Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная селекция in vitro как способ получения растений, ограничивающих развитие стерин-зависимых насекомых

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клеточная селекция in vitro как способ получения растений, ограничивающих развитие стерин-зависимых насекомых"

РГБ О?

АНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

г И чип I

На правах рукописи

ЛЕВАШИНА Елена Александровна

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ IN VITRO КАК СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ, ОГРАНИЧИВАЮЩИХ РАЗВИТИЕ СТЕРИН-ЗАВИСИМЫХ НАСЕКОМЫХ

Специальность: 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1994

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук Л.А.Лутова

Официальные оппоненты: доктор биологичесикх наук

К.В.Квитко,

кандидат фармацевтических наук И.Е.Каухова

Ведущее учереждение: Научно-исследовательский институт сельско-хозяйственной микробиологии

Защита состоится О 1994г. в '14- часов мин,

на заседании специализированного совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени .кандидата биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке СПбГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время широкое использование пестицидов привело к возникновению серьезных социальных и экономических проблем. Несмотря на то, что массовый химический контроль за сорняками и вредителями является действенным оружием в борьбе с ними, актуальным остается вопрос о поиске новых способов защиты растений. Одним из подходов к решению этой проблемы можно считать создание устойчивых растений методами биотехнологии.

Возможность получения растений, устойчивых к насекомым-вредителям уже показана для целого ряда культур. Важную роль в возникновении устойчивости играют особенности метаболизма растений. Наличие метаболических взаимодействий оказывает влияние как на выбор насекомыми определенных растений-хозяев, так и на способность последних воздействовать на выживаемость и размножение насекомых. Среди многих веществ, состэзляющих неотъемлемую часть пищевого рациона, стерины растений играют важную роль, так как насекомые не способны синтезировать стерины de novo, то есть, зависят в своем развитии от экзогенных стеринов. Эта метаболическая особенность может быть использована для создания новых биологических способов контроля численности насекомых. Промежуточные продукты биосинтеза, которые накапливаются в клетках растений при ингибировании специфических ферментов биосинтеза стеринов, не могут быть использованы для биосинтеза экдизона, что приводит к нарушениям морфогенеза насекомых.

Способность стериновой диеты влиять на плодовитость дрозофилы была продемонстрирована в эколого-генетической системе "дрожжи-дрозофила". Эти результаты, а также известные из литературы сведения об анализе и характеристике растений с измененным синтезом стеринов, послужили основой для создания модели "растение-дрозофила", которая позволяла "бы отбирать формы растений по их способности изменять плодовитость насекомого. ^

Цель и задачи исследования. Основной целью исследований являлось получение растений, ограничивающих развитие насекомых, используя методы клеточной селекции.

В задачи работы входило:

1. Разработка методов клеточной селекции для получения растений табака Мсойапа ¡аЬасшп и Ыкойапа р1итЬа£т1/о1ш. устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину и фунгициду бэйтану.

2. Сравнительная характеристика состава фитостеринов на разных уровнях организации растительных тканей (каллус, регенерирующий каллус, растение).

3. Анализ изменения спектра стеринов каллусных тканей N.plumbaginifoiia при культивировании на питательных средах с возрастающими концентрациями селективного агента.

4. Определение и анализ состава стеринов форм растений, устойчивых к селективным агентам.

5. Оценка устойчивых к нистатину и байтану форм табака в модельной системе "растение-дрозофила".

Научная новизна и значимость работы. В работе предложен новый метод опосредованной селекции на устойчивость к насекомым-вредителям, когда устойчивые формы отбираются через селекцию вариантов с измененным составом фитостеринов.

Впервые методами клеточной селекции микрокаллусов получены клеточные линии табака, устойчивые к полиеновому антибиотику нистатину и фунгициду байтану. На предложенный метод клеточной селекции на уровне микрокаллусов получено авторское свидетельство.

