Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

кДНК-гибридизационные зонды для идентификации рота- и коронавирусов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "кДНК-гибридизационные зонды для идентификации рота- и коронавирусов крупного рогатого скота"

всероссийский н^учно-ессжвовататьский институт экстшгамезналеной ветеринарии теш я.?.коваленко

российской академии сеяьшэхозйственшг наук

На нравах рукошси

гращук владшир Николаевич

кднк- гиБндагащшнныЕ зодаы для клкнтяшдцш рота- и к'оронавйрусоз крупного рогатого скота

03.00.23 - биотехнология

Авто р..о ф э р а т диссертации на соискание ученей степени кандидата Отологических наук

Москва - I9S2

работа выломана в лаборатория молекулярной бжшэтш и биохимии Всероссийского научно-исследовательского института экспераментапшой ветеринария имени Я.Р.Коваленко и лаборатории биосинтеза нугсшиновых кисло г Института молекулярной биологии имени В.А.Зпгазьгардта Российской ¿кадзыии Наук. •

Еапный руководитель

Завздувдяй лабораторией молекулярной биологии и биохимик БКЗВ, академик РАСХН, профессор Г.О.Корсшслоз.

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарные наук, прсх^ссор Б.Г.Оршзкин- (Всероссийский к&учно - исследовательский -институт эксггзрзыэнтзльясй ветеринарии ш.5. Я.Р.Козаленко). .

Кандидат сйаюгичвсхшс наук В.А.-Краевсккй (йасютуа- биологии развития км. К.Е.Кольцова).

Вздущеэ учрзздениз - .Московская вэтсржнарная аквдокия ка&пп К.К.Скрябина. /

адата состоится " ^ ; С^-МС-Сиу^^с- 19Э2 г. в

часов на засздяшз специалкзированЕого совета К.020.26,01 по зада® диссертаций на соисканзэ ученой сгешш. кандидата паук при Всвросси£<зиж научао-исслэдозательском институте окспврг&и-тзльной зэтервнзрзгя аш -Я.Р.Ковалэнйо по аддээсуг 105472, Москва, Кузьмазнн, Б15ЭВ. * • ,

С дасеертшегзй ызазо овнакс&шься в библиотеке ВШВ.

¿вторефэрспг разослан " « /С-О'ЛСу "^^ хэзг г.

Гчегый секретарь спец^млзгировгагого совета, кяц.цздат ветерзларшх каук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы: Одной из главных пртля гибели молодняка сельскохозяйственных гошотннх з постна? альный период является острее., гастроэнтериты, вызываемое бактериальной инфекцией или знтеропатогевныш вирусаж (Vanier r. et al., 19ВЗ)- Среда представителей семейств эытэропатогвннюс вирусов рота- и короназсруен составляют основную грушу возбудителей изфэкционши гастроэнтеритов (Holrces х.н.t et al., 1983; Estes '¡ff.X. et al. j "¡983; Spaan W. st al., 19B8). По данным Mebus С.A. et. al. (1969), ЛЭТВЛЪЕОСТЬ ДЛЯ 50ВОрОЗ[ДеЕКНХ телят При ротавирусном гастроэнтерита варьирует от 15 до BCS. Исследованиями House J.А. (1973) было устансвжно, что каздый чагварпй случай гибели телят от да бактериального гастроэнтерита происходят по щжчкЕб коронавирусной ЕЕфекцяз. ;

Для дзагнссзиш рота-, й коронавирусных инфекций применяются разлпгшке метода; изоляция вирусов в культурах клеток, серологические, прямая и т,®уяозлзктронная ' микроскопия и здей^рофораз в ноляакрЕламидаом .геле . (Букркнсквя А.Г.. 1986; Горбачев 2.Н. и соав., 1589).' ' J .

Однако, метода изоляции рота- (BR7) .и хорэнавируса (ВС7) крупного рогаюго скота пвлзотся достаточно, трудоемкие и занимают большею количество времени; неида электронной микроскопии - технически слошщ и малопригодна для проведения массового анализа образцов (ïaporta I. et al-, 1979; Sharpes R.L. et al., 1975: Cfcasey D. & Lucas M.A., 1577; Prasad B.V.Y. et al., 1988). Метод алектрсфоретаяеского исследования вирусных нухлешовыг кислот в агврозшх г таляакр&язшдаах галях широко применяется 'при изучении вариабельности вирусного генома и для электрсфорегйПйрованйя различных итгмкоз ротавяруссв (Kodger S.M. çt al., 1977; woOrae H.A. et al,-,1932). ■

Дчя идентификации жоготестэивм гпташов рота- и корона-ьчрусов яспаяъгузтся ?ггсг.э традиционные серологические метода -резкая Е9йтрализ2Ц5зе горжжепшг • гегагтлзказаеаи. связывания компгети-га г. шазвофэркэзтшгй анализ (Гоголзв S.H., Коромыслов Г.®., ISS4; 1938). Дальвёйзбну распространенна этез: катодов в Сйрбйблеаеой стешет препятствует кнь^тельп&я вариабельность новергвостпш: гяннспротзкнов рота- и коронавкрусс®, обусловленная активный* процессами гэнеткчэской рэконокгаЕЯи пх IHK (Faulfciei—Yalls G.?, et al,. 1932: Hundley F. et al., 1937; Spaan

w. et al., 1988). По этой же причине существующие на сегодняшний день вакцинные препарата нэ в полной степени обеспечивав? надежную защиту кязотвих от рота- и коронавирусвого возбудителей. В сеязи с вуза воееикавт необходимость создания эффективной ганно-шшэнерЕОЙ вакцшш ( îiidtheen К- et al.» 1965; Offii P. et al., 1986; Estes K.K. et al., 1987; Spaan W. et al., 1988 ), a такк-з разработав новых методов диагностики рота- и коронавирусной инфекция, основанных на достижениях современных методов молекулярной биологиг я биотехнология. Такзм перспективным диагностическим катодом является метод молекулярных гябрщдазационкых зондов.

