Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Каннабиноидная регуляция в центральной нервной системе виноградной улитки
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Каннабиноидная регуляция в центральной нервной системе виноградной улитки"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ РАН

на правах рукописи 00348687 1

ЛЕМАК Мария Степановна

КАННАБИНОИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ В ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

03.00.13- физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

~ з ДЕН 2009

Москва 2009

003486871

Работа выполнена в лаборатории клеточной нейробиологии обучения (заведующий - доктор биологических наук, профессор П.М. Балабан) в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор института — доктор биологических наук, профессор П.М. Балабан).

Научный руководитель:

доктор биологических наук П.М. Балабан

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук_Е.Е. Воронежская_

кандидат биологических наук_A.B. Шевелкин_

Ведущее учреждение:_Биологический ф-т МГУ им. М.В. Ломоносова_

Защита состоится _17_декабря_ 2009 г. в 14_ часов на

заседании специализированного ученого совета (Д-003.10.01) при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва, ул. Бутлерова, 5а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВНДиНФ РАН. Автореферат разослан £ Ц. 2009 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время механизмы эндоканнабиноидной регуляции синаптической передачи, обнаруженной относительно недавно в центральной нервной системе млекопитающих, подвергаются активному изучению. Сейчас является общепризнанным, что эндоканнабиноидная система играет важную роль в процессах обучения, памяти, пищевом и оборонительном поведении, нейропротекции (Капо, 2009). Открытие каждой новой медиаторной системы поднимает вопрос о ее эволюционном происхождении. Древность происхождения и распространение среди широкого числа таксонов может свидетельствовать о фундаментальной важности и универсальности данного механизма передачи сигнала в нервной системе. Таким образом, необходимо исследовать составляющие эндоканнабиноидной системы и их структурные и функциональные особенности у различных видов не-млекопитающих позвоночных и беспозвоночных животных. Современные генетические исследования показали, что рецепторы, гомологичные каннабиноидным рецепторам (СВ-рецепторам) млекопитающих, найдены у всех классов немлекопитающих позвоночных и имеют высокую степень сходства с человеческим СВ1-рецептором (Egertova, 2001). Среди беспозвоночных животных элементы эндоканнабиноидной системы описаны у кишечнополостных, иглокожих, двустворчатых моллюсков, плоских и кольчатых червей, но отсутствуют у насекомых и круглых червей (Salzet, 2000; McPartland, 2003; Egertova, 2005). Несмотря на то, что у беспозвоночных найдены эндоканнабиноидные лиганды, ферменты гидролиза каннабиноидов и, в ряде случаев, СВ1-подобные рецепторы, а также показано влияние экзогенных каннабиноидов на пищевое поведение гидры и оборонительное поведение планарий, очень мало известно о нейрофизиологических механизмах действия каннабиноидной системы у беспозвоночных животных. С этой точки зрения актуальным является исследование физиологической роли каннабиноидов в регуляции эффективности нервных связей у брюхоногих моллюсков, которые давно используются в качестве модельных объектов в нейрофизиологии для изучения корреляций между целостным поведением и контролирующими его нервными сетями (Gover & Abrams, 2009; Watanabe et al., 2008; Kandel et al., 1995). Одним из ярких примеров подобного использования является анализ нейронной сети, обеспечивающей

рефлекс отдергивания жабры у морского моллюска аплизии (Kandel et al., 1995).

Аналогом отдергивания жабры у аплизии является оборонительная реакция улитки Helix - втягивание головы и щупалец в раковину в ответ на болевой стимул. Сенситизация этого рефлекса коррелирует с длительной фасилитацией входов от кожного нерва на командные нейроны оборонительного поведения - гигантские идентифицированные нейроны париетальных и плевральных ганглиев, спайковые разряды в которых способны вызвать генерализованную оборонительную реакцию улитки (Balaban & Bravarenko, 1994; Захаров И.С., 1988, Zakharov et al., 1995). Кроме того, в оборонительной нервной сети улитки идентифицированы механосенсорные нейроны, которые образуют моносинаптические входы на командные нейроны оборонительного поведения, являются глутаматергическими и участвуют в формировании оборонительного поведения улитки (Malyshev, 2002; Bravarenko, 2004), что позволяет детально исследовать регуляцию синаптической передачи в отдельных синаптических контактах, контролируя как пре- так и постсинаптический нейроны.

Таким образом, улитка Helix является очень удобным объектом для исследования роли каннабиноидной системы в регуляции синаптической передачи у беспозвоночных животных.

Цели и задачи исследования

Целью нашей работы являлось подтверждение существования эндогенной каннабиноидной системы в ЦНС брюхоногих моллюсков и ее структурно-функциональное описание. Для достижения данной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать параметры связывания синтетического агониста СВ1-каннабиноидных рецепторов [3Н]СР-55,940 в препарате мембран нервной системы улитки Helix lucorum

2. Методом иммуногистохимии исследовать распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС двух видов улиток рода Helix

3. Определить влияние агониста СВ1-рецепторов анандамида и антагониста АМ251 на эффективность возбуждающей синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum

4. При использовании анандамида и АМ251 исследовать участие эндоканнабиноидов в регуляции кратковременной и долговременной пластичности связей нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lue or um

Научная новизна

Впервые описано наличие CBl-подобных рецепторов в нервной системе брюхоногих моллюсков, показано участие эндогенных каннабиноидов в регуляции кратковременной и долговременной пластичности синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum. Обнаружена новая форма кратковременной пластичности моносинаптической связи между механосенсорными и гигантскими нейронами оборонительного поведения: кратковременное каннабиноид-зависимое подавление возбуждающей передачи в результате низкочастотной стимуляции сенсорных входов (SSE). Показано, что сезонная активность серотонинергической системы является модулирующим фактором при выработке SSE.

