента последнего воздействия на животных до отбора гистологического материала

Следовательно, необходимым условием формирования толерантности к действию химического агента (ксенобиотика) является предварительный синтез HSP. Так, результатом индукции HSP и последующего поступления в организм животных гексобарбитала и АА (через 24 часа) было значительное снижение белкового синтеза, особенно в перицентральной зоне печеночной дольки. Выраженная зональность в реакциях, объясняется большей интенсивностью обменных процессов в этих клетках и, следовательно, более быстрой ответной реакцией на действие агента (Сидорова В. Ф. и др., 1966).

На основании вышеизложенного можно предложить следующую схему основных этапов формирования "перекрестной термотолерантности" к действию на организм экологически опасных факторов химической природы.

ВНЕШНИМ ПРОТЕОТОКСИЧЕСКИЙ ФАКТОР

Повреждение

клеточных

белков

Индукция

синтеза

НБР

Модуляция чаперон-регулируемых процессов

Накопление в клетке функционально активных Н5Р

Минимизация метаболической активности клеток

Г \

ТОЛЕРАНТНОСТЬ к действию внешних повреждающих агентов

_0_

гЭх-длд:зЖ:ч,ем,\к и,.,.-'о;ян,ы ф акт ор ы ' Т.(урдлЫиаецяъге ксенобиотики) \ ,'- - ■•■■.;•

и

ВЫВОДЫ

1. Изолированное и комбинированное действие физического (гипертермия) и химического (ксенобиотик) факторов внешней среды на организм оказывает выраженное влияние на активность системы биотрансформации ксенобиотиков.

2. Гипертермическое воздействие (тепловой шок) изменяет токсикокинетические и токсикодинамические параметры действия ксенобиотиков (гексобарбитала, акриламида) за счет снижения активности процессов их биотрансформации на фенобарбитал-, но не 3-метилхолантрен-индуцирусмых изоформах цитохрома Р-450.

3. Применение умеренного гипертермического воздействия для модуляции процесса индукции фенобарбитал-зависимых изоформ цитохрома Р-450 в равной степени эффективно при его предварительном применении (за 24 часа) или через 24 часа после поступления индуктора в организм.

4. Результатом действия теплового шока является изменение показателей нейро-, гепатотоксического, мутагенного эффектов промышленного ксенобиотика - акриламида, при его поступлении в организм на 24 часе после гипертермического воздействия.

5. Одним из механизмов формирования "перекрестной термотолерантности" является изменение уровня пиридиновых клеточных нуклеотидов, связанное с модуляцией активности гликолитических процессов и окислительного фосфорилирования, а также белок и рРНК синтезирующих процессов, сопряженных с реструктурированием ядрышкового аппарата гепатоцитов.

6. Комбинированное воздействие теплового шока и никотинамида, а также изолированное применение последнего, в значительной степени редуцирует токсические эффекты акриламида.

Публикации по теме диссертации

1. Влияние акриламида на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в изолированной печени // Коррекция гомеостаза: Матер. VII Всерос. симпоз., Красноярск, март, 1996. - Красноярск, 1996. - С. 148 -149 (соавт. А.П. Винокуров, А.Б. Егорова, А.П. Рупенко).

2. Изучение редокс-потенциала и процессов перекисного окисления липидов в гепатоцитах в постгипсртермическом периоде in vivo // Студент и научно - технический прогресс: Матер. XXXV Междунар. науч. студ. конф., Новосибирск, 1997. - С.4 (соавт. Е.В. Бородина, А.П. Винокуров).

3. Мутагенный эффект акриламида и его коррекция тепловым шоком // Там же. - С.56 (соавт. К.В. Пуртов)

4. Реструктурирование ядрышкового аппарата гепатоцитов крыс в восстановительном периоде теплового шока и при острой интоксикации // Там же. - С. 96 (соавт. О.В. Круглик, М.И. Голдина, A.B. Тупицина).

5. Изменения ядрышкового аппарата гепатоцитов перипортальных и перицентральных зон при острой экзогенной интоксикации на фоне теплового шока // Тез. докл. студ. междунар. науч.-практ. конф. посвящ.100 - летию со дня рождения проф. И.И. Гительзона, Красноярск, 1997. - С. 85-86 (соавт. A.B. Тупицина, М.И. Голдина).

6. Достижение перекрестной терморезистентности к цитотоксическим эффектам акриламида in vivo // Тез. Конф. молодых ученых КНЦ СО РАН, Красноярск, 1997. - С. 89-90.

7. Протеотоксичность в повреждающем действии ксенобиотиков // Там же. - С. 32-33 (соавт. А.Б. Егорова, C.B. Михуткина).

8. Исследование влияния гипертермии на токсикокинетику акриламида у крыс // Технологии неистощительного землепользования: Тез. конф. профессорско-преподавательского состава КрасГАУ, Красноярск, 1997. - С. 8283 (соавт. А.Б. Егорова, В.П. Нефедов).

9. Функционально-метаболические параметры перфузируемой печени in situ в восстановительном периоде теплового шока при острой экзогенной интоксикации // Гомеостаз и окружающая среда: Матер. VIII Всерос. симп. (с междун. участием), Красноярск, 1997. - С. 99-105 (соавт. Л.П. Рупенко, А.Б. Егорова, и др.).

10. Коррекция цитотоксических эффектов акриламида предварительным гипертермическим воздействием // Там же. -С. 92-99 (соавт. А.Б. Егорова, К.В. Пуртов и др.).

11. Тепловой шок модулирует цитотоксичность ксенобиотиков in vivo // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1998 (в печати) (соавт. А.Б. Егорова, В.В. Иванов, В.П. Нефедов).

12. Возможный путь патогенетической коррекции токсических эффектов акриламида // Достижения науки и техники - развитию города Красноярска: Тез. докл. науч.-практ. конф., Красноярск, 1997. - С.516 - 517 (соавт. Г.В. Пушной, А.Б. Егорова)

13. Изменение цитотоксических эффектов ксенобиотика в посггииертермический период // Тез. докл. III съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1997. - С. 193 (соавт. А.Б. Егорова, В.П. Нефедов).

Список сокращений

АА - акриламид

АТФ - аденозинтрифосфат

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

НА (N10) - никотинамид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ФБ - фенобарбитал

Ф - фруктоза

ЦГ - циклогексимид

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

цх Р-450 - цитохром Р-450

3-МХ - 3-мстилхолантрен

08Н- восстановленный глутатион

НБ (ТШ) - тепловой шок

НБР - белки теплового шока

КАО(Н) - никотинамидадениндинуклеотид (восстановленный)