Впервые на основе устойчивой к нистатину клеточной линии было получено растение табака, которое при его использовании в качестве корма дрозофилы, достоверно снижало плодовитость насекомого. Показано, что выделенная форма характеризуется измененным спектром стеринов, а именно присутствием группы д7-стеринов. Впервые был проанализирован и дана биохимическая характеристика состава стеринов клеточных линий табака N.plmbagimfoЧa.

Практическая ценность работы. Продемонстрирована принципиальная возможность получения растений, характеризующихся измененным спектром стеринов, которые при их использовании в качестве корма дрозофилы, способны достоверно снижать плодовитость насекомого. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования предложенного подхода опосредованной селекции для получения растений,' устойчивых к насекомым-вредителям, что может служить основой нового биологического способа защиты растений.

Предложенный метод клеточной селекции на уровне микрокаллусов удобен для быстрою скрининга на устойчивость к

селективным агентам практически всех видов растений, введенных в культуру тканей.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на V и VI Съездах ВОГиС им.Н.И.Вавилова (Москва, 1987; Минск, 1992); на международном конгрессе по симбиозу (Иерусалим, Израиль, 1992); на международном семинаре ЮНЕСКО по вопросам взаимоотношений между растениями и насекомыми (Ленинград, 1992); на 4 международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. 7 тезисов и получено 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована рисунками и схемами, 16 таблицами и 6 фотографиями. Список литературы включает 116 наименований, из них 18 - на русском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Семена табака (Nicotiana тЬасшп L., сорт Амбалема (4х—48) и Nlcotiana plumbaginifolia L. (2n—20}) были получены из Института табака и махорки г.Краснодара. Каллусную культуру индуцировали из частей асептических проростков на среде для каллусообразования RMNO (Сидоров и др., 1985).

В качестве селективных агентов применяли: полиеновый антибиотик нистатин (3200efl/MrXSigma) и фунгицид триазольного ряда байтан, полученный из ВИЗР РАСНХ.

Нистатин (0.1-60 мг/л) и байтан (200-600 мг/л) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавляли в стерильную питательную среду в различных концентрациях.

Ступенчатую селекцию на устойчивость к нистатину или байтану проводили, используя культуру микрокаллусов, как описано у Лутовой и др. (1992).

Протопласты выделяли из мезофильных тканей листьев регенерантов табака и культивировали как описано у Сидорова (Сидоров и др., 1985).

При статистической обработке результатов применяли методы, приведенные в руководствах по статистике. Основные показатели, рассчитанные в работе: проценты и доверительные интервалы по

методу Фишера; критерий однородности; а также значение х

среднего (Терентьев, Ростова, 1977).

Для биохимического анализа состава стеринов использовали ткани устойчивых к селективным агентам линий и культур дикого типа N.tabacum и N.plumbaginifolia, а также регенеранты, полученные на основе устойчивых клеточных линий. Материал культивировали как на средах с селективными агентами, так и на конрольных средах. Отобранный материал замораживали при -20°С в течение 24 часов и подвергали лиофильной сушке. Экстракцию и анализ стеринов проводили двумя способами: методом Вудса (Woods, 1971) и методом, описанным у Мейлот-Вернье и др. (Maillot-Vernier « а/., 1991).

Пригодность клеточных линий табака и растений регенерантов в качестве пищевого субстрата дрозофилы исследовали на линии мух Кантон С, поддерживаемой в стандартных условиях (Лутова и др.,. 1992). Опыты проведены совместно с научным сотрудником лаборатории генетики животных БиНИИ СПбГУ Л.б.Бондаренко, как описано у Лутовой и др. (1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ОБСУЖДЕНИЕ

1, Разработка методов клеточной селекции для получения растений табака Mcotiana tahacum и Nicotiana plumbanmifolia. устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину и Фунгициду байтану.

