Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика реакций клеток на действие факторовкриоконсервирования

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Кинетика реакций клеток на действие факторовкриоконсервирования"

Л6 О 16 ФЕВ

Л

Й96.

1НСТИТУТ провлел КРЮБЮЛОГП та крюмедицини

на правах рукопису

Розанов Леошд Федорович

К1НЕТИКА РЕАКЦ1Й КЛ1ТИН НА ДНО ФАКТОРIВ КРЮКОНСЕРВУВАННЯ

03.00.22 - кр1об1олоПя

АВТОРЕФЕРАТ д1сертащ1 ка здобуття вченого ступеню доктора 01олог1чних наук

Харгав - 1995

Робота виконаяа в 1нститут1 проблем кр1об1олог1: ?а кр1о1.:адицшш Над1онально1 Академ! 1 наук Украши

Науковий консультант:

доктор бшлог1чних наук е.0.Горд1днко

0ф1.щйя1 опоненти:

акадсмж НАН Украпш, доктор б!олог!чних наук, професор I.С.Магура

доктор б1олог!чних наук, професор В.О.МоЮвев

доктор 61олог1чних наук, професор Ю.П.Благой

Проводка устаиова:

1нститут ф!а!олог!1 !м. 0.0.Богомольца НАН Украгнк, м.Ктв

Захист в1дбудеться "/9" 1996 р. о /З***

годин! на зас!данн! спец!ал!зовано! ради Д 50.21.01 при 1нституп проблем кршб^логП та кршыодицшш НАН УкраКки (310015, м.Харшв, вул. Переягапвська, 23)

Автореферат розгслано " / " 199^Гр.

Вчекий секретар спец!ая1говано'1 ради, доктор кодичних наук, професор

А.М.Гольцев

ЗАГАЛША ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТЙ.

Актуальнiсть проблема. Досл1даэння поведЛпот кл!тин в rlno- та гШертоШчних розчннах речовин, як( проникають або не проникають у юптини в умовах rino-, нормо- та rinepTep-Mii, а такой безпосередаьо у цикл! заморояування- в!дтаюван-ня, е одним з класичних тдход:в (Грщенко В Л.,Белоус А.М., 1994 ) до внвченяя законом1рностей крiошшкодгетшя та крю-оахисту 1сл1тин. Визначена з експеримешчв реакШя клтш на д!ю осглотичних фактор!в певно! сили в сполученн! з 'ф1зико-математичним аналгзсм повед1нки юл тин в аномальних умовах дае багату шфор?лэц1ю для анал!зу причин та механ1зм!в попь кодиуючого впливу pi3Hix фгзичних фактор¡в, як i дгють на pisHitx етапах циклу кр1оконсервування (Гордюнко е.О., Пуш-кар Н.С., 1994 ). ЕквШбраШя юитин у крюзахксних середо-вкцах е важлнвим этапом спиаЦзацИ мотод!в крtоконсервуван-ня та задоз1льною коделлю щодо прогнозу пошкодаення юл тин осмотичнсм фактором у процес! заморояування-в}дтакшання. Вивчення процесiB та явищ, що виникають на цьому еташ у кл1танн1й суспензП, як правило, стае частиною будь-якого системного дослшвння кр1об1олог1чш1Х проблем i дае суттеву шфоркашю про об'ект, який консервуеться. Вона необх1дна для ф1зико-катематичного моделивання (Mazui» Р., Miller H.H., 1976 ) та визначекня моаливого характеру пошкдазпня кл!тин на посл1дуючих етапох циклу кргсконсервування. Не зваяазчи на вэлку р i ЗНС! !йН 1 TH 1 СТЬ В1ДГук1В ptOHüX 610Л0Г1ЧНЯХ об'ект!в на одеотиш! екстремальн! вшива когяа ваэпачити деяк! уШверс&льи! неспец£$1чн1 реакцП та ознакя шпкодан-ня, яти е загалыгокз, практично, для ycix клгтпн. До такпх реакцП, зокреха, налзпать дег!дратаШя та рег1дратащя кл1-ин (’ierynsn H.H., 1974 ), явзза набухенга та утворэкня кэч-брошшх nyxnptB (Boraard Л.G., Puller B.J., 8ha*r H.W.,1990).

Вйвчення динам 1ки росту останн!х, можливо, мае значения но т1льки у випадку визначсння мзхан1зм!в кр1опошодкення, вопо кие зв'язок такон 1 з фундаментальной проблемою будозп кл1-тшш та 11 ф!зико-хишчного стану.

Дане досл!дкэння грунтувалось на вивченн! кшетшш про-Ц8С1В деПдратацП, реПдратацП та набух аши кл!тин мэ'годами експзрпкэнтального та ф 1 зико -матоматпчного модожвання на етапах еквШбрацП У розчшах кр1оиротектор1в та солей, а такон у процос1 закороаування-в 1 дтаювання.

Метою дослШеяня було вивчекяя законом¡рностей розви-

тку реакцШ кл!тш р!зкого типу на дш фактор 1в, як! суп-\

роводаувть згмороиування-в!дтаювання, та умов, при яких Ш реакцП мають м!сцо.

Задач I .юслШлэння. У згод1 з постазленою нзтою було порэдбачено виргпшая так! задач!.

Х.Вкзначити умоел та дана\пку пожодаоння кл1тен кон-цэнтровашки розчиншли кр1опротвктор1в та солей.

2.Вивчитп, як вшшваать умови протИсання цроцес1в дзП-дратацП та внутр!шньокл!тинно1 кристал 1зацП на динам 1ку розватку реакцШ кл!тин р1зного типу на ц! фактора.

3. Визчитп к!нетику зы1шзвання об•ему кл1ткн, поза- та внутр¡шньокдIппшо I концэятрацШ крпдротектору та сол1 при 1зотерл1чн(й експозиц!! кл!тшших сусданз1й у розчинах кр!о-протоктор^в з р1знов копцонтрац1ев пропикаючих та но проышеа-ючш. у КЛ1ТКШ1 добавок при вар'Ирувапн! пильност! суспзнзП та ¡нших параметр ¡в з залученням засобгв экспериментального та ф1зико-матоматичного моделювання.

4. Вивчити кшетику зшнввашя об'ему клтш, внутр!-пньокл1тиштх концентрац!й кр! протектора 1 сол! та внутр(-шньоюп теплого пэрэохолодаоння при закороцувапн1 юптшших суспзнзШ з р!зио» шзидк 1 стю та вар* 1руванн1 {игшх найб1льш

вагомих параметров засобат експериментального та ф1зи- ко-математичного моделювання.

Наукова новизна. Вперше вивчен! законом !рност! явща набухания кл1тин р!зного типу з пошкоджзною та !нтактною мембраною у процес1 замороаування юптшшо! сустенз 1! та експозицп клтш в середовищах р1зного складу. Одерхаш експериментальн! та теоретичн1 даш, як1 не погоджуються з класичними уявлениями щодо меха1изм1в та законом¡рностей кр1опошкодження кл!тинних структур та св!дчать, що для !х пояснения, аналгзу та тлумачення необхгдно залучати не т!ль-кк ШЛ0Е8ННЯ мембранно! теорП проникност!, але й положения фазоЕо! теорп будови гаптини, Отриман! нов1» не в:дом1 ра-шиз даш ¡подо данам!ки передгемолшганих трансформации та кпгатпки гекол!зу ерятрощтв у гшертошчнпх розчянах крго-протектор! в та солей. Одержан! дан! щодо залекност1 крзста-л!зацп в кл!ткнних суспензгях в1д початкового переохолод-хвння поза:ин тинного розчину та режиму крюконсервуваиня.

Теоретичне та практична значения роботи. 3 залучениям одеряаклх даних побудовано схему розвлтку крюпошкодзхэння юл тин при заморояуванш та вказаш моклив1 засоби !х кр!о-захисту. Са доиокогою чисельного моделюзання отримэш нов1 даш щодо процес!в масоперзносу м!п: кл!тинами та оточуючим 1х середовспен на р!знях етапах циклу кр!оконсервувашя. Сшфзючлсь на ц! даш, сформульовано рекомендаш! шодо опти-¡пзацп о-эсоб1в кр!оконсервування. Теоретично вагомими е результата ^одо К1нэтлчних особливостей розвктку процесу го;,«ол1са у серэдовацах р!зного складу. 3 практично! точки сору загляшкз я даш про залоги!сть кшотикя процесш насо-пзргпссу у к^тши-пй суспенз!!, яка коксервуеться, вгд Шль-еост! :;л!т:ш у суепеизП, а такоя дан! и;одо кшетпкн пере-охолод-ешст внутр!ш1ьокл1 тинного сзродсвтаа на еташ криста-

л1зацП.