Положения, выносимые на защиту

1. В центральной нервной системе наземной улитки Helix lucorum содержатся белки, гомологичные каннабиноидным рецепторам первого типа млекопитающих.

2. Эндоканнабиноиды участвуют в регуляции пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения, снижая эффективность возбуждающей синаптической передачи.

3. Работа каннабиноидной системы подвержена сезонным изменениям и зависит от активности серотонинергической системы.

Апробация работы

Основные материалы диссертации докладывались на VIII ВосточноЕвропейской конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных в Казани (2006), на XX конгрессе Физиологического общества имени И.П. Павлова (2007 г., Москва), на 11-м симпозиуме ISIN (2007, Тихань, Венгрия), на конференциях молодых ученых ИВНДиНФ РАН (2006, 2008, Москва).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 1 статья в рецензируемом журнале и тезисы 4 докладов на российских и международных конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением методов исследования, главы результатов и их предварительного обсуждения, общего обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком. Список литературы содержит 127 источников.

МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

Наше исследование было проведено на препаратах изолированной центральной нервной системы взрослых виноградных улиток. Взрослые улитки вида Helix lucorum L. были собраны в Крыму и содержались в дальнейшем в лабораторных условиях. Улитки вида Helix aspersa были выращены из яиц, полученных от лабораторной популяции.

Метод радиолигандного исследования связывания с полным насыщением

Препараты изолированной ЦНС гомогенизировали в холодном (4°С) ТМЭ буфере при помощи гомогенизатора Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком (10 перемещений при 700 оборотах в минуту). Полученную суспензию центрифугировали при 1000 g при 4°С в течение 10 минут, отделяли супернатант и центрифугировали при 18000 g в течение 25 минут. Осадок ресуспендировали в ТМЭ буфере, разделяли на аликвоты и быстро замораживали. Аликвоты препарата мембран хранили в жидком азоте вплоть до дальнейшего использования. Концентрацию общего белка в пробах определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Связывание меченого тритием синтетического агониста каннабиноидных рецепторов 1-го типа (СВ1-рецепторов) [3Н]СР-55,940 (5-(1,1-диметилгептил)-2-[5-гидрокси-2-(3-гидроксипропил)циклогексил]фенол[боковая цепь-2,3,4-3Н(Ы)]; получен в PerkinElmer Life Sciences, Boston, USA) проводили в 96-луночных фильтровальных планшетах Millipore (GF/B). Фильтры предварительно смачивали в течение 2-х часов при комнатной температуре в 100 мкл НМЕ буфера. Затем фильтры промывали 200 мкл НМЕ буфера и добавляли в лунки пробы и необходимые реагенты. Связывание проводили в течение 60 минут при

температуре 30°С, каждая проба содержала 200 мкл НМЕ буфера, 0.1% раствор бычьего сывороточного альбумина, очищенного от жирных кислот (БСА, Acros Organics, Geel, Belgium), 15 мг мембранного белка и радиолиганд [3Н]СР-55,940 в возрастающих концентрациях. Неспецифическое связывание определялось при тех же условиях внесением избытка (2 мкМ) немеченого лиганда [ЗН]СР-55,940 (Sigma, США). Инкубацию прерывали при помощи системы вакуумной мембранной фильтрации Millipore. После окончания инкубации фильтры промывали три раза в 200 мкл НМЕ буфера, содержащего 0.05% БСА, при pH 7.2 и температуре 4°С. Затем фильтры высушивали, помещали в сцинтилляционные пробирки и на следующий день измеряли уровень радиоактивности. Константа диссоциации Kd и количество рецепторов Втах рассчитывали, исходя из параметров кривой насыщения, при помощи программы SigmaPlot (Jandel Scientific, США).

Иммунохимическое окрашивание ЦНС улитки

Препараты изолированной центральной нервной системы с сохраненными щупальцами фиксировали в течение 2-х часов при температуре 4°С, в качестве фиксатора использовали 4% раствор параформальдегида в 0.1 М фосфатном буфере. Затем препараты несколько раз промывали фосфатным буфером. Для иммунохимического окрашивания мы использовали как препараты целой центральной нервной системы (whole-mounts), так и срезы толщиной 10 мкм. Для приготовления срезов препараты после промывки фосфатным буфером проводили по спиртам до ксилола, затем заливали в парапласт и нарезали.

Для иммунохимического окрашивания мы использовали три вида первичных поликлональных антител кролика (AT) против СВ1-рецепторов млекопитающих: AT, выработанные к синтетическому пептиду третьего цитоплазматического домена СВ1-рецепторов человека (Chemicon, АВ-9415); AT, выработанные к начальному участку (1-150 аминокислотный остаток) N-конца СВ1-рецепторов человека (СВ1(Н-150), Santa Cruz Biotechnology, Inc.); AT, выработанные к рекомбинантному пептиду, соответствующему первым 77 аминокислотным остаткам крысиного СВ1-рецептора (Anti-CB 1(1-77), Calbiochem). Для всех трех видов антител на мозге крыс была показана иммунореактивность к нейронам, несущим каннабиноидные рецепторы.