- Этот метод основан на гибридизации тем или иным сшсобои меченого зонда с нуклеиновыми кислотами- вирусов, или

эуг.ариот, обусловленной кошленентарностью спецпйччзсх-сой нуклеотатдьой последовательности зонда г уникальной последовательности нуклеиновой кислоты сйслсгяческого объекта. Учитывая определенную коксорвативность конкретного участка генома, несущего ползун шформа^ш о характерном для данного рода вирусов белке (Езпртаэр, Еирусосшцифггаской.РНК-иолшэразз рота-или коронаежруеэз) » представляется возможней разработать шбриди-зацнонккй сокд для обнаружения всех представителей этого рода (Coiisn J. et al-, 1934-; Estes a.К. et al.,. 1984). Использование же в качестве молекулярного зонда последовательностей генов, кодарушдас яовархноствк& вирусше протеины, предоставляет реальную возможность для ди&$ерзвцяэльяой вдэЕте$якацаи рота- и коронавирусэых кгазшов, относящихся к различным теротипам (Ricoardaoîi iâ.i. et al., 19S4-; ïotter ¿.A. et al., 1937? Naïagomi T., Nabagoau. 0.. 1989)-

Несошзнзэ, что кгашэксная задача выделзшя последовательностей генав, кодируиплх вадр- или тшослецЕфгчэсккз антигены роте- и короназгруса KFC; ш. ашлвфакацяи в составе генетических векторов, продуктивного синтеза зирусяых антигэнов з экспрессярухааа векторах с -целью последующей разработай генно-мнаенэрша вакцины додана решаться поэтапно путем:

(I) ?лолокуляршго синтеза - кДНК- вирусных последовательностей;

(II) получения представительной библиотека- варусшх генов в каком-либо фнговом Езк.торэ, (III) выбора подходящих для разработки жегностечзского зонда фаговых :сл<зноз, (ГУ) перегслонироБань'я ешящйщяроввныых вирусных последовательностей в плазмидный вахтер с последующим их клонкрованиэм в составе

зкспрессирупцих векторов.

деда;_и_за£взг_исслеаовяяийл

Целью настоящих исследований являлось конструирование специфического. гибрвдизационного зонда для идентификации коронаЕзруса крупного рогатого скота, осуществляемое путем молекулярного синтеза кДНК на матрице геномной Ж штамма КЛ 2 коронавируса КРС, а такке клонирование синтазирзванзых кДЯК в фаговом векторе A gt 10 ив экспре сслрущем таггмидном векторе pgem4-z. Кроме того, предусматривалась, -разработка гибридиза-циоеного ротавирусного зонда на основе рекоыбинштной плазмида pBRY.o6.; отработка оптимальных условий право довил дот-гибрндизациозного анализа, используемого для здентификации рота-к корокавнрусов КРС, а также . сравнение его с другими методами обнаружения зтпх вирусов.

Для достижения поставленной цели в процессе работы необходимо било решить следующие задата:

1. Провести электрофореткче схоз исследование Ж выделенных: в различных регионах страны штаммов и полевых язолятов ротавируса КРС для послэдупцего педтверздения результатов дот-габрядязацгонного анализа..

2. Получить кДНК- .ратавпруенкй зонд и отработать условия достижения максимальной чувствительности и сшщфвчваст ДНК-РНК та брядиз агшеьнаго анализа, используя образцу выделенных ротаваруешх РНК.

3. Осуществить молекулярный синтез дИНК короназяруса крупного рогатого скота; провести молекулярное .клашровзвиэ последовательностей короваверусноЯ кДНК в фаговом. Еэкторэ. я gt ю и перэклонкровать их в эксярессирувщий вектор, pGSm-Z. ,

4. Отобрать рекокбинантннй клон, седэргащий. дЩЗК- последовательность, подходам ю для конструирования специфического коронавкрусного ГЕбридЕзацаовногс зонда. '

Ь. Отработать дат- гибридазадаонвый метод ейнерунення . РЯН коронавируса КРС в культур альзом и фекальной материале с Еспхользсзээяем сконструированного молекулярного згада.

Научная новизна работе. Впервые е отрззз осуществлен нолэкуляршй синтез кДНК' на матрице геномной Ж итк/гиа КЛ 2 коронавируса НРС. Получена- кДНК- библиотека коровэвврусных гзнов в фзгэ gt ю, а тайга их клоиотека г клетках E.cali. Разработан гибрздпзацнояакй зонд для ядонтифгкащга коронавируса КРС, имеющий

протяженность 2.7 тысяч нуялеотиданх пар (т.н.п.) и содержащий кДНК- последовательности коронавирусных генов, кодирующих структурные: н- нуклаокапсиданй и м- мембранный , а также неструктурный 9.5 кД вирусный протеина.

Проведено злектрсфэре титрование РНК 8 штаммов и 19 изолятов ротавируса КРС, вкд&леннкх в различии регионах страны; предложен кДНЕ- гибридизацноЕНЫй зонд для обнаружения ротанируеов у КРС. С использованием разработанных кДНК- зондов показана высокая эффективность применения дот- гибриднзационяого метода для независимого обнаружения в фекальном . матариале рота- и коронавирусов SPC.