Для определения сублетальной концентрации селективного агента микрокаллусы N.tabacum подвергали действию нистатина в концентрациях от 30 до 60 мг/л питательной среды (Таблица 1). Во всех вариантах опыта селективный агент подавлял рост микрокаллусов. Устойчивые микрокаллусы были способны к нормальному росту на среде с ПА. В качестве сублетальной мы приняли концентрацию нистатина 50 мг/л. Котролем служили каллусы, культивируемые на среде без селективного агента.

В экспериментах по изучению влияния байтана на рост микрокаллусов N.plumbaginifolia были использованы среды, содержащие 50-500 мг/л селективного агента (Таблица 2). В качестве контроля служили среды без селективного агента (контроль 1) и среды с растворителем (ДМСО) (контроль 2).

Таким образом, были подобраны сублетальная (50 мг/л) и летальная (60 мг/л) концентрации нистатина для селекции устойчивых клеточных линий табака N.tabacum.

Таблица 1.

Влияние нистатина в различных концентрациях на рост микрокаллусов табака Ы.юЬасит.

Вариант Исходное кол-во Кол-во растущих микрокаллусов

опыта микрокаллусов (%) и доверительные интервалы

Контроль 231 9В.З

96.2-99.6

Нистатин 30 мг/л 231 81.0

75.7-85.8

Нистатин 35 мг/л 231 18.2

13.5-23.4

Нистатин 45 мг/л 252 6.0

3.4-9.3

Нистатин 50 мг/л 252 1.2

0.9-2.5

Нистатин 60 мг/л 252 0.0

0.0-0.1

Концентрацию байтана, соответствующую 300 мг/л, применяли для отбора первично устойчивой культуры Н.р1итЬа&т/оИа. В дальнейшем устойчивые штаммы активно росли при летальных концентрациях ингибитора (400 и 500 мг/л).

Таблица 2.

Влияние различных концентраций байтана на рост микрокаллусов табака N.plшnbag¡nl/oUa.

вариант опыта Кол-во. исходных микрокаллусов Кол-во растущих микрокаллусов (%) и доверительные интервалы

Контроль 1 100 83.0

82.3-83.7

Контроль 2 100 85.0

84.2-85.9

Байтан 50 мг/л 100 55.0

54.0-56.0

Байтан 100 мг/л 94 44.6

43.5-45.7

Байтан 150 мг/л 100 27.0

25.1-27.9

Байтан 200 мг/л 98 20.4

19.6-21:2

Байтан 250 мг/л • 96 12.0

11.4-12.6

Байтам 300 мг/л 100 4.9

4.6-5.4

Байтан 350 мг/л 100 0

0.0-0.9

СХЕМА СЕЛЕКЦИИ

ФОРМЫ ЫлаЬасит Ы.р1итЬа^Ш/оИа

Получение Селективные условия

первично Нистатин 50мг/л Байтан ЗООмг/л

устойчивых (Н.-50) (Б.-300)

клеточных Мутагенная обработка УФ-облучением

линий 6 мин. 4 мин. 2 мин

у

±

Этапы

субселекции

(Б) (А) Н.-50 Н.-50 Н.-60

Н.-О

-О

Н.-60 Н.-О

Б.-300 I

бг°

Б .-300 Б.у450 Б .-200 Б.-200

I I

Б .-300 Б .-300

ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ

1-^

Проверка сохранения признака устойчивости

Вторичная культура микрокаллусов

I I

(Б) (А) Н.гО Н.гО

Н.-О

I

Н.-оО

Протопласты

13(5) Н.-60

1

V

Н.^50 Н.-50 Н.-О

I

Н.-60

Рис.1. Схема используемой в работе ступенчатой селекции на устойчивость к полиеновому антибиотику нистатину и фунгициду байта ну.

Для увеличения количества мутантных клеток в популяциях, микрокэллусы облучали УФ-светом в присутствии сублетальной концентрации селективного агента. Для М.шЬасит использовали

облучение в течении 4 и 6 минут, при которых наблюдали появление большего количества устойчивых микрокаллусов, способных к росту на среде с селективным агентом, для Ы.р1итЬахШрИа - 2 минуты.