Перед инкубацией в растворе первичных AT препараты в течение 2 часов отмывали в блокирующем растворе для предотвращенная неспецифического

связывания. Затем препараты инкубировали с первичным AT, разведенным на блокирующем растворе, в течение 48-72 часов при комнатной температуре. Перед добавлением вторичных AT препараты тщательно отмывали в блокирующем растворе в течение 6 ч., инкубация с вторичными антителами продолжалась 24-36 часов, после чего препараты снова отмывали блокирующим раствором в течение 6 часов. В качестве вторичных антител мы использовали иммуноглобулины, соединенные с флюоресцентными группами (Alexa, Molecular Probes). После отмывки как целые препараты, так и срезы заключали в заливочную среду Aqua-Poly/Mount (Polysciences, Inc) и исследовали при помощи микроскопа AxioPlan (Zeiss, Germany), снабженного устройством для эпифлюоресцентной микроскопии, камерой Camedia С-4000 (Olympus, США) для ввода данных и программой анализа изображений KS-300.

Для проверки специфичности иммунного окрашивания ставили две серии контрольных экспериментов: в первой серии опускалась стадия обработки первичными AT; во второй использовался раствор первичных AT, предварительно истощенный взаимодействием с раствором соответствующего антигена.

Вестерн-блот гибридизационный анализ

Белки денатурировали в стандартном буфере додецилсульфата натрия. Затем образцы прогревали до 95°С в течение 5 минут и электрофоретически разделяли в 12% геле SDS-PAGE с использованием системы Mini-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA). После проведение электрофореза белок переносили на PVDF-мембраны. Мембраны блокировали в течение 1 часа 5% раствором обезжиренного молока в Трис-буферном растворе с добавлением Tween (ТБР-Т). Затем на каждую полоску наносили равное количество общего белка (40 мг), и мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С с поликлональными AT кролика, выработанными к синтетическому пептиду третьего цитоплазматического домена СВ1-рецепторов человека (Chemicon, АВ-9415). Затем мембраны инкубировали в течение 1 часа с вторичными AT, выработанными к IgG кролика, коньюгированными с пероксидазой хрена, в 5% растворе обезжиренного молока в ТБР-Т, при комнатной температуре. Связавшиеся антитела проявляли с помощью набора реагентов хемолюминисценции для Вестерн-блот анализа (Western-blot chemiluminescence reagents kit, Life Science Products, Boston, MA), хемолюминисценцию визуализировали на рентгеновской пленке.

Электрофизиологические эксперименты

После анестезии изотоническим раствором М§С12 разбивали раковину животного и закрепляли ногу в восковой ванночке. Затем вскрывали гемоцель и извлекали окологлоточное нервное кольцо, обрезая нервы, идущие к периферии. В сериях экспериментов со стимуляцией сенсорных нервов правый и левый 2-е кожные нервы обрезали как можно дальше от ганглиев. Затем окологлоточное кольцо помещали в заполненную раствором Рингера для холоднокровных препаровальную ванночку, после чего пинцетами снимали соединительнотканные оболочки ганглиев. Активность нейронов регистрировали внутриклеточно по стандартной методике стеклянными микроэлектродами, заполненными 2 М раствором КАц. Сопротивление электродов варьировало от 10 до 50 МОм в зависимости от размера регистрируемых нейронов. Мы регистрировали внутриклеточно возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП) гигантских нейронов, участвующих в оборонительном поведении улитки, расположенных как в париетальных (левые и правые ПаЗ, Па2), так и в плевральных (левый и правый Пл1) ганглиях. В качестве тестирующей стимуляции мы использовали как электрическое раздражение 2-го кожного нерва, вызывающее суммарные ВПСП во всех трех типах гигантских нейронов, так и стимуляцию тел плевральных механосенсорных (МС) нейронов, вызывающую моносинаптические ВПСП в основном в Пл1 нейронах, и в некоторых опытах удавалось одновременно зарегистрировать моносинаптические ВПСП в Пл1 и ПаЗ нейронах.

Мы провели несколько серий экспериментов с различными схемами стимуляции:

1. Только тестирующая стимуляция 2-го кожного нерва или МС нейронов, частота 1/2.5 мин.

2. На фоне тестирующей стимуляции 2-го кожного нерва проводили высокочастотную тетанизацию 2-го кожного нерва (три пачки стимулов частотой 10 Гц, по 100 стимулов в каждой пачке, интервал между пачками 1 мин, амплитуда стимулов та же, что использовалась для тестирующей стимуляции)

3. На фоне тестирующей стимуляции МС нейронов проводили высокочастотную внутриклеточную активацию постсинаптических нейронов (10 пачек стимулов амплитудой 15 нА частотой 16 Гц, в каждой

пачке 100 стимулов, интервал между пачками 10 с).

4. Тестирующая стимуляция МС нейронов, частота 1/30 с. На фоне тестирующей стимуляции на постсинаптический нейрон подавали деполяризующую ступеньку тока, вызывавшую спайковый разряд частотой 12-15 Гц, затем продолжали тестирующую стимуляцию.

5. Тестирующая стимуляция МС нейронов, 1/30 с. Через 5-10 мин от начала стимуляции проводили низкочастотную тетанизацию 2-го кожного нерва (три пачки стимулов частотой 1 Гц, в каждой пачке 10 стимулов длительностью 3 мс, интервал между пачками 20 с, интенсивность стимуляции в 10 раз превышала интенсивность контрольного подпорогового стимула).

Часть экспериментов проводили в летний период на фоне подавления функции серотонинергических нейронов. За 2-7 дней до проведения данной серии улиткам вводили в полость тела нейротоксин 5,7-дигидрокситриптамин (5,7-ДГТ, Sigma) в дозе 20 мг/кг массы тела животного. 5,7-ДГТ растворяли в физиологическом растворе Рингера для холоднокровных с 0.1% аскорбиновой кислотой в качестве антиоксиданта.