Практическое значение работы. Предложен .экспресс- метод

электрофора титрования РНК в мнкрошгасгшах поляакрилашдзого геля, ясдользушнй для сравнительного анализа- ж дкфференциагяш различных изолятов и штаммов ротавируса у КРС. Отработаны условия ДНК-РНК дот- ТйбридЕзациснного анализа, рекомендуемого для точной идентификация з надежной диф^эренциавди- рога- и коронавирусов у КРС при смешанной форма инфекции.

Нспользуеше для аглшфгкащш .. коронавирусных -кДНК рекомбинантвке фаги и шшгмщщ являются.-основой для получения продуктивной экспрессии генов коронанарусных протеинов в клетках E.coli.

Материалы диссертационной работы вошли в подготовленные 'Методические рзкшенд&ции по адентифекацки ротввнрусов методой РНК-ДНК гибридизации", одобренные Ученым, соввточ ВМЗЗ от 07.12.SO и, экспертной ксмяссиеЗ по биотехнологии отделения ветеринарной медицины ВАСЗЭйд от 11,12.1990.- Штодатослю рекомендация предназначены дня ' использовали. - в . практике. и научно-исследовательской работа.

Апробация результатов доследований. . Материалы диссертационной работа подучила положительную.- оценку на научной конференции молодых ученых ЗИЭВ "Цроблемы ветеринарной биотехнологии и инфекционной патологии нквоетых" .1967 и 1988 гг., использованы в докладах на заседании Секции биохияш с.-х. животных Воасовзного биохимического общества (1988 г.),. на-засйданш Ученого совета ВИЗЗ (1988 г.), на нвтчЕО-нетодическом сещнгре.по биотехнологии (1989 г. ) и скипозауиэ, посзягдашом вопросам иммунологической диагностики и кмунопрофилактики вирусов животных (Грейфсвальд, Германия, 1989).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 3 научных работах.

,, Объем работа. . Иатеркалн диссертации навожены на 160 страницах- машинописного-• текста и состоят из следущих разделов: введения, . обзора-i литературы,- -результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и прилежания. Материалы диссертация иллюстрированы 13 рисунками и 4 таблицами. Список цитируемой ■ литературы содержит 30 работ отечественных и ISO иностранных авторов.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и кзтода исследований

Работа выполнена в лаборатория молвкуляржй биологии и биохимии ВКЭВ к лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот ММБ АН СССГ. ЗараяеЕные штампами FM i рота- и ЮГ 2 коронавируса КРС перевиваемые культуры клеток почки теленка (кввк) и легкого эмбрионоз коровы (ЛЭК), а также образцы фекалий от. больных хавотннх с сзяитомэкомплэксом диарея был предоставлен нам сотруд-никеш лаборатории эпизоогологш, диагностики и. профилактики гелудочпо- кишечных болезной КРС (ВйЗВ) Н.й..- Иатвгкной и Н.Л. Соколовой.

Конц&вярЕрованне вирусного материала осуществляли методом таягзнцЕгль"ой фяльтра'ТЕИ с использованием системы ¡síinitan Ultrafiltration ("Milipore", США) и ультраценгрЕ&утированием.

Длл нрозздзния гешю-знгзнершх работ ш конструирования зондов исдользсеяли длазмздн pBR 322, pGEU4-Z 2 фаговы? вектор X gt ю, а в качестве хо&язв - бактериальные нтакмы нв Ю1, ГН 5а, Ш 514 2 ЕЯ 1061 E.ooli.

При шрещиваваи бактериальных культур использовали среду ьв, при высезе бактериофага - агаркзованнуэ ерзду те и буфер su. Мдентвфгкагст раком&шантзнх блякек . бактериофага осуществляли методом т-Ебрядазации с радкогашшно-мэченой коронаварусной РНК, рекомбинаятЕне гслош енявляж- на ташках , с згеризованной ьв, содержащей по I кЫ селективного гистохвшческого красителя x-gal ( 5чзроко-4-хяоро-3-зщдолил-р-галактозкд ) и индуктора lac-промотора ггао ( 7-кзопрош!л-1-тт:с- p-D -галактозпд ), а также 75 мкг/мл ампициллина.

Плаз.'шнул ДНК Енддлдпи методом щелочного лизиса ( Biraboira н.с. & Doly J.A., 1979 )- Электрофорез ДНК, извлечение ДНК из

легкоплавкой агарозы проводили по методика, излоаенной в руководстве Hazüatis 2. et. al. (1984).

Выделение кнопкой РНК рота- и коронавнрусв КРО осуществляли фенол-додецклсуяьфагнны методом при добавлении до 250 мкг/мл фермента протешазн К ( "Mercic", Германия ).

Синтез короаавирусЕой кДНК осуществляли методом, разработанным cubler V. & Hoffcan в.J. (1983), о использованием набора " oDNA Syatheelo System " ( "Атегепаш", Великобритания ).

Нотяроваяш синтезированной кДКК с линкерами и Еакторной ДНК проводили с использованием ДНК лягазы фага 14. Упаковку in vitro, рассэв рекомйинштнык фагов и выделение фаговой ДНК осуществляли, согласнс руководствам Т. Манкатиса и соав. ( 1984 ), а татс&е Д. Гловера ( 1288, 1989 ) и К. Дейвиса ( 1990 ).

Включение в ДНК радиоактивной метки проводили ызтодом "ник-траксляции" (Risk? P.Y.J, st. al., 1977) и "рассеянной затравки" о яспользованизн наборов " Niok-5'ranslation Kit " и " iíultiprime DNA labeling System" ("Amei-sham", Великобритания) И радиоактивных нуклеозвдтрифосфатов [a-32P]dilTP ("¿raarehaa" и FC "Изотоп", Узбекистан).

