Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кинетика первичных процессов бактериального фотосинтеза
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетика первичных процессов бактериального фотосинтеза"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

УДК 577.345: 577.355: 577.377

ГОДИК ВАЛЕНТИНА ИВАНОВНА КИНЕТИКА ПЕРВИЧНЫХ ПРОЦЕССОВ'БАКТЕРИАЛЬНОГО «0Т0СИНТЕЗА

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соисхание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва - 1989

Работа выполнена в Межфакультетской проблемной НИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н.Белозерского МГУ им. .И.Б. Ломоносова

Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук Ю.В.Морозов Доктор биологических наук В.А.Шувалов

Доктор физико-математических наук А.П.Лосев

В е д у щ а я организация: Институт спектроскопии АН СССР

Защита состоится _" _ 1989 гола в_ часов

на заседании Специализированного Совета Д.053.05.53 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ

Автореферат разослан "_" _1989 года

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

1 Т/Е.КРЕНДЕЛЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Фотосинтез - важнейший природный процесс. лежащий в основе жизни на Земле, изначальный источник энергии в биосфере. Уникальность этого процесса обусловлена прежде всего его первичными стадиями, в ходе которых энергия солнечного излучения с высокой эффективностью преобразуется в более стабильные, биологически приемлемее формы энергии. Среди разнообразного мира живой природы только фотосинтезирующие организма - растения, водоросли, зеленые и пурпурные бактерии - имеют специальный аппарат для такого преобразования. Прочие организма поддерживают свою жизнедеятельность, используя - прямо или косвенно - солнечную энергию, запасенную ранее при фотосинтезе. Выяснение физико-химических закономерностей первичных процессов фотосинтеза, помимо важного фундаментального значения, представляет интерес в прикладном аспекте, открывая возожность управления этим жизненно важным процессом, создает основы повышения урожайности сельскохозяйственных культур. Не меньшее значение имеет и моделирование первичных стадий фотосинтеза, которое закладывает основы для создания экологически чистых источников энергии, быстродействующих запоминающих устройств и различных биотехнологических процессов, предназначенных для синтеза ценных органических веществ. Воника-ющая при этом главная проблема состоит в том, чтобы выяснить основные особенности структурной организации фотосинтетического аппарата и физических механизмов процессов, благодаря которым достигается высокоэффективное преобразование короткоживущей энергии фотоиндуцироваиных электронных возбужденных состояний в миллионы раз более стабильную энергию разделенных зарядов. Достигнутые в последние годы успехи поставили данную область исследований в ряд наиболее продвинутых разделов молекулярной биологии и биофизики. Среди выдающихся достижений следует упомянуть о выделении из Фотосинтетических мембран и кристаллизации препаратов реакционных центров (РЦ), (Reed, Clayton, 1968; Clayton, Wang, 1973; Michel et al., 1983). Рентгеноструктурные исследования одиночных кристаллов РЦ (Deisenhofer et al., 1934; Michel et al., 1986) позволяли выяснить детали пространственной организации пигмент-белкового комплекса (ПБК) рц, включая ближайшее водно-белковое окружение молекул - партнеров первичного разделения зарядов. Однако, очевидно, что даже детальное знание структуры система недостаточно для выяснения механизмов ее функционирования. Весьма информативны!« в

этом отношении являются спектральные методы высокого временного разрешения (Борисов. 1986). Эти методы давно и успешно используются при изучении механизмов фотосинтеза в ряде лабораторий у нас в стране.(Ахманова, Борисова. Гуриновича, Красновского, Литвина, Иатвееца, Масловаг Пискарскаса, Ребане, Рубина, Пащенко, Фрей-берга, Чибисова, Шувалова и др.) и за рубежом (Duysens, Clayton, Parson, Zankel, Lavorel, Moya., Dutton, Rentzepis, Ke, Hoff, Windsor, Holzwarth, Sundstroo, Grondelle).

Характер протекания первичных процессов у разных фотосинте-зирующих организмов имеет свои специфические особенности, однако главные его закономерности весьма сходны (Шувалов, Красновский, 1983; Рубин и др., 1987). Универсальным является построение фотосинтетического аппарата из пигмент-белковых комплексов светосо-бирающей антенны (ССА) и реакционных центров. Функция первых состоит в поглощении квантов света и передаче энергии электронных возбужденных состояний на РЦ, где происходит преобразование энергии этих состояний в энергию разделенных зарядов. Сходство в организации первичных процессов у разных представителей мира фотосинтеза, определяемое общностью их главной функции - эффективного преобразования энергии света в энергию разделенных зарядов -- делает оправданным использование для выяснения фундаментальных закономерностей трансформации энергии наиболее просто организованных объектов, каковыми являются пурпурные бактерии. Первичные процессы бактериального фотосинтеза включают в себя : (1) поглощение света молекулами бактериохлорофилла (БХЛ); (2) миграцию энергии электронных возбужденных состояний между пигментами ССА; (3) перенос энергии от пигментов ССА на РЦ; (4) преобразование энергии электронных возбужденных состояний в энергию зарядов разноименного знака, разнесенных поперек сопрягающей внутриклеточной мембраны.

К началу выполнения данной работы (1970 г.) целый ряд важных деталей в механизмах протекания стадий (2)-(4) не был ясен. Спорным был вопрос об участии триплетных состояний пигментов в первичных процессах фотосинтеза. Относительно механизма разделения зарядов в РЦ общепринятым было представление, экспериментально обоснованное Красновским (1948 г.), согласно которому этот процесс пред-стазляет собой фотохимическую окислительно-восстановительную реакцию. Предполагалось, что первичным донором электрона в этом процессе является специальная пара БХЛ РЦ, Р870, а первичным акцептором - молекула убихинона Qa (Clayton, Straley, 1970; Slooten,

1972; Cogdell et al., 1974). В растворах реакции такого рода протекают обычно через триплетное состояние пигментов (Чибисов, 1981) и отличаются невысоким квантовым выходом. В тех случаях, когда такие реакции протекают через синглетное возбужденное состояиие, квантовый выход может достигать высоких значений, однако, образующиеся продукты нестабильны, рекомбинируя за десятки пикосе-кунд (Holten et al., 1976). Представлялось важным выяснить, какие особенности протекания первичного разделения зарядов в фотосинтетических РЦ обеспечивают квантовый выход этого процесса, не достижкмлй в растворах. Существовал и ряд вопросов принципиальной важности касательно механизмов стадий (2) и (3). Так, данные о путях, скоростях и механизмах гетерогенной миграции энергии в ССА пурпурных бактерий носили косвенный характер и были противоречивы. Не было полной ясности в вопросе о том, какие состояния молекул БХЛ ССА участвуют в переносе энергии к РЦ, каковы скорости и механизма этого переноса. Важность перечисленных проблем для построения единой картины первичных процессов фотосинтеза и для выяснения общих закономерностей превращения энергии света в электрохимическую форму и определила задачи настоящей работы.

Цели и задачи исследований. Целью работы явилось выяснение принципов структурной и функциональной организации фотосинтетического аппарата пурпурных бактерий, которые определяют высокую эффективность преобразования энергии света, а также физических механизмов последовательных стадий этого преобразования. В работе поставлены следующие конкретные задачи:

выяснить природу состояний, посредством которых осуществляется перенос энергии от ССА к РЦ;

изучить кинетические закономерности переноса энергии от пигментов ССА к РЦ, выяснить его механизмы и определить эффективность;

исследовать пикосекундную динамику электронных возбужденных состояний в спектрально гетерогенных ССА пурпурных бактерий, выяснить на этой основе топологию взаимного расположения различных ПБК в t.iei.iSpanax ;

определить кинетические и энергетические характеристики промежуточных стадий в разделении зарядов в РЦ;

изучить роль пигмент-белковых взаимодействий в ходе первичного процесса преобразования энергии на ранних наносекундных и пикосекундных стадиях;

воспроизвести в искусственной системе основное свойство фо-

тосинтетической CCA - малую скорость безызлучательных потерь при высокой локальной концентрации пигмента.

Научная новизна полученных результатов заключается в установлении ряда фундаментальных закономерностей преобразования энергии света в ходе первичных процессов бактериального фотосинтеза:

- Обнаружена кинетическая неоднородность флуоресценции пурпурных бактерий, обусловленная спектральной и структурной неоднородностью фотосинтетического аппарата, а также наличием в ней компонентов разной природы: гшкосекундной "фотосинтетической" флуоресценции; "фоновой" флуоресценции пигментов, не включенных в систему миграции энергии к РЦ; наносекундной рекомбинационной люминесценции, источником которой являются РЦ с нарушенным переносом электрона на начальном участке фотосиктетической электрон-транспортной цепи.

- В прямом опыте показано, что пикосекундная флуоресценция и фотохимический захват синглетных возбужденных состояний БХЛ ССА реакционными центрами являются конкурирующими процессами. Данный факт непосредственно свидетельствует, что перенос энергии к РЦ в бактериальном фотосинтезе происходит посредством синглетных возбужденных состояний БХЛ.

- Обнаружено, что закрытые РЦ тушат синглетные возбужденные состояния БХЛ ССА за пикосекундные времена, благодаря чему обеспечивается фотохимическая стабильность фотосинтетического аппарата.

- Изучение пространственной, временной и энергетической организации процессов миграции энергии в спектрально гетерогенных

ССА пурпурных бактерий показало, что в них реализуется пикосе-кундный направленный от периферии фотосинтетической единицы (ФСЕ) к РЦ перенос энергии возбуждений. Важная роль в создании направленности переноса принадлежит выявленной методом флуоресцентной спектрохронографии спектральной неоднородности длинноволновых околоцентровых форм БХЛ. В результате, время и эффективность первичного разделения зарядов в изученных системах практически не зависят от размеров ФСЕ.

- Необходимом фактором достижения высокого С 98%) квантового выхода разделения зарядов в фотосинтетических РЦ является включение в этот процесс промежуточных пикосекундных состояний, в которые вовлечены молекулы порфириновой природы, входящие в состав РЦ. Одним из проявлений существования таких состояний является наносекундкая люминесценция, которая возникает при рекомбинации промежуточных продуктов в условиях, когда перенос электрона

из порфиринового комплекса РЦ на хинонные акцепторы ингибирован.

- Стабилизация продуктов первичного разделения зарядов на пи-ко-, наносекундных временах осуществляется при участии протонов водно-белковых водородных связей и связанной белком воды.

- Генерируемый в результате работы фотосинтетической цепи переноса электрона мембранный потенциал является первичным регуля-торным механизмом фотосинтеза, повышая вероятность рекомбинации промежуточных короткоживущих продуктов разделения зарядов в РЦ.

