Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетические и функциональные свойства изоферментов аденилаткиназы и их роль в энергетике миокарда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинетические и функциональные свойства изоферментов аденилаткиназы и их роль в энергетике миокарда"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ЛИТОВСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ВИТКЯВИЧЮС Конрадас Теодора

КИНЕТИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИЗОФЕРМЕНТОВ АДЕНИЛАТКИНАЗЫ И ИХ РОЛЬ В ЭНЕРГЕТИКЕ МИОКАРДА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС - 1991

Работа выполнена в лаборатории метаболизма ЦНИЛ при Каунасской медицинской академии

Научный руководитель - кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник П.П. Джея

Официальные оппоненты - член-корреспондент Литовской АН,

доктор биологических наук, профессор ¿.А. ЯСАЙГИС - кандидат биологических наук, доцент Ю.П. КАДЗЯУСКАС

Ведущая организация - Всесоюзный кардиологический научный

центр АМН СССР, лаборатория биоэнергетики ыиокарда

Защита состоится ".. &УУРА.. 1891 г. в И часов на заседании специализированного совета К 011.05.01 в Институте биохииин Литовской Акадешш Наук (232021, г. Вильнюс, ул. Мокс-линннку, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института . биохииин Литовской АН.

Автореферат разослан "А®." .>Ь}Щ:'л9~......1ВЭ1 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

збБЙТЕ-БРАЖЕШШЕ В.5?.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность теш. В последние года проблема передача энергии в гивых клетках является объектом пристального вниианил многих исследователей (Saks et al., 1978; Jacobus, 1S85; Bessaan, Carpenter, 1885; Dzeja et al., 1888). ВаАную роль d этом процесса играет креатншшназа (Saks et al., 1978) и аденилатк. наза (I>zeja et al., 1885). Однако, а отлтгае от креатинкинази, участие адена-латкяназы в транспорте энергии внутря к^еткн является сравнительно калоизученым, также как й функциональная взаимосвязь ыевду оботш энерготранспортншк системам. В 1878 году (Даея, Толейгшс п др., 1878) была высказана гипотеза о существовании в аизых клетках отдельной аденклаткиназной систеиы транспорта энергии. Ь осново этой гипотезы лежат различная локализация я согласованное функционирование шггохондриального (AKg) и цнтоплазиатического (AKj) кзофериентов аденилаткнназн. В совокупности аденилаткхптз-ная система открывает возможность передача двух макроэргпческюс фосфатных связей в одной молекуле АТР, этим увеличивая скорость я эффективность передача энергшз а дкффузвонно ограккчекной внутриклеточной среде. Несмотря на то, что возиозность функционирования адешдатгашазноЗ скстеш транспорта энергия была показака между изолированный! и'дтохондрхяш! седда s гексокшазой в система in vitro (Dzeja et al., 1885; Дяея п др., 1888), а позднее такте з скелетных шшцах (Zeleznikar et al., 1£J30), окончательно эта проблема остается нерепенноЯ.

Не менее вакнш является такне вопрос о шшянпи игигяп на функционирование аденялаткшшзиой састеш. Tea более, что возникновение ьшогнх фори сердечной недостаточности шзет быть обусловлено каругенияии ферментных энерготранспортяых ссстец в ¡аокар-диальноЭ клетке (Чазов п др., 1878).

Принятие соврапвгош: АК - адеяняаткяназа, Ар^А - дадено-зшшентгфссфат, ДГОВ - дптво-бпс-нлтробензойпая кислота, ДГГ -датпогрейтол, К§ - креатинфосфат, КК - креатплкгназа, §ц - неор-ганическпЯ фосфат, §ЕП - фосфюенолппруват, ЭДТА - этплендиаита-тетраацетат, ЭГТА - этпленгликол-бкс-ашшоэтнлтетраацетат, Sg -элементарная сера.

Работа выполнена в рамках Всесоюзной научно-технической программ 0.69.01 ("Разработать эффективные методы и средства профилактики, диагностики и лечения основных заболеваний сердечно-сосудистой системы") по теме "Изучение механизмов регуляции энергетического метаб1лизма сердечной клетки в норме и при ишемии", й гос. регистрации 0160С58788.

Даль работы: изучение кинетических и функциональных свойств изоферментов аденилаткиназы, их распределения в миокардиальной клетке, а такае роли аденилаткиназной системы э энергообеспечении ыиокар&иельной клетки в норме и при ишемии миокарда.

Задача:

- определить кинетические характеристики митохондриального и цитоплазматического изоферментов аденилаткиназы.

- изучить влияние элементарной серы на активность отдельных изоферментов аденилаткиназы, на работу перфузируемого сердца и на скорость деградации аде:иннуклеотидов при ишемии миокарда.

- изучить функциональную взаимосвязь между ыитохондриальны-Ш1 изоферментами аденилаткиназы и креатинкиназы.

- изучить возможность функционирования аденилаткиназной энерготранспортной системы в передаче энергии от митохондрий к изолированному актомиозину, а также роли аденилаткиназы и креатинкиназы в процессе сокращения и релаксации изолированного акто-ыиозина.

- определить распределение изофермегтов аденилаткиназы в миокарде и изменения их активности при ишемии.

Научная новизна. Показано, что аденилаткиназная реакция для митохондриального изофермента сердца кролика сдвинута в сторону образования ADP, а для цитоплазматического - в сторону образования АТР и AMP. Соотношение активностей митохондриального и цитоплазматического изоферментов аденилаткиназы- в миокарде кролика составляет 1:1,57. Впервые установленно, что элементарная сера ингибирует цитоплазматический изофермент аденилаткиназы. Влияние серы направлено на SH-группы фермента. На перфузируемом сердце кролика сера оказывает сосудорасширяющий эффект, снижая активность цитоплазматической аденилаткиназы и сократимость миокарда.