ПОЛОЖЕНИЯ. ЯК1 ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗДХИСТ. '

1. Набухания е ушвэрсальною иеспэщз^чною роакШею кл1тин но TiJibKK на д!ю tíeotohíi, але ñ ка поикодкуючу д!ю заморозування-в i дтахвання та гшертошчннх: роз чин i в солей та 1ф1опротектор1в. Onip, який чкшть шпшатрвкс клтш роз-тягуванню Шд час набухания, веде до утвороння моибрапних пухщнв, як i продовзсують осштичну рэакцШ iuiítsh.

2. Щ1лыпсть oííxffl у суспенз! ï бозиосереднього впливу на процесн масоперзносу на еташ кристал1зац!! ко глаз, алз 1снуе tï посерэднШ вниш, який вгдбувазться через характеристики б1ооб'екту, як! Bin набуваз шд час експозкц! I у кр!озахиспому сервдовшц1: зб1лыпэвпя пПлыюст! 1сл í тш! у суспенз í I на отаи! експозиц! ! у крЮзахисному розчпн! вэдэ до зшшшня ступеня ïx збезводнення, р1вня насичення Kpîonpo-токтором та níKOBoro значения концентрацП виутр i шньокл ¡ тинного електрол!ту, що, в свою чергу, шыиваз на к1нэттсу паре охолодаэння кл1тин на eTani кристал1зац!ï.

3. Первохолодаення позакл!тшшого po34imy ведз до зыи-швня швидкост1 охолодхення, при як!й стае моаливоэ крнста-л1зац!я всерэдин! кл!тини; перзохолодйення виутрiшньоклi тайного середовища шд час охолодаэння з rocTífaioa швидк1стю, в свою чергу, зростае конотонно Илькп п!д час швидкого охо-лоднення та коли в!дсутня суттева дег!дратац1я кл!тин до початку заморозхування - в îiesîx вкладках за стад!еа зро-стання переохолодаоння настае стад i я його виразного зшшен-ня.

4. К1кетика гекол!зу орптроциИв у розчннах гл1цор!П1а,

1,2-пропанд1ола та дшэтилсулы&жсида, як! g Пшжшчшки по в1дноиеннй до Езпрошкзючого компонента, в облает i концентраций в!д 5 до 202 при знксэнШ томпарзтурз галшуеться,

а в обласн концентраШй вще, нш ЗОЙ -40Ж, навпаки, мае Micue ïï прискорення.

АпробаЩя роботи. Матергали дисертацгйжн роботи до-повиалися на I та II М1жнародних конферетцях по крюбю-логп ( Харк1в, 1988, 1992 pp. ), на II Всесоюзна конферен-ц! ï по анабюзу (Рига, 1984 ), пщнчних робочих нарадах по проблем! "Консервашя генетичних pecypciB" (Пущино, 1983, 1990, 1992 )

Публ1кащ ï. lio матергалам дисертацП опублшовано 2 монографiï та 23 статт!.

Обсяг та структура роботи. ДцсертаШйна робота склада-еться з вступу, огляду л1тератури, опису матерi алib та метод i в ■ трьох глав, в шок вккладеш результата власних дос-л!джень та ïx обговорення, заключения, висновкгв та списку лгтератури, який míctiítb 254 дакерела. Робота викладена на 242 стортках машинописного тексту, мютить 86 малюшив та 6 таблшь.

МАТЕР I АЛИ ТА МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕНШ

Для виргаення сформульованих задач були використан1 г'етоди KpioMiKpocKoni Ï, спектрофотометр 11, фазовоконтрасноi шкроскопп, волькшнометрн, осмометрп та фшнко-мате-матичного моделювання крюбюлопчних процесс.

Об'ектами досл1дяення у робот i були еритроцити донорсь-koï кров!, кл1тини KícTKOBoro мозку щура, кл!тини пер I тоне-ального ексудату, тканев1 лндфоцити, яйцекл1тини та ембрюш1 миш1.

У крюмисроскошчннх дослгдяеннях як крюпротектори були викорнстан! глШерин та пол 1етиленгл1 коль з молекулярною масою 400 ( ПЕО-400 ). При дослдаенш кшетики осмотичних рзакщй та набухания кл!тин у розчинах крюпротекторгв та солей були викрясташ ПЕГ-100, ПЕГ-400, ПЕГ-1500, глщерин,

1,2-пропанд1ол ( 1,2-ГЩ ), д 1 иэт 1 лсульфэксид (Д?ЛС0). хлорлд та щтрат натр¡я.

Вивчення npoueciB закороаувакня-вiдтаювання здШсиюзаЕ! за допомогою виготовленого нами крюпристроэ до Miicpo скопу. Температура зразка у кр1опристро! вкм!р:озалася за допомогою хрокель-копзлево! теркопаря та готенц1ог.етру та була об'ек-том рогуллвання программам блоком. Шд час крtомiкроскопiч-НИХ ДОСЛ1ДЕЭНЬ був впкористашй 1 нторфэронц i firn-поляр i зац1й-ней кпкроскоп pso-5 (Полыда) у рзккш штор|аронщйного контрасту у склад! мйсроустановки ЫКУ-3.

’ Вазчення к1Н0Гики npoueciB, то в1дбуваються в б!оло-гччних об'ектах на еташ експозшШ у кр1озахисннх серэ-довищах, проведено за допомогою установки, яка була заз-начена вэдз, або за допомогою ппзэртованого м!кроскопу МБ1-13 у решай фазового контрасту з ресстращвю реакц!й, як! спостер!галися, на к1кошивку. KptM того, вивчення кшотики гемол1зу еритрощшв в сзрздовщах р i зного складу було проведено на спектрофотометр! "Pye Unicam SP-8000" по стаццарт-Н1Й М6ТОДИЦ1.

В них досл!даеннях 10 мкл кров! додавалось до кювети спектрофотометру, яка м!стила 3 мл розчину кр!опротектора при певшй температур! у д!апазон! Bifl 5°С до 37°С. Температуру у кювет! Шдтримували за допомогою спещального пристрою. Шнетику зм1ни мутност! cycneHsii (при к = 760 км) ре-естрували безпосередньо шсля пером¡Еування кровi з крюпро-тектором.

Оскотичн! характеристики розчиШв вивчали вим!рюванням депрес!i точки плавл!нпя кожного розчину за допомогою термометра Бекмана або м!кроосмометра 0ШСА-Ц-О1.

Обчислення Biдносних кл!тинншс oö'eMiB (плод) було проведено або за допомогою проецирування фотограф!чнкх зобра-

кень luiiTHH (на одноршому за товщиною nanepi), або в им даваниям середнього д!аметру зображення кл!тини. Статистичну обробку цифрових даних проводили за стандартною методикою Стьюдента-Ф i шера.

К1льк1сний анал1з npoueciB масопереносу на деяких этапах циклу кр!оконсервування кл1тинно! суспвнзП здШснювали за допомогою ЕОМ шляхом виршення р^внянь термодинамики не-оборотшх процес1в, адаптованих (Горд1енко 6.0., 1989) до крюбюлоПчних задач. ’

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСШДНЕНЬ ТА IX ОЪТОВОРЕШЯ. осмотнчш реакцп клiтин i процеди масопереносу на етзп! i30Temt4H0t експозш!! у розчкнзх солей та еквШбрацП у розчинах крюпротектор^в.