Научно-практическая значимость работы состоит, прежде всего, в установлении фундаментальных закономерностей, лежащих в основе организации в пространстве и во времени системы высокоэффективного светосбора от сотен молекул БХЛ на РЦ и последующего преобразования энергии синглетных возбужденных состояний в энергию разделенных зарядов. Выявленные закономерности могут послужить основой для создания искусственных систем, эффективно преобразующих энергию света в электрохимическую форму, для практических разработок в области молекулярной биоэлектроники. Обнаруженные особенности организации спектрально гетерогенных ССА могут быть использованы для создания светособирающих систем, которые поглощали бы свет в широком спектральном диапазоне, перекрывающем практически весь диапазон солнечного излучения, и эффективно передавали поглощенную энергию на центры ее преобразования.

Разработанный метод "временного рычага" используется для изучения быстрозатухающих двухкомпонентных свечений методом фазовой флуорометрии. Исследование наносекундной рекомбинаци-онной люминесценции используется для характеристики функционального состояния РЦ и начального участка цепи электронного транспорта у фотосинтетических бактерий, для изучения влияния на эффективность фотосинтеза таких факторов среды как температура, влажность, химические соединения типа гербицидов и т.д. .

Апробапия работы. Основные результаты диссертации докладывались на 1 Всесоюзном симпозиуме "Проблемы биофотохимии" (г.Москва, 1070 г.), на 2, 5, 6 и 7 Международных конгрессах по фотос-интепу (г.Стресса, 1971 г.; г.Халкидики, 1980 г.; г.Брюссель, 1983 г.; г.Провиденс, 1986 г.), на 20, 21 и 26 Всесоюзных совещаниях по люминесценции (г.Сухуми, 1971 г.; г.Киев, 1975 г.; г.Самарканд, 1979 г.), на Всесоюзной конференции "Молекулярные механизм.! трансформации световой энергии при фотосинтезе" (г.Москва, 1976 г.), на Всесоюзном семинаре по биофотонике (г.Пущино,

1977 r.)i на Всесоюзной конференции "Быстропротехающие процессы преобразования световой энергии при фотосинтезе" (г.Москва, 1979 г.), на 4 и 5 Международных семинарах по переносу энергии в конденсированных системах (г.Прага, 1981 г. и 1985 г.), на 19-ом координационном совещании специалистов стран-членов СЭВ "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата" (г.Пущино, 1981 г.), на Всесоюзном семинаре "Механизмы превращения энергии при фотосинтезе" (г.Москва, 1982 г.), на 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (г.Москва, 1982 г.), на Всесоюзной конференции по возобновляемым источникам энергии (г.Ереван, 1985 г.), на 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (г.Киев, 1985 г.), на 1-ом Европейском конгрессе по фотобиологии (г.Гренобль, 1986 г.), на 4-ой Всесоюзной школе "Применение лазеров в биологии" (г.Кишинев, 1986 г.), на 2-ой Всесоюзной конференции "Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии" (г.Ленинград, 1987 г.), на Всесоюзной конференции "Физико-химическая биология и биотехнология фототрофных микроорганизмов" (г.Москва, 1987 г.), на Международном симпозиуме "Спектроскопия сверхбыстрых явлений" (г.Вильнюс, 1987 г.), на Рабочем семинаре "Лазерная спектроскопия сложных молекул" (г.Таллин, 1988 г.), а также на научных семинарах Лаборатории им. А.Н.Белозерского МГУ, хафедр биофизики физического и биологического факультетов МГУ.

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 37 статьях, двух обзорах, а также тезисах перечисленных выше конференций .

Структура и рфьем работы. Диссертация включает введение, изложение методов исследований, изложение экспериментальных результатов, занимающее 7 глав, заключение и выводы. Она изложена на страницах машинописного текста, содержит 59 рисунков и библиографический список цитируемой литературы, включающий наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глаза 1. Методы и объекты исследований

Решение задач, поставленных в настоящей работе, было связано с необходимостью применения целого ряда оптических методов и, в первую очередь, кинетической флуоресцентной спектроскопии высокого временного разрешения. Кинетика затухания флуоресценции

песет информацию о балансе между различными каналами релаксации первого синглетного возбужденного состояния молекул. Поскольку скорость и эффективность первичных процессов бактериального фотосинте-теза высоки, особые требования предъявляются как к чувствительности, так и к временному разрешению соответствующих приборов. Вполь до середины 70-х годов необходимом требованиям удовлетворяли лишь фазовые флуорометры (Лаковитц, 1986). В разделе 'Фазово-модуляцион-ный метод измерения времен жизни Флуоресценции* рассмотрены основы метода, обоснованы соотношения между величиной фазового сдвига гармонически модулированного возбуждающего света и излучения флуоресценции, а также f.fexay коэффициентом демодуляции излучения и длительностью пребывания молекул в первом синглетном возбужденном состоянии. Рассмотрены факторы, ограничивающие временное разрешение и чувствительность метода, установлены границы его применимости. Далее, в разделе "Метод временного рычага Фазовой йлуорометрии' описан оригинальный способ измерения параметров многокомюнентных свечений с помощью фазового флуорометра с одной частотой модуляции. Метод используется в тех случаях, когда необходимо определить время жизни короткоживущего вариабельного компонента свечения (его время жизни т1 может быть короче временного разрешения используемого прибора) при условии, что время жизни второго долгохивущего компонента тг остается неизменным. При этом небольшие изменения т1 в пикосехундном диапазоне приводят к значительным изменениям измеряемой величины времени жизни т в наносекундном диапазоне (Borisov, Godik, 1972). В общем случае справедливо выражение: дт = — Ату т . Изложенный метод был использован в данной работе для изучения пикосекунд-ной флуоресценции пурпурных бактерий. Начиная с 1983 года, сходный метод используется французским! исследователям! (Sebban, Hoya, 1983; Sebban et.al., 1984, 1985).

В разделе 'Конструкция Фазового Флуорометра* описаны принципиальные особенности использованной установки и ее основные параметры: частота модуляции возбуждающего света - 12,3 МГц, спектральный диапазон регистрации - видимая и ближняя инфракрасная область, временное разрешение - 30 пс, чувствительность - 10 фотонов/см2, пороговое значение времени жизни для пурпурных бактерий, флуоресцирующих в диапазоне около 900 нм с квантовым выходом менее 1%, - 100 пс.

Несмотря на относительно высохое временное разрешение фазового флуорометра, надежность и простоту его эксплуатации, однозначные данные могут быть получены с его помощью только при изу-

чении экспоненциально затухающих свечений. В связи с этим часть экспериментов по прямой регистрации кинетики затухания флуоресценции в пикосекундном диапазоне была проведена совместно с лабораторией пикосекундной спектроскопии Института физики АН ЭССР (К.К.Ребане, А.М.Фрейберг, К.Э.Тмжшанн). В разделе ЧСинетичес-кая Флуоресцентная спектроскопия пикосекундного временного разрешения* изложены основы метода ижульсной флуорометрии. Проведено сравнение приборов, работающих с высокой и низкой частотой повторения возбуждающих ишульсов. Отмечено, что первые более предпочтительны для фотосинтетических исследований, поскольку позволяют значительно снизить плотность возбуждающего света и тем самым избежать искажающего влияния нелинейных процессов. В разделе "Комплекс пикосркундного спектрохронограФа* приведено описание им1ульсиого флуорометра, использующего квазииепрерыаное возбуждение от синхронно накачиваемых лазеров на красителях и систему регистрации на основе электронно-оптической камеры (ЗОЮ, работающей в режиме непрерывной гармонической развертки, синхронизованной с импульсами лазера. Источником возбуждающих мпуль-сов является лазер фирм! 'Spectra-Physics* на красителе оксазин--1 (-750), обеспечивающий частоту повторения млульсов 82 МГц, длительность одиночного импульса 3 пе, среднюю мощность - до 300 |£т. Лазер на красителе синхронно накачивается Кг*-ионным лазером с активной синхронизацией мод оптико-акустическим модулятором. Флуоресценция регистрируется через моиохроматор с помощью проявленной ЭОК типа УНИ-93М. ЭОК сопряжена с блоком синхронной развертки, что позволяет регистрировать и накапливать свечения, возбуждаемые каждым лазерным имдельсом. Свечение экрана ЭОК регистрируется суперкрежиконом SIT-500, сопряженном с оптическим мюгоканальным анализатором 0SA500 и ЭВМ типа ЕС-1010. Это позволяет автоматизировать процессы регистрации и обработки данных. Основные параметры прибора: спектральная область регистрации 350- 1100 им; спектральная область возбуждения - 685-850 нм (340-420 „ нм при использовании второй гармоники); спектральное разрешение -- 7 см"'; яярюы аппаратной функции по полувысоте - 10-15 пс; временное разрешение - Э-5 пс; чувствительность - 10г-103 фотонов в секунду на элемент разрешения; дюшмческий диапазон - 3.103.

Для проведения необходимое исследований-потребовались объекты разной степени сложности: клеточные суспензии бактериальных культур, субклеточные оргаиеллы - хроыатофоры, сохраняющие в кнтактном виде весь фотосинтетический аппарат, изолированные

пигмент-белковые комплексы CCA и РЦ. В каждом конкретном случае предпочтение отдавалось наиболее интактным объектам.

Глава 7. Взаимосвязь Флуоресценции пурпурных бактерий и функционального состояния йютосинтетических РИ

Во вводной части данной главы кратко рассмотрены основные оптические и физико-химические свойства молекул хлорофилла, которые представляются существенными для реализации выполняемых ими в ходе фотосинтеза функций. Обсуждены существующие представления о механизмах миграции энергии в фотосинтетических системах и роли кинетических флуоресцентных исследований в изучении этих механизмов .

Целью работ автора, описанных в данной главе, было установление природы состояний, участвующих в переносе энергии от околоцентровой ССЛ к РЦ. Последний вопрос имеет ключевое значение, поскольку лишь при условии, что -этот перенос осуществляется по син-глетным уровням, кинетические флуоресцентные исследования несут непосредственную информацию о скоростях и механизмах изучаемых процессов. Представление о синглет-синглетном переносе энергии при фотосинтезе, широко принятое в литературе, вплоть до недавнего времени опиралось на косвенные данные об увеличении выхода флуоресценции фотосинтетических бактерий в ответ на переход РЦ в закрытое, фотохимически неактивное состояние (Vredenberg, Duysens, 1964; Clayton, 1966). При этом предполагалось, что параллельно с выходом ф увеличивается также и время жизни свечения т, что справедливо только если исследуемое свечение является кинетически гомогенным и может быть охарактеризовано одним значением времени жизни, связанным с выходом соотношением (Турро, 1967):

т = фто (2.1)

где т0 - радиационное время жизни, равное для БХЛ 12-18 не (Connoly, Jansen, 1982; Лосев и др., 1987). В случае ижогокомпонентного затухания соотношение (2.1) справедливо для отдельных компонентов, но не для суммарного свечения. Как всякие косвенные данные, данные стационарных флуоресцентных исследований не могли исключить возможность альтернативных механизмов: переноса энергии с участием триплетных уровней молекул БХЛ или диссоциированных носителей заряда (см. , -пример, Литвин, 1975; Борисов, Годик, 1975).