В процессе шзешш миокарда сера снизает скорость распада АТР. При ишемии миокарда (1 час) активность мнтохондриального изофер-лента эденилаткиназы (А!^) увеличивается на 40 а иатриксного (AKg) снкгается на 77 % без изменений обцей активности адеьн-латкиказы и ее цитоплазиатического язофераентч (AKj).

Установлено, что скорость синтеза креатинфосфата в ипохондриях сердца завксит от активности аденилаткиназы п соотковеиия ATP/ADP. Внешняя гексокиназа, понижая соотнесение ATP/ADP, конку-рарует с мчтохондрнальной креатинкиназой за АТР, зыходещий из ия-тохондриЯ. Аденялаткиназная система транспорта энергия увеличивает поток энергии от митохондрий к изолированной? актоииозяяу, а крэатинкяназиая система сштает скорость, но увеличивает эффективность этого процесса. После евлгываяия яоноз кальция в Cesua-гохондряаяьиоЗ среде креатшшкаэная, по ко зденилаткиназная сзс-•теиа регенерации АТР обеспечивает релаксацкэ. сокращенного ахтсма-озина,

Практячаское згатяка. Теоротпчгские еиьоды работы об участии кзо£ерментоэ аденклаткияеси р транспорте энергии внутри кг.о-кардиальяоЯ клетки, а тага» о функциональной вьаЕпгосвязи мвдду оденнлатккиазноЯ п креатнккинезиоЯ энерготранспортшш свстодокя

вкявчоку з курс лекций по бпожя д!:п студзлкт ¡СаукасскоЕ лицтшеггой акадешш.

Сбнарузениая способность злг:.интар:»о?! сер:; ясшя'лть скорость распада АТР при ткяот кповаря*, а тага» ояагдаать сосудорз«п$-рлщчй с^окт иохет способствовать поиску «Kmmcsyrrssc ко*«* лекарственных средств.

Солоктпвная т сг""»*' t < « -г " «

0Д2ЯЯ,"ЗГПГКаг;У HOW" " "Т • »» ' Г - •»» * -

скях работа::, р. " * г - * 4

oSso;:r~.;o ингг.йгр''" • п. с. , - < «, -

упяктьея от доро^"^*" * r"4 г*г ** 4 ' '

В ХОД» й'ССГ "г- t ~ i (v "

sasma :§'2SS3, . ~ "s

into шшшаоста с - - - ~ . ; )

кнодейстггл t-rp: , чг гс-» —. * « ** w *•?<• *,

пользуя 4 «sewn " ' тF ' ~ фосфата з схстракто ояологкчгского осьеета.

Публикации и апробащш работа. Результаты опубликованы в 13 научных работах и доложены на следующих съездах и конференциях: 1) на Всесоюзной симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена", Пущино, 1988; 2) на 3-еы симпозиуме Советской секции метдунароиного общества по исследованию сердца, Баку, 1888; 3) на 4-ой Европейской конференции биоэнергетиков, Прага, 1988; 4) на 8-ой конференции Европейской секции международного общества по исследованию сердца, Будапешт, 1987; 5) на 4-ом съезде биохимиков Литовской ССР, Вильнюс, 1988; 8) нр 10-ой конференции Европейской секции международного общества по исследованию сердца, Роттердам, 1889, 7) на 8-ой биохимической конференции Прибалтийских республик, Каунас, 1990.

Объс-ц в стуетура диссертация. Дясертация изложена на 137 страницах машинописи, илюстрирована 22 таблицами и 19 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (238 назв.).

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили сердце кролика, а такэе изолированные митохондрии к актомиозин.

Митохондрии сердца выделяли методом дифференциального центрифугирования с применением трипсина и его ингибитора (Schölte, 1973; Saks et al., 1974). Среда гомогенизации содержала 0,18 мМ KCl, 10 мМ трис-НС1, 0,5 мМ ЭДТА, pH 7,35 при 0±2°С (Дзея и др., 1983). Выделение изолированного актошгозина проводили согласно методике (Honig, 1968).

Потребление кислорода митохондриями регистрировали поляро-графически, применяя закрытый электрод типа кларка (5042-0 "Ра-даометер", Дания). Все полярографические и спектрофотометричес-кяе измерения проводили при температуре 37°С в инкубационной среде, содержащей 0,15 M KCl, 10 «M трис-HCl, 5мМ KHgP04, pH 7,2.

Для рН-метрической регистрации скорости окислительного фос-форилировання и аденилаткиказной реакции в митохондриях использовали комбинированный микроэлектрод Е.-5003 "Sigma" ,США. Измерения проводили при 37°С в инкубационной среде, содержащей 150 кМ

KCl, 5 Idl KHgPO^, 1,25 Iii HgClg, pH 7,2. При использования сахарозной среды, вместо KCl присутствовало, з зависимости от условия опыта, 0,1 или 0,3 ¡¿I сахарозы.

Регистрации сокращения и релаксация изолированного ак-.онно-зина проводили согласно методов (Ebashi et al., 19S4j. Необходимое для релаксация изолированного актоиасзина связывание ионоз а аякубоциокой среды проводили пря помощи 3 «Я L7TA. Активность АН, скорость синтеза KS, концентрации в биологической экстрдто ADP определяли энзжатяческигш ue-одаш на спектрофотометре 557 "Hitachi" пря 340 Ш1 (Уа)кег, Dom, 1S32; Williamson, Согкеу, 188Э).

■Перфузия сердца проводили по Лангепдорфу в взоуетряческоа •ршшз кодифицированным растьоро« Тираде (144 »«'? îteCl, 4 KCl, 1,8 г,'il CaClgt 10 Ш Тркс-KCl, 10 u'i глакога, pli 7,4), пасадеи-■mai кислородом. Акпяятуду сердечтос сокращений кзыаршт при помочи кеханотрона 6 ЮС 1С.