Для отбора устойчивых штаммов в работе бып использован метод ступенчатой селекции. Варианты опытов различались по конкретным этапам субселекции (Рис. 1). В результате ступенчатой селекции происходило уменьшение количества первично устойчивых линий. Так, при селекции клеточных штаммов Ы.мЬасит, устойчивых к нистатину, из 60 первично устойчивых нами было получено 6 линий, способных расти в присутствии нистатина.

Таблица 3.

Результаты проверки сохранения признака устойчивости к нистатину (50 мг/л) у микрокаллусов табака Ы.юЬасит после прохождения морфогенетического цикла "каллус-регенерант-каллус".

Номер Количество Кол-во растущих

растения микрогаллусов микрокаллусов,(%)

Контр. 320 0.9

0.4-1.6*

1 166 44.8

33.2-49.7

2 160 63.2

58.6-69.4

3 96 40.1

32.6-48.1

4 96 48.3

39.8-51.6

5 64 85.6

79.4-90.1

6 62 90.2

81.6-98.6

7 93 73.1

69.2-78.4

8 120 91.2

83.1-98.6

9 148 56.8

49.7-59.4

10 243 89.7

80.4-92.6

Примечания: * - доверительные интервалы; жирным шрифтом отмечены варианты, характеризующиеся повышенным уровнем устойчивости к нистатину.

Для осуществления морфогенетического цикла получали растения-регенеранты на основе устойчивых клеточных линий. При анализе сохранения устойчивости в морфогенетическом цикле использовали два подхода: в первом эксперименте изучали уровень устойчивости вторичной .. культуры микрокаллусов, а во втором • устойчивость протоклонов, выделенных из устойчивого растения-регенеранта. В обоих случаях растения-регвнеранты различались по уровню устойчивости к нистатину (Таблица 3).

Для одного из регенерантов, получившего название 13(5), показан 90% уровень устойчивости протоклонов к летальной дозе селективного агента. Растения 13(5) были высажены в почву для проведения генетического анализа признака устойчивости к нистатину. Однако в течение двух лет попытки индуцировать цветение оказались безуспешными. Неспособность к цветению в условиях, при которых растения табака дикого типа легко зацветают, может быть вызвано как физиологическими изменениями, обусловленными долгим культивированием в условиях ш vitro, так и генетическими изменениями.

В серии опытов на N.plumbaglnifolio мы модифицировали схему селекции на устойчивость к байтану. Устойчивые варианты проводили через неселективные среды с последующим высевом на среды с байтаном (Рис. 1), Первично устойчивые линии характеризовались замедленной скоростью роста по сравнению с контрольными. Изменилась морфология каллусов, из светлых и легко диспергируемых они превратились в ,темные и гранулированные. В результате субселекции из 45 первично устойчивых штаммов удалось отобрать 8 устойчивых линий, которые оценивали в модельной системе "растение-насекомое" и подвергали биохимическому анализу.

Таким образом, отработан метод клеточной селекции in vitro с использованием культуры микрокаллусов для Получения линий табака, устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину, впервые отобраны клеточные линии N.plumbaglnlfolia, устойчивые к фунгициду байтану, ингибитору биосинтеза стеринов. Анализ стабильности признака в морфогенетическом цикле "каллус-регенерант-каллус" и сохранение признака после культивирования в неселективных условиях свидетельствуют о мутантной природе полученной устойчивости, однако невозможность проведения классического генетического анализа не позволяет называть мутантными полученные устойчивые формы.

2. Оценка устойчивых к нистатину и байтану Форм табака в модельной системе растение-дрозофила.