Нами установлено, что флуоресценции пурпурных бактерий, помимо кинетической неоднородности, обусловленной спектральной и структурной гетерогенностью ССА, свойственна неоднородность, связанная с

присутствием в ней компонентов разной физической природы: "быстрой" пикосекундной флуоресценции и замедленной наносекундной рекомбина-ционной люминесценции (рис.1). Источником последней являются РЦ с восстановленным первичным стабильным акцептором - феррохиноном qa. Как правило, вклад компонента наносекундной люминесценции в клеточных суспензиях, не отмытых от среды роста, составляет 1-2% по амплитуде. в некоторых случаях при переходе к насыщающему свету величина этого вклада несколько увеличивается из»за дополнительного фотохимического восстановления QA (рис.2). В суспензиях хроматофоров в отсутствие специальных редокс-добавок вклад наносекундного компонента составляет менее 0,1%. Этот факт является причиной того, что в импульсных пикосекундных измерениях наносекундные компоненты часто то не обнаруживаются (Campillo et al., 1977; Paschenko et al., 1977; Freiberg et al., 1984). Иное дело фазовые измерения, имеющие оптимальную чувствительность в наносекундной области: данные таблицы 1 показывают, что при вкладе наносекундного компонента всего 0,1% как сами величины времени жизни суммарного свечения, т , так и изменение т при закрытии РЦ определяются этим коиюнетом свечения.

Таблица 1.

Время жизни комплексного свечения, состоящего из быстрой флуоресценции и наносекундной рекомбинационной липмнесцен-

пии .пои измерении т тазов Вклад наносекундного компонента по амплитуде ни метелей Т , НС (слабый свет, РИ ОТКРЫТЫ) Т , НС (насыщающий свет, РН <Ьотоокислены)

1% 1,64 0,84

0,34 1,04 0,60

0,1% 0,60 0,45

0,05% 0,19 0,24

0,01% 0,09 0,21

Время жизни быстрой флуоресценции т^ взято равным 60 пс, а наносекундной люминесценции т} - 4 не. Вклад первого компонента при закрытии РЦ увеличивается в 3,5 раза, а второго - остается неизменным (см.текст)

п. г.* О

тг >1.5 1 /20

Рис. 1. а) кинетика затухания флуоресценции хроматофоров R.rubrum при средней плотности возбуждающего света с длиной волны 375 нм (1) 2,5-10"5Bt/cM* и (2) 2*10~3Bt/cU* ; б) тоже, что и 2(а), но в "присутствии дитионита натрия

-1-1-1-1-;-;-

D 2DD 4 DO t,nc

Рис. 2. Кинетика затухания флуоресценции интактных клеток

Rb.sphaeroides при 920 ны: (1) возбуждающий свет с длиной волны 385 нм интенсивностью 1= 101 * фотонов/см2- с; (2) то же, но I = 1016 фотонов/см2« с

Рассмотрение флуоресценции пурпурных бактерий как кинетически однородного свечения приводит к значительному завышению временной константы ее затухания, а также определяемых на этой основе параметров миграции энергии в околоцентровой антенне (Zankel, 1978; Holzwarth, 1988).

Далее на*м была изучена зависимость параметров пикосекундного компонента фотосинтетической флуоресценции от состояния РЦ. Измерения проводили как для препаратов хроматофоров, у которых вклад н&носекундного комтонента был пренебрежимо малым (рис.1а), так и для клеточных суспензий со значительным вкладом наносе-кундного компонента (рис.16, 2). Во веек случаях наблюдалось увеличение времени жизни пикосекундного компонента свечения в 3-4 раза при переходе РЦ в фотоокисленное состояние, причем сходные данные были получены как методом 'временного рычага" фазовой флуорометрии (Codik, Borisov, 1977, 1979; Годик, 1980), так и пикосекундной спектрохронографии (Codik et al., 1984; Freiberg et al., 1984; Borisov et al., 1985). Типичные данные по зависимости времени жизни пикосекундного компонента, его выхода и доли РЦ в фотоокисленном состоянии от интенсивности возбуждающего света приведены на рис.3 для наиболее просто организованного объекта - хроматофоров Rhodospirilium rubrun. имею-

Рис. 3. Выход флуоресценции (1) и ее время жизни (2) хроматофоров R.rubrum при 900 НМ как функция средней плотности возбуждающего света с длиной волны 375 нм, (3) -аналогичная зависимость для доли фото-окисленных РЦ, Р*/Р

щих лишь один тип ПБК. Из рисунка видно, что по мере того как РЦ переходят в закрытое фотоокисленное состояние, время жизни пикосекундной флуоресценции и ее выход увеличиваются параллельно друг другу в 3-4 раза; при этом время жизни составляет 60 10 пс при открытых и 200-250 пс при закрытых РЦ. К сходным выводам относительно величины времени жизни "фотосинтетической"

флуоресценции и ее зависимости от состояния РЦ пришли авторы работ (Пащенко и др., 1987; Васильев, Пащенко, 1987). Рассмотрение данных, приведенных на рис.3, в рамках простой кинетической модели свидетельствует о том, что основным каналом релаксации энергии синглетных возбужденных состояний БХЛ ССА, конкурирующим с их издучательной дезактивацией, является захват открытыми РЦ. При этом необходимо учитывать обнаруженный (Godik, Borisov, 1977) факт тушения синглетных возбужденных состояний БХЛ ССА закрытыми РЦ.

Скорость тушения возбуждений РЦ в разных состояниях (PIQ4, ~PlQk~, Р* IQ^ ), как и скорость дезактивации энергии синглетных возбуждений в ССА, лишенной РЦ, определяли на основании данных флуоресцентных измерений хроматофоров и ПБК Б880, которые получали из бактерий Rhodoapirillua rubrum (таблица 2).

Таблица 2.

Константа скорости тушения синглетных возбужденных состояний БХЛ ССА различными состояниями РЦ (К}), рассчитанная на основании измеренных значений времени жизни т и выхода флуоресценции g хроматофоров и ПБК ССА Б880 Rhodospirillura rubrua

Состояние ?Н т, пс ф, отн.ел.

?юд 60110 0,08 1,7.1010

P*IQA 230*20 0,3 4.10s

рвдА- 75?10 0,2 1,3.Ю10

(44-6 не)

Комплекс ССА 750+100 1,0 1,3.10s

Сходные данные получены нами и для хроматофоров Th.roseoper3icina

где помимо этого удалось измерить скорость тушения возбуждений БХЛ ССА РЦ в состоянии с восстановленным промежуточным акцептором I. Время жизни возбуждений при этом состоянии РЦ составляет 280±20 пс, а соответствующая макроскопическая константа тушения -- 3,5.109 с"1 . Итак, РЦ после перехода в закрытое состояние продолжают служить ловушками энергии синглетных возбужденных состояний БХЛ ССА. Биологическая целесообразность тушения закрытыми РЦ определяется тем, что лишь незначительно понижая квантовый выход захвата открытыми РЦ при интенсивностях света, близких к насыщающим, оно уменьшает выход долгоживущих весьма реакционно

способных триплеткых состояний BU ССА - потенциальных участников ряда фотодеструктивных реакций. Дальнейшее обеспечение фотохюмчесхой стабильности фотосннтетичесхого аппарата в условиях интенсивного освещения достигается посредством дезактивации триплетных состояний БХЛ за счет триплетно-триплетного переноса энергии на иизхолежащий уровень молекул каротинокдов, при-сутвувцих обычно во всех ПБК, эа исключением ПБК некоторых му-таиткых ятамюв (Xraanovskii, 1983). Обсуждено несколько феноменологических механизмов, которые могут быть ответственны эа туяение возбуждений закрытым! РЦ: (1) перенос возбуждения на фотоокисленный рц по резонансное механизму; (2) тушение за счет донорно-акцепторного взаимодействия полярных возбужденных состояний БХЛ ССА с ионными состояниями БХЛ РЦ; (3) существование околоцентрового пигментного комплекса с повышенной вероятностью безызлучательного тушения (Grondelle,Duysena, 1980). Последний механизм не получил экспериментального подтверждения. В зависимости от конкретного типа закрытого состояния РЦ оба из первых двух перечисленных механизмов могут давать тот или иной вклад .в наблюдаемое тушение.

Полученные данные о тушении синглетных возбуждений закрытыми РЦ позволили устранить противоречие с экспериментальными данными, в которое вступало широко принятое теоретическое описание ! переноса энергии к РЦ у пурпурных бактерий, известное под названием модели Вреденберга-Дайзенса. В рамках этой модели увеличение выхода (и времени жизни) фотосинтетичесхой флуоресценции при переходе от открытых РЦ (ц>°) к закрытым ) составляет: «р0/«р* - ( 1 - »»з ) (2.2)

В модифицированной нами, с.учетом тушащих свойств РЦ, модели это увеличение равняется:

¿/^Ji-JbZ&.Y;:!^ + К ')

{ V 3 Кг+К г) (2.3)

Выражение для зависимости выхода флуоресценции от доли РЦ в открытом состоянии при этом имеет следующий вид:

■г = «с0Г К£ + к, (1 -z pt/p„)+ zHi р[/р,1

L (2.4)

Здесь Кj - константа скорости тривиальных потерь энергии в ССА по излучательному и безызлучательному каналам; К}, - макроскопическая константа скорости и квантовый выход захвата энергии возбуждений открытыш РЦ, соответсвенио; К - константа .

тушения закрытыми РЦ; Р„ > pi " полная концентрация и концентрация закрытых РЦ i-того типа, соответственно.

Позднее выражения, сходные с (2.3) и (2.4), были получены в работах (Den Hollander eh al., 1983; Grondelle et al., 1985).

При регистрируемых в экспериментах значениях квантового выхода захвата, равных 0,9-0,95 (Loach, Secura. 1966; Борисов и др., 1974), увеличение выхода флуоресценции, согласно соотношению Вре-денберга-Дайзенса (2.2), должно составлять 10-20 раз, а согласно (2.3) и данным, приведенным в таблице 2, - 3-4 раза, что находится в хорошем соответствии с экспериментальны»« данными. В тех случаях, когда суммарный выход флуоресценции увеличивается значительно меньше, чем в 3-4 раза, имеет место нарушение нормального протекания первичного разделения зарядов, например, за счет химического восстановления 0д. Эти данные не подтверждают выдвинутую в наших ранних работах (Borisov, GodiJc, 1970, 1972, 1973) гипотезу о том, что основной причиной малого роста выхода флуоресценции при закрытии РЦ является "фоновая" флуоресценция от пигментов, не связанных с процессом фотосинтеза. Вклад флуоресценции такого рода в свечение бактерий, обычно, незначителен. Роль "фонового" компонента флуоресценции в наших измерениях времен затухания комплексного свечения бактерий методом "временного рычага" (Borisov, Godik, 1970, 1972; Borisov et al., 1977) принадлежала компоненту наносекундной рекомбииационной люминесценции.