Регистрация электрофизиологических потенциалов производилась на IBM PC совместимом компьютере, частота дискретизации от 1 до 5 кГц, АЦП ~ DIGIDATA 1320 (Axon Instruments). В каждой точке тестирования измеряли пиковые амплитуды ВПСП при помощи программы "Axoscope". Все величины выражали в процентах, за 100% принимали обычно 3-5 стимул до начала воздействия (например, аппликации веществ или тетанизации, в зависимости от эксперимента). Вычисляли средние ± стандартные ошибки средних. Статистическую достоверность различий между группами данных оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа (One-way ANOVA) и с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона (Wilcoxon rank-sum test) с использованием программы SigmaStat 3.1 (Systat Software, Inc.). РЕЗУЛЬТАТЫ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел 1. Каннабиноидные рецепторы в центральной нервной системе виноградной улитки

1.1 Определение специфичности и параметров связывания синтетического агониста каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки

Чтобы выяснить, содержатся ли каннабиноидные рецепторы в нервной ткани улитки, мы применили метод радиолигандного исследования связывания с полным насыщением (см. методы, эксперименты были проведены совместно с М. Ю. Бобровым и сотр. на базе ИБХ РАН). В качестве лиганда использовался неселективный агонист каннабиноидных рецепторов с радиоактивной меткой [3Н]СР-55,940.

Анализ кривой насыщения (рис.1) показал, что происходит специфическое связывание агониста с препаратом мембран нервной ткани виноградной улитки. Константа диссоциации равнялась 8.83 ± 1.2 нМ (среднее ± стандартная ошибка), максимальное количество связанного лиганда, отражающее количество рецепторов в пробе, Втах составило 170 ± 13 фМ/мг белка (среднее ± стандартная ошибка). Полученные данные однозначно подтвердили существование мест специфического связывания каннабиноидов в нервной ткани виноградной улитки. Однако параметры связывания показали низкую аффинность рецепторов улитки к

[3Н]СР55940, нМ

Рис. 1 Кривая связывания радиолиганда каннабиноидных рецепторов на препарате мембран нервной системы улитки. При увеличении концентрации лиганда происходит насыщение связывания, что говорит о наличии специфических мест связывания каннабиноидов в ЦНС улитки. Параметры связывания: константа диссоциации Ка = 8.83 ± 1.2 нМ, максимальное количество связанного лиганда Втах = 0.17 ± 0.013 пМ/мг белка

агонисту СР-55,940, а также небольшое количество рецепторов по сравнению с мозгом млекопитающих. Так, например, СВ1 рецепторы мозга крыс, по нашим данным, имели Kd связывания [3Н]СР-55,940 равную 0.62 нМ и Втах равное 1400 фМ/мг белка. Эти параметры сопоставимы также с результатами, полученными при исследовании связывания в мозге крыс (WA Devane, 1988), в культуре нейронов крысы (Jung М, 1997) и в мозге полосатого данио (zebrafish, Rodriguez-Martin I, 2007). Плотность СВ-рецепторов и их чувствительность к стандартным лигандам у других беспозвоночных, например гидры (Di Marso, 1999) также существенно ниже, чем у позвоночных животных. Возможно, что эти данные отражают действительное второстепенное значение эндоканнабиноидной системы для нервной деятельности беспозвоночных, но не исключено, что различия вызваны вариациями в строении и чувствительности к лигандам рецепторных белков различных таксономических групп животных.

1.2 Локализация каннабиноидных рецепторов в центральной нервной системе виноградной улитки

В первой серии экспериментов (эксперименты сделаны совместно с Иерусалимским В.Н., лаб. КНО, ИВНДиНФ) мы провели сравнение иммунореактивности к антителам против СВ1-рецепторов у двух видов виноградной улитки: Helix lucorum и Helix aspersa. Окрашивание проводилось как на срезах (Я. lucorum п = 7, Я. aspersa п = 8), так и на целых препаратах (Я. lucorum п = 11, Я. aspersa п = 10) центральной нервной системы улитки. Мы использовали три варианта первичных антител к различным участкам эндоканнабиноидных рецепторов человека и крысы (см. Методы). Иммунная реакция на препаратах обоих видов улитки была получена только для поликлональных AT кролика, выработанных к синтетическому пептиду третьего цитоплазматического домена СВ1-рецепторов человека (Chemicon, АВ-9415). Мы обнаружили специфическое окрашивание нейропиля во всех ганглиях ЦНС Helix lucorum. Наиболее интенсивно нейропиль окрашивался в церебральных, буккальных, плевральных и педальных ганглиях. В некоторых ганглиях мы наблюдали отдельные мелкие (5-15 мкм) клетки, иммунореактивные к CB1R-антителам. Общая схема локализации иммунореактивных волокон и клеточных тел в ганглиях Helix lucorum показана на рис.2, А. Одиночные иммунореактивные клетки видны в буккальных и педальных ганглиях. Необходимо отметить, что в педальных ганглиях кроме нейропиля симметрично выкрашиваются по одной

клетке в ростромедиальных областях, в которых расположены преимущественно серотонинергические нейроны, участвующие в модуляции оборонительного поведения. В каждом из церебральных ганглиев можно видеть по три группы

Рис. 2 Иммунореактивность к антителу против СВ1 -рецепторов человека в ЦНС улитки Helix lucorum

(A) Общая схема распределения иммунореактивных нейронов и волокон. БГ -буккальные ганглии, ЦГ - церебральные ганглии, Пл-ПаГ -плевропариетальный комплекс ганглиев, ПеГ - педальные ганглии.