Радиоактвшза иечевже коронавлруской РНЕС проводили при помощи голинук®отхшшназн фага Т4 ("Boehringsi«", Германия), с использованием [7~32РШ? (РО "Изотоп" ),

Очистку мэчэкой £Н1С ж РНК от Еевклшнвашхся радиоактивных нуклеоткдов осуществяялг методом хромато^айби с использованием биогеля Р-6 Du ( "Bio-Rad", США ).

Рестрккцзэзвнй анализ рэкокбянантных ДНК фага к gt ю и плазмидных ЗШ мроводщщ, используя рес^мцаруидио ендонуклеазы ШО "Фермент" (йй'Ба).

Электрофорез нуклеиновых кислот проводили с использованием элэктрофоретичешзго оборудования и .псишисршагагдЕНх гзлэй йярнн "Phamaoia", а также агарозных гелей и буферов, приготовленных из реактивов фнрж "Sigma" ( США ).

Перенос ®К и НЖ на пейлоновуя. мембрану Нуъопй-Н ("Amersham") осуществляли по методаке, прэдлоадаюй Southewi Б. ( 1Э75 ), с Есшльзованкэм для переноса ios ssc буфера.

Прэдгибрзшзащго и гибридизацию нмаобЕЛязованных на мембране ультрафиолетова! ойлучонием ДНК и .РНК. .проводили в раствора, содержащем 502 ^ормшвд, 6z ESC, Ъх раствор Дэнхардта, 0.5g SBS и 100 мкг/мл дашгзрироваяной ДНК спермы лосося. После 16 час инку-

бации при температуре 42°С мембрану отмывали от несвязавшайся меченой днк или рнк в 2х ssc,o.2iS'SDS и 1х ssc,o.2i sbs по 30 мин при 65° С. Учет результатов гибридизации проводили при помощи авторадиографического метода с использовавшей рентгеновской пленки FM-B, "Kodak" ( США ) и усиливающего экрана.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Отработка метода молекулярной гибридизации

Не первоначальном этапе исследований для отработки метода ДНК-РНК гибридизации мы использовали геномные РНК . некоторых штаммов ротавируса крупного рогатого скота, внделенных в различных регионах страны, а такие рекомбинантвяо ротаЕирусную плазшду pBRV.oS., любезно предоставленную нам J.Cohen (ЛШ, Франция). Эта-плазмида состояла из вектора pBR 322-к интегриро-взвкой в его полюинкер кДНК- последовательности G-ro сегмента генома ротавируса КРС, кодирующего осноеной протеин V? б вириона.

Качбстао выделения и очистки ротавируснкх ИИ определяли, проводя электрофоретшшроваяие препаратов .РЕК методом диск-электрофсреза в 10-15% градиентных" полизкрилагадяых гелях на электрофоретической системе . PhsstSystem фтран "Phaiuiaoia" (Швеция); этим еэ методом провзря.ш результаты разрабатываемого РНК-ДНК дот- гкбридизацтонного анализа фекальных образцов. Электрофоретвп. т.е. распределение 11 фрагментов генома после электрогГюроза в полнакриламэдво:« - геле, является характерным признаком для каядого штамма, ротавируса. Изменение электро-форетичеясой подзипности . фрагментов-, обычно связано со значительными перестройками их вуклеотиданх последовательностей, вклжчащюли потерю или же' перенос части генетического материала 1 еэ другие фрагменты рстазирусяого генома. Несмотря на различия в профилях миграции отдельных сегментов генома, вез исследованные FHK принадлежали к "длинному" злектрсфаретипу, что установлено путем сравнения с рефэрентшлл штаммом за 11 ротавируса обезьян, обладающего "длиешш" электрофоре типом вслэдстше значительной мобильности Ю- и 11-го сегментов генома.

Для отработки метода дот-габрлдизационного анализа с очищенпыми РЕК различных штаммов ротавируса КРС применяли разные типы нитроцэллюлозннх и нейлоновых меибрая, использовали различные метода нанесэния и иммобилизации ("пришивания'*)

образцов РНК на мембранные фильтры. Кроме того, осуществляли подбор компонентов гибридиз ационной среды и температуры протекания ДНЕ-РНК гибрвдизационной реакции; при отмывке мембран использовали отмывочные смеси, варьирующие по составу и процентному соотношению ингредиентов. В зависимости от природы и способа метания гибридизационного зонда-. ("ник"-трансляция -"Multipritne") подбирали оптимальные количества вводимых в реакцию гибридизации зондов с учетом их удельной радиоактивности. Помимо этого исследовали влияние декстрансульфата, а также изначального объема гибрадиз ационной смеси и продолжительности самой гибридизации.

Пример дот-гибридизационного анализа 18 образцов РНК при помощи . кДНК- ротавирусного зонда представлен на рис. I. •Изолированную от ялазмвдной части конструкции рВКУ.Об. 1.0 т.н.п. кДНК- последовательность 6-го сегмента генома ротав1фуса КРС метили "ник"-трансляцией и использовали в качестве зонда в реакции гибридизации с РНК, выделенными из фекальных образцов от телят с выраженной клинической картиной острой диареи. Этил мэтр-дом было исследовано 30 образцов: образцы JfcJS I-II (1-ая груша) и Hü 12-18 (2-ая груши) были получены, из Наро-Фоминского и Загорского районов Московской. области, а образцы М 19-30 (3-я группа) с Северного Кавказа (Чечено-Ингушетия). Как следует из рис. I, при чувствительности анализа, составляющей 25 пкг геномной ротазнрусной РНК, в 14 из 18 образцов 1-ой и 2-ой групп нами было обнаружено присутствие ротавируса КРС.