В целом, полученные в данном разделе работы результаты являются прямым свидетельством того,что перенос энергии к РЦ происходит по синглетным уровням молекул БХЛ, и создают надежную основу для использования кинетических флуоресцентных исследований с целью определения скорости, эффективности и механизмов переноса энергии от ССА к РЦ.

Глава 3. Миграция энергии в длинноволновых околопентроьых формах БХЛ ССА. Перенос энергии к РЦ

Результаты предыдущей главы использованы для определения эф-<*ектинности, скоростей и механизмов, [.«играцин энергии в ядре ÍCE--компл<:'Ксах ПВК Б875(890) - РЦ, в которых происходит сопряжение процессов миграции энергии по ССА и захвата ее РЦ. Для определения эффективности переноса достаточно определить времч затухания пикосекундной "фотосинтетической" флуоресценции при открытых РЦ (т") и иремя затухания возбуждений а ССА, лишенной РЦ (т ). Для бактерий R. rubrtin, Rhodob.icter sphaeroidcs ■ дикий тип, Chromatiun

Biimtissinun и Thiocapsa rosecopersicina: т° = 60+10 ПС; тд = = 0,7í1,2 не. При этом эффективность захвата составляет (Borisov et al., 1985): ф = (тд - = 0,9 f 0,95, что нахо-

дится в согласии в данными, полученными другими метода»« (Loach, Secura, 1966; Борисов и др., 1974; Пащенко, 1987).

Для извлечения информации о микроскопических параметрах, характеризующих движение возбуждений в изучаемой системе, применяли теоретическое описание процесса по методу случайных блужданий. Корректность такого описания базируется на следующих данных. Спектральные характеристики пигментов in vivo, особенно при комнатной температуре, свидетельствуют в пользу сильного электрон-колебательного взаимодействия, в связи с чем даже при близком расположении пигментов, обеспечивающем значительную энергию межмолекулярного взаимодействия ~ кТ, время когерентности возбуждения не должно превышать нескольких гшкосекунд (Kenkre, Knox, 1974; Nedbal, Szocs, 1986). Время жизни возбуждения в ФСЕ на порядох больше, следовательно, по истечении нескольких пикосекунд возбуждение может рассматриваться как локализованное. При аппроксимации структуры комплексов Б875 - РЦ двумерной квадратной решеткой, в узлах которой расположены элементарные ПБК Б875, включающие пару молекул БХЛ ССА (всего 12-15 димеров на один димер РЦ-Р870), были получены следующие параметры: время одиночного скачка - 0,5г-1 пс (отвечающее элементарной скорости переноса 1-2-1012 с"'), время первого прохода - »30 пс, эффективность захвата ~30%. Рассчитанные на основе этих данных феноменологические константы, характеризующие изотропную диффузию в указанном приближении, составляют: коэффициент диффузии Д = (5т-7) •10"3 см^с"1, диффузионная длина - 60-70 Близкие величины получены в работе (Пащенко, 1987). Диффузионная длина 50-70 8 отвечает моноцентральной организации ФСБ, что противоречит многочисленным экспериментальным данным (Clayton, 1966; Борисов и др., 1974; Monger, Parson, 1977; Sakker et al., 1983; Grondelle, 1985). В частности, экспоненциальный характер затухания флуоресценции пурпурных бактерий, зарегистрированный нами при промежуточных интенсивностях возбуждающего света, когда лишь часть РЦ находится в открытом состоянии, а другая часть - в закрытом, возможен только при мультицен-тральной организации ФСЕ. В условиях, когда каждый РЦ обслуживается своим незаиисимым фондом молекул-сьетосйор8'и*ов, флуоресценция солхна затухать по биэкспснснщлальному закону с временными конгтантами 50-60 пс и 200-300 пс. Это противоречие показывает

неадекватность широко принятого в литературе при теоретически* описаниях движения возбуждений в ФСЕ приближения, предполагающего структуру последней в виде однородной изотропной квадратной решетки. Более соответствует имеющимся на сегодня структурным данным модель организации комплексов Б875 - РЦ Цубера (Zuber, 1986, 1987), в основу которой положены результаты электронно-микроскопических исследований повышенного разрешения мембран пурпурных бактерий, содержащих БХЛ fe (Hiller, 1979, 1982; Engelhardt et al., 1986). В рамках этой модели все 24-30 молекул длинноволновой форм;.! БХЛ окружают РЦ одним концентрическим слоем; межмолекулярные расстояния в пределах этого слоя лежат в диапазоне 12-17 X; расстояние же от ближайшей молекулы БХЛ ССА до РЦ составляет не менее 25-30 8. Это обусловлено значительными размерами ПБК РЦ, а также расположением специальной пары Р870 примерно в центре белковой шубы, образованной L- и М-субъединицами белка РЦ (Deisenhofer et al., 1984, 1985). В таких условиях между молекулами БХЛ ССА должна реализоваться быстрая субпикосекундная миграция энергии, а перенос энергии от БХЛ ССА на БХЛ РЦ должен происходить за десятки пикосе-кунд. Отсюда следует, что в «СЕ могут сосуществовать два типа движения возбуждений: мелкомасштабный (диффузионный) и крупномасштабный (прыжковый). В работе (Киприянов, Карпушин, 1988) показано, что в этом случае определение из кинетических флуоресцентных данных диффузионных параметров экситонов с использованием формализма, развитого для случая изотропной диффузии, дает параметры прыжкового движения, которое не сопровождается значительными диффузионными смещениями за время жизни. Движение по диффузионному каналу (по молекулам БХЛ ССА , в нашем случае) при этом может характеризоваться на порядок большими значениями коэффициента диффузии и, соответственно, значительно большими значениям! диффузионной длины. Это позволяет согласовать многочисленные данные с том, что при комнатной температуре у пурпурных бактерий не менее 12-17 РЦ обслуживаются общим фондом молекул БХЛ ССА (Grondelle, 1985; Borisov et al., 1985).

В недавних работах (Borisov et al., 1984; Kraner et al., 1984) выдвигалось предположение о существовании в пределах длинноволновых околоцентровых форм БХЛ специальной минорной фракции молекул, имеющих максимум поглощения, смещенный на ~25 нм в более длинноволновую область относительно максимума поглощения БХЛ РЦ. Было предположено, что данная фракция молекул концентрирует возбужденные состояния за пикосекундные времена и сопрягает процессы »«г-

рации и захвата возбуждений в ФСЕ. В связи с этим нами было показано, что при комнатной температуре измеримой концентрации возбуждений в длинноволновой части полосы Е880 не происходит, в согласии с данными (Васильев, Пащенко, 1987). При 77К обнаружено характерное увеличение времени затухания флуоресценции при увеличении длины волны регистрации. Кинетика флуоресценции в длинноволновой части спектра при этом имела время нарастания 3-5 пс, что свидетельствует о том, что в системе осуществляется перенос возбуждений от более коротковолновых центров к длинноволновым. В пользу спектральной неоднородности формы БХЛ Б880 свидетельствует также коротковолновый сдвиг максимума флуоресценции пурпурных бактерий, который регистрируется при высоких плотностях возбуждения, когда проявляются нелинейные процессы аннигиляции возбужденных состояний (Vos et al., 1986; Freiberg et al., 1989). Однако, приведенные данные не согласуются с гипотезой о существовании минорной длинноволновой формы БХЛ: если предположить, что обнаруженная неоднородность Б880 представлена двумя полосам!, то, согласно нашим данным, минорная полоса должна быть расположена с коротковолновой, а не с длинноволновой стороны от максимума суммарной полосы. Полученные данные связаны нами с проявлением направленного вниз по энергетическому градиенту переноса энергии между отдельными центрами, составляющими неоднородно уширенную полосу Б880. Отличия в спектральном положении отдельных центров могут быть обусловлены разным локальным окружением молекул БХЛ, например, асимметрией в расположении заряженных или дипольных группировок. По данным (Eccles, Honig, 1983), наличие одиночного точечного заряда на расстоянии 3,5 А от макрецикла молекулы БХЛ приводит х сдвигу его Q3-полосы до 1400 см"1 . Направленный перенос энергии может приводить к укорочению времени захвата возбуждений РЦ при условии, что наиболее длинноволновые центры ближе остальных расположены к РЦ. Как показано ниже, значительный эффект может оказывать обнаруженная неоднородность околоцентровых форм БХЛ в ускорении процесса захвата n ССА большого размера, представленных несколькими типами ПБК и несколькими спектральными формами БХЛ ССА.

Глава 4. Пикосекундная динамика направленного переноса энергии в спектрально гетерогенных антеннах пурпурных бактерий

В данной части работы проведено изучение скоростей и путей гетерогенной миграции энергии у пурпурных бактерий Rb.sphaeroides

и Chr.minutissimum. содержащих два типа пигмент-белковых комплексов ССА Б800-850 и Б875. До недавнего времени такие данные носили косвенный характер. Было обнаружено, что при селективном пикосекундном возбуждении наиболее коротковолновой форьы Б800 и спектрально селективной регистрации с разрешением 2-4 нм, кинетика затухания флуоресценции зависит от длины волны регистрации как при комнатной, так и при низкой температуре. Массив спектрально-кинетических данных, полученных при разных температурах, на разных культурах, при разных состояниях РЦ, удалось описать в рамках единой модельной схемы, основанной на кинетических балансных уравнениях. В основу разработанной схемы легли данные, полученные при низкой температуре, когда кинетика изучаемых процессов в системе упрощается вследствие практического отсутствия переноса энергии против термодинамического градиента. Модель предполагает существование в фотосинтетических мембранах двух типов ПБК Б800--850 с разными временами переноса энергии возбуждений к ПБК Б875 и несколько отличным спектральным положением максимумов поглощения форны Б850. Перед тем, как сравнивать теоретические кривые, описывающие кинетику флуоресценции, с экспериментальными зависимостями, проводили свертку первых с аппаратной функцией прибора. Параметрами в модели были: величина констант скоростей переноса энергии между отдельными спектральными формами БХЛ, число молекул и спектральное положение максимума форм>1 Б850 в пулах с быстрым и медленным переносом к Б875. Удовлетворительное согласие с экспериментом было достигнуто при условии, что (1) время переноса энергии от Б800 к Б850 составляет 1-2 пс; (2) время переноса возбуждений от основной (-75%) массы молекул Б850 к Б875 составляет 5-7 пс;

(3) время переноса от остальных молекул Б850 составляет 50-60 пс;

(4) максимум поглощения молекул Б850 с более длинным временем переноса энергии к Е875 имеет на 5-10 нм более длинноволновое положение, чем у остальных молекул этой форж; (5) время захвата возбуждений из Форш Б875(890) составляет 60-70 пс при открытых и ~ 200 пс при закрытых РЦ. Рис.4 иллюстрирует адекватность выбранной модели для описания динамики возбуждений у Chr.minutia-simum при 77К. Важно, что не менее хорошее согласие между экспериментальными и теоретическими зависимостями было получено и при комнатной температуре, как для закрытых, так и открытых состояний РЦ.