(Б, В) Иммунореактивность к антителу против СВ1-рецепторов человека в плевральных ганглиях после воздействия кофеином (whole mounts). (Б)Левый плевральный ганглий. Видны мелкие иммунореактивные клетки и иммунореактивные нейриты. Калибровка 100 мкм.

(B) Тот же ганглий при большем увеличении. Видна сеть иммунореактивных нейритов, оплетающих Пл1 нейрон. Калибровка 200 мкм.

Пл 1 нейрон отмечен звездочкой (*)

иммунореактивных клеток, а также иммунореактивные волокна в церебро-плевральной коннективе у входа в церебральный ганглий. В висцеральном и правом париетальном ганглиях также находятся три небольших группы иммунореактивных клеток. В плевральном ганглии в основании церебро-плевральной коннективы окрашивается нейропиль, а также некоторое количество мелких неидентифицированных клеток.

Расположение иммунореактивных к каннабиноидным рецепторам волокон и клеток на препаратах улитки Helix aspersa сходно с препаратами Я. lucorum, например, паттерны окрашивания церебральных ганглиев полностью совпадали у обоих видов. Однако, у Я. aspersa совершенно не окрашивались буккапьные ганглии, отсутствовали иммунореактивные тела клеток в плевральных ганглиях и в ростромедиальной области педальных ганглиев. Интересно, что у взрослых улиток Я. aspersa, в отличие от вида Я. lucorum, в париетальных ганглиях окрашивались тела неидентифицированных крупных нейронов, соседствующих с гигантскими нейронами оборонительного поведения, и отростки этих нейронов, которые распространялись в плевральные и висцеральные ганглии, а также в анальный, интестинальный и паллиальный нервы. Насколько известно из литературы, до сих пор не было данных, указывающих на возможность функциональных изменений распределения каннабиноидных рецепторов в мозге. Сейчас общепринятым фактом является, что повышение уровня внутриклеточного Са2+ активирует эндоканнабиноидную систему, в частности, инициирует синтез и выделение эндоканнабиноидов (Cadas Н, di Tomaso Е, 1997).

Мы решили проверить возможность влияния уровня внутриклеточного кальция на распределение каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки. В одной из серий экспериментов иммунохимическое окрашивание части препаратов улиток вида Я. lucorum проводилось после аппликации кофеина, неспецифического агониста рианодиновых рецепторов, который легко проникает в клетки и вызывает резкое увеличение концентрации внутриклеточного кальция (Albrecht MA, Colegrove SL, 2002). После воздействия кофеином в концентрации 10"4 М в плевральном ганглии появлялось некоторое количество иммунореактивных тел клеток, отростки которых в основном оставались в этом же ганглии (рис.2, Б). Тела гигантских нейронов оборонительного поведения в плевральных и париетальных ганглиях оставались неокрашенными, однако, появлялась сеть нейритов, оплетающих тело гигантского интернейрона плеврального ганглия,

1

2

3

98 кСе '>ис' 3 Вестерн-блот анализ

(1) Препарат мембран печени крысы, контроль. Не окрашивается антителами

64 кСб против СВ1 -рецептора (2) Препарат 1 мембран мозга крысы (3) Препарат

мембран ЦНС улитки. Хорошо видно, что

50кСа на дорожках (2) и (3) антителами против человеческого СВ1-рецептора выкрашивается полоса белка с молекулярным весом 64 кДа

участвующего в оборонительной реакции в ответ на раздражение головы и щупалец улитки (рис.2, В). Кроме того, в правом париетальном ганглии появлялись две группы неидентифицированных иммунореактивных тел нейронов, дающих отростки в паллидарные нервы. Иммунореактивность отростков и тел нервных клеток вблизи гигантского оборонительного интернейрона плеврального ганглия позволила предположить вовлеченность эндоканнабиноидов в регуляцию функциональной активности синаптических связей, участвующих в реализации оборонительного поведения.

1.3 Проверка специфичности иммуногистохимического окрашивания с помощью вестерн-блот анализа

При проведении вестерн-блот анализа для сравнения были взяты препараты мембран мозга крысы и цитозольная фракция печени крысы. На рис.3 хорошо видно, что на препаратах ЦНС улитки и мозга крысы антителами к СВ1-рецепторам окрашивается единственная полоса белка, молекулярный вес которого около 63-64 кОа, что хорошо совпадает с характеристиками гликозилированной формы СВ-рецептора млекопитающих. В то же время на препарате печени крысы (контроль) не наблюдалось специфического связывания антител к каннабиноидным рецепторам. Таким образом, полученные результаты подтверждают существование в ЦНС виноградной улитки белка, специфически узнаваемого антителами к каннабиноидному рецептору млекопитающих. Раздел 2. Функциональная роль каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки

2.1 Влияние анаидамида, синтетического агониста каннабиноидных рецепторов, на эффективность синаптической передачи

Для проверки гипотезы о функциональной активности СВ-рецепторов в

нейронной сети, вовлеченной в оборонительное поведение улитки, мы использовали аппликацию синтетического агониста СВ-рецепторов анандамида в концентрации 10"5 М, которая вызывала статистически достоверное снижение амплитуды ВПСП относительно контроля: так, до аппликации анандамида средняя амплитуда ВПСП составляла 91.5 ± 3% (п = 7) и соответственно 96.5 ± 3% (п = 6) в контрольных экспериментах, амплитуда через 10 мин после аплликации равнялась 69 ± 7% (п = 7) и соответственно 89.5 ± 5% (п = 6) в контрольных экспериментах (р < 0.05, везде указано среднее ± стандартная ошибка), рас.4 А, Г.