Для исследования влияния выделенных клеточных линий и регенерантов, устойчивых к нистатину и байтану, на плодовитость насекомых проводили оценку растительного материала в модельной системе "растение-дрозофила". Выделенные нами устойчивые к нистатину клеточные линии при их использовании в качестве корма дрозофилы изменяли плодовитость насекомого (Таблица 4). При этом, наблюдали как увеличение плодовитости по сравнению с контрольными опытами, так и достоверное снижение этого показателя. Отмечаемое различное влияние исследуемых форм на плодовитость мух скорее всего связано с тем, что в результате селекции на устойчивость к нистатину отбирается широкий спектр измененных вариантов, в том числе и по биосинтезу стеринов, включая формы, имеющие большую . пищевую ценность для питания дрозофилы, чем растения дикого типа. Способность повышать или понижать плодовитость мух проявлялась однонаправленно на различных уровнях дифференциации растительных тканей. Плодовитость дрозофилы была всегда выше при использовании гомогенатов побегов, чем каллусных тканей.

При анализе нистатин устойчивого варианта 13(5) в модельной системе отмечали достоверное снижение плодовитости дрозофилы (Таблица 4),.

При использовании устойчивых к байтану клеточных линий N.plumbagШfolia в модельной системе "растение-дрозофила" нам не удалось выявить линии, достоверно снижающие плодовитость насекомого (Таблица 5) по сравнению с контролем. В целом, плодовитость насекомых, вскармливаемых гомогенатами линий //.р/итЛв^'шуы/о, была значительно ниже не только плодовитости, при их

. Таблица 4.

Результаты теста в модельной системе "растение-дрозофила" устойчивых к нистатину вариантов Ы.юЬасит.

Формы Плодовитость Формы Плодовитость

Контроль 1 50.8 ±6.29 (каллус) Клеточная линия А 13.8±3.14 Клеточная линия Б 21.3 ±4.29 Контроль 2 60.8±7.20 (регвнврамт) Регенерант 25.2±5.68 (Линия А) Регенерант 13(5) 9.0±6.58

Таблица 5.

Результаты теста устойчивых к байтану' клеточных линий табака Ы.рктЬацШ/оИа в модельной системе "растение-дрозофила".

Клеточные линии Повторности Плодовитость

1 3 8.2±5.9

2 4 11.1 ±3.7

4 3 14.3±6.5

5 3 10.5±3.6

6 3 7.4±4.4

7 4 11.8±7.7

8 3 20.0±16.1

9 3 ¿0.6± 14.5

10 3 10.6±4.6

Контроль (каллус) 4 18.0±12.0

Контроль (дрожжи) 5 51.1 ±25.1

выращизании в стандартных условиях (источник стеринов-Дрожжи), но и плодовитости, наблюдаемой при использовании в качестве корма гомогенатов каллусов табака ЫлаЬасмп (Таблицы 4 и 5). Мы предполагаем, что снижение плодовитости дрозофилы в модельной системе было вызвано повышенным содержанием веществ вторичного метаболизма в каллусных тканях N.plшnbagini|Ыia.

3. Определение и анализ состава стеринов Форм растений, устойчивых к селективным агентам.

Ответить на вопрос, насколько устойчивость к нистатину или Сайтану и способность снижать или повышать плодовитость насекомого связаны с изменениями в биосинтезе фитостеринов, должны были эксперименты по биохимическому анализу.

При анализе состава стеринов растений ШаЬасит дикого типа (Таблица 6), показано, >гго группа обычных стеринов составляла до 98% общего количества стеринов и включала такие стерины, как холестерин, кампестерин, ситостерин и стигмастерин, при этом отмечали доминирование стигмастерина над ситостерином. Результаты биохимического анализа регенеранта 13(5) выявили не только количественные изменения в соотношении основных стеринов (доминирование ситостерина), но и появление новой группы д7-стеринов, нехарактерных для вида Ы.юЬасит, которая составляла до 16% от общего количества стеринов (Таблица 6). Отмечали увеличение общего

Таблица 6.

Состав стеринов регенерантов Ы.шЬисит, полученных из контрольной и устойчивой клеточной линии.