Чисельяе моделювання npoueciB масопереносу на еташ 1зотерм1чно1 екслозицп кл!тин у комбшованому водному роз-чин! проникаотого кр!опротектору та непроникаючо I сол(, яке засновано на мембрашпй теорИ проникност!, дозволило нам вивчити кIнетику зм1ни кл!тинного об'ему, поза- та внутр1-шнкяшттших концентрации крюпротектора та електролит1в при pisroix початкових значениях деяких, найб1льш вагомих, параметр!в. Система д!ференц¡йних ргвнянь М1стить у co6i коеф!ц!енти проникност i юптшно! мембрана до крюпротектору (1:) та води (Ьр); в1дношетя плоцг поверхн! кл1тпни до ii об'ег-'у (т); Е1дносш початков! значения поза- (out) та внут-риласкдгоапшх (in) концентрацШ крюпротектора (тс, (0)) i сад! (^2(0)), iiKi визначали тс в1дношэння готочних значень ос::от;гшого тиску до остлотичного тиску ф{31олог1чного розчи-ну; 31Дноаення загального об'ему кл1тин до повного об'ему суспензП (дам: цгльшсть кл!тин у суспензП або гематокрлт

- ;г0), сб’емну частку ссмотичпо неактивних речовин у iuiiTmii (а ), ксеф!ц1снт В1лбиття in'> та тют —... - ---------------- ■

чисельного моделювання даш були подан! в заленност! Ыд безрозмгрного параметра 1п(1+ t/г0), де t - поточней час, а 10 = (7Ьр1с±1^0))_1, де, в свою чергу, и;|п(о) - осмотичний тиск ф13!олог!чного розчину.

Анал!з результат!в чисельного моделювання вказуе, що реакц!я клики на експозиц!ю у г!пертон!чних розчинах шс-тить у сосН, як г оч!кувалося, дв! фази: фазу дег!дратацп та фазу рег!дратацп. Ревень деггдраташ! виивляе виразну залешпсть не Т1лыси в!д концентрат I крюпротектора в поза-кл!тинному середовищ!, але й вгд щ!льност! кл!тин у сус-пензп ( малЛА та 2А ): чин ыенше щльшсть, тим б1льпе депдраташя, та навпаки. 3 даних, як! зведен! на малЛА, також вишмвае, що ргвжшрне зростання концентрат! крюпротектора в позаюн тинному середовищ! викликае нер1вном!рне змэншення об’ему клтши, яка збезводшоеться. У диапазон! великих концентрац1й збезводнення зростае мзна виразно, Шзк у дгапазон! малих. Де пояснюе ефект так званого "мш1мально-го об'ему", який спостер!гаеться в эксперимент!, без залу-чення спгрних уявлень Мегушап Н.Т. щодо мехашчного опору клгтинн стисненни.

Аналш фази рег!дратацп вказуе на те, що г! тривалють залзжить не Т1льки В1д параметру проникност!, але, крйл того, вгд концентрат! проникаючо! речовини у позаюн тинному середовищ! ( мал 1А; ЗА). В свою чергу, ргвень ретдратацП залежить, перш за все, в!д концентратI непроникаючого компонента в позаюптинному середовики: чем вона вще, тим мен-ше об’ем, який досягаеться юи тиною з часом( мал 4А ). Отке, залучення до крюзахисту коккЯ кованого розчину. який включае речовини, що проникають, ! речовини, як1 не проникають кр1зь мембрани кл!тин, дозволяв на етап! еквШбрацП не Т1лыси яопягнути необхишо! концентрат! крюпротектора у юн тин!,

Мал Л. К тетина зм1 нювання в1дносного

об1ему шптинн (А), введения концентраций внутрIшньо- (Б) та

позайТвинного (Г)

крюпротектора, внут-р1шньо- (В) та гозак-л!тинного (Д) елект-| рол1та упродова 1зо-тершчно! експозицп кл1тин у середовнШ, яка М1 стать проникаю-чий крюпротектор та непроникагочий елект-ролгт.

Розрахунок проведено при сшдуючих значениях параметр1в: Я°и*<0) = (3, 6, 9): я§и1ЧО) = 1; а = 0,2; А= -----£—= 0,001;

Ьр х|п(о)

gn= 0,5; о = 0,95.

З.п

п

Мал.2. Кшетика зм:-чн»вання вшюсного общему кл1тини (А), зводоно I концентра-Ц1I внутрИлньокл!-тинного електрол1та (Б) упродовк ¡зотер-М!чно* експозкш I юл тин у середовики яке м1стить проника-ючиЗ кр!оиротектор та непроникаючий електрол1т.

Розрахунок проведено при слгдуючих значениях параметра: я^и*(0) = 6; ^*(0)= I; а= 0,2; А= 0,01; ео=(0; 0,25; 0,5; 0,75); а =0,95. але ! збезводаи кл1тину до необхдаого ступеня. Ш обидва ефекти зшшують 1мов1рн1сть внутр1шньокл1тинно5 кристал1за-ц11 - одного з ведучих факгор!в кр(опошкодження- на еташ заморожування.

Як свгдчать результата ф1зико-математичного моделюван-ня, час реПдратацП моке бути поставлоно у в1дпов}дн1сть до часу насичсияя кл!тин крюпротекторсм (мал. 1А,Б га ЗА,Б), який, як 1 час рег!дратацП, залашть вгд початковоI концентрат* позакл!тинного кр!опротектора та параметру прошпшос-

и. Знайдена в1дпов!да]сть дозволяе ощнювати проншапсть клIтин до разных кр!опротекгор1в но часу реггдраташI.

Чисольке моделювашя дозволяе вивчитн 1 змаш концен-траци внутр1Шьокл1 тинного електрол!ту - параметра, який

1.СС .ог> Г^О „..7Б- ^ ...е . г5

О?

ее*.

вг>.

..-••• •- . - - . ‘

зг.

1па+ь/'х'ф)

' » г А е к ю

7 in 'П2 © в

£ .гг

5

>; _ .& '■

3 1 .ТВ

1

< £ А е. £ 1© *

Мал.З. К1нетшса зм1-нювання В1дносного

об'ему кл!тини (А), зведених внутр!шньо-кл1тинних концентра-щй крЮпротектора (Б) { електрол!та

(В) упродовж ¡зотер-М1ЧН01 ЭКСПОЗИЦП КЛ1ТИН у СврвДОВИЩ, яка м Ютить прониха-ючий крIопротектор та непрошкаючий елэктрол1т. Розрахунок проведено при сл1дуючжк значениях парамвтр1в: тс?и+'(0) = 6;

^*(0)= 1; а = 0,2; А- (0,001; 0,01;

0,1); 60=0,5;

о = 0,95.

важко ощнити в експеримент!. Шк ц!еI концонтрац!! тим ви-ншй, чим вще початкова концентрац!я позакл!тинного крЮпротектора то меншо гематокриг I параметр пронигеност1 ( мал. 1В,2В,ЗВ). Яхс сл!дуе з малЛА.В, 2А,В,ЗА,В, зм1ни концентра-цп внутр1шньокл1 тинного крЮпротектора, як I зм1ни концентрат! позакл1ткнного ( малЛА.Д ), задов!льно в!дпов!дають фазам депдратацп та реПдратацп ялIтин. Концентрат я по-закл1тинного крЮпротектора, в свою чергу, виразно зм)нюеть-оя Т1лыш на еташ депдраташ I, на етзт рзггдратэцП ¡1

1.СС .зг ... .. А

•ее .те

• .< ©01 . - •••'

.33 -ЯГ*

о г а к к ±ф

4.0 . Б

З.Е.

з.е .1 и . •-1

г.©

1.Б 1.0. X. .© .01 у' ’/ ...•'.’©01 1п<1+Ъ/'гс?>

С г а 4 к $я>*

4.5. 4.Ф, 3.5 3.0 г.5. ть >ч^.©01 .О)' ' V чо в

г.©

1.Е 1.© 1п<1+Ь/^0>

€ ^ 4 -¿5 ё ё 1э

Мал.4. К{нетика зм1нювання в1дносного об1 ему кл!тини упродова 1зотершчжн ексцозицп хштин у сере до вид I, яке м Ютить проникаючий 1фЮпротектор та непроникаючий електро-Л1Т. •

Розрахунок цроведено при сл1дуючих значениях ларамет-р!в: %?и1:(0) = 6; я£и1:(0) = (0; I ;2) а= 0.2; А= 0,001; во=(0,5); а =0,95.

зм1ни мал! ( мал.1А,Г ). У зв'язку з цим внм1рювання проник-ност1 юн тин до крЮпротектора з залученням даних про зм1нн його концентрат 1! у позакл!тинному середовищ! мало ефектив-но.