Тотальнул lisешш ииокарда (аутолиз 1 ч) восгроязводъ-та по методике (Araigcr et al., 1878), а в случае перфузируекого сердца - отключением перфузата путей перегаткя аорта.

Изоелектрофокусяроваяяе кэофермептов АК проводили согласно методике (Vesterberg et al., Î8SS) ка аппарате LI© 2117 Hultiphor, Швеция).

Статкстическу» обработку данных при расчет* средней ор^ме-тяческоЯ я среднего хеадратячоского отклонения проводила по (Лакни, 1CS8).

РЕЗУЛЬТАТУ К ИХ ОВВДДЕИИВ •

Определение кзяетесюос cgogcra кптогегтакяльттога ;т ггттго-пласкатгнеского изобергентоэ еданилаткзшкгч-

lias било по—с"*"» —~~ '£€5), пггохондрп-

альянЛ а цэтояяег л 1 А ~ " ? 'Ч сесойти прыгать

в трзясйегт4 * - несган еэ ксполь-

еоп?.!П'Л в'скстс:; in vi*го. -> гяэчода! пспстйпт

Няхззяяса (K-j) г«!^- <* субстр-шо

(табл. 1) поязза- % ч-о »— * р чцгя для с ""г -

алы'ого кзо^ф/о т» 1 сг "Vi сюрочу сераро™-4*- ~ AD?, а для щггспластапгкского - з сторону ооразосанпя AT? a Àf'.P,

Таблица 1

Значения констант Ыихаэлиса (К^ для митохондриального (А^) и цнтоплазиатическогс (АКр изоферментов аденилаткиназы сердца кролика (ь«?)

Значения Кт, икН Среда -:-:---

Субстрат АК<> АК,

инкубации 1

АМР 0,15 U KCl 30,6+2,7 235+27

0,10 М KCl 18,2+2,5* -

0,05 U KCl 9,6+0,9*

Üg-ADP 0,15 A KCl 97,7+8.7 ' 43,1+2,0

Пршечаняе: « - статистически достоверные изменения по сравнении с контроле« (0,15 kl KCl), р < 0,01.

Это соответствует предлоаенной раннее схеые внутрикнеточного переноса энергии с участием этих изоферментов АК'(Джея и др., 1888; Dzeja et al., 1985).

Обнаружено, что при понкаенин ионной силы инкубационной среды от 0,15 мМ до 0,05 ull КС1 уменьшается значения Кш митохондриального изофермента Шу для АИР (табл. 1). Возможно, что это является следствием умеренного набухания ыитохондриального ыа- ■ трикса и сблиления внутренней и внешней нитохондриальных мембран. В результате этого уменьшается неперемешивающнеся мегаекбранное пространство и облегчается поступление AiíP к AKg. К тому se необходимо отметить, что редуцированное ыегмекбранное пространство характерно для митохондрий in vivo (Jasaitis, 1974). Оказалось, однако, что понижение ионной силы и указанном интервале не приводить к изыенбнкв значения Кц дрр окислительного фосфорилирования. Кроне того, с понижением тоничности сахарозной инкубационной среда от 0,3 М до 0,1 !■! сахарозы значение Кщ дур для AKg повышается от 18,3+4,3 шсМ до 25,5+2,8 ш;М (р<0,05), -а значение Ки для окислительного фосфорилирования уменьшатся от 22,2+4,1 до 12,8 ±1,2 к;сМ. Это означает, что влияние ионной силы на значение % АМР Щг ке явлется обуслозленншз только ее осмотическим действием на митохондрии.

Имеются указания на то, что активность АК сердца быка зависит of величены ионной силы среды (Toraasselli et al., 1680). Проведенные нами исследования показали одинаковую активность AKj в изотонических 0,15 Ы КС1 н 0,3 М сахарозной средах. В то не время обнаружено влияние природы аниона инкубационной среды на активность AKj. Так, по сравнению с контрольной 0,15 М КС1 средой, в. 0,15 М СН3С00К среде активность AKj увеличивается на 54 % (р<0,001), а в 0,15 Н KN03 среде - понияается на 20 % (р<0,05).

Влияние элементарной серы на активность аденилаткиназы и работу изолированного сердца кролика.

Показано (Conner et al., 1883), что элементарная сера (Sg) ингибирует аденилаткиназу, однако механизм действия, а такае влияние Sg на активность отдельных изоферментов АК остаются не-выявлениыми.

Как показано на рисунке 1, Sg ингибирует только цатоплазма-тический изофермент аденилаткиназы (AKj) и не влияет на активность митохокдриального изофермента (AKg). Те не саше результаты были получены и с разрушенными (замораживание - оттаивание) китохондриями. Это означает, что неэффективность Sg по отношению к АК2 не связана с ее недоступность» к этому изоферменту в интак-тных митохондриях. В присутствии дитиотрейтола (ДТТ) ингибнцня серой снимается и активность AKj возрастает даже выше контрольного уровня (рис. 1).

Зффект ДТТ (рис. 1) показывает, что действие Sg связано с участием в процессе ингибирования SH-групп фермента. Проведенное нами титрование реагентом Эллмана (ТорЧинский и др., 1977) показало, что количество SH-групп нативной аденилаткиназы (AKj) сера спивает незначительно. Однако, после денатурации фермента доде-цялсульфатом натрия Sg почти в три раза поникает количество его свободных SH-групп (р<0,05). Кроме того Sg уменьшает количество SH-групп свободного цистеина. Таким образом, полученные нами результаты доказывают способность Sg взаимодействовать с SH-rpyn-пша ферментов. Тем не менее, возникает вопрос, почему Sg не ингибирует другие чувствительные к SH-реагентам фермента? Это, очевидно, обусловлено различной реактивностью SH-групп с различными SH-реагентами, которая определяется структурными особенностями SH-реагентов, а такяе локализацией SH-групп в глобуле фер-

Контроль 90 мин. Последующая

инкубация 90 мин. инкубация , с в8 Sg t ДТТ

Рис. 1. Влияние элементарной серы на активность цчтоплагшз-тичаскогб (AKj) и иитохондриального (AKg) изоферыентов одеиклат-киназы (п«5). Концентрация Sg - 50 ыкМ, ДТНБ - 2,0 uli, ДГТ -1,0 мМ. В качестве препарата Sg крподьзовали 1,5 иУ раствор сера в абсолютном алкоголе.