Эти исследования показали наличие в ФСЕ пурпурных бактерий пикосекундного направленного (от более коротковолновых форм БХЛ к самой длинноволновой околоцентровой форме) переноса энергии синг-

Рис. 4. А - экспериментальные кинетики затухания флуоресценции хроматофоров Chr.minutissi.mum при 77К для ряда длин волн, указанных на рисунке. Непрерывными линиями показаны аппроксимаци-онные кривые, построенные в рамках кинетической модельной схемл, описанной в тексте. В - спектральное распределение относительных амплитуд отдельных компонентов в кинетике затухания флуоресценции; численные значения над модельными кривыми обозначают время жизни соответствующих компонентов

летных возбужденных состояний. Скрытая спектральная неоднородность околоцентровой формы способствует дополнительной направленности этого переноса, а также обеспечивает совпадение переноса по термодинамическому градиенту с пространственной его направленностью к РЦ. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что все молекулы Б875 непосредственно окружают РЦ. Такая система переноса энергии к РЦ в спектрально гетерогенных антеннах обусловливает практическое равенство времен захвата открытыми РЦ (тз = 60 пс) в 4СЕ разного размера (24-30 молекул БХЛ на один РЦ у я.rubrum и 120-160 молекул у Rb.3Phaeroi.des и ehr .rainutissimum «Годик и др. , 1986; Васильев, Пащенко, 1987; Freibergetal., 1988, 1989).

Данная серия исследований позволила предложить обобщенную ки-нетико-энергетическую схему миграции энергии в спектрально гетерогенных ССА пурпурных бактерий (рис.5), а также гипотетическую модель взаимной укладки различных ПБК в мембранах.

Глава 5. Модельные системы йютосинтетической светособисаютей антенны

В данном разделе была поставлена задача воспроизвести главные из обнаруженных в предыдущих разделах работы свойств фотосинтетической ССА: (1) малые безызлучательные потери (константа скорости ~10э с*1 ) при локальной концентрации пигмента, обеспечивающей средние межмолекулярные расстояния 20 8, что является необходимым условием для реализации эффективной миграции в системе; (2) направленность переноса от коротковолновых к длинноволновым центрам.

В сисгеглэ на основе полимерных пленок яз полистирола, содержащих хлорофилл з, при концентрациях пигмента выше 4-10"3 М обнаружен направленный перенос энергии от мономеров на ассоциаты, поглощающие в более длинноволновой части спектра. Однако константа Сезызлучательного тушения у ассоциатов хлорофилла (100-200 пс"1) в 5 раз выше соответствующей константы у молекул БХЛ в ССА пурпурных бактерий. Более перспективной оказалась система на основе липосом «из яичного лецитина, содержащих хлорофилл и феофитин, в которой образование тушащих ассоциатов не происходило вплоть до концентраций 8-10"2 и, отвечающих средним межмолекулярным расстояниям около 20 %. Показано, что за время жизни возбуждения при этом может реализоваться 200-500 актов перекоса и что процесс миграции охватывает практически всю липосому. в системе на основе хлорофилла в определенных условиях происходило образование флуо-

; ис, 5. Кинетико-энергетическая схема пикосекундной динамики синглетных возбужденных состояний БХЛ в спектрально гетерогенных ССА пурпурных бактерий, в также последующих стадий преобразования и стабилизации этой энергии в РЦ

ресцирувщих длинноволновых ассоциированных форы пигмента, на которые энергия возбуждений поступала направленным потоком. Показана принципиальная возможность сопряжения полученных систем с ловушками типа бактериальных РЦ, так что эффективность захвата составит 70% для хлорофилла и 85». для феофнтина. что приближается к свойствам ССА пурпурных бактерий.

Глава 6. Короткоживуяие рекомбннаиионные свечения в изучении промежуточных стадий в разделении зарядов в PI1

Задачей первостепенной важности в области первичных процессов фотосинтеза является выяснение механизмов быстрого, практически необратимого превращения энергии электронного возбужденного состояния в энергию разделенных зарядов, которое осуществляется фотосинтетическими рц. в основе этого превращения лежит свойство молекул хлорофиллов к обратимому взаимодействию с донорам* и акцепторами электрона (Красновский, 1948). До середины 70-х годов было общепринятым, что разделение зарядов в бактериальных РЦ представляет собой фотохимическую окислительно-восстановительную .реакция, в которой донором является специальная пара БХЛ РЦ, Р870, а акцептором - молекула Q. После того, как было установлено, что суммарное время захвата (включающее времена миграции энергии синглетных возбужденных состояний по молекулам БХЛ ССА, переноса этой зиергии к РЦ и собственно время первичного разделения зарядов) составляет около 50 ne (Borisov, Godik, 1970, 1972), а время жизни конечного' продукта реакции - P870*Q4~ - лежит в диапазоне сотен миллисекунд, мы предположили (Borisov, Godik, 1973), что процесс разделения зарядов должен включать несколько стадий. В цитированной работе обосновано, что переносу электрона на Q^ должна предшествовать промежуточная пикосекундная стадия, в которую вовлечены молекулы порфири-новой природы, входящие в состав РЦ: в противном случае, не может быть достигнут высокий квантовый выход этого процесса. Наличие такой стадии было вскоре показано в прямом эксперимента (Parson et al., 1975). Согласно последним данным, время образования первичного промежуточного состояния составляет 3-5 ne (Breton et al., 1S86, Fleming et al., 1988). Примерно за такое же время (5-6 пс) затухает флуоресценция фотоактивного Р870 (Kononenko et al., 1980; РазсИепко et al., 1985; Freibegrg et al., 1985), что прямо показывает , что первичное разделение зарядов происходит через синглэтнсз возбужденное состояние Р870.

Независимом способом получения информации о динамике быстро-

протекающих процессов разделения зарядов является изучение реком-йииационной люминесценции, возникающей в холе излучательной дезактивации его продуктов. В данном разделе работы приведено обоснование метода измерения вклада короткохивущих послесвечений в суммарную люминесценцию фотосинтезируюцих организмов с помощью модуляционных измерений. Применение описанного метода позволило обнаружить у ряда фотосинтезируюцих бактерий послесвечения в микросекундном временном диапазоне. Ранее считалось, что наиболее корот-коживущиыи являются послесвечения с временем жизни в десятки-сотни миллисекунд, поскольку с таким временем рекомбинируют Р870* и QÄ" (Carithers, Parson, 1974). Интенсивность обнаруженных ыикросекундных послесвечений охазалась на несколько порядков выше, чем миллисекундных, а поскольку регистрируются они только в присутствии функционально активных РЦ, сделан вывод, что данные свечения является результатом излучательной дезактивации промежуточных состояний, имеющихся на участке между первичным состоянием с разделением зарядов Р*Х~ (которое дезактивируется в нано-, пикосекундном диапазоне) и состоянием Р870*од~.

Наносекундная рекоШикапионная люминесценция пурпурных бактерий. Изучение компонента замедленной люминесценции, отражающего рекомбинацию продуктов начальной стадии разделения зарядов Р*I*, проводили в условиях, когда происходила стабилизация промежуточного пикосекундного состояния до наносекундных времен за счет ииги-бирования переноса электрона к 0Д при его химическом или фотохимическом восстановлении. Освещение пурпурных бактерий в этих условиях приводит к фотонакоплению состояния Р870-I-0д~ и падению выхода их флуоресценции (Shuvalov, Klimov, 1976; Климов и др., 1976). Это падение, величина которого зависела от температуры, было связано с исчезновением замедленной лтмнесценции, возникающей при рекомбинации Р870* и I". Hat« было показано, что при фотонакоплении (или химическом восстановлении) 0Д~ наблюдается резкое увеличение регистрируемого времени жизни флуоресценции т до 2,5-3 не, что значительно превосходит время жизни флуоресценции БХЛ даже в ССА в отсутствие РЦ (см.табл.2). В этих условиях наблюдается резкая диспропорция в значениях т и выхода свечения <р , однозначно указывающая на неоднородность свечения, на присутствие в нем компонентов разной длительности. Определение времени хизии наносекундного кошо-нента, а также его вклада в исследуемое свечение проводили как фа-зово-модуляционным методом (Годик и др., 1979), так и методом импульсной флуорометрии с помощью промышленного флуорометра "Ortec"

с длительностью аппаратной функции около 1,5 не (Godik, Borisov, 1979). Установлено) что в условиях, когда первичное разделение зарядов ограничивается коделексом молекул порфкриновой природы Р!(, в свечении бактерий, наряду с компонентом быстрой флуоресценцмм г; временем жизни ~ 60 пс, присутствует долгоживуций комюнент г. эр.-;--менем жизни 4-6 не в моноэкспоненциальном приближении. Отиовстид интенсивностей составляет 1,5*2/1,0 в пользу последнего кок-полента. У бактерий, ССА которых содержит один тип ПБК, представленный одной спектральной формой БХЛ, спектры быстрой и наносекунлной л:->-•жнесценции идентичны. Рекомбннационная природа наносекундного компонента показана в опытах с Thlocaoaa roseoperslcina и Chr .»1 ■■ nutisslnum. когда данный комзонент свечения исчезал по мере того, как РЦ накапливались в состоянии с восстановленным промежуточный акцептором (рис.6).

Рис. 6. Кинетика фотоиндуци-рованных изменений поглощения н времени хязнм Флуоресценции т хроматофороа ТЬ.Г0ав0рсга1с1па В присутствии 1 иг/ил дитмонита натрия. Оптическая плотность образца при 890 км - 0,6 опт.ед. при оптическом пути 1 см. Стрелка*« показаны моменты помее|ения образца на возбуждающий свет

Это свойство наносекундной люминесценции, не проявляться . в условиях, когда первичное разделение зарядов ингибировано, однозначно указывает на ее рехомбинационную природу и создает основу для использования флуоресцентных измерений в качестве простого, чувствительного и надежного теста функционального состояния РЦ, а также начального участка цепл переноса электрона.