Стерины Контроль 13(5)

д'-кампестерин л7-ситостерин д7-авенастерин 24-зтиледенлофенол % от общего 0 0 0 0 количества стеринов 1 6 2 7

а 0 16

Циклоартенол 24-метиленциклоартенол Циклоэукаленол 1 0 1 3 3 1

б 2 7

Холестерин Кампестерин Ситостерин Стигмастерин 5 17 22 54 4 10 38 25

в 98 77

Общее количество стеринов (мг/г сухого веса) 3.9 4.9

Примечания: а - суммарное количество д'-стеринов; б - суммарное количество промежуточных соединений; в - суммарное количество основных фитостеринов

количества стеринов в клетках устойчивой формы в 1.2 раза по сравнению с таковым в клетках регенерантов дикого типа.

Таким образом, для устойчивой к нистатину формы 13(5) табака Ы.юЬасит было показано, что способность достоверно снижать плодовитость мух в тесте "растение-насекомое" сопровождается изменением в составе стеринов, а именно, появлением новой группы ¿'-стеринов. По результатам комплексного подхода к анализу нам представляется возможным считать выделенную как устойчивую к нистатину форму мутантной.

Анализ состава стеринов клеток Ы.р1итЬа$1т/оИа проводили в тканях различного уровня организации: каллус и органогенный каллус. Сравнивали состав стеринов устойчивых и контрольных форм, а также состас стеринов в клетках каллуса и регенерирующего каллуса.

Таблица 7.

Влияние различных концентраций байтана на состав стеринов клеток культуры каллусов N.plшг^bogbф^^a■

Камус Органогенный каллус

Стерины Концентрации байтана (мг/л)

0 200 300 400 500 0 200 300 400 500

% от общего количества стеринов

Циклоартвнол 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

24-метилен-

циклоартенол 1 2 0 6 4 1 5 5 3 5

а 1 3 О « 4 1 5 5 3 3

Обтузхофолиол 0 13 16 20 19 0 8 В 10 5

Дигидро- 24

обтуэиофолиол О 14 16 19 0 8 6 сл. 9

4а.14«-ДИМв"П1Л-

5а-стигмаста-В,2-

24(28)-дием-ол 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

24{28)-дигидро-

Фекостеоин 0 13 37 24 37 0 16 14 23 20

14а-метил-5а-

стигиэст»Б,2-24

(28Удичн-М-ог. 0 9 2 0 0 0 0 0 0 0

14а-мвтил-йв-

стигмастанол 0 0 0 0 0 0 11 14 15 12

14в-0ИГТ11Л-^-

холестанол 0 0 0 0 0 0 7 14 22 16

б в 5в » <• 75 0 5» 56 70 62

Изофукостерин 0 0 5 0 0 0 0 3 сл. сл.

Холестерин 6 3 3 10 2 9 6 7 8 6

Кампестерин 16 24 сл. 3 сл. 13 14 6 6 сл.

Ситостерин 58 13 6 15 13 31 12 11 17 16

Стигмастерин 19 7 7 6 6 46 13 12 9 11

в 99 47 21 34 21 99 45 39 40 33

Обще« кол-во сте-

рииоа(мг/г с.а.) 2.2 1.4 0.9 0.5 .1.2 0.9 0.7 0.4 0.2 0.3

Примечания: а - суммарное количество промежуточных соединений, образующихся до обтузиофолиола; б - суммарное количество метил- дЧлеринов; в - суммарное количество обычных д5-стеринов; сл. - вещество было обнаружено в следовых количествах

Как • показали результаты анализа (Таблиц» 7), состав стеринов каллусных клеток включает в себя набор обычных для рода КИсойапа д5-стериноа (холестерин, кампестерин, ситостерин и стигмастерин), а также небольшое количество (до 11%) промежуточных веществ биосинтеза. Общее количество стеринов в каллусных клетках более, чем в 3 раза, превышает значение этого же показателя в клетках регенерирующих каллусов.

Нами не было обнаружено различий между контрольной и устойчивыми клеточными линиями по составу стеринов при обоих способах культивирования.