мента (Sabadie-Pialoux et al., 1976).

С пойощья кинетического анализа установлено, что Зд является неконкурентным ингибитором по отног&шш к AMP к ADP.

В спектрофото.'.'етрических исследованиях дифференциальный спектр комплекса AKj - SQ относительно AKj it Sg в ультрафиолетовой области показал, что Sg специфически взаимодействут с адеш;-яаткиназой с образованием фердент-ингибиторного комплекса.

Поскольку Sg обладает липофвльньиз свойстваш, ыожко прод-пологать, что она проникает чероз биологические ыембракы, В этой связи интересно было проследить, как Sg влияет на активность AKj в иитакгном миокарде, а также ка физиологические параметры перфу-зируемого сердца кролика. Судя по иопучоннт результате;,« (табл.

Таблица 2

Влияние элементарной серы на физиологические параметры перфузи-руемо^о сердца кролика и активность цитоплазматической (АК^) аденилаткиназы (п-7)

Амплитуда Проток Активность

Условия сердечных перфузата AKj

опытов сокращений (мл/мин.) (мкМ ADP/шш/мг

(мм) белка)

Контроль 23,5+1,5- 19,2+1,1 1,57+0,15

(30 мин)

Этанол (0,4%) 21,8+2,9 30,5+2,5 -

(20 мин) с.н. p1<5,oi

. Этанол (0,4%) 15,5+1,1 41,5+4,3 0,79+0.12

+ сера* pj<0,02 Pg<0,05 Pj<0,002

' (20 мин)

Прзхечаше: В скобках указано время, после которого делались соответствующие измерения.

Pj - по сравнению с контролем; р2 - по сравнению с этанолом.

* - 1 мл насыщенного раствора серы в абсолютном этаноле на 250 мл перфузата.

2), находящаяся в перфузате Sg снижает амплитуду сердечных сокращений и увеличивает проток перфузата. В этих опытах ставили контроль на этанол, поскольку в нем была растворена Sg. Сосудорасширяющий эффект этанола известен. В наших опытах он также увеличивал проток перфузата, но в комбинации с Sg вазодилатация увеличивалась еще на треть. Эти результаты в совокупности позволяют отнести Sg к новому классу сосудорасширяющих веществ. Необходимо отметить, что действие некоторых ныне используемых сосудорасширяющих веществ также связано с их влиянием на SH-группы бельков (Thadani, 1887). Обнаружений также, что после перфузии сердца с Sg в миокарде на 2Р % снижается общая активность АК. Это снижение в основном обусловлено ингибированием AKj, активность которого снижается на 50 % (табл.2). Поскольку AKj участвует в энергообеспечении сокращения миофибрилл (Dzeja et al., 1985), падение его активности может повлечь за собой снижение сократимости сердца

(табл. 2). Однако, регуляция сокращения сердечной мышцы достаточно слошшй процесс и делать однозначные выводы пока нельзя.

Функциональная взаимосвязь иевду аденилаткиназэй и креа-тинкинозой в митохондриях сердца кролика.

Известно (Ozawa, 1938; Jacobus et al., 1973; Дяея и др., 1883), что активности локализованных в мешембранном пространстве «ктохондри^лькых изоферментов АК и КК в отдельности вполне хватает для поддержания дыхания митохондрий в присутствии AMP или креатина и АТР на уровне близкой максимальному. Однако, в присутствии физиологических концентраций KS, «аксиальный уровень дыхания шггохондрий достигается лишь при' наличии в системе креатина и АЫР (Джея и др., 1883). К тому ае, оба изоферыента выступает в качестве первого зезиа соответствующих адекклаткиназноО (Dzeja et al., 18S5) и креатинкиназной (Saks et. al., 1874) зиер-готранспортных систем. О возможном функциональном, езаишдействйЕ иитохондриалыюй КК, А1С и окислительного фосформирования отиг-чается в работах Бессмана (Веззвап et al,, 1878, i860, 1881). С целью дальнейшего изучения функциональной взаимосвязи чешду шг-тохондряальной АК и I® ш регистрировали скорость синтеза М ш:-тохоидрлями сердца кролика в присутствии в инкублционной среде креатина к'различных комбинаций адеишшуклеотвдов. Для определения влияния АК на скорость синтеза К§ параллельно проводили кз-ыорения б присутствии ингибитора аденкпаткяиази - ApgA. Накск-иалышя скорость синтеза KS бала обиаругсо при наличии в среде AMP ш АТР (0,16 к'.!). В этих условиях такие наиболее выражена роль АК, она на 31,5 % увеличивает скорость синтеза Ш (рис. 2). Однако, с повызениеы концентрации AT? до 1,0 кН АК понижает скорость синтеза К$ на 17 % (рас. 2). Это означает, что при паэкгос концентрациях АТР (0,18 кМ), мктохоцдряальная одеиилаткиназа (AKg) выступает в роли регенератора АТР, а с увеличение« концентраций АТР (до 1,0 i2J) AKg вступает в конкуренция с КК за АТР,

Наш таю:© обнаружено, что с увояяченкеы концентрация гек-сокинави и при наличии 1,0 Ш АТР о -кнкубацттоЯ среде скорость синтеза Ш нитохондриальноЕ крг<шшкю$азо8 постепенно падает. Б то re время концентрация ADP в шеубацшншой сроде- увеличивается пропорционально падению скорости синтеза К§. Это означает, что гексоккваза способна конкурировать.с штохопдриальиоЕ КК за пс-