Проведенные исследования явились важным звеном в цепи доха-

зательств существования промежуточных состояний в ходе первичного разделения зарядов в РЦ. Кроме того, они показали, что одним из каналов распада промежуточной ион-радикальной пары является образование синглетного возбужденного состояния Р870 , которое мигрирует к молекулам БХЛ ССА и здесь излучается в виде наносекундной люмжесценции. Хотя данный процесс наблюдается в условиях, когда нормальный путь фотосинтетического переноса электрона блокирован восстановлением , изучение наносекундной рекомбинационной люминесценции позволяет получать важную информацию о динамике и энергетике первичного разделения зарядов.

Энергетическое положение промежуточного состояния PB70*I" относительно синглетного возбужденного состояния Р870*. Несмотря на значительный прогресс,'достигнутый в последние годы в понимании механизмов функционирования бактериальных РЦ, целый ряд важных моментов остается неясным, например, природа первичного промежуточного состояния с разделением зарядов Р*I" , а также роль .высокочастотных внутримолекулярных колебательных мод и низкочастотных колебаний белкового окружения в релаксации этого состояния (Jorter, 1980; Kakitani, Kakitani, 1981; Marcus, 1987; Bixon et al., 1987; Scherer, Fisher, 1987.). Выяснение этих вопросов невозможно без определения величины энергетического зазора А Е, отделяющего состояния'Р870* от Р*I". Величины д Е, полученные разным* авторам!, варьируют от 0,05 до 0,4 эВ. Одной из причин^ этого расхождения является, на наш взгляд, тот факт, что энер-. гетический уровень промежуточного состояния не является фиксиро-. . ванным по завераении франк-кондоновской релаксации. Согласно гипотезе, высказанной нами в работе (Godik et al., 1982), в условиях, " когда фотосинтетический путь переноса электрона прерван химическим восстановлением (5д, релаксация состояния состояния Р*1~, обладающего значительным дипольным моментом, протекает в течение всего времени жизни этого состояния, вовлекая в дипольные пере. стройки все более крупные участки ближайшего водно-белкового окружения: от смещений небольших заряженных (или полярных) атомарных группировок, до/локальных смещений отдельных крупных участков бел, ковой структуры. Эти движения белковых структур перекрывают диапазон от пикосекунд до миллисекунд (Шайтан, 1984), в результате чего величина л Е увеличивается с течением времени, достигая величин "0,4 эВ на Mixpo- и ьиллисекундных временах (Woodbury et al., 1987; Takiff, Boxer, 1988). Представление о релаксации состояния Р4I" после завершения процесса франк-кондоновской термолизации подтвер-

задается зависимостью спектра состояний Р*I" от времени регистрации (Akhmanov et al., 1980; Kiraaier et al., 1988). •

В свете вышесказанного, в качестве основной энергетической характеристики процесса разделения зарядов в РЦ следует рассматривать разницу в величинах свободных энергий состояний Р870* и первоначально образованного состояния Р*I". В данной работе такое определение проведено для бактерий w.rubrua и Rb.gphaeroidcs на основании измерения начальных амплитуд быстрой и замедленной люминесценции в кинетике затухания их флуоресценции в восстановительных условиях с привлечением кинетического модельного описания наблюдаемых процессов. Разница в величинах свободных энергий син-глетного возбужденного состояния БХЛ ССА и термолизованного состояния P*i" составляет 0,1*0,14 эВ,- в хорошем согласии с данными работ (Woodbury, Parson, 1986; Логунов и др., 1987).

Глава 7. Динамика первичного разделения ядоядов в РП пурпурных бактерий по данным наносекундной реко^иначионной люминесценции. Роль белка как динамической систем»!

При изучении температурной зависимости параметров наносекундной рекомбинационной люминесценции нами было обнаружено, что ее выход уменьшается при понижении температуры с энергией активации 0,1 эВ, как это можно ожидать в рамках общепринятой схемы разделения зарядов в РЦ, а время жизни остается практически неизменным в диапазоне температур 200-300К. Сходные данные были получены затем в работах (Bochove et al., 1981; Woodbury, Parson, 1984, 1986), в которых была установлена также мультяэкспоненциальность затухания этой люминесценции. Для объяснения обнаруженной независимости времени жизни нам« было предположено, что в ходе вышеупомянутой релаксации состояния Р*х" происходит не только понижение энергетического уровня этого состояния, но н осуществляется значительная пространственная реорганизация всего донорно-акцептор-кого комплекса. В результате этого, в цепи процессов, приводящих к генерации наносекундной люминесценции, появляется относительно медленная тешературно независимая стадия переноса электрона (Godik et al., 1982). В соответствии с пространственной организацией РЦ было постулировано, что такой стадией является перенос электрона между двумя практически изоэнергетичными состояниям« Р*Р800" и Р*БФф", которые возникают на определенной стадии релаксации состояния Р*1". По существу, предложенная модель весьма

сходна с моделью Хаберкорма (Haberkorn, Nichel-Beyerle, 1979), которая была развита авторами для объяснения малой величины обменного взаимодействия в ион-радикальной паре Р*I", не согласующейся с высокой скоростью разделения зарядов между Р и I. Существенной разницей является тот факт, что Хаберкорн, подобно Шувалову и Парсону (Shuvalov, Parson, 1981), рассматривает подсостояния синглетной ион-радикальной пары Р* Р800" и Р*Бвф" как постоянно существующие, а в нашей схеме эти подсостояния появляются в ходе динамической эволюции состояния Р*I" на временах порядка сотен пи-косекунд. Обсуждаемая модель не является единственно возможным объяснением температурной независимости времени жизни рекомбинаци-онной люминесценции: понижение температуры мало скажется на скорости затухания рекоыбинационной люминесценции также в условиях, когда канал рекомбинации Р*I', приводящий к генерации наносекундной люминесценции, вносит лишь незначительный вклад в суммарную скорость дезактивации состояния Р*1~. Учитывая, что разница в свободных энергиях синглетного возбужденного состояния БХЛ ССА и Р*I" составляет около 0,12 эВ, данное объяснение также с неизбежностью предполагает, что в ходе первичного разделения зарядов должна происходить значительная реорганизация донорно-акцепторного комплекса. Наличие быстрой, нано- и пикосекундной динамики белка (МсСашпоп et al., 1979; Munro et al., 1979; Karplus et al., 1981; Lakovicz, Cherek, 1981; Демченко, 1988), в том числе и белка РЦ (Shulten, 1988), делает весьма вероятным участие в ходе этой реорганизации легких полярных группировок белка. При этом электростатическое взаимодействие промежуточного состояния, обладающего значительным дипольным моментом, с полярной средой, может оказаться существенным для обеспечения эффективности и направленности процесса разделения зарядов (Rubin ct al., 1980; Fok, Borisov, 1961; Godik ct al., 1982; Warshell et al., 1984, 1986).

С целью выяснения роли быстрой динамики водно-белковой матрицы РЦ в стабилизации промежуточных продуктов разделения зарядов нами было изучено влияние на ход процесса рекомбинации ряда воздействий, направленно нарушающих структурную динамику белка. Наиболее сильным воздействии такого рода явилось обезвоживание препаратов хроматофо-ров. В этих условиях ~50"4 РЦ оказывалось неспособными к разделению зарядов; в остальной части РЦ квантовый выход разделения уменьшался примерно на порядок. Существенно изменялись и параметры рекомбинаци-онного свечения: время его жизни укорачивалось в несколько раз, а выход возрастал, что свидетельствует о нарушении нормального проте-

кания релаксационных процессов, стабилизирующих состояние Р*1". Это нарушение может быть обусловлено тем, что дегидратация устраняет молекулы связанной воды и разрывает внутрибелковые водородные связи, драматически меняя локальную подвижность белка (КагвсЬеН еь аХ., 1984). Несоигенно, что определенную роль при этом могут играть и чисто структурные изменения ПЕК РЦ, вызываете дегидратацией.

Лальнейшие доказательства важной роли водно-белкового окружения в стабилизации промежуточного состояния были получены в опытах по изотопному замещению воды в препаратах хроматофоров я.гиЬгиа на тяжелую: 2н20 или н2" о. Техника замещения состояла в том, что предварительно глубоко высуиенные образцы увлажняли обычной водой (контроль), 2Нг0 или Н21 * О. Эффект проявлялся вскоре после увлажнения, что показывает, что он обусловлен легко обменивающимися протона>м. Как видно из данных таблицы 3, достигаемое при изотопном замещении изменение временя жизни наносекундной яетмнесценции коррелирует со степенью предварительного обезвоживания, приближаясь к величинам, наблюдаемо« при дегидратация.

Таблица 3.

Влияние изотопного замещения Н?0 на 3Н20 а пленках хроматофоров я.гиЬгия на время жизни т рехоыОинационной люминесценции бактериохлорофилла в присутствии 10'3 Н

о-(Ьенатролина и 10'2 Н аскорбата натрия_

Степень предварительной Время жизни, т не, Величина эффекта: дегидратации образца после увлажнения - ■ -т / т

Нг0 гНгО Нг0 гн?о

1,0 0,8 0,7 0,6 0,4

1.6 1,6 1,5

Расчет, проведенный в рамках модельной схем), сходной с приведенной в работе (Radeaaker, Hoff, 1981), показывает, что для объяснения полученных эффектов следует предположить, что величина энергетического зазора между состояниям! Р870* и Р*1" ужяьаастся при обезвоживании и дейтерировании в раза. Сходство влияния обезвоживания и дейтермровакия на ход рекомбинации промежуточных продуктов разделения зарядов в РЦ указывает, что дейтерированже,. подобно обезвоживанию, способно уменьшать хонформационнуп подвкх-

ность и увеличивать жесткость ПБК РЦ. Тот факт, что дейтеркрование может оказывать подобные эффекты на динамические свойства белков, обнаружен в работах по изучению их термостабильности (Лобышев, JKa-линиченко, 1978). Изотопное замещение НгО на Н21в0 никакого влияния на рекомбинационную люминесценцию не оказывало, откуда следует, что именно протоны участвуют в образовании энергетического барьера, стабилизирующего промежуточные продукты на пико-, наносекундных временах.

Дополнительное подтверждение этому заключению получено при изучении влияния на ход рекомбинации состояния Р*I" »«огоатомных и одноатомных спиртов. Криопротекторы: глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль, диметилформажд, - обладающие способностью вытеснять воду из биоструктур и модифицировать систему внутрибелковых водородных связей, оказывали эффекты, сходные с дейтерированием. Величина достигаемого эффекта коррелировала со степенью гидрофоб-ности использованных соединений, т.е. с их способностью проникать вглубь меьвранного диэлектрика.

На примере одноатомных спиртов и других растворителей с известными показателями гидрофобности, протон-акцепторной силы и полярности показано, что высокая проникающая способность в гидрофобные области мембран перестает играть решающее значение в величине воздействия на параметра рекомбинационного свечения, хогда низка протон-акцепторная сила этих соединений.