Результаты биохимического анализа показали (Таблица 7), что культивирование каллусов табака в присутствии байтана приводило к изменениям в биосинтезе стеринов растительных клеток. Обработка байтаном во всех использованных концентрациях (200-500 мг/л) приводила к накоплению 14а-метил-гР-стеринов. Общее количество 14«-метил-дв-стеринов в тканях возрастало по мере увеличения концентрации ингибитора и достигало максимального значения при летальных дозах (400 и 500 мг/л).

Полученные результаты позволяют сделать вывод об ингибирующем действии коммерческого фунгицида байтана на фермент цит.П450-обтузиофолиол-14-деметилазу в клетках М.р1итЬа%1П1/оИа.

Все исследованные нами устойчивые к байтану клеточные линии и в селективных условиях не отличались от контрольных по характеру изменения биосинтеза стеринов в ответ на действие селективного агента.

Возникновение устойчивости можно отнести за счет изменений в результате мутации одной из предполагаемых мишеней действия триадименола (например, етн-каурен-оксидазы, фермента биосинтеза гиббереллиновых кислот), несвязанной с биосинтезом стеринов. Также, учитывая сложный состав коммерческого фунгицида байтана, в экспериментах могли быть отселектированы линии, устойчивые к фуберидззолу. В настоящее время в лаборатории имеются данные для клеточных линий И.р1итЬа%т1/оИа 6 и 8, подтверждающие их устойчивость к фуберидазолу.

Полученные результаты свидетельствуют о тесной взаимосвязи между составом стеринов растительных клеток и плодовитостью дрозофилы в модельной системе "растение-насекомое". Как было показано в случае устойчивой к нистатину формы табака 13(5).

достоверное Снижение плодовитости дрозофилы, наблюдаемой в тесте с устойчивым вариантом растения, по сравнению с плодовитостью в контроле, сопровождалось изменениями в составе фитостеринов (появление д7-стеринов). И наоборот, если в тесте не удается выявить варианты, достоверно снижающие плодовитость насекомого, то можно предполагать, что полученная устойчивость скорее всего не связана с изменениями в биосинтезе стеринов, что и было подтверждено биохимическим анализом устойчивых к байтану клеточных линий К.р1итЬа^п\/оИа.

Итак, предлагаемый подход опосредованной селекции позволяет получать растения, устойчивые к нистатину и байтану. Полученные результаты показали правомерность использования комплесного подхода к анализу выделенных форм: устойчивость к селективному агенту, способность влиять на плодовитость насекомого; биохимический анализ изменений в спектре фитостеринов.

ВЫВОДЫ

■ . Отработан метод клеточной селекции из микрокаллусов по получению устойчивых клеточных линий и регенерантов к нистатину и байтану для растений рода №сойала.

2. Получены клеточные линии и регенеранты ЫлаЬасшп и N.plшnbagimfoUa, устойчивые к нистатину и байтану.

3. При оценке устойчивых форм в модельной системе "растение-насекомое" выявлена изменчивость по способности гомогенатов клеточных линий и растений удовлетворять потребности дрозофилы в экзогенных стеринах. Среди исследованных вариантов отобраны растения 13(5), которые достоверно снижали плодовитость дрозофилы при их использовании в качестве корма насекомого.

4. Дана биохимическая характеристика состава стеринов клеточных линий растений N.гаЬасшп (сорт Амбалема) и N.plшnbagini/olía. Показано, что спектр стеринов включает в себя как основные д^стерины высших растений: ■ холестерин, кампестерин, ситостерин и стигмастерин, так и промежуточные соединения, составляющие до 11% от общего количества стеринов в клетке.

Б. Выявлены различия в спектре стеринов на разных уровнях дифференцировки тканей (каллус, органогенный каллус). Общее количество стеринов в каллусных клетках в 3 раза превышало общее количество стеринов в клетках органогенного каллуса.

6. Показано, что присутствие в питательной среде коммерческого фунгицида байтана приводит к накоплению промежуточных продуктов биосинтеза, в основном 4а,14а-диметил-лР-стеринов и их производных. Это может свидетельствовать о подавлении байтаном работы фермента цит.П450-зависимой-С14-деметилазы.