Û Ж

fi ATP 0,Г6Й1 ,V1? ОЛбй? /!*? •»0,16-Л ATP 4-Î.Gtil ATP

Fisc. 2. Вляякке адетшшгшгзга ка скорость езягеса креатет-фосфата .кятоховдрэдш сердца гфалнга, о гаеяашостн от ксацеитра-ЦЗИ AT? (ЫЗ). Контроль » СЙСТЛЦЗ СТОЯбЗЗН, 35ПТрТ1Х0ГтНШ? - посла введения 50 istfl ApgA. Концгптрэдая изтожщрааяьного балка -0,13 мг/ия, субстрат окзслаша - 1,0 »:'! Шфуяата * ката. * - статкстотаскз достосергш kcîïsschsîî по срааяапяэ с контролем (р<0,001)

пояьгоеаивж Aï?, кал шсевзго, тая я cmeaïqayntaro э :«уоясядр-ях. Зтот факт прятчатозаа с учггс?! того, что !0Г кягет Солее близкое расположила к путли AT? ез ггшйсоц^пй п, вероятно, сбрззуат фувацзоаалыг-З кож-гкс с ацг^гауг^естидтрапмо-чавоЯ (Saks ot ai., 1Q76). В то гг время, гекеогтвазкая реакция ппаатячссги с тсфцодашше«® яшгяется болов г^оэтппкой, чгм

(Ниатепкопз et al-., ÎCCO). 5то, варо-тгао, я ся-р-эдэдяз? есход rrî rcrrrQ-p; ** 1 ""jarrc-c r.'I.

Прозэдешп ет всс-здо::*. г.; cc«Jt'cct* * ^-»«noBspotsatmn впсг.яттсхоадргальго2 ШС с использованием $сс2<юяо.«жруеата аш) п шфусаткгшаса а качестве МГ-рзгопсряруг^зй crrcTstai позагзлз, "та скорость скатеза I© аааяепт с? кокцбктрацяп С>„ э myffausomd! среде. Прп осэдешш 15 кЗ С-и скорость сяитеза КЗ поснззстся почтя

в десять раз. Однако, при увеличении концентрации Ф„ до 30 мМ наблюдается понижение скорости синтеза КФ на 15 % (р<0,02). Последнее можно объяснить определенным уменьшением фосфатного потенциала среды, а также ингибкрущим действием Фн на КК {Четверикова и да., 1Р78). В отсутствие указанной АТР-регенерирующей системы, каличие 15 мЫ Фн в среде повышает скорость синтеза КФ всего лишь на '37 X (р<0,01). Дальнейшее увеличение концентрации Ф„ з среде до 30 мМ ие влияет на скорость синтеза КФ.

Примечательным является то, что в отсутствие в инкубационной среде Фй АТР-регенерирующая система не увеличивает, а снижает скорость синтеза КФ. Анализ этого явления показал, что в среде без Фн КК ингибируется фосфоенолпируватом (I50" 0,45 мН). Ин~ибв-руицее действие ФЕП на М отмечено также и в работах Четвериковой с сотр. (Четверикова и др., 1978). Тем не менее, группа Сакса (Сакс и др., 1977) не наблюдала этого эффекта. Однако в этих экспериментах при измерении активности КК был применен трис-калия ацетатный буфер (50 мЮ. В подтверждение этому в наших опытах в среде без Фн, в присутствии 50 ыМ ацетата калия ФЕП не влияет на скорость синтеза КФ.

Таким образом, ингибирущий эффект ФЕП на КК связгн не только с отсутствием в инкубационной среде Ф„, но и ионов ацетата.

Роль аденилаткиназы и креатинкиназы в процессе сокращения и релаксации изолированного актомиозина сердца кролика

''оказано (Д«ея и др., 1986; Dzeja et al., 1885), что АК увеличивает скорость и эффективность передачи энергии от митохондрий к гексокииазе в системе in vitro. Для дальнейшего изучения энерготранспортной роли АК мы использовали более близкую к условиям in vivn систему, включающую изолированные митохондрии и актомио-зин сердца кролика. При поступлении энергии в виде АТР происходит сокращение (суперпреципитация) изолированного актомиозина, которое, согласно литературным данным (Kohama К. et al.1986), аналогично сокращению миофибрилл in vivo.

Использование вместо митохондрий АТР-регенерирующей системы, состоящей из пируваткиназы и ФЕП, показало, что амплитуда и скорость сокращения изолированного актомиозина в присутствии АТР зависит от концентрации пируваткиназы. С повышением ее активности до 5,МЕ/мл скорость и амплитуда сокращения изолированного акто-

инозина постепенно увеличивается. Это означает, что изолированный актоияозян, подобно натязкыы ииофиориллац (tfallieann et al., 1884), чувствителен к изменению соотнопения ATP/ADP а величины энергии гидролиза АТР. Сбнарувено таюае, что скорость сокр^ения изолированного актоиизина увеличивается с воповстаниеы фосфатного потенциала среды. Это соответствует аналогичной зависшюсти сокращения сердца от величины цнтоплазыатяческого фосфигного потенциала миокардиальной клетки (Gioba, 1885). Оказалось, что скорость сокращения изолированного актоинозина падает с увелпеннем концентрации Зц во внесшей среде. Эффект 5Ц такне, очевидно, обусловлен пошшениеи фосфатного потенциала среда. Кроме того, накопление иоает веста к ннгнбкроваш® КК (Четверзкова а др., 1876), учавствувцеЯ в энергообеспечения шофзбралл (L'cCIelian et al., 1883; ШИпапп el al., 1884).

Таюш образом, как скорость, так я амплитуда сокращения ггзо-лированкого актомзозика прямо зависят от его энергообеспечения.