Вивчення кШетики осмотичних реакц1й кл!тин пер1тонеа-льного ексудату миш та еритрощтв людини у розчинах КаС1, цитрату натр!я та ряду кр!опротектор1в з 1зотошчною концентрат ею Ыа01 показало, що в загальних рисах ця кшетика прогнозу еться у меках мембранно! теорП прониклось. У розчинах непроникаючих речовин ШаС1, цитрат натр1я та ПЕГ-1500) кл1-тини п!сля дег!дратацП, ртень яко! залеииь В1д осмотично-го таску розчишв, залшаються дег1дратованкми ак до пору-шення проникност! юйтинних мембран. У розчинах речовин з р1зним ступеней проникностI ( глщернн, ПКГ-100 та ПЕГ-400) за фазою дэПдратацП настае фаза реПдратаЩ!, яка тривае тим мэншо, чем вшп,9 прошкнЮть КЛ1ТКШ1 до дано! рэчовшш.

15

Поруглпня кембрашо! прогасяост!, 1коз1ра1сть якого зростас з! зроставнят.г'л осмотнчпого тпску розчпну» у цьогду вяпадку соло ЛО Зб1ЛЫЯСЯПЯ Об'ему КЛ1Т2И ДО р!ппя, ЩО БЕВЯЗ Зй ПОЧа-

ТКОВ’ЙЬ

Пожкодеонпя кл!т:ш, яке у розчипах шпронившзчпх речо-вки впявляеться ж дестаб1л!зац1я збезводяеного стану, а в розчипах пронинаачях - як прпскорзшш пронесу рег1дратац1! 1 яке в обох вяпадаах закЮТуеться набухапнга кл1тин (мал.5), момха штерпрэтуватл язе зростання цроиикност! мембран до речевня, що пропикатаъ, або 1! у творения до речовин, що у норм! но пронияаигь кргзь кембрани юл тин.

Мал.5. Кшетика ем1-НЮВ2ИНЯ В1 дяосного об'ему КЛ1ТШ1 перитонеального ексудату упродовзх експозкт ц в розчинах N301 (А)

I глШерина (Б). Приштка: кржзI а 1 б демонструють осио-тичну ПОВЭДЦШУ кл1-тин, як! зазнають пошкодаення в проце-с! експозицП.

Вавчення дпнамИси набухакня пошкодкених двг1дратац1ею еритрошямв та юптян перитонеального ексудату показало, що, якю при набухши осташИх кл1тишшй об‘ем зростае монотонно, еритрошгт протягом набухания демонструють не мона, н1я дв! розносешпс у час! трапсформэц! I. в ход1 яких ьпкроско-

^ —1|Г------- —~|л

~2 к V кк £ к

2г,Б 105' глицерин в

2.0. 1.е Г / _ - . 6

1.0, / /

•с. —-* -- -6 -2 с

.0 1п<1*Ь/с>

< * 1 ё 3 А ^ к ^ к *

tIm товного круга.

У зв'язку з визначеною при анал!31 результатов чисель-ного моделювання в!даов!дн!стю часу, за який кл!тинний об*ем повартаеться до початкового значения, часу насичення клгтини крюпротектором була проведена оц!нка проникност! кл1тин перитонеального ексудату та еритроцит!в до розчшпв гл!цери-на, ПЕГ-100, ПЕГ-400 та ПЕГ-1500. Встановлено, що для насичення еритроцит1в розчинами глЩериау та ПЕГ-100 нав!ть у концентрат ях 30-40% досить експозиц!I протягом двох-трьох хвилин, тод! як кл!гини перитонеального ексудату за 20 хви-лш експозиц!ï встигають в!дновити початковий об*ем т!льки у присутност! малих концентрацШ цих крЮпротектор1в (5Я-ний розчин гл!церину та 5 -20%-н! розчини ПЕГ-100). При б!льших концентрат ях вказаних речовин об'ем кл1тин протягом 20 хвилин в!дновлюватися не встигае.

В розчинах ПЕГ-400 малих концентрацШ (5 та 10£) кл!ти-ни перитонеального ексудату за 20 хвилин експозиц!I виявляли т!льки тендентю до в!дновлення об'ему. При б1льших концен-трац1ях таку тендентю не виявлено. В розчинах ПЕГ-1500 yclx вивчених концентрац!й як еритроцкти, так 1 кл!тини перитонеального ексудату збер!гали збезводнений стан. Виявлено зв'я-зок осмотичного тиску розчин!в та ïx проникност! з пошкод-женням кл!тин. Так, наприклад, глШерин та ПЕГ-100, як! у високих концентрац!ях не викликають пом!тного гемол!зу ерит-роцит!в, гошкодкували кл!тини перитонеального ексудату. ПЕГ-400 та ПЕГ-1500, в свою чергу, завдяки пор!вняно шзькому осмотичному тиску ïx розчин!в за час експозиЩ ï до гом!тного порушення мембранно! проникност! не приводили.

Реаки!1 кл!тин на д!ю Фактор!в заморокування-в 1 дтаювання ------**лчотпияяня ггооцес!в масопереносу на етап)

крястал1зац11 дозволило нам впвчити на цьо;.5у етаШ к1петику ЗМ1НИ В1ДГОСН0Г0 1СЛ1 тинного об'ему, Еяутр t ЕНЬОКЛ i тайного переохолодоння та зведених внутр 1 еньоклt тпнних концентрата кр!опротекгора та електрол1та. Як початков! унови при р!шен-Hi система днференЩЯних р!внянь були влкорнстан! к1нцев1 значения параметрiв на попередн!х етапах.

Як t оч1кувалося, охолодаення з постШною пюидк!стю приводило до деПдратацП шитин та до зростання внутрiиньо-кл1тенних концентрат й крЮпротектору та сол1. Повед1нка внутр1шньокл1тинного переохолодгэЕня в цнх уновах, припуска-ючи, що позакл!тишей розчин не переохолодауеться, була, однак, б1льш складною. На мал.6 зведеШ к1нетичш залешюст! зм1ни внутр 1 еньокл ! тинного переохолодазння при р1зних значениях рэгидного параметру р = Tq/ т^, дэ т0=ЗЮ к, £ -свядкtсть охолод^эння, а т0= (7 Lp ^(0))_ 1 (7 - в!днопен-ня плоц1 иовзрхн! кл1тини до II об'е?ду, Ър - ковф(ц1ент ф1льтрацП, а осмотлчний тнек ф1з1олог!чного розчину). Мал. 6А,Б t В 1лвструоть ставлення кШэтнки зм1нення внут-ptеньокл!тинного тарэохолодаення до трьох тпп!в початковз умов, со шпливають, .головним чином, з уков екв!л1брац11 кл!тип у кр1озахнснсму розчин!. Взпадок А в1дпов!да8 пэдоз-ПЭ експозапП, кола кл1тшш на початку крзстал!заШ! знахо-дяться у Ебэзводненсму стан!, а кр1опротектор пэ встпгаз проникнута у кл1тинз в значит к!лькост!. Внпадок Б в1дгоз!-дае серэда!й довзян1 експознцИ, при ях1й об*ем кл1тгнз до початку крастал1зацП встигаэ в!дновлт!ся т1лькя до значения

0,6S8Vo, але концентрат я кр1опротекгора у KJitTiiHt вэлзса. Нарешт!, Е:шадок В в1дяов1дзе епспозиц!!, при як!й об'см кл!тяш Естзгае майка нош1стэ в1днов1гглся, а кснцэнтрац1я кр1бпротектора блнзька до р!вня наепчення. Як видно з мапа-гсу 7, пзреохолодпэння внутр!шпьокл1 тинного розчину зростае

Мал.6. Кшетика зм!- • нювання внутр1шньо-шнтинного переохо-лодеоння шд час зшорокуваня. Розрахунок проведено при сл!дуючих значениях параметр!в: р=Т0/Тг0 = - 1,25 (I); - 2,5 (2);

- 6,2 (3); -310 (4);

(A) - у0= 0,46; «^“(0) = 1,149; 1С°и*(0)= 3,641; ^(0) = 0,59;

(B)- у0 = 0,698; 1С^(0)= 5,389; %?и*(0)= 6,0; я£и*(0)= 1;

(В) - У0= 0,902; 1^(0)= 3,187; ГС?и4(0)= 3,416; и£а1ЧО)= 0,91. '

!з знигенням температуры монотонно т!льки при малих абсолзот-них значениях параметру р. 1з зменшенням цього параметру внутр!еньокл1тиннэ переохолодаення суттево зм!нюзться. Спо-чатку Еде його зростання, а пот !м зшження з переходом до облает! в!д,еыних значень. Дег!дратац1я кл1тин до початку кристал!зац!I, в свою чергу, веде до повного переходу в!д монотонного зростання переохолодаення до його двохфазного зм! нювання або монотонного зншеення.