В следующей серии экспериментов мы тестировали влияние анандамида на суммарные ВПСП, вызванные стимуляцией 2-го кожного нерва, в состав которого входят отростки МС нейронов. Частота тестирующей стимуляции также составляла 1 раз в 2.5 мин. В некоторых экспериментах (п = 6 в контроле и п = 5 в опытах с анандамидом) мы регистрировали суммарные ВПСП одновременно в Пл1 и ПаЗ нейронах. Аппликация анандамида в той же концентрации вызывала достоверное снижение суммарных ВПСП в Пл1 нейроне (рисЛБ, Д). Однако в париетальных нейронах ПаЗ и Па2 амплитуда суммарных ВПСП не изменялась после аппликации анандамида (рис. 4 В).

Таким образом, агонист каннабиноидных рецепторов вызывает небольшое по величине, но достоверное синапс-специфическое снижение амплитуды возбуждающих ВПСП как чисто глутаматергической природы, так и смешанных ВПСП. Полученные результаты согласуются с описанными выше данными о невысокой плотности и чувствительности к стандартным агонистам каннабиноидных рецепторов виноградной улитки. Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание показало, что в исследуемой области иммунореактивность к антителам против человеческих СВ1-рецепторов значительно усиливается в активированном кофеином препарате. Возможно, что в оборонительной микросети виноградной улитки эндоканнабиноидная регуляция "включается" только при повышении общей активности сети.

2.2 Влияние анандамида на долговременную фасилитацию глутаматергических входов

Ритмическая стимуляция ипсилатерального кожного нерва обычно приводит к постепенному снижению амплитуды суммарных ВПСП в гигантских интернейронах (Балабан, Захаров, 1992). Однако высокочастотная тетанизация того же нерва вызывала долговременную фасилитацию - значительное (более

200% в отдельных связях) увеличение амплитуды ВПСП, которое сохраняется в течение 1 - 2 часов после тетанизации. Непосредственно после тетанизации амплитуда ВПСП увеличивалась в среднем на 60% (от 90 ± 3% до 153.6 ± 9%, р < 0.001) в ПаЗ нейронах, и примерно на 110% (от 90 ± 4% до 200 ± 26%, р < 0.001) в Пл1 нейронах, как показано на рис.6 А, белые точки. В некоторых экспериментах

— до аппликации

■••• после аппликации X " ® 10 15 20

Рис. 4 Влияние анандамида на эффективность синаптической передачи между механосенсорными нейронами и ипсилатеральным Пл1 и ПаЗ нейронами

(А) Аппликация анандамида в концентрации 10"5 М снижает амплитуду моносинаптических ВПСП в Пл1 нейроне, вызываемых стимуляцией механосенсорных нейронов. (Б) Аппликация анандамида в концентрации 10"5 М снижает амплитуду суммарных ВПСП, вызванных стимуляцией 2-го кожного нерва, в Пл1 нейроне и не влияет на амплитуду суммарных ВПСП в ПаЗ нейроне (В). Момент аппликации отмечен стрелкой. (Г, Д) Примеры моносинаптических и суммарных ВПСП соответвенно до и после аппликации контрольного раствора (вверху) и анандамида (внизу)

тетанизацию проводили на фоне преинкубации с анандамидом (концентрация 5*10"6 М). Мы обнаружили, что анандамид вызывает тенденцию к снижению начальной величины фасилитации в Пл1 нейронах и достоверно уменьшает длительность фасилитации в этих нейронах {рис.5 А, черные точки: непосредственно после тетанизации амплитуда ВПСП в среднем увеличивалась на 65% (от 92.5 ± 4% до 169 ± 11.5%), не отличается'от контроля, р = 0.34, однако через 30 мин после тетанизации амплитуда ВПСП опускается до начального уровня и ее величина достоверно ниже контрольной, р < 0.01). Интересно, что в данной серии экспериментов преинкубация с анандамидом снижала начальный размер и длительность фасилитации также и в ПаЗ нейронах {рис.5 Б, черные точки: непосредственно после тетанизации амплитуда ВПСП увеличивалась на 35% (от 84 ± 3% до 120 ± 7%), что достоверно ниже, чем в контроле, р < 0.001, амплитуда ВПСП падала ниже начального уровня уже через 30 мин после тетанизации и была достоверно ниже, чем в контроле, р < 0.05). Таким образом, мы можем заключить, что каннабиноиды могут участвовать в регуляции долговременной пластичности в оборонительной нейрональной сети виноградной улитки. Интересно, что в данном случае длительная фасилитация подавлялась и в париетальных, и в плевральных гигантских нейронах. Известно, что в формировании длительной фасилитации задействованы также серотонинергические нейроны педальных ганглиев (Balaban et al., 2004). Возможно, что в данном случае эффект анандамида реализовывался не напрямую через подавление пресинаптических входов от механосенсорных нейронов, а путем снижения активности серотонинергических нейронов.