Наиа было показано, что добавление АК (7,3 tSS/ia) з сгстеиу, зключащ/э югеохоядрия н изолирований актоадозан, а присутствии < ADP (20'пла 100 шсМ), увелячнваэ^ скорость и егяшпуду сократим актоьшозина. С учестом скорости сокращения изолированного актоинозина, которая наблюдается в тех зэ услов:их в отсутевпе шгго-хондркй, становится очевздкиа, что зффект экзогенной АК обусловлен главныа образон ее АТ?-регепешфзру2~еЗ акпсностьэ. В то е-з вргая результата, полученные с пр:п'енениеи высокоспецкфяческого . ингибитора аденплзтшшеа Ар^А, показывает:, что, даm с учете:! чисто АТР-регенер.-фуи^еЯ аденнлатккяазкоЗ активности, как скорость (ряс. S), так а еипяптуда сокращения изолированного акто-ыгознна пря ннгпбирозанки АК существенно енкеаптся. При этом не-сбходга» учесть, что ApgA не действует иа активность актоипози-иозоП АТРазы (Kurebayashi at al., 1SS0), а такие на скорость окислительного фосфоралировання иатс>хоадра2 (Luslorff et al., 197В). Регистрация дахшш матохондряЗ в присутствия изолированного актоызоззна после введения 100 АТР показало, что пяпл-бирогакзе АК а этях услоззяя оттает Vg скорость дахання кзто-хаздриЗ (рпс 3).

При инициация сокращения азолировакиого актоинозина низкоЗ концонтрадаеЗ АТР (10 ккН), шггохондрап (0,03 «г белка/из) почта в два раза увеличивают скорость а амплитуду сокрпг,енкя язолпро-

-AX +AK -АК +AK

сокращение дыхание актоииозика шгсохондрий

Рис. S. Влияние ингибирования аденилаткиназы на скорость сокращения изолированного актошюзнна и на скорость Y3 дыхания митохондрий в системе ir vitro. Концентрация актошюзина - 0,5 ыг белка/ми, митохондрий - 0,03 иг белка/ыл (сокращение) и 0,5 кг белка/ил (дшсанке). Субстрат окисления для митохондрий - 4 мМ а-кетоглзотарата. АК ингибировалм с помощь» 50 мкИ Ар^А.

ванного актоииознна. Это означает, что митохондрии участвуют в процессе роггиераини АТР. Ингибирование АК в этих условиях ведет к падению скорости и амплитуда сокращения изолированного акто-ииоэина.

Таким образом, представлены вше данные указывают на ва£-ноеть функционирования АК в процессе энергообеспечения изолированного октошюзкка.

Изучение роли КК в системе in vitro, состоящей из изолированных митохондрий и актомиозина, показало, что б присутствии креатина, № и 100 мкЫ ADP, экзогенная КК резко увеличивает скорость сокращения изолированного актомиозина (рис. 4). Однако, скорость V3 дыхания митохондрий в этих условиях после введения 100 мки АТР КК заметно снижает (рис 4), Это означает, что в данных условиях проявляется роль КК как термодинамического буфера (Meyer fet al., 1884; Stucki, 1S80), т.е., КК, увеличивая скорост

+КК

к

т

t

сокращение актомиозина

дыхание митохондрий

Рис. 4. Влияние креатинкиназы на скорость сокращения изолированного актомиозина и на скорость Vg дыхания митохондрий в системе in Yitro. Концентрация креатина - 10 мМ, КФ - 15 мМ, КК -2,7 МЕ/мл. Остальные условия см. в подписи к рис. 3.

сокращения изолированного актомиозина за счет регенерации АТР, снижает количество ADP, способного обратным сигналом поступать к митохондриям и стимулировать их дыхание. Тем. временем, образовавшийся креатин является сравнительно Малоэффективным активатором дыхания митохондрий сердца (Дяея и.др., 1983).

Поскольку релаксация мышцы также является энергозависимым процессом (Eisenberg et al., 1985), мы исследовали роль АК и КК в этом процессе. Сокращение изолированного актомиозина инициировали добавлением 100 мкМ АТР. Оказалось, что в отсутствие митохондрий при связывании ионов кальция только КК при наличии КФ в среде способна вызвать релаксацию изолированного актомиозина. При этом .уровень релаксации увеличивается с повышением концентрации КФ, что может быть обусловленно соответсвущим увеличением АрР-рефосфорялирующего потенциала миофябриллярноЯ КК. Кроме того, существенная часть адениннуклетидов, з том числе я после сокращения увеличивающийся пул ADP, является связанымя с мяо$кбрнл-лами (Meyer et al., 1884; Zeleznikar et al., 1SS0). Возможно, именно поэтому мзофибрилляряая I®, прикрепленная к М-лшшлм ыло-

фибрилл (Wallimann et al., 1984) и находящаяся в тесном контакте с данным пулой ADP, способна рефосфорилировать его и вызывать релаксацию изолированного актомиозина. Тем временем, для АК потребность связывания ее активным центром одновременно двух молекул ADP затрудняет регенерацию асоциированного с миофибриллами пула ADP, а вместе с этим и релаксацию изолированного актомиозина.

Изменения активностей изоферментоз аденилаткнназы и влияние элементарной серы на содержание адениннуклеотндов в миокарде кролика при ишемии.

В настоящее время известно (Frank et al., 1884), что в иио-кардиальной клетке существуют три изофермента АК, различающиеся кинетическими, электрофор этическими к «монологическими свойствами. Это цитоплазматический изофермент (AKj), локализованный•в цитоплазме, митохондриалькый изофермент (AKg). находящийся в мэг-ыембранном пространстве ыитохондрий, а такке «атрнкснын игофер? мент (AKg), локализованный в шзтохогадриальнои матриксе. Известно, что изоферменты AKj и AKg является составной часть» аденилатки-назкой энерготранспортной системы (Dzeja et al., 1985), a AKg играет вахнуэ роль в процессе субстратного фосфорилгрования (Heldt et al., 1987). Влияние ишемии на активность изоферыентов АК до сих пор является мало кзучекым (Авилов к др., 1934; Толейкис и др.,1838).