ОдорааШ результата» пера за все, свгдчать, що оптша-льне значения регжмпого парамэтру швиено особливо точке витрзмуватиоя тальки на початковому этапi кристалiзацi i, s нз б1ля евтектично! облает!.

На в i,да í ну в1д раиз.шого параметру р. вшгав параметру g0 на кшетику переохолодаекня був незначним. Проте, якщо врахуватл, що цей параметр moss впливати на р!вень дег!дра-тацй та ступгнь насичення юптини крюпротектором на еташ еквШбрацП, то вакливють toro для процесу кр!оконсэрву-вання стае очевидною.

Досл1дкення к1нетики реакцП еритрощпЧв людини, кл!тин лоткового мозку тура, юн тин перитонеального ексудату та тканевнх лпфщшв мшп на з8мороаувашя-в1дтаивашя, як i Оули проведанi методом 1фЮ.’,пкроскош í, доводять, що в зага-льнпх рисах ця кинетика вгдпов1дае положениям двохфакторно¡ теорП крíопоекодшкня. Г/ря повальному замороауванн! кшети-ка SMtíffi об'ему кл1тин виявляла cxosiCTb з повед(нков об'ему кл1тш у розчшах нэпроникаючих речовин. При швидкому замороауванн! кл!тини замерзали внутр t иньокл 1 ткано i ix ос ем не зм!нивався. В останньому випадку (мал.7), проте, у npoueci пов1ль- ного в!д!гр!ву була виявлена значна дег!дратац1я КЛ1ТНН, якi збер1гали сво! розм1ри у npoueci заморояування, що, мабуть, обумовлено повернешям кл1тин до гтертошчних

Мал.7. Кшетика зм1-нювання в1дносного об1 ему юптин KICTKO-вого мозку щур i в уп-родовж швидкого та пов1льного в1д!гр1ву шеля швщцсого замо-рожування.

ото*-р«гв поси* вкст|вого ССФ^С/мин) tW01.6 . , М * /' .„о БОвС/ммн « т *•*’' 4 • /1-е 1°С/Ним "ч / \ •' «S '* / V •«. Т»°С , .2

• -is -4с -к <!

розчин1в на етап! в1д1гр!ву. Швидкий в!Д1гр1в знижував р!-вень дег1дратац!1 кл1тин на цьому еташ. Пошкодяення кл1тин, як! були заморожен! пов!льно без захисту крIопротектором, починалось, перевакно, як Т1льки вони збезводнювалися до певного "критичного оО'ему”. Критичний р!вень дег!дратацП еритроцит!в в1дпов1дав зменшенню площ! 1х екватор1ального зр!зу приблизно у 2,5 рази. Кл1тини перитонеального эксудату та к1сткового мозку зменшували плоту свого м!кроскоп1чного зоОраження п1д час дег!дратац!1 при гов1льному замороауванн! максимально до р!вня 40-65* та 30-50% в!д початкового значения в1дпов!дно. У наблшмнн! 1зотропного стиснення це в!д-пов!дае втрат! кл1тинамн 50-7ОХ та 40-65Я води.

Характер виявлених у процес! пов1льного замороаування кр!опошкодаень був, у загальних рисах, схокем з характером пожодшння кл!тин у процес1 дег1дратац!1 концентровашвгп розчинами нэпроникаючих речовин. Об’ем кл!тин, що були дег!-дратован! у каналах м1к кристалами льоду, Д9стаб1л1зувався та починав зростати (мал.8). У раз! достатньо пов!льного

Мал.8. К1н8тика зм1-шзвання в!дносного об1ему кл!тин перитонеального ексудату миа! при заморояуван-н1 31 швцдкостяш: 0,3° С/хв (А), 1°

С/хв (Б) ( нззахип;эна суспенз!я ).

заморожування (при швидкостях охолодкення 0,3 та 1°С /хв та при в1дсутност1 початкового переохолодяення позакл!тинного розчину ) реггдраташя кл!тин з порушеною мембранною проник-н!стю завериувалася 1х набуханиям, а у випадку еритроцит!в -гемол13ом. Таким чином очевидно, що порушення проникностI кл!тин коке статися на етап! заморожування внасшдок '¿х де-пдратацп. Ш даш суперечать гШотез! Моп^в т.з. та ¡нших автор!в про те, що кл1тини пошкоджуються при пов1льному за-моровуванш внасл1Док втрати мембранних лтШв у пронесI !х стиснення при деПдратац! 1, що робить мембраны нест!йкими до наступно! репдратащ I на еташ вшгр1ву та веде до зрос-тання мембранно! проникност! внасл!док дефШиту мембранноI пов8рхн1. Необх1дно визначити, що пошкодаення окремих шитив при пов1льному заморожуванн! моке виявитися ще до того,' я» вони значно збезводнюються. Цей факт суперечить гшотез1 Мегутап Н.Т., ЗПДНО ЯК1Й ЮИТИНИ ПОШКОДКУЮТЬСЯ при ПОВ1 явному заморояуванп! внасшдок !х нездатност! до стисненнг п!сля досягнення м№!мального об'ему. Збгльшення темпу замо-рсзгування приводить до зростання температурного диапазону, 5 якому в!дбуваеться дег!дратац1я кл!тин, та виюночае або мас-куе ефекти 1х пошкодаення на етап! заморожування. У цьом; внпадку пошкодаення виявлялося т!льки на еташ вШгр1ву, т до процесу рег!дратац!1 кл!тин, яка обумовлена зниження! тон!чност! позакл!тинного середовища, додаеться реПдрата-Ц1я, що обумовлена проникненням у юитини речовт, як! , норм! не проникавть в них, що такоа приводило до набуханн. кл!тин з пильним цитоматриксом та гемол!зу оритрощтв Зб!льшення ступени переохолодження препарат!в до початк кристал1зац1I, в свою чергу, приводило до зниження темпера

тури, при як!й в1дзначалася максимальна дзПдраташя кл1?кн та зыиження швидкост1 охолодження, при якШ стае копишво» внутрйиньошптинна крпсталшащя або В1триф1кац1я частково збезводнених юитин. Наприклад, ввутрЯнньоклшшна кристал защя у переохолоджених суспензгях ерлтрощшв, як! не були шд захистом крюиротектору, виявлялася нав1ть при шздкост! охолодаення Ю°С/хв, а в суспенз1ях клшш тсткового козку та перитонеального ексудату - при швидкост! 0,3°С/хв. У той же час у в!дсутност1 значного переохолодаення кл!тини к!ст-кового мозку та перитонеального ексудату не показували Судь-яких ознак внутр1шньокл1тинно1 кристал!зац11 до швидкост1 охолдодження 60°С/хв» а еритроцити нав!ть при так!й ивидкос-т1 охолодкення вставали частково збезводнюватися. Переохо-лодження юл тин, як1 були замороаеш з малими швидкостями, пр1шодило також до того, цо юптини виявлялися достатньо р1вном!рно розташованими у заморожених препаратах, не згур-товувалися замороженням та не виявляли ознаки не1зотропно1 деформат I при збезводнюванш, тод1 як в умовах фазового переходу, який був близький до р1вноваги, так1 ознаки виявлялися.