2.3 Действие селективного блокатора каннабиноидных рецепторов АМ251 на эффективность синаптической передачи

Ранее было показано, что синтез и выделение эндоканнабиноидов в мозге млекопитающих происходят только в ответ на возрастание нейрональной или синаптической активности (Piomelli, 2003). Для проверки гипотезы о существовании тонической модуляции эндоканнабиноидами синаптической передачи между МС нейронами и Пл1 нейроном мы апплицировали синтетический антагонист СВ1-рецепторов АМ251 в концентрации 2*10"5 М непосредственно в чашку с препаратом. Мы обнаружили слабое увеличение амплитуды ВПСП, которое не было достоверным и не отличалось от изменений, вызываемых аппликацией растворителя без антагониста в контрольных

экспериментах. Таким образом, мы можем предположить, что при фоновой активности данного синаптического контакта не происходит постоянного

Рис. 5 Анандамнд достоверно снижает величину и длительность долговременной фасилитации синаптических ответов в гигантских интернейронах

Сравнение амплитуды суммарных ВПСП в Пл1 нейроне (А) и в Па2 и ПаЗ нейронах (Б) на фоне анандамида (черные точки) и контрольного раствора (белые точки). Вещества добавляли в ванночку с препаратом ЦНС за 15-20 мин до начала регистрации ВПСП.

Момент высокочастотной тетанизации 2-го кожного нерва отмечен стрелкой. По оси абсцисс - время эксперимента, по оси ординат - амплитуда суммарных ВПСП (за 1 принята амплитуда ответа за 10 мин до тетанизации, частота регистрации ВПСП 1/2.5 мин, ответы объединены по 4). В каждой точке показана стандартная ошибка, для сравнения групп данных использован критерий суммы рангов Уилкоксона (Wilcoxon rank-sum test) ,* - р < 0.05, ** - р < 0.01, *** - р < 0.001

выделения эндоканнабиноидов.

В следующей серии экспериментов мы апплицировали АМ251 в той же концентрации спустя 10 мин после предварительной внутриклеточной активации плеврального нейрона Пл1. В качестве активирующего воздействия мы использовали высокочастотную внутриклеточную тетанизацию. Сама по себе такая активация не вызывала заметных изменений в амплитуде ВПСП, однако через 10-15 мин после добавления антагониста СВ1-рецепторов амплитуда ВПСП возрастала примерно на 20% относительно контрольного уровня (р < 0.05). Полученные данные свидетельствуют, что при внутриклеточной активации Пл1 нейрона выделяются эндоканнабиноиды, снижающие эффективность глутаматергических моносинаптических контактов между MC и Пл1 нейронами.

Раздел 3 Участие эндогенных каннабиноидов в кратковременной пластичности синаптической передачи

В предыдущих сериях экспериментов мы использовали тестирующую стимуляцию пресинаптического нейрона, подававшуюся с частотой 0.0066 Гц (межстимульный интервал 2.5 мин). При этой частоте наблюдается небольшая скорость привыкания ВПСП в постсинаптическом нейроне, средняя амплитуда ответа на 10 стимул (через 25 мин от начала стимуляции) составляла 66 ± 5%, за 100% принята амплитуда ответа на первый стимул, однако теряется информация о событиях, длящихся менее нескольких минут. Как было показано ранее (Wilson RI, 2001; Ohno-Shosaku Т, 2002), эндоканнабиноидная система участвует в кратковременной регуляции как возбуждающей, так и тормозной передачи. Для исследования этих феноменов мы увеличили частоту тестирующей стимуляции в 5 раз (до 0.033 Гц, межстимульный интервал 30 с), но при этом увеличивалалась и скорость привыкания ВПСП в гигантских интернейронах, средняя амплитуда ответа на 10 стимул (через 5 мин от начала стимуляции) составляла 46 ± 11%, за 100% принята амплитуда ответа на первый стимул. Тем не менее, примерно к 7 -10 стимулу величина ВПСП практически выходила на плато. Для исследования кратковременной пластичности мы подбирали синаптические контакты, в которых амплитуда моносинаптических ВПСП изначально была достаточно большой (3-6 мВ), и начинали регистрацию, когда амплитуда ВПСП падала до 1.5 -3 мВ.

3.1 Вызванное деполяризацией подавление возбуждения

Одним из многократно описанных механизмов действия эндоканнабиноидов

является так называемое вызванное деполяризацией подавление возбуждения (DSE: depolarization induced suppression of excitation), которое заключается в индукции синтеза эндогенных каннабиноидов в постсинаптической терминали в ответ на кратковременную (1-5 с) деполяризацию постсинаптического нейрона, и затем также кратковременном (порядка нескольких минут) ретроградном подавлении активности возбуждающих, обычно глутаматергических, входов (Kreitzer, 2001; Straiker, 2005; Chiu, 2008; ). В следующей серии экспериментов мы проверили, реализуется ли данный механизм кратковременной пластичности в моносинаптических контактах между нейронами, участвующими в

. контроль, п = 5

контроль, п = 9

на фоне АМ251 2М0"6 M, п = 4

на фоне АМ251 Ю^М, п = 3

деполяризация постсинаптического нейрона

Время, с

450

Рис. 6 Кратковременная пластичность в Пл1 нейроне

(А) Кратковременная деполяризация постсинаптического нейрона Пл1 не вызывает изменений эффективности входов от механосенсорных нейронов. (Б) Низкочастотная тетанизация 2-го кожного нерва вызывает кратковременнное уменьшение амплитуды моносинаптических ВПСП в Пл1 нейроне. Преинкубация с агонистом каннабиноидных рецепторов АМ251 в концентрации 2*10"5 М полностью блокирует эффект низкочастотной тетанизации в Пл1 нейроне. Преинкубация с АМ251 в концентрации, сниженной в два раза, практически не изменяет величину депрессии, вызванной низкочастотной тетанизацией нерва.