7. Выделенная в результате клеточной селекции на устойчивость к нистатину форма Ы.юЬасит 13(5), использование которой в тесте с дрозофилой приводило к достоверному снижению плодовитости насекомого, характеризуется измененным составом стеринов. Появление новой группы д'-стеринов сопровождалось увеличением общего количества стеринов в клетках растений 13(5).

8. Разработан новый подход к получению устойчивых к насекомым растений, включающий 3 независимых теста: (1) клеточная селекция на устойчивость к веществам фунгицидного ряда; (2) оценка в модельной системе "растение-дрозофила"; (3) биохимический анализ спектра фитостеринов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лутовз Л.А., Козырева О.Г., Левашина Е.А. Использованиэ метода культуры клеток для выделения клеточных линий, устойчивых к нистатину//В сб.: Тезисы V съезда ВОГиС. М„ 1987.-Т.1.-С.164.

2. Лутова Л.А., Козырева О.Г., Левашина Е.А., Бондаренко Л.В., Байрамова Н.Л., Инге-Вечтомов С.Г. Клеточная селекция как метод получения мутантов растений с измененным составом фитостеринов// Всесоюзн. конф. "Генетика соматических клеток в культуре". Звенигород, 1989: Тез. докл.-М., 1989.-С.82.

3. Лутова Л.А., Левашина Е.А., Бондаренко Л.В., Байрамова Н.Л , Инге-Вечтомов С.Г. Гетерогенность клеточных линий и химерность растений-регенерантов при селекции на устойчивость к нистатину// Всесоюзн. конф. "Генетика соматических клеток в культуре". Звенигород, 1989: Тез. докл.-М.6 1989.-С.83.

4. Лутова Л.А , Бондаренко Л.В., Козырева О.Г., Левашина Е.А., Инге-Вечтомов С.Г. Использование лабораторной модели "дрозофила-растение" для поиска растительных форм, блокирующих рзззитие дрозофилы//Труды IV Всесоюзн. совещания по проблемам биологии и генетики дрозофилы, Одесса.-1989.-С.13.

5. Лутова Л.А., Левашина Е.А., Бондаренко Л.в., Байрамова Н.Л., Андронова Е.В., Инге-Вочтомов С.Г. Мутации высших растений по биосинтезу стеринов//Генетика.-1992.-Т.28.-М2.-С. 129-136.

6. Лутова Л.А., Ходжайова Л.Т., Левашина Е.А., Абдель Нассер. Использование ингибиторов биосинтеза стериноа для получения мутантов высших растений//Труды Межд. совещания по биотехнологии высших растений, Алма-Ата, 1993.-С.120.

7. Lutova L.A., Levashina Е.А., Bondarenko L.V., Bayramova N.L., Inge-Vechlomov S.G. Biochemical mutants of higher plants in plant protection from pcsts//Intern.Symb. Congr., Israel,-1991.-P.61.

8. Lutova L.A., Levashina E.A., Bondarenko L.V., Bayramova N.L., Inge-Vechtomov S.G. Nystatin in the plant cell selection for insect resistance. Elaboration of ecologically safe methods for agriculture// Proc.of the Russian-Finnish Synip.-St.Petersburg.-1993.-P. 112-121.

9. Lutova L.A., E.A.Levashina, L.T.Hodjaiova, Abdel Nasser, L.V.Bondarenko, S.G.Inge-Vcchtomov. New method for development of plants with complex resistance to vermin//Proc. IV Inter. Congr. of Plant Mol. Biol.-Amsterdam, 1994.

Авторские свидетельства:

1. Инге-Вечтомов С.Г., Лутова Л.А., Бондаренко Л.В., Левашина Е.А., Байрамова Н.Л. Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям. 115/89 кр. Заявка П4777299/13/001607/. Положительное решение от 25.12.1990. A.C.N 1717016.