Кр1опротектори (гл1церин та ПЕГ-400) поширювали д!апа-зон температур, у якому вгдбувалася дег1дратац1я кл1тин. Зб1льшення концентрат '! крЮпротектора у суспензП еритроци-т!в до 20% приводило до виразного зникення розм1р!в кл!тин навгть при швидкостI охолодкення 60°С/хв. В суспензиях кл1-тин кIсткового мозку та перитонеального ексудату зб:льшення концентрат 1 кр1опротектор1в до 20%, навпаки, запоб!гало детдратацп клгаш як при швидкому, так I при пов1льночу замороиувашп. Анал1з даних цодо осмотичних реакций кл1тш у присутностI кр!опротектор1в показуе, цо у зоШ субнульовях

температур кр1опротектор, який концентруеться замороауван-ням, може виступати у po.ii деггдраташйного фактору. ЬПдсут-н!сть осмотичних реакшй кл1тш перитонеального ексудату та к1сткового мозку п!д час заморожування у' присутност! глше-рину та ПЕГ-400 можна пояснити тим, що клiтини, як! експону-ються у цих розчинах, не встигають вщювити со i й початковий об'ем на еташ експозиц!i внасл!док невелико! проншсностi глшерину та ПЕГ-400 в цi клггини.

Динам!ка набухання юл тин у розчинах проникаючих кр!опротектор1В. гшотошчлих по Nací.

При вивчешп npoueciB набухання кл1тин у розчинах проникаючих кр1опротектор i в• як! не м!стять речовин, що не про-никають (а такок в г i по- та гшертошчних розчинах непрони-каючоi солi) ми намагалися вир!шити дв! задач!: а) виявити ознаки та законошрност! пошкодаення клшш в умовах, що моделюють порушення мембранно! проникност! у процес! заморо-кування-вiдтаювання; б) ощнити пронккшсть шнтин до розчи-н!в деяких кр! опротектор i в по швидкост! IX рег!дратацП у цих розчинах.

Процеси набухоння еритрощгПв вивчали методами спектрофотометр! i та MiKpocKoníi у режимах фазового та штерферен-ШИного контрасту. При вивченн! процес!в набухання яйцекл!-тин та ембрюШв t.íKmi застосовано метод вольюмшометрп -м!кроскопП з вим1рюванням в!дносно! площ! зображення юитин з метою к1льк1Сно! от шеи ix об'емних змш.

ШкроскоШчн! досл!днення показали, що час репдратацП еритроцит!в при набуханн1 в I, 3 та бМ-ному водних розчинах гл!церину не перевишуе, в!дповгдно, 40 с, I та 5 хвилин. Процес набухання йде, перевакно, у напрям1 дискоцит стоматоцит-набухлий стоматоцит. Набухлий стоматоцит е пере-

вазною передгемол1тичною формою еритроцита у розчинах глще-рину усIX вивчених концентращй. Процес гемоллзу, в свою чергу, складаеться з двох влразних стад!й: 1)р1зкого затемнения фазово-контрастного зображення кл1тини, яке супровод-куеться втратою юн тиною свIтлого ореолу, а икШ - зьпщен-ням шлтини у щлзонтальному напряг,п; 2)поступового знебар-влення зображення кл!тини до майке поеного злиття з фонил. Перша фаза гемол!зу, яка тривае приблизно Зс, пов'язана, на наш погляд, з р1зким вжкидоы розчину гемоглоб1ну з шлтини в позакл!тинне середовшце, а друга - з подалыпим постудавим виходом гемоглоо!ну з кл!тшш. Наш погляд базуеться, перш за все, на положениях теор11 фазового контрасту, а такон на вивченШ зображень" ргзних форм юл тин, як! обертаються в процес1 руху у препарат!,на вивчешп форм тшэй еритрощшв

I, нарешт:, на сгостер1ганш "реактивного ефекту" - змиаення юл тин на початку гемолшу. Неможливо пояснити затемнения зооракення кл!тин 1накше, ни: зменшенням показника заломлен-ня внутр1шньоюптинного розчину, яке пов'язане з втратою кл!тиною гемоглоб1ну. Треба в(дзначити, що перша стад1я ге-мол!зу мало залежить вгд концентрат1 крюпротектора в поза-кл1 тинному сере довшш, друга, напроти, значно залежить в!д ц1 еI концвнтрацп. Так, наприклад, час знеСар&лення клиин в розчинах I, 3 та 6М глщорину, був в1дпов1дно 10-20 с, 30 с та I хвилина.

Сдактрофотометричш досл!дження к1нетики процес¡в гемо-Л1зу еритрощтв у безсольових розчинах глщерину, 1,2-ПД та ДМСО, що оули наш проведен!, назначили наступне. Зб1льшення (до певноI меж!) концентратI крюпротектор1в та зшшення температуря ведуть до зростання часу 502-ного гемолгзу кл!-тин (кал.9). Одиак, ¡снуе критичний ршень концентрат г

крюпротектора, перевищення якого веде до р!зкого зниження часу ЬОЖ -ного гемсшзу. Для ДМСО та глШерилу ця концентра-ц!я складае 30£ , а для 1,2-ПД - 40%. Зменшення часу 50% -ного гемол1зу, яке спостер1галося у концентрованих розчинах кргопротекторш при зниженш температури. можна пояснити, мабуть, р1зким збитыпенням пронииюст I еритроцитарних мембран до крюпротектору внаслиок г!пертон1чного стресу.

Мал.9.3алежн1сть часу 50^-вого гемол1зу еритрощшв людинн у водних розчинах Д1мэ-тилсульфоксида в Iд

концентрат I крюпротектора (А) та температури (Б).

В тлому дан1 спектрофотометр11 вказують на те, що ге-мол!з еритрощгпв в розчинах кр1опротектор!в, як! не мЮтять не пронккаючих до кл!тип додатк1в, може бути насл!дком в меш, нш двох параметра: коефщ!ента проникнення кр!опро-тектора до юнтини та ппертошчного стресу. При ощнюванн1 проникливост! еритроцит1в до розчишв глШерину, 1,2-ВД та ДМСО ршшх концентращй у д!апазош температур 5-37°С по часу 50^-ного гемол1зу, звертае на себе увагу той факт, цо

1,2-Щ насичуе юптини у 8-15 раз1в ШЕидие, нш глщерин, а ДМСО -у 1,5 рази швидше, шк 1,2-ПД.

Яосл1дн:еныя npousciB набухания яйцекл1тин та ембр!он!в мини у середовищах р1зного складу показало, що незалежно В1Д того, цо шщ!юе набухания (порушення мзмбранно! проникност! в умовах rinepTOHií. чи порупэння осыотнчно! равноваги на KJiiTHHHiü мембран! внасл1док поступу до кл!тини крюпротек-тора з середовища, яке не м1стить непроникаючо1 речовшш), п1сля появи на поверхш клтпш ыембранншс пухир!в, а шод1 й до iz появи, набухання цнтоматриксу шитини пршпшяеться

Ыал.10. К1нетика зм!-нювання е iдносно i площ! м!кроскоп1чного зобрахення бластоме-р!в ембр1она ксзп в

0,078М-ному розчшп NaOl (A) i в О.ЗМ -ному водному розчин! дасо (Б).

£ - зшшвання площ1 бластомера; б - smí-нзовання плод! бластомера з пухирем.

Зроствння об1 ему пухир!в п!сля припияення набухання цитоматриксу виявляе виразну залегал сть В1Д присутност! у позакл1 тинному середовйщ! непроникавчого кошонента. Так, у розчшах ДМСО, як i не шстять сол! (як i30T0Hi4Hiix, так i ппертошчних концентращй) pícT мембранних пухирш продов-нувався, поки не затримувався zona pellucida, шсля чого nyxirpi або проростали кр1зь дефекты у СлискучШ оболониi

(мал.Ю )

(¡зотоШя), або зшжали, що, мабуть, пов'язано з íx розривом (гшертошя). У той ке час у розчинах ДМСО з гшертон!чною концентрат ею Nací (двохнратне розбавлення ¡зотошчного роз-чину Naüi) та у розчинах сол1 з концентращею 0.078М зб1ль-шення об <ему мембранних пухир!в було мена значним, i вони не досягали мея1 zona pellucida.

йвертае на себе увагу той факт, цо яйцеюиткни на в1д-мшу В1Д ембрюшв не утворювали пухкр1В нав1ть при значному набуханш. •

теля утворення мембранних пухщнв цитоматрикс не т!ль-ки пришшяв набухания, але шод! й виразно стискувався.