По оси абсцисс - время от начала эксперимента, по оси ординат - амплитуда моносинаптических ВПСП (за 1 принята амплитуда ответа за 2.5 мин до тетанизации). Стрелками отмечены пачки тетанизирующих стимулов. В каждой точке показана стандартная ошибка среднего, *** р < 0.001, ** р < 0.01, * р < 0.05

оборонительном поведении улитки. Мы стимулировали с частотой 0.033 Гц механосенсорные нейроны плеврального ганглия, и регистрировали ВПСП в Пл1 нейроне, как описано выше. Через 5-10 мин от начала тестирующей стимуляции между стимулами в постсинаптический нейрон через второй электрод подавали ступеньку тока + 10 нА, длительностью 15 с, которая вызывала деполяризацию Пл1 нейрона на 20-30 мВ и спайковый разряд частотой 12-15 Гц. Затем продолжали регистрацию тестирующих ВПСП. Однако, против ожиданий, такая деполяризация постсинаптического нейрона вызывала незначительное, статистически недостоверное снижение амплитуды ВПСП в Пл1 нейроне {рис.6 А). Таким образом, мы можем заключить, что в данных синаптических контактах механизм DSE не участвует в регуляции эффективности синаптической передачи.

3.2 Синаптически вызванное подавление возбуждения

Мы обнаружили, что низкочастотная тетанизация 2-го кожного нерва, содержащего в том числе и отростки МС нейронов, вызывает кратковременное, продолжительностью около 2 мин, снижение амплитуды моносинаптических ВПСП в Пл1 нейроне (рис.6 Б, белые точки). В то же время амплитуда моносинаптических ВПСП, вызванных стимуляцией того же самого пресинаптического МС нейрона и зарегистрированных в ПаЗ нейроне, не изменяется. Для проверки гипотезы об участии СВ-рецепторов в данной форме пластичности, в некоторых экспериментах кожный нерв тетанизировали на фоне преинкубации с блокатором СВ1-рецепторов АМ251 в концентрации 2x10"5 М. В этом случае низкочастотная тетанизация не вызывала снижения амплитуды ВПСП в Пл1 нейроне {рис.6Б, черные точки). При снижении концентрации АМ251 в два раза (до 10"5 М) в существенно меньшей степени блокирует снижение амплитуды ВПСП после низкочастотной тетанизации {рис. 6 Б, серые точки). Полученные данные свидетельствуют об участии эндогенных каннабиноидов в кратковременной синапс-специфической регуляции глутаматергической моносинаптической связи между МС нейронами плеврального ганглия и Пл1 нейроном. Мы можем предположить, что найденный нами феномен является аналогом обнаруженного в мозжечке крыс синаптически вызванного подавления возбуждения (synaptically evoked suppression of excitation, SSE; Beierlein, 2006).

3.3 Сезонная выраженность SSE в моносинаптических связях механосенсорных и гигантского плевральных нейронов

При исследовании SSE мы обнаружили, что за тетанизацией кожного нерва

не всегда следует кратковременная депрессия ВПСП, зарегистрированных в Пл1 нейроне. В предыдущих работах в нашей лаборатории было показано, что долговременная пластичность афферентных входов на гигантские нейроны плевральных и париетальных ганглиев может зависеть от сезона (Malyshev, 1998). Мы проверили, не распространяется ли эта зависимость и на кратковременные пластические изменения. Как оказалось, SSE удавалось вызвать только в экспериментах, проведенных в осенне-зимний сезон (рис. 7, белые точки). В весенне-летних экспериментах в среднем амплитуда ВПСП не изменялась в течение первой минуты после тетанизации, а затем появлялась тенденция к возрастанию амплитуды ответов.

Таким образом, наши данные показали, что появление кратковременной каннабиноид-зависимой депрессии моносинаптических входов Пл1 нейрона коррелирует с осенне-зимним периодом. Возможно, такая связь обусловлена взаимодействием между серотонинергической и эндоканнабиноидной системами в ЦНС виноградной улитки.

3.4 Зависимость выраженности SSE в моносинаптических связях механосенсорных и Пл1 нейронов от уровня серотонина

Было показано, что одним из важных модуляторных факторов в нервной системе улитки, участвующих в том числе и в сезонных изменениях, является серотонин (Hiripi et al., 1973; Zakharov et al., 1995; Grinkevich et al., 2000; Solntseva et al., 2008). Кроме того, известно, что модуляторные серотонинергические нейроны как получают афферентные входы через 2-й кожный нерв, тетанизация которого вызывает SSE, так и сами дают отростки в этот нерв. Чтобы проверить возможную связь появления SSE со степенью активации серотонинергической системы, мы провели летнюю серию экспериментов на препаратах с фармакологически поврежденными серотонинсодержащими нейронами. За 2-7 дней до приготовления препарата улиткам вводили нейротоксин 5,7-диокситриптамин (5,7-ДГТ), который отличается от серотонина наличием одной дополнительной гидроксильной группы и вызывает подавление синтеза серотонина, а также обратимую деградацию терминалей серотонинергических нейронов, что ведет к снижению уровня серотонина в нервной системе и подавлению подкрепляющей функции серотонинергической системы улитки (Baumgarten et al., 1987). Мы обнаружили, что через 3-4 дня после введения 5,7-ДГТ в ответ на тетанизацию кожного нерва вырабатывается SSE, параметры

которого совпадают с параметрами SSE, наблюдавшимися в осенне-зимний период (рис. 7, серые точки). Через 5-7 дней после введения 5,7-ДГТ, когда предположительно начиналось восстановление поврежденных

серотонинергических терминалей (Vehovsky et al., 1988) в ЦНС, уменьшалась величина и длительность депрессия ВПСП, и затем амплитуда ВПСП не только возвращалась к базовому уровню, но и показывала тенденцию к дальнейшей потенциации (рис. 