Получены результаты дот-гибрвдизационного анализа РНК 12 образцов 3-й группы. При помощи специфического зонда ротавирусную РНК выявляли в 5 образцах: чувствительность метода достигала 5 пкг геномной ротавирусной РНК. Всего специфическим ротавирусным зондом присутствие геномной РНК ротавируса КРС в образцах фекалий было обнаружено нами в IS из 30 исследованных случаев, возникновения диареи у телят. •

Полученные дот- гибридизационным анализом данные проверяли параллельными электрофоре тиче скими исследованиями материала образцов и двумя методами серологического анализа.

Как следует из табл. I, во всех без исключения случаях результаты независимых дот- гибридизационных и электро-форетических исследований не противоречили друг другу; совпадение же получанных наш данных с результатами серологического

зло и

Я В с

® £ В Е Е В а | Ш 1 ? •

« 1 '.л 1 ш е

11 ш У.З ш тг 1Г

ш т т Р

14 Е Щ в _. • •

о 15" © © 9'

\ о © □ шШ *

в » © ф

■ ©

Рис. I. Дот-гибридизационный анализ выделенных из фекалий телят образцов ШС при помощи ротавирусного зонда

На рисунке представлены результаты гибридизации образной РН 1-ой (й№ 1-11) и 2-ой (йй 12-18) групп. Указанные образ: коятроли наносили на мембрану согласно следующей схеме:

Линия А: 1-11. РНКсбразцов .И6 1-11 в порядке возрастания ноиера

В: 1-11. Ю_Д разведения -РНК этих образцов

с: 1-11. разведения --. „ -

В: 1-11. 10 -3 разведения -ч:„ -

также

Е:

1-4. последовательные десятикратные разведения

геномной РЖ ротаЕируса КРС от 75 нг до 25 пкг, испсльзуеше в качестве внутреннего стандарта

- „ - ДНК и РНК клеточной культуры мг>вк. на которой пассировали ротавирус КРС

6-9.

на которой

10-11. РНК ротавируса КРС, денатурированная кипячением, в течение 2 мин Р: 1-7. РНК образцов ЯЗ 12-18 в пшядке возрастания номора

5-9. препарата вотавирусной РНК* штамма РМ I КРС 0: 1-9. 10 разведения РНК, указанны! дай позиций г. 1-9

ю-11. РНК_гютавщ>уса КРС, денатурированная 0.1И иаон Н: 1-9. Ю | разведения РНК, указанных для позиций Г. 1-9 I: 1—9. 10 — —

10-11. РНК ротавируса КРС, денатурированная при 80 °0

• в течение 2 меш Чувствительность метода составляет 25 пкг геномной РНК ротавируса КРС.

анализа наблюдалось в 13 случаях, составляя 81% для реакции диффузионной креципитацки (РДП) и 61% для иммуноферментного анализа (ИФА). Несовпадения с результатами гибридизационного и электрофоре тичгского анализа отмечались в . РДП для образцов Ж» 2 и II, а также. в ИФА для образцов А» 12 , 20 , 22 и 28: несмотря на присутствие геномной РНК, белковые кошонэнты ротавирусшЯ частица здесь не были обнаружены. Однако, точно так же, полоштвлшлв титры антигена, установленные в ИФА для образцов M 23, 26 и 27, не подтвэрвдались результатами дот-, гибридщзационшго и электрофоретического анализа.

Таблица I.

Результаты исследования образцов на присутствие роташруса КРС дот- гибрвдизациоиннм, злектро-форетаческим и серологическим анализом •

m Выявляемое дот- Регистрация РНК

иссл. гибридвзацией электрофоретн- Результаты Титр в ИФА

образ- максимальное ческим методом РЖ *

цов разведение РНК

I 10"? + . + не иссл.

2 3 Itrî кг3 + -+ . + * и

4 — - - и

5 - - - П

6 7 I0"3 + + », W

8 9 IÔ1 + + *» п

10 ю i + + И

II . ш. + . - H

12 ions + не иссл. -

13 + - « ■ 1:8

14 ИГЙ + .„ . 1:32

15 . « i -- i» 1:4

16 + ,, w 1:8

17 10"? « 1:16

18 I0"d + « п 1:8

19 " о - . п -

20 ю i + я -

21 10, + « 1:32

22 Д. -..д. .< —

23 — — И 1:16 ' 1

24 ■ - - - е- - " -

25 - - и -

26 - - « 1:32

27 — п - п 1:8

28 ю i + п -

29 то"1 + ■ « 1:128

30 - -

2.2.2. Разработка коронавирусного гибридизационного зовда Синтез коронавярусной кДНК осуществляли на линейной матрице РНК штамма ЮГ 2 коронавируса КРС с использованием набора ■ сША Synthesis Kit ("Amersham", Великобритания) (рис. 2). Первую цепь кДНК синтезировали при помощи обратной , транскриптазн, и олиго(<ш)12_18- праймера , комплементарного'. поли(А)-области геномной РНК. Затем матричную цепь РНК полученного РНК-ДНК комплекса гвдролизовали при помощи фермента РНК-азы Н, вторую цепь кДНК достраивали сразу двумя' ферментами: ДНК-далимеразой из E.coli и фага (Gubler ТТ. & Hoffman B.J.-,' 1983). .