Как показали наши исследования, активности изофериеитов АК с тканевом экстракте контрольного миокарда распределены следующим образом: AKj - 43 %, AKg - 20 AKg - 25 %. После 1-часовой иие-шш эти значения были следующими: AKj - 46 %, /Jig - 47 %t AKg -7 %. Примечательно, что соотношение как.® измеренных активностей пзоферглентов АК| и AKg (i,57:i) соответствует данным других авторов (fe'alker et ft1., 1882) для сердечной маэд» бика, где оно равно 8:2.

Анализ изшгстШ активности изоферыентов АК в тканевом экстракте миокарда после шазш показывает, что активность AKg посылается на 40 %, а активность АКд уменьшается на 77 %, Общая ьдшшдашказпая активность, как к се цатоплазиатического нзофер-копта при зток не изменяется. Наряду с спектрофотометричесмш определением активности изоферионтов АК ми проводили изоэлектрофо-

кусирование белковых фракций тканевых экстрактов контрольного и ишешЛеского миокарда. Изоэлектрофокусирование показало увеличение активности для АК2 на 31 % и понижение для АК3 на 42 % после 1-часовой ишемии. Это согласуется с данными, полученными спек-трофотометрическим методом. Оказалось также, что при ишемии количество белка изоферментов АК2 и AKg не изменялось.

Выявленное ранее (Толейкис и др., 1986) снижение активности изофермента АК2 после 30-минутной ишемии в изолированных митохондриях как бы противоречит нашим результатам. Необходимо, однако, отметить, что при ишемии (Кальвенас и др., 1984) и в процессе выделения повреидается целостность как внешней, так и внутренней митохондриальных мембран. Это может привести к выходу данного изофермента, находящегося в меямембранном пространстве, во внешнюю среду. Этим можно было бы объяснить понижение активности Изофермента AKg в изолированных митохондриях. Причины повышения активности AKg в тканевом экстракте пока неизвестны. Возможно, что при этом имеет значение переход АК2 из митохондрий в другую структурно-функциональную среду и изменение физико-химических свойств цитоплазмы в ишемической клетке.

С одной стороны, выход изофермента AKg из митохондрий может отрицательно сказываться на функционирование аденилаткиназной энерготранспортной системы (Ддея и др., 1986.; Dzeja et al., 1985). С другой стороны, повышение активности АК2 должно способствовать увеличению мощности АТР-регенерирующей системы, и таким образом, может играть положительную роль при ишемии.*

Причина и роль снижения активности изофермента АКд также пока не ясча. Поскольку этот изофермент играет важную роль в процессе субстратного фосфорилирования (Heidt et al., 1987), наблюдаемое после ишемии значительное уменьшение его активности монет отрицательно сказываться на энергетическом состоянии и стабильности самих митохондрий. Однако, с дугой стороны, уменьшение активности АКд может быть рациональным если считать, что образовавшийся во время субстратного фосфорилирования GTP в большей степени может использоваться в белок синтетических реакциях и способствовать протекании репарационных процессов.

Как было отмечено ранее, Sg, обладая липофилными свойствами, способна проникать через биологические мембраны и ингибироват! изофермент AKj. В этой связи т исследовали влияние Sg на дегра-

дацию адениннуклеотидов в перфузируемоы сердце кролика при ишешш. Обнаружено, что скорость распада АТР в периоде до 15 минут ишешш миокарда без SQ составляет 34,2+2,4 нмоль/мин/г влажной ткани, а в присутствии S0 - 21,5+2,5 нмоль/шш/г, т.е. снижается на 37,1 (р<0,02). В присутствии S8 также отмечена тенденция к снижению скорости падения общего количества адениннуклеотидов при ишемии. Эффект Sg нельзя целиком отнести только к ингибированию AKj, так как показано. (Баужайте и др., 1987), что Sg также обладает умеренным разобщающим и ингибирующим действием на дыхание митохондрий сердца, а в комбинации с ДТГ иигибирует аденшгауклеотидтран-слоказу. Тем не менее, способность Sg понижать скорость распада адениннуклеотидов при ишешш миокарда может иметь определенный практический интерес.

ВЫВОДЫ

1. Митохондриалышй изоферыент адензлаткииазы (AKg) сердца, кролика характеризуется высокий сродство!.; к AMP (КЕ дщ*« 9,6 шШ;

цддцр0 93 шШ), а цитсплазнатлческмй изоферыент <АКд) - к АВР (Km Аир= 235 (.'.к?!; KQ 43 мкМ). Это показывает, что адеа:;-

латкипазная реакция в митохондриях сердца кролика сдвинуто в сторону образования ÄDP, а в цитоплазме - в сторону образования АТР к AMP.

2. Активность адеиалаткииази зависит от природы анкона инкубационной среда. Так, ионы ацетата окавывгют актнвкрущое, а ионы нитрата - ингибирующае действие,

8. Элементарная сера селективно иигибирует цитонлазаатичас-кий изофармонг аденидаткшшаи (AKj). Ингнбирувчнй з^фокт сора обусловлен взаимодействием с БН-группами фермента. Сера является иекошэд*,ь з и отаоыенкк AUP и ADP кнгкбиторон AKj.

4. Нп Пч-jx уо/?/емом сердце- кролика элементарная сер*, окази-ваот сосу; ориСш.^« днй аффект, иигибирует актввиоеть цатоплаша-тачсского ,.»у '-(¡та адеишгатгашаш и евкааот сократимость ьшо-кврда. Пр »_ si , юкарда элементарная сера сюиает скорость распада АТР.