Подученные данные подтвердили представление о том, что энергетический уровень промежуточного состояния Р*I" не является фиксированным после завершения франх-кондоновской термолиэации и показали, что релаксация состояния Р*1" в диапазоне сотен-тысяч пи-косекунд представляет собой динаыичесхий процесс, вхлючающий переполяризацию водородных пигмент-белковых связей и (или) связанной воды. Последний процесс стабилизирует промежуточное состояние и контролирует эффективность и направленность первичного раз-разделения зарядов (см. также Пащенко и др., 1986; Paschenko et al., 1987; Логунов И Др., 1987).

Глава Я. Влияние мембранного потенциала на наносекундную рекоК>инаиионнуд лкмшесиениию (Ьотосинтезиоуюших ЯШММЙИ

Светоиндуцярованный перенос электронов в мембранах фотосинте-эируюцих организмов является электрогенным, что обусловлено трансмембранным расположением переносчиков. Исследование влияния мем-

бранного потенциала на замедленную рекомбинацконную люминесценцию является известным способом выяснения степени электрогенности отдельных стадий переноса электрона по фотосинтетической цепи (Fiei-schman, 1978). Так, интенсивность миллисекундного послесвечения, отражающего рекомбинацию Р870* и Q(", увеличивается при энергиза-ции мембран хроматофоров, что принято связывать с уменьшением энергии активации процесса рекомбинации трансмембранно расположенных Р870* и 5 В виду того, что перенос электрона при этом осуществляется при участии промежуточного акцептора I, сходный эффект можно было ожидать и для наносекундной люминесценции при условии, что перенос электрона на участке Р870-Г является электрогенным. Действительно, энергизация мембран хроматофоров я.rubrum за счет гидролиза неорганического пирофосфата и AT® сопровождалась сокращением времени жизни наносекундной люминесценции от 4-6 до 2-3 не и ростом ее выхода в 1,5-2 раза. Показано, что этот эффект обусловлен влиянием электрической составляющей трансмембранной разности потенциалов. Полученные данные позволили заключить, что перенос электрона от Р870 к X имеет трансмембранную составляющую (Borisov et al., 1980). Позднее этот вывод был подтвержден в прямлх опытах по регистрации электрического потенциала на мембранах хроматофоров с пикосекундным временным разрешением (Trissl, 1983; Deprez et al.1986). Он согласуется также с данными рентгеноструктурных исследований кристаллов изолированных РЦ (Delsenhofer et al., 1984, 1985).

Обнаруженное влияние мембранного потенциала на наносекундную рекомбинационную люминесценцию пурпурных бактерий сходно с эффектами, наблюдавшимися при "обезвоживании, дейтерировании и прочих воздействиях, которые направленно нарушали быструю динамику белка РЦ. В результате, необходимая стабилизация состояния Р870*I" не достигалась, и квантовый выход разделения зарядов падал. В согласии с этим, Поповик и др. (popovic et al., 1987) наблюдали, что приложение электрического поля с напряженностью порядка создаваемой электрической составляющей мембранного потенциала сопровождается падением квантового выхода разделения зарядов в пленках изолированных РЦ на 20-25%. Полученные нами результаты позволяют заключить, что энергизация фотосинтетических мембран является первичным регулятор-ным механизмом фотосинтеза пурпурных бактерий.

Данный вывод справедлив и по отношению к зеленым водорослям Chlorella vulgaris, у- которых энергизация тилахоидных мембран сопровождается изменениями выхода и времени жизни флуоресценции на свету насыщающей интенсивности, сходными с описанными выше для пур-

пурных бактерий в восстановительных условиях (Годик, Борисов, 1983).

В Заключении диссертации подведены основные итоги проделанной работы, рассмотрен ее вклад в построение общей картины первичных процессов бактериального фотосинтеза и в выяснение общих принципов эффективного преобразования энергии света в электрохимическую фор му.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

Комплексное исследование кинетики и механизмов последовательных стадий преобразования энергии света в ходе первичных процессов бактериального фотосинтеза: (1) миграции энергии электронных возбужденных состояний между молекулами БХЛ ССА; (2) переноса этой энергии к РЦ; (3) преобразования энергии электронных возбужденных состояний в энергию разделенных зарядов в РЦ; (4) последующей стабилизации образовавшихся зарядов,- позволило установить следующие закономерности:

1. Первичные процессы бактериального фотосинтеза - миграция энергии поглощенного света к РЦ и преобразование этой энергии в энергию разделенных зарядов - осуществляется через синглетные возбужденные состояния молекул БХЛ за пикосекундные времена. Фотохимическая стабильность фотосинтетического аппарата достигается за счет тушения энергии синглетных возбужденных состояний закрытыми 1Ц.

2. Исследование пространственной, временной и энергетической, организации системы доставки энергии возбуждений в спектрально гг -терогенных ССА пурпурных бактерий показало, что ь этих системах реализуется пикосекундный, направленный от периферии ФСЕ к РЦ поток энергии возбуждений, в результате чего время захвата возбуждены 1х состояний РЦ и его эффективность практически не зависят от размеров ФСЕ.

3. Высокий квантовый выход разделения зарядов в РЦ достигается за счет протекания этого процесса через промежуточное пикосе-кундное состояние, в которое вовлечены молекулы порфириновой природы, входящие в состав РЦ. Наличие такой стадии показано как посредством регистрации наносекундной замедленной люминесценции хромато-форов ряда пурпурных бактерий, отражающей рекомбинацию промежуточных коротхоживущих продуктов, так и в прямых опытах по изучению кинетики затухания пикосекундной флуоресценции изолированных препаратов РЦ.

4. Стабилизация промежуточного состояния в разделении заря--

в РЦ на пико-, наносекундных временах осуществляется при участии водно-белковых водородных связей и (или) связанной белком воды. Вследствие этого энергетический уровень промежуточного состояния не является фиксированным после завершения франк-кондоновской' термолизации. Отсюда следует, что процессы переноса электрона между молекулами, внедренными в белковые матрицы, которые сопровождаются значительным перераспределением плотности заряда в система, нельзя рассматривать в отрыве от быстрой динамики белка уже на пи-косекундных временах.

В работе получены также следующие результаты:

1. Установлено, что в люминесценции пурпурных бактерий присутствуют компоненты разной природы: пикосекундная "фотосинтетическая" флуоресценция, испускаемая молекулами БХЛ ССА в ходе миграции энергии синглетных возбужденных состояний к РЦ; "фоновая" флуоресценция от пигментов, не включенных в систему переноса энергии к РЦ; замедленная люминесценция, источником которой являются РЦ с нарушенным переносом электрона на участке I-QA:

а) характер зависимости времени жизни и выхода пикосекундной "фотосинтетической" флуоресценции от доли РЦ в открытом состоянии прямо свидетельствует о том, что флуоресценция и захват синглетных возбужденных состояний БХЛ ССА реакционными центрами являются конкурирующими процессами;

б) установлено, что захват энергии синглетных возбужденных состояний БХЛ ССА открытыми рц происходит за 50-60 пс, а дезактивация энергии этих состояний в ССА, лишенной рц, - за 0,7-1,0 не. Закрытые рц типа р*, Piqa", PI"Qa" тушат синглетные возбужденные состояния БХЛ ССА за 200-300 пс. Эти данные использованы для разработки теоретической модели, описывающей процессы миграции и захвата энергии синглетных возбуждений в ФСЕ пурпурных бактерий, которая находится в хорошем согласии с экспериментальными данными;

в) обнаружено, что наносекундные компоненты свечения представляют собой главным образом замедленную люминесценцию, возникающую при рекомбинации продуктов первичного разделения зарядов в РЦ с ингибированным переносом электрона на участке 1-0д. Вклад наносекундной люминесценции в суммарное свечение бактерий варьирует от < 0,1% до нескольких процентов. Показано, что данный компонент свечения играет определяющую роль при фазовых измерениях времен затухания флуоресценции фотосинтетических бактерий.

2. Изучены пути, определены скорости и эффективность переноса энергии в спектрально гетерогенных светособирающих антеннах пур-

пурных бактерий:

а) время переноса энергии от молекул БХЛ спектральной формы Б800 к Б850 составляет 1-2 пс при комнатной температуре и 77К, квантовый выход - 0,99;

б) ПБК Б800-850 образуют в мембранах два типа агрегатов, отличающихся положением максимума полосы Б850 на 5-10 нм; при этом агрегаты, характеризующиеся более коротковолновым положением максимума, непосредственно примыкают к Б875, а более длинноволновым - расположены на периферии ФСЕ. Время переноса энергии к Б875 от комплексов первого типа, включающих 70-80% молекул БХЛ, составляет 5-10 пс, а от комплексов второго типа - 40-60 пс;

в) комплексы Б875 непосредственно окружают РЦ и передают ему энергию возбуждения за 60i10 пс с квантовым выходом 0,9-0,95;

г) околоцентровые формы БХЛ ССА Б875 (880, 890) характеризуются скрытой спектральной неоднородностью, которая проявляется в характерной зависимости кинетики затухания флуоресценции от длины волны регистрации при 77К;

д) время захвата (60±10 пс) и его выход (0,9-0,95) одинаковы у бактерий, имеющих разные размеры ФСЕ:(30 молекул БХЛ ССА на один РЦ у R.rubrum и 120-160 молекул у Chr.minutissimum. Th.roseopersicina и Rb.snha&roides), откуда следует, что миграция энергии по молекулам

БХЛ ССА не лимитирует скорость захвата возбуждений РЦ;

ж) показано, что представление о хаотической диффузии возбуждений в ФСЕ является оправданным лишь в применении к комплексам Б875-РЦ при комнатной температуре. Параметры такой диффузии в предположении структуры ФСЕ в виде двумерной квадратной решетки, образованной димерами БХЛ, составляют: время одиночного скачка возбуждения - 0,5-1,0 пс; коэффициент диффузии - (5г7). 10"'1сМ2- с"1 ; диффузионная длина - 60-70 8 при открытых и ~250 & - при закрытых РЦ.

4. В искусственной модельной системе на основе липосом из яичного лецитина реализовано основное свойство фотосинтетической ССА: скорость безы;злучательных потерь ~ 10э с"1 при средних межмолекулярных расстояниях ~ 20 X.

5. Показано, что первичное состояние в разделении зарядов в РЦ Р*1~ образуется за 5i2 пс. Разница в величинах свободных энергий образовавшегося состояния и синглетного возбужденного состояния БХЛ ССА составляет ~О,1 эВ.