По завершению синтеза кДНК- продукт использовали в реакции лигирования с короткой специфической последовательностью ScoR I - Sma I адаптера, представлявдего. собой специально синтезированный сайт рестрикции для эндоцуклеазы EooR I. I

BCV

ш

s'

Mi

~r~z

BCV

C.DM

jvi

I--r~

¡¡«тедгкот^» dJuic/fJT) npzi/Mtp

ЗЯЯЯЛЯЯЯ ЗТТТГ

Рис.2. Схема синтеза комплементарной ДНК коронавируса крупного рогатого скота

р.

11

Схема клонирования фрагментов кДНК коронавируса КРС приведена на рис. 3. Двухцепочечные молекулы кДНК. с пришитыми по тушм концам адаптерами использовали для лигирования при помощи ДНК-лигазн.фага т^ с зквимолярными соотношениями левого и правого плеча ДНК фаге К gt Ю; после этого рекомбинантные ДНК упаковывали в фаговую частицу. Упаковочный экстракт непосредственно использовали для амплификации библиотеки, высевая на чашки с агаризованной та- средой и клетками E.ool'i. с покрытого лизисныш бляшками газона клеток снимали отпечатки-реплики на нитроцеллалозные мембраны и проводили гибридизацию с радиоактивно-меченой РНК коронавируса крупного рогатого скота.

Из гибридизувдихся фаговых бляшек выделяли рекомбинантные фаговые ДНК, расщепляли их эндонуклаазой EooR Г, разгоняли в агарозном геле, осуществляли перенос денатурированных фрагментов на нейлоновую мембрану Bybond N по методу Саузерна и гибридазовали с радиоактивно-меченой геномной РНК коронавируса крупного рогатого скота.

Из рекомбинантных фаговых ДНК, обнаруживших хорошую гибридизацию с короназирусной РНК, изолировали кДНК-последозательности размером 1.0 - 3.5 т.н.п. и использовали для перехловирования в экспрессирувдий плазмидаый вектор pGHSH-Z. Было отобрано 53 клона рекомбшантного фенотипа, формировавших на селективной среде с хромогенным красителем x-gal и индуктором дактозного оперона xptg колонии белого цвета. Ракоыбшшнтный клон, вьщешзшщй-из вектора pQEH4-z (фрагмент протяженностью 2.7 т.н.п., был выбран нами для амшшфжацяи коропазируснсй кДНК и ее испытания в качестве молекулярного гибридизационного зонда.

Специфичность короназирусного зовда проверяли путем его гибридизации с нанесенными на мембрану геномными ДНК и РНК, выделенными из различных источников. Отмечалась гибридизация с содержащим коронавирус КРС культуральныы материалом и рекомбипан-тной коронавирусной плазмидой рвст-2. в то ке время не отмечалось гибридизации зонда с ДНК E.ooii, вектором клонирования pGE£l4-z, а также нанесенными на мембрану в качестве отрицательных контролей генокшаш РНК ротавируса и РНК вируса диареи крупного рогатого скота.

Полноразмерным, включающим 2.7 т.н.п., коронавирусным зондом были исследованы образцы РНК, выделенные от животных 1-ой и 3-й групп (Рис. 4). Специфический зонд гибридизовался с 16 образцами

о

ЛсЬегиа» иапо

Чйе '¿г^Са +

шшютж.

Лпсдх

-О—+

я£>21

Рпс. 3. схома клонирование кДНК коронавируса КРС в фаговых и плазгдщных векторах.

I I 3 к $ $>

Я В

С В

в

в

9 ■

• ф

ф ■

- Щ

. В2

I

Рис. 4. Дот-гибридизационный анализ выделенных из фекалий телят образцов РНК при помощи. молекулярного коронавирусного зонда "

Представлены результаты гиОридизацЕК образцов РНК 1-ой и 3-Е . группк {Ш 1-11 и Ш 19-30).. с. 2.7.Т.Н.П. кДНК-.корснавнруснш слэдуюцей последовательности: - '

Линий А: 1-12. декатурипованные нагреванием РНК .образцов ДО. 19-30 I порядке возрастания номеров ; 13-16. последовательные десятикратные разведения от 5 нг до 5 пкг 1.С5 Т.Н.Е.. фрагмента ..зонда <;. В: 1-12. педенатурированные .РНК образцов ¿в® 19-30 , 13-16. шслэдовзтельше десятикратные разведения геномной РНК коронавируса КРС от В.нг до 5'пкг •• С: 1-11. денатураровазше нагтюваЕЕе.ч РНК образцов 1-И в порядке возрастания номеров | 13-16. последовательные . десятикратные_разведошя гзвомноа РНК рогавнруса КРС от" • 5 нг до 5 пкг т>: 1-12. не денатурированные ¿©Х .образцов.. Ш 1-11

13-16. последовательные •деся'^кратшо разведения гзномаой РНК ротавируса КРС от, 5 ет до -о пкг Ж: 1-7. различные препараты кулътур:<льзого, коронавируса КК 8. препарат ДНК • и РНК клеточной культуры ЛЭК, па

которой пассирозали корозавирус .крс ■ 9- геномная РНК вируса диареи телят • 10-11. культуральный коронав$фус КЛ 2 КРС

12. геномная РНК вируса парагриппа КРС 13-16. последовательные десятикратные разведения 1.05 т.е.п йрагменга зонда от 5 нг до 5 пкг Р: 1-7- РНК различных препаратов культурзльного коронавируса КРС 8-12. препараты, указанные для позиций е. 8-12 13-16. последовательные десятикратные разведения геномной

РНК коронавируса КРС от 5 нг до 5 пкг Чувствительность метода превышает 5 пкг геномной РНК корон вируса КРС.