Б. уазду шггохопдрнальшш ввофорешшши адокалыткштвы к 1фаатяшашаш суцзствует опрадоленнал функциональная ввашосшшь. В присутствии АКР в области шкашх концентраций AIP (0,Ш.й!) адо-

нилаткиназа увеличивает, а в области более высоких концентраций АТР (Г,0 мМ) - снижает скорость синтеза креатинфосфата з процессе окислительного фосфорилирования. Это свидетельствует о возможности положительного взаимодействия, а также о конкуренции между данными ферментами за общие субстраты. . —

6. Экзогенная гексокиназа, понижая отношение ATP/ADP, конкурирует с ммтохондриальной креатинкиназой за АТР, синтезируемый в митохондриях. В АТР-регенирующей системе, включающей фосфоенолпи-руЕат и пируваткиназу, лишенной анионов фосфата, креатинкиназа ингибируется фосфоенолпируватом (150=0,45мМ). Ингибирующий эффект фосфоенолпирувата предотвращается анионами фосфата или ацетата.

7. В реконструированной системе, состоящей из. митохондрий сердца и изолированного актомиозина, аденилаткиназа и креатинкиназа увеличивают скорость и амплитуду сокращения актомиозина. При этом, аденилаткиназа увеличивает, а креатинкиназа - снижает скорость дыхания митохондрий. После связывания ионов кальция в безмитохондриальной среде креатинкиназная, но не аденилаткиназ-ная система регенерации АТР обеспечивает релаксацию сокращенного актомиозина.

8. В миокарде кролика активность цитоплазматического (AKj), митохондриального (АК2) и матриксного (АК3) изоферментов адени- . латкиназы составляет соответственно 46, 29 и 25 % общей аденилат-кина?ной активности. После 1-часовсй ишемии миокарда, активность митохондриального изофермента увеличивается на 40 %, а матриксного - понижается на 77 $ без изменений общей аденилаткиназной активности.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Виткявичюс К., Трумпицкас А., Дяея.П. Кинетически«; особенности функционирования митохондриальной аденилаткиназы //

В сб.: Актуальные вопросы исследования роста и репарации тканей. - Каунас, 1985. - С. 18-19.

2. Виткявичюс К., Джея П., Толейкис А. Кинетические особенности функционирования митохондриального и цитоплазматического изоферментов аденилаткиназы // Тез. Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена". -Пущино, 1986. - С. 28.

3. Dzeja P.P., Vitkevicius K.T., Toleikis A.J. Uitochon-drial and cytoplasmic adenylate kinase of myocardial cells: kinetic parameters and possible physiological significance // In: 3th Symposium of soviet section of the Internationpl society for heart research. - Baku, U.S.S.R, 1986. - P. 49.

4. Dzeja P., Kalver.as A., Vitkevicius K., Toleikis A., Praskevicius A. On the role of cellular energy uetabolism // In: 4th European Bionergetics Conference. - Praque, 1983", - P. 335.

5. Dzeja P., Vitkevicius K., Toleikis A., Praskevicius A. Functional interrelationship between adenylate kinase and creatine kinase in rabbit heart Bitochondria // J. Mol. Cell. Cardiol.

- 1887. - Vol. 19, Suppl. III. - P. S.20.

8. Днея П.П., Виткпвич»с К.Т., Бауяайте И.О., Банене Р.П., Григалюнене В.И., Толейкнс А.И., Прашкявичюс А.К. Физиологическая роль изоферментов аденилаткиназы // Тез. к IV съезду биохимиков Литовской ССР "Достижения Бкохимиа в Литовской ССР". - Вильнюс, 1888. - С. С7-8Э.

7. Vitkevicius К.Т.,' Dzeja P.P., Toleikis A.J. Effect of myocardial ischenia on the activity of adenylate kinase is^enzy-шез in rabbit heart mitochondria and myocardium // J. Mol. Call. Cardiol. - 1889. - Vol. 21, Suppl. IV. - P. S.12.

8.'Vitkevicius K., Dzeja P., Toleikis A, Praskevicius A. Kinetic and functional properties, of rabbit heart mitochondrial and cytoplasmic adenylate kinase // Eksperimentine biologija.

- 1880. - Nr. 1. - P. 58-61.

8. Виткявичюс К., Джея П., Толейкнс А. Роль аденилаткиназы и креатинкиназы в передачи энергии от митохондрий сердаа к изолированному актомиозину // Экспериментальная биология. - 1890.

- № 2. - С. 44.

10. Джея П., Виткявичж: К., Баукайте И., Багдонайте Д. Функциональные особенности еденилаткиназноГз систем внутриклеточного транспорта энергии in vitro // Экспериментальная биология. -1980. - & 2. - С. 55-58. ■

11. Виткявичюс К.Т., Джея П.П. Изменение активности нзофер-ментов аденилаткиназы сердца кролика при киешш.// Еэл. эксперта, биол. и мед. - 1990. - К 8. - С. 148-149.

12. Дагис А.И., Виткявичюс К.Т., Бальчюнас Г.А., Гендвилене В.И., Джея П.П., Толейкис А.И. Влияние элементарной серы на активность аденилаткиназы и работу изолированого сердца кролика // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1990. - № 10. - С. 377-379.

13. Виткявичюс К.Т., Джея П.П. Влияние ишемии на активность изоферментов аденилаткиназы в миокарде кролика // В кн.: Труда научно-производственного объединения "Фермент" и Литовского фармацевтического общества. - Каунас, 1990. - С. 30-34.

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ЛИТОВСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ВИТКЯВИЧЮС КОНРАДАС ТЕОДОРО -

КИНЕТИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИЗОФЕРМЕНТОВ АДЕНИЛАТКИНАЗЫ И ИХ РОЛЬ В ЭНЕРГЕТИКЕ МИОКАРДА БУМАГА ТИПОГРАФСКАЯ 60x84 1/16. ТИРАЖ 100 ЭКЗ. ЗАКАЗ 257. УСЛЛЕЧ.ЛД.00. ОТПЕЧАТАНО РОТАПРИНТОМ В ИНСТИТУТЕ ИНФОРМАЦИИ ЯИ1ВЫ.232000.ВИЛЬНКС,ТОТОРЮ 27.