Набухания ембрюшв у розчинах 0.078М NaCl та 0.32М ЛГЛСО ПОЧИНЭЛОСЯ з приблизно однохвилинною затримкою, яку мокна пояснити як опором цитоматрикса набуханию, так й особ-лсвостями методики. В свою чергу, затримка мала м!сце у цнх розчинах такой мш моментом пршзинення набухания цитоматрикса та моментом появи мембранних nyxnpiB (мал.Ю), що поясни-ти шакше, шя ошром цитоматрикса набуханию, немоаливо.

Таким чином, результата описан о i сер i i дослшв показали, що цитоматрикс клшши веде себе як осмотично активна фаза, яка спрокожна чшшти ошр силам розтягнення, a nyxiipi з моменту íx появи беруть на сеое регуляцш kjiiтинного об'е-му.

ВИСНОВКИ.

I. Набухания е утверсалыюю неспециф1чною реакц)ею зил тин не т!льки на гшотошю, в тому числ1 й гшотонш, яка викликана проникненням крЮпротектора до юптини з ппото-HiHHoro по непроникаючому компоненту розчину, але й реакцisa на пошкодження, яке викликане заморояуванням-вгдтаванням або експозишею у гшертошчШх розчинах кр1опротектор1В та со-

лей.

2. Шд час екогозицП у гшертошчних розчинах, осмо-тичний тиск яких перевищуе критичний р!вень, набухания почи-наеться тим ранте, чем СНльше це перевшцення; шд час повинного заморокування набуханию майке заващи передуе дег!д-ратащя клгтин з втратою останшми в1д 40% до 70% води.

3. Альтернативою зростанню об’ему цитоматрикоа шд час набухания може бути поява на поверхш юл тин мембранних пу-хир!в, як! продовжують осмотнчну реакшю кл1тин (цитоматрикс при цьому припиняе набухания та кош нав1ть стискуватися); повед!нка цитоматер1ала св1дчить про те, що вш веде себе як фаза, яка В1др1зняеться по його ф1зико-хш1чним властивостям В1д оточуючого клЛини розчину I, зокрема, яка мае обмекеш можливост1 до розтягування.

4. Чисельне моделювання осмотично! повед!нки юл тин на еташ ¿зотершчног експозиц; I в гшертошчних розчинах показало, що так званий "м1н!мальний об'ем " достатньо адекватно описуеться без залучення допущень щодо мехашчного опору кл1тин стисненню за допомогою р!внянь ыасопереносу термоди-нашки необоротних процес!в у перервних системах.

5. Кл1тини, як1 збер1гали св1й об'ем внаслиок швидкого заморокування, незалезхно в!д того, показують вони чи н! оз-наки внутр1оньокл1т1шно1 кристал 1зацп, збезводнаються в раз1 пов1льного вшгр^ву до значень ой'ешв, ЯК1 е харак-терними для пов1лыюго замороазлвання; така деПдраташя стае можливою завдяки тому, цо внутрхшньоюпташи кристали льоду таить ранШе, Шк позакл1тинн1.

6. Позаклгакше переохолодкення Беде до зсуву процоса збезводнзовання кл1тин шд час заморокування в зону б!льш низьких субнульових температур та знккуе свидкють gz.qx.oa-

пснш, при як!й в^дбуваеться впутрiшньоглiтинэа кристал 1за-ц!я; шгутр1шньо1Слгпшно шрэохододгюшш в раз i охолодкекня з пост!йеою пвидк 1 стю зростаз монотонно Пльки при великих швпякостях охолодгзянл у B№yTH0CTi сугтево! дег!дратацп кл1тпн; в irnax вяггадках за стадtею зростання яереохолодаен-пя на поча-гкогшу STani кристал шац i i сд1дув стад1Я його вирззного ЗШИЗЗННЯ.

7. Зрост акня ’Д1льност1 кликн у суспекзП веда до зни-взная ступзня 1х збезводкешш, ризпя впу тр!шньокл 1 тенно! косцонтрэцп олоктрол^у на этап i гзотерр.пчжп експозицп кл1тт в гшзргоШташу 1ф1озахисному серэдовизп; на этапг кристал i зац i J змШа цього парекзтру на к!нотику масопзрэносу бззпосерздньо не вплквае.

8. Перех!д ердтроцкт!в з дукз збезводнекого стану в горз дгемолi тичну фор?,^ у кокцзнтрозаких розницах Nací з!дбу-зазться не гкшльно, а дрока розд1дзтжп у час1 стрибкоми.

9. Пвроваккою порвдгешл I точною формою эритроципв, як1 набухають у бэзсольових розчкнах глщерина s набухлий стогла-тоцит. Процес його гекол!зу, який спостер!гаеться методом фазово-контрастно! шкроскопИ. мостить у соб1 дв! стадП: ”потеи1ення" кл!ткн, яке в!дбуваеться у середньоку за 3 с та íeoaí супроводкуеться змццзнням EuiiTini у горизонтальному напрям!, й сл iщюче за ним знебарвленкя, ятцдк!сть якого тем иенша, чем вице концентрата крюпротектора у позаюи тинному сэредовнщ; коли концентратя кр!опрот^"-ра зб1льшуеться В1Д О до 6Ы, час знебарвлення зростаз приблизио у 6 раз!в.

10. Час повного геьюл!зу еритрошшв, як! набухають у концентрованих водних розчинах глШерина внасл1Док його про-никнення до кл1тш, в десятки раз!в перевадуе час початку гемол!за в суспензп кл!тш; час 50%-ного геькшзу еритроци-

Т1В у розчинах глЩерина, 1,2-ПД та ДМСО зростае з шдвшцен-ням концентраци крюпротектора та зниженням температури. Перевшения концентратею крюпротектора певного критичного ршня (30-4056) веде до зниження часу 50$-ного гемол1зу при зниженшх температурах (5-15°С).

II. 3 залученням одержавдх даних пооудовано Ппотетичну схему розвитку крюпошкодження кл1ткн шд час заморожування-в1дтаювання з вказ1вкою можливих засоб1В щодо Их крюзахисту на деяких етапах кр1оконсервування.

Розанов Л.Ф. "Кинетика реакций клеток на действие факторов криоконсервирования". Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.22 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомвдицины Национальной Академии Наук Украины, Харьков, 1995.

Изучены закономерности явления набухания клеток разного типа с поврежденной и интактной мембраной в процессе замора-швания клеточной суспензии и экспозиции клеток в средах различного состава. Получены экспериментальные и теоретические данные, не согласующиеся с классическими представлениями о механизмах и закономерностях криоповреядения клеточных структур и свидетельствующие о том, что для их объяснения, анализа и трактовки необходимо привлекать не только положения мембранной теории проницаемости, но и положения фазовой теории строения клеток. Получены данные о динамике цредгемо-литических трансформаций и кинетике гемолиза эритроцитов в гипертонических растворах криопротекторов и солей. Получены данные о зависимости кристаллизации в клеточных суспензиях от начального переохлаждения внеклеточного раствора и режима

схема развития криопозрездэнкя клеток прл зазлорзгагвянпи --отштяаияи и указана возкогдют способа пх краозациты. Г/это-дом чяслотяюго глодэл:гровпиия получош поста дгапшэ о процессах гдассопоропоса :.:озду юигаккпг п скру-'л^эй их срэдоя на различных этттах ¡г;акото:яюратурюго копсэрхзпровппия, на осногэ когорих ифор.!ушрсвшш рокогзнцацш! по ОПТЕКЛЗаЦИИ катодов врпсконсорвхфоваш’я.

Rozanov Ь.?. Kinetics of oeil гсорспзез to influence of cryopreservation üaoior-в. ”si!U3ori?t. The dissertation Гог decree of doc Lor of biological science by speciality 03.00.22 -oi’yobiology, Institute for problems of Cryobiology and Cryomsdicine of national Ukrainian Aoadcmy of Science, Kharkov, 1935.