РНК из фекалий, геномной коронавирусной РНК и вирусосодержащим кулътуральным материалом. При чувствительности реакции, провышаащей 5 шг геномной коронавирусной РНК, отсутствовала гибридизация с 7 выделенными образцами РНК, а такие всеми используемыми в реакции отрицательными коктроляш: нуклеиновыми кислотами культуры меток МВВК, на которых пассировали коронэвирус; НИ ротагируса КРС, РБК парагриппа КРС и РНК вируса ДЯ2рея КРС.

Результаты гибридязационного скрипюта РНК при помощи 2.7 т.н.п. коронавируспого зонда, а такгз результаты злектрофоре-тического и серологического исследования образцов приведены в • табл. 2. Одновременно двумя методами - гкбрвдизациошшм и электрофоретическим - коронавирусный гастроэнтерит диагностировался у 14 кивстши:,' за исключением двух случаев (образцы И I к 7) дэнЕые анализов полностью подтверждают .друг друга.

Моано предположить, что в образце Д I произошел глубокий гидролиз коронавирусной РНК на мелкие фрагменты различной длины, габридизуициеся с зондом,, не не мигрирующие в геле единой полосой. В случае образца 7,. по-видиглому, произошла деградация однонитевой короназзрусной- РНК.'.- при нанесэнш на мембрану вследствие РНК-взного загрязнения. .

Исследованные дот- гибридизацией ж электрофорэтически образцы фекздзй параллельно анализировались двумя серологическими методами. В 14 случаях результате серологического анализа подтверждали дот- гибридиззционзыэ исследования: совпадение с результатам роакцви тарксяэния гемагглстинации (РТГА) составляло 55Ж , с результатами тзлунофер,рентного анализа (ИФА) - 75%. Расхоздешд результатов габрэдизацшнного анализа с данными РТГА наблюдали в пяти случаях, которые касались образцов ЛШ 1,3,6,7 и 10. По техническим причетам образцы. РНК 2-ой группы не были исследованы дот- гибридизацией, ..что з определенной степени затрудняло сравнение этого метода с РТГА- анализом. Тем не менее, согласующиеся данные дот- . гиОридззеции • и электрофореза не подтверждали результатов обнаружения коропавирусного антигена методом РТГА в трех образцах ($£ 3, 6 и 10 ) и методом ИВА в образце Л 25, а танке отсутствие коронавирусного антигена, установленное иммунофэриептм анализом з образцах К& 21, 23 и 27.

Таблица 2.

Результаты исследования образцов на присутствие коронавируса КРС дот- гибриднзационным, злектро-форетическим и серологическим анализом

№ Экстраполируемое Регистрация РНК

иссл. максимальное раз Титр в Титр в ш

образ- ведение РНК, вы- элеятрофорети- РШ.

цов являемое зондом ческим методой

I _ не иссл.

2 10 0. + 1:4 ; «

3 ' - 1:8

4 ю § 10 и + 1:32 «

5 + 1:4 II

6 - - 1:4 и

7 1-5° ■ + 1:16 п

8 + 1:4 и

9 ю-*5 + 1:4 л

10 — г. - 1:4 4«

II 10 0 + 1:256 «

12 не иссл. + 1:256 «

13 „ + . 1:4096 и

14 п + 1:4096 г

15 + 1:4096 п

16 « + 1:4056 к

17 п 4- 1:4096 - «к

18 10? + 1:4036 я

19 + не иссл. 1:4096

20 10 0 ю ° ю У + м 1:4096

21 + . п -

22 + .. и 1:4096

23 10 Т + . I» -

24 ю-1 + п 1:512

25 - - 14 1:128

26 "" т - К -

27 10 3 + п -

28 10 л + тг 1:4096

29 — о - п —

30 10 А + п 1:4095

Возможность независимого обнаружения а дифференциации возбудителей в одних и тех же образцах фэкзлаг при скэшенной форме рота- к коронавирусной кафекции КРС бнла подтверздена нам:« с использованием разработанных рота- и ж>рэнавирусных кДНК-зовдов. Об атом свидетельствует анализ - результатов дот-гибридЕзацконных исследований, приведенных в табл., I и 2. Из имевшихся з нашем распоряаенш 30 выделенных образцов РНК при исследовании 8 образцов ( 4-6, 8, 19, 24, 25 и 30 ) рота-вирусный возбудитель не обнаруживался ни одним из применяемых

методов. Тем не менее, последующими исследованиями с использованием разработанного коронавирусного зонда было установлено, что в шести из'этих случаев ( образцы J6S 4,5,8,19,24 и 30 ) острая диарея была обусловлена присутствием в кишечнике телят коронавирусов. В остальных двух случаях диарея могла быть вызвана каким-либо другим инфекционным агентом вирусной или , бактериальной природы.

Таким образом, полученные данные по дот- гибридизационному и электрофоретэтескому анализу, представленные в таблицах I и 2, убедительно свидетельствуют о возможности . диагностирования одновременного . течения рота- и корснавирусной инфекции у 7 животных 1-ОЙ И 3-Й группы ( 2, 9, II, 20-22 И 28 ). Во 2-ой груше присутствие ротззируса определяется указанными методами у всех яивотннх ( Ш 12-18 ). В то жо зремя отсутствие результатов дот- гибридязационного исследования этих образцов коронавирусным зондом позволяет говорить о наличии . коронавирусного гастроэнтерита у животных 2-ой группы лишь на основания данных серологического анализа.