6. Обнаружено, что одним из путей рекомбинации промежуточного состояния Р*1" является образование синглетного возбужденного состояния Р870 , излучательная дезактивация которого дает начало замед-

ленной люминесценции с временем жизни и И15ч; ние этой люминесценции представляет собой уникальный способ не,лучения информации о механизмах стабилизации продуктов первичного разделения зарядов:

а) показано, что разнообразные воздействия, нарушающие быструю динамику белка РЦ: дегидратация, изотопное замощение зоды, добавление в суспензии хроматофороь органических веществ, способных модифицировать водородные связи белка, - приводят к нарушению протекания релаксационных процессов в ПКГ> РЦ, стабилизирующих промежуточное состояние. При этом наблюдается падение времени жизни и рост выхода реком-

бйНаЦИОТ.'НОГО

б) энергизация фотосинтетических мембран хроматофоров приводит

к сходным эффектам, что обусловлено уменьшением 8 этих условиях энергетического барьера, препятствующего рекомбинации трансмембранно расположенных зарядов Р870* и I". Итак, генерируемый в ходе работы фотосинтетической цепи переноса электрона мембранный потенциал нарушает процесс стабилизации промежуточного состояния, являясь, тем самым, первичным регулнторным механизмом фотосинтеза.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1. Борисов А.К)., Годик В.И., Чибисои А.К. 0 типах («грации энергии при бактериальном фотосинтезе// Молек.биология.-1970.Т.4.--С.500-506

2. Барашков Б.П., Борисов А.Ю., Голяк Л.П., Самуилов В.Д., Чибисов А.К. Участие триплетных состояний в бактериальном фотосин-тезе//Научн.докл.высш.школы.-1970.Т.3.-С.135

3. Борисов А.Ю., Годик В.И., Фетисова З.Г. Определение квантового выхода преобразования энергии при фотосинтезе 1. Обоснование метода для различных типов фотосиитетических единиц//Молек.биология. - 1974. Т. 8. -С.458-466

4. Барский E.JI., Борисов А.Ю. , Годик D.H., Ильина М.Д. Определение квантового выхода разделения зарядов 2. Разработка двух вариантов метода//Молек.биология.-1974.Т.8.-С. 927- 935

5. Борисов А.Ю., Годик В.И. Начальные стадии первичных процессов фотосинтеза//Биофизика фотосинтеза/Под ред.А.Б.Рубина.М.:Изд-во МГУ,1975.-С.124-144

6. Годик В.И., Борисов А.Ю., Самуилов В.Л. Промежуточные состояния, образующиеся при разделении зарядов в реакционных центрах в условиях низкого окислительно-восстановителыюго потенциала сре-ды//Молек.биология.-1978.Т.12.-С.290 296

7. Годик В.И. Кинетические и энергетические характеристики первичного разделения зарядов в бактериальном фотосинтезе//Быстро-протекающие процессы преобразования световой энергии при фотосинтезе/Под ред.A.B.Рубина.М.:Иэд-во МГУ,1980.-С.15-18

8. Годик В.И., Котова Е.А., Борисов А.Ю. Наносекундная реком-бинационкая люминесценция пурпурных бактерий//ДАН СССР.-1979 4.Т.245. -С.990- 993

9. Борисов А.Ю., Годик В.И. Новый тип пикосекундных люминесцентных послесвечений, излучаемых хлорофиллами фотосинтезирующих организмов//Изв.АН СССР сер.физ.-1980.Т.244.-С.738-744

10. Фалков П.М., Годик В.И., Котова Е.А., Борисов А.Ю. Низкотемпературная приставка для флуорометрических исследований //Биол. науки.-1980.»10.-С.98-103

11. Годик В.И., Борисов А.Ю. 0 природе вариабельной флуоресценции растений//ДАН СССР.-1983.Т.268.-С.211-219

12. Годик В.И., Нокс П.П., Кононенхо А.А., Борисов А.Ю., Рубин А.Б. Влияние обезвоживания на первичные пикосекундные стадии разделения зарядов у Rhodospirillum гubrиш//Иолек.биология.-1984.

Т.18.-С.1562-1568

13. Годик В.И., Тимпманн К.Э., Фрейберг A.M., Борисов А.Ю., Ребане К.К. Пикосекундная кинетика затухания флуоресценции при различных состояниях реакционных центров у Thiocapsa roseooersicina// ДАН СССР.-1985.Т.284.-С.491-494

14. Годик В.И., Нокс П.П., Кононенко А.А., Борисов А.Ю., Рубин А.Б. Влияние замещения H 0 на H 0 и НО, одно- и многоатомных спиртов и непротонных растворителей на динамику фотохимического разделения зарядов в реакционных центрах хроматофоров Rhodospirillum Х111ШШ/ /Молек. биология .-1986.Т.20.-С.1305-1312

15. Борисов А.Ю., Галутва О.А., Мамлеева Н.А., Годик В.И. Моделирование светособирающей антенны фотосинтеза с помощью липосом, содержащих хлорофилл и феофитин//Молек.биология.-1986.Т.20.-С.1655-1664

16. Годик В.И., Тимпманн К.Э., Фрейберг A.M., Борисов А.Ю., Ребане К.К. Перенос энергии между различными пигмент-белковыми комплексами у пурпурных бактерий Rhodobacter sphaeroides/ZHAH СССР.-1986.T.289. -С.714-717

17. Годик В.И., Фрейберг A.M., Тимпманн К.Э. Спектральная неоднородность полосы поглощения Б880 у Rhodospirillum rubrum по данным флуоресцентной пикосекундной спектроскопии//ДАН СССР.-1988.Т.298.

-С.1469-1473

18. Borisov A.Yu., Godik V.I. Fluorescence lifetime of bacterio-chlorophyll and reaction center photooxidation in purple bacterium// Biochim.Biophys. Acta. -1970.V..223 .-P. 441-443

19. Borisov A.Yu., Godik V.I. Storage of light energy in photo-synthesis//The Photosynthetis Unit, Conference Abstrack Book, Gat-1inburg.-1970.-B-13

20. Borisov A.Tu., Godik V.I. Energy transfer in bacterial photosynthesis. 1 .Light intensity dependence of fluorescence lifetimes//

J.Bioenergetics.-1972.V.3.-211-220

21. Borisov A.Yu., Godik V.I. Energy transfer in bacterial photosynthesis .2.Bacteriochlorophyll fluorescence lifetimes and quantum yields for some purple bacteria//J.Bioenergetics.-1972.V.3.-P.515 -523

22. Borisov A.Yu., Godik V.I. Excitation energy transfer in photosynthesis//Biochim.Biophys.Acta.-1973.V.301.-P.221-248

23. Borisov A.Yu., Fetisova Z.G., Godik V.I. Energy transfer in photoactive complexes obtained from green bacterium Chloroblum limicola/ZBiochim.Biophys.Acta.-1977.V.461.-P.500-509

24. Godik V.I., Borisov A.Yu. Excitation trapping by different states of photosynthetic reaction centers//FEBS Letters.-1977.

V.82.-P.355-358

25. Godik V.I., Borisov A.Yu. Short-lived delayed luminescence of photosynthetic organisms.1.Nanosecond afterglows in purple bacteria ait low redox potential//Biochim.Biophys. Acta.-1979 .V. 548. -P.296-308

26. Godik V.I., Borisov A.Yu. Short-lived delayed luminescence

of photosynthetic organisms.2.The ratio between delayed and pronpt fluorescence as studied by the modulation method//Biochim.Diophys. Acta.-1980.V.590.-P.182-193

27. Borisov A.Yu., Godik V.I., Kotova E.A., Samuilov V.D. Membrane potential effect on nanosecond recombination luminescence in Rhodospirillum rubrua//FEES Letters.-1980.V.119.-P.121-124

28. Godik V.I., Urbanova M., Vacek K., Borisov A.Yu. Chlorophyll in polysterene as a model of light-harvesting antenna of photosynthesis//Studia Biophysica.-1981.V.82.-P.179-184

29. Kotova E.A., Samuilov V.D., Godik V.I., Borisov A.Yu. Nanosecond recombination luminescence stimulated by o-phenan-troline//FEBS Letters.-1981.V.131.-P.51-54

30. Godik V.I., Kotova E.A., Borisov A.Yu. Nanosecond recombination luminescence of purple bacteria. The lifetime temperature dependence in Rhoflo^nirillvi rnhri"^ chromatophores// Photobiochem.Photobiophys.-1982.V.4.-P.219-226

31. Godik V.I., Freiberg A.M., Timpmann K.E. Picosecond spectrochronography study of energy utilization by photosynthetic bacteria//Proc.Acad.Sci.Estonian SSR, phys.,math.-1983.V.33.-

P.211-219

32. Freiberg A.M., Godik V.I., Timpmann K.E. Excitation energy transfer in bacterial photosynthesis studied picosecond laser spectrochronography//Advances in Photosynthesis Research/C.Sybesma ed..Martinus Nijhoff/Dr.W.Junk Publishers.-1984.V.1.-P.45-48

33. Borisov A.Yu., Freiberg A.M., Godik V.I., Timpmann K.E., Rebane K.K. Kinetics of picosecond bacteriochlorophyll luminescence in vivfl as a function of the reaction center state// Biochim.Biophys.Acta.-1985.V.809.-P.1221-1229

34. Freiberg A.M., Godik V.I., Timpmann K.E., Kharchenko S.G., Borisov A.Yu., Rebane K.K. Exitation energy transformations in bacterial cells 3tuduied by picosecond fluorescence spectroscopy// Proceedings 5 Intern.Seminar on energy transfer in condensed matter,Prague.-1986.-P.211-212

35. Freiberg A.M., Godik V.I., Kharchenko S.G., Timpmann K.E., Borisov A.Yu., Rebane K.K. Picosecond fluorescence of reaction centers from Rhodospirilluii rubrun/ZFEBS Letters. -1985.V. 189. -

P.341-344

36. Godik V.I., Freiberg A.M., Timpmann K.E., Borisov A.Yu., Rebane K.K. Picosecond kinetics of excitation energy transfer between different pigment-protein complexes and reaction centers in some purple bacteria//Progress in photosynthesis research/

J.Biggins ed.,Martinus Nijhoff Publishers.-1987.V.1.-P.41-44

37. Freiberg A.M., Godik V.I., Timpmann K.E. Spectral dependence of the fluorescence lifetime of Rhodospirillum rubrun. Evidence for inhomogeneity of B880 absorption band//Progress in photosynthesis research/ J.Biggins ed.,Martinus Nijhoff Publishers . -1987 .V. 1 .-P. 45-48

38. Freiberg A.M., Godik V.I., Pullerits T., Timpmann K.E. Directed picosecond excitation transfer in purple photosynthetic bacteria//Chemical Fhysic3.-1988.V.128.-P.227-236

39. Freiberg A.M., Godik V.I., Pullerits T., Timpmann K.E. Picosecond dynamics of heterogeneous excitation energy transfer in purple bacteria//Biochim.Biophys.Acta.-1989.V.973.-P.93-104