- Port tarts of availing р1шпож:поп of various type cells with damaging and intact placrna шожЪгалз during freezing of cell suspensions and exposing of cells in solutions of various composition have been investigated. Experimental and theoretical data vrhioh are not agreed with conventional hypothesises on the ceohsaiitiaa and parttena of cellular compounds cryodEaagea have bean obtained. These data confira that not only principles of membrane pameability theory, but the principles of phase theory of cell organization must be used to explsne, analyaa and intnrpritate our observations. The zi'i:t data dealing îîith dyrmru.es of preceding to hyr-olyais transforaationa and kinetics of erythrocyte hyir.o-lyaia in the hypertonic solutions of oryoproteotants and aalto have been reosived. The data concerning the dependence of oryatall ization in cell suspension iron initial supercooling of extracellular solution and regins of oryopreser-vation have been, obtained.

Using the obtained data the development scheme of cell cryodamages during freezing-thawing lias been, drawn up and possible paths of oell defend have been pointed up. By the method of numerical modelling the new data oonoeming the processes of mass transport between the cell and its surrounding medium during the various steps of low temperature ory°preservation. oyole have been obtained. On the basis of these data the recomendations on optimisation of oryopreser-vation methods have been formulated.

Список poOiT, опубл1кованих по tsmi дасертаци

1.Пушкарь H.C., Белоус A.M., Вияневский В.И., Итгаш D.A., Розанов Л.Ф. Низкотемпературная кристаллизация в биологических системах./ Киев: Паукова Думка, 1977. - 242 с.

2. Белоус А.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Бжшшия мембран: Замораяивание и криопротекция./ Москва: Высшая школа, 1987.-76с.

3. Пушкарь Н.С., Бронштейн В.Л., Розанов Л.Ф. Механизм обезвоживания заморокенных клеток при отогреве // Доклады АН СССР.- 1976.-т.230, ГГ I - С.217-219.

4. Розанов Л.Ф. {Микроскопическое исследование процессов замораживания и отогрева клеточных суспензий.// Проблемы гематологии и переливания крови . -1977.-II 2.-С.22-27.

5. Бронштейн В.Л., Розанов Л.Ф. Начальное переохлаждение как фактор повреждения при заморааивании клеточных суспензий // Криобиология и криомедицина.-I977.-н 3.- С.26 -29.

6. Гордивнко Е.А., Каков Г.С., Розанов Л.О. Обезвоживание и некоторые механизма крпоповрездения клеток при низкотемпературном консервировании суспензий// Криобиология и криомвдицина -1977. - КЗ,- С.29-34.

крномодлдша -1977. - Т. 3.- С.29-34.

7. Ктккн 10.А., Вроютэйн В.Л., Розанов Л.Ф. Изучение влияния структуры льда па процесс обезволтапия и Енутрякдэ-точиуп кристаллизацию// Криобиология и кркомедкцина.- 1977. -N 3.- С.35-41.

8. Новиков A.H., Кулешова Л.Г., Розанов Л.Ф. Моделирование процесса щутрнхлеточяой крпсталлиации // Биофизика.-1980.-Т.25, И 1.- С.129-133.

9. Кулеяова Л.Г., Розанов Л.Ф., Яобасэнко H.II. Мякрос-кошявскод изучоккз кинетики изменения обьема клеток в гипертонически средах// Пробдокн гематологии и переливания крови.- 1980.- И 4.- 0. 32-35.

10. Кулеяова Л.Г., Розанов Л.Ф. Кзучошю кинетики взаимодействия эритроцитов человека с г-сряопротекторами и солями// Криобиология а нршмздицина.- 1930.- И 7.- С. 40-44.

11. Кулешова Л.Г., Гордкенко Е.д., Розанов Л.Ф. Реакция клеток на гипертоннческпе воздействия при криопротекции// Биофизика.-I982.-Т.27,н 4.-0.660-664.

12. Пушкарь К.С., Гордиенко Е.А., Гордиешсо О.И., Кулешова Л.Г., Розанов Л.Ф. Физико-химические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий// Криобиология.-1985.-N I.-0.23-29.

13. Некоз Й.А., Розанов Л.Ф., Пнчугнн Ю.И. Влияние хлорида натрия на физико-хкгическио свойства растворов 11Э0-1500//' Криобиология.-1989.-к 2.- С.24-27.

14. Розанов Л.Ф., Розанова Е.Д.» Некоз И.А. Кинетика взаимодействия зритоцитов человека с растворами глицерина и I,2-пропаидиола// Криобиология,-1389.-й 4,- С.30-34.

15. Розанов Д.Ф., Розанова Е.Д. Оценка внутриклеточной концентрации глицерзиа в эритроцитах человека методом пер-

турбационной дифференциальной спектрофотомзтрии //' Проблемы криобиологии.-1992.-N 2.- C.55-S7. '

16. Розанов Л.Ф., Смольянинова Е.И. Осмотическое пове- ' дение яйцеклеток и,эмбрионов мыши. Роль цитоскелета// Проблемы криобиологии.-1992.-N 4 -.С.26-32.

17. Гордиенко Е.А., КоваленкЬ И.Ф., Розанов Л.Ф., Смо-

льянинова Е.И. Влияние- концентрации хлористого натрия на проницаемость мембран яйцеклеток и эмбрионов мыши для молекул вода// Проблемы Криобиологии.-I993.-N 4.- С. 25-28. .

18. Гордиеко Е.А., Гордиенко О.И., Коваленко И.Ф., Розанов Л.Ф. Экспериментальное изучение кинетики гипотонического и кислотного гемолиза эритроцитов человека методом малоуглового рассеяния// Проблемы криобиологии.- I994.-N I.-С.32-39.

19. Розанов Л.Ф., Розанова Е.Д. Гемолиз эритроцитов человека в растворах глицерина и I,2-пропандиола при температурах 8 - 37°С// Проблемы криобиологии.-1994.- М2.- С.3-7.

20. Розанов Л.Ф., Смольянинова Е.И., Гордиенко О.И. К вопросу о роли мембраны и цитоматрикса в развитиии криопов-ревдения клеток// Проблемы криобиологин.-1994.-Ш.-С.12-18.

21. Розанов Л.Ф., Гордиенко Е.А., Кулеаова Л.Г. Неспе-цкфнческие реакции клеток на физико-химические факторы криоконсервирования// В сб.: Биохимические аспекты криоповрекде-ния и криозаадаты клеточных систем.- Харьков, 1989.-С.48-52.

22. Некоз И.А., Гордиенко Е.А., Кулешова Л.Г., Розанов Л.Ф. Особенности гемолиза эритроцитов в водных растворах глицерина// В сб.: Криоконсервирование клеток и тканей.-Харьков, 1989. - С.54-61.

23. Гордиенко Е.А., Гордиенко О.И., Розанов Л.Ф. Пассивная утечка ионов калия из эритроцитов в средах, содержа-

¡цах глицерин и [,Я-пропандилл// В сб.: Физико-химическиз свойства п бтагопэтескоо дойстгаю хфгюпротектороЕ. - Харьков, 1990,- С.33-35.

24. Розанов Л.Ф., Розанова Е.Д. Взаимодействие эритроцитов человека о раствораш дамексида яра температурах 5 -3?°С// В сб.: tfiisitKo-ximiwecKKQ свойства и биологическое действие криопротекторов.- Харьков, 1990.- С. 140-144.

25. Розанов Л.Ф., Гордиенко Е.А., Гордиенко О.И., Кулешова Л.Г., Смольянинова E.if. Фазовая теория строения клеток кпк основа для новой концепции криоповреждения и криозащиты клеточных структур// В сб.: Физико-химические процессы в криобиологических системах.- Харьков, 1991.- С. 134-140.

26. Goi’dienko Е.А., Kovalenko I.P., Rosanov L.F., Sno-lyaninova Б.I. Physiao-matheraatioal analysis and experimental oonforiaation of hypotonia lysis oell meohaniem// Cryobiology.- v.30, И S.- 1993.- P.620-621.

Юшчов1 слова: чисельнв моделювання, первохолодження, заморэиувзкпя, осмоти'пп реакцп, кшетика гемол!зу, набу-хшшя, клтгана суспенз1я.

В iffioEt дальний за випуск академик НАН Укра^нк В Л. Грищенко

Птдписано до друку 26.12.95 р. Об’ем фгз.п.л. 2,2, умов.л. 2,2. Замовленкя Р 48, тираж 100 прим.

Ротапринт ФТ1НТ НАН Украгни, Харк1В-164, пр. Лентна, 47