В результате проведенных исследований были отработаны условия ДЕ2С-ЕНК дот- гибрядизацконяого анализа для обнаружения рота- л коронавнрусЕЫХ РЖ при помощи .кДНН- зондов и" был сконструировав кДВК- гибривдзвщгсЕннй зонд для идентификации коронавируса у КРС. Заключительным этапом исследования молекулярного ксрояаварусного зонда явилось эндонуклеазисе картирование его нуклеотидвой последовательности. Полученные в процессе выполнения ряда блот- гибридизаций радиоавтографы позволяли нам достоверно распознать выщепляемые рестриктазаш фрагменты корснавирусной кДНК и предложить рестршащозную карту клонированной кДНК- последовательности, гибридизационного зонда:

EooR I ХЪа I Hind III EcoR I

tgagsa ь-!-'-1

gj ■ 450 600 1650 bp

полилинкер

где x - сайт узнавания для авдонуклеазы хьа I;

н - соответственно для эндонухлеазн Hind III в полилинкере плазмидного вектора pGEM4-z.

-о

Ч) О-

I

«г

£

«х>

О»

Г

5-

Рисунок 5. Локализация клонированной областа

на генетической карте коронавзруса КРО.

Как видно кз рис. 5, клонированный наш кДНК- фрагмент З^-кснцевой частя генома коронавируса - КРС, протяженностью 2.7 т.н.п., охватывает область двух важнейших в функциональном отношении гонов: г*- зуклескапсидного и и- мембранного коронавирусного протеинов, а также третьего гена, кодирующего неструктурной вирусный протеин с молекулярной массой 9.5 кД.

ВЫВОДЫ:

1. Проведено элекгрофоретипирование' геномных РНК 8 культуралызнх итаммов, а тагов 19 изоллтов ротавируса крупного рогатого скота, выделенных от больных телят в различных регионах. Все изученные ротавируенкэ РЕК характеризуются "длшным" электрофоретипом.

2. С использованием разработанного для обнаружения ротавируса КРС кДНК- зонда отработана простые методы подготовки исследуемого материала и оптимальные резины проведения ДНК-РНК дот- гибридкза-ционного анализа с целью идентификации инфекционного агента в присутствии энзогеншхх бактериальных и вирусных ДНК и РКК.

3. Осуществлен глолекулярнкй синтез комплзжзнтарных коронавирусных ДНК; полутона кДНК- библиотека генов коронавируса зсрупного рогатого скота в фаге. л. ^ то, а также клонотека, вклзочаацая 53 рексдаййшзнкх клона в.со11 с 1.0-3.5 т.н.п. кДНК- вставками, перэкри!ВЕНща«и 152 вирусного генска.

4. Из полученной шноии выделен клон, содержащий рекомбинант-

ную шазшду рСЕ£4-2 ы, на основе которой разработан гибридкза-ционвый зонд для нлентв?3жкацяя коронавируса КРС.

5. Методом рестригахионного энслиза охарактеризовала плгзкида р0Ш4-г ы, содержащая г.7 т.н.п. кДНК- ксронавярусннй фрагмент, вкличащна полные яуклеотвдшэ последовательности мембранного м- гликопротеина я куклеокапсядяого я- фосфопротеина коронавируса КРЗ. Показана возможность использования клонированного фрагмента, а такт» отдельных его .последоватэльЕостэй в качестве гпбридизеця-снного зонда, используемого для дггзнтрфшащш коронавируса КРС.

6. Показана пранцапиавьЕвя возможность диагностики рота- и коронасарусной яяфэкцкк у КРС методом дот- гибридизации с использованием разработанных рота- -и коронавируснкх зондов. При исследовании 30 образцов фзкашй из 3 хозяйств установлено

присутствий ротавируса у 19, а коронавируса - у 16 телят. Смешанная рота- и коронавирусная инфекция выявлена у 7 из 30 обследованных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен экспресс- метод электрофоре титрования ротавирус-ной РНК в микропластинах шлиакриламидного геля.

2. Получена плазмида Ы, используемая в качестве источника молекулярного зонда, разработанного для идентификации коронавируса крупного рогатого скота. Сконструированная плазмида рОЕМ4-2; ы представляет основу для разработки системы амплификации вектор - хозяин, необходимой для синтеза '¿- и К-коронавирусных антигенов. - ■

3. - Высокоспецифяческий и чувствительный метод иденти&щацЕЕ рота- и коронавирусов с помощью разработанных кДЖ- гибрадизацк-онных зондов моезт быть рекомеццован для практического использования при диагностике рота- к корокавпрусной инфекции у крупного рогатого скота.

Список работ, опубликованных по теые днсеертащи.

1. Grasuk, Т.Н., 5okolova; Н.Ь. Idsntiiiaicruag der Rota- und Coronaviren des Riiid.es mit Eilte üsr BHS-HSS-Etybridisation 3 Rilmscr Symposium " Immunologisohe Diagnostik und Insalooprophylaxe animaler Virosen " ( Identification of bovine Rota- and Coronaviroses with the help oi DUA-PJNA- Hybridization ) // Arbeitskreis " Imnunologie und lnmonoprophylgcie ". DDP., Greifswald, 1989. Seite 23-252. G.P. Xoromyslov, S.K. Artyushin, A.D. Zaberezhny, ат»й V.Ji. C-i-a3h.uk. Development oi Hybridization Probes on the Basis oi Recombinant DIU to Identity Porcine Parvoviruses and Rotaviruses. // Arch, csper. Vet. med., beipzig 44 ( 1990 ). 3. Канатов Б., Гоголев U.U., Артнвшн C.K-, Гращук B.H. Электро-форетипы ротавирусов телят // Депонирован в ВИНИТИ, i«., 1930.- М (222 ).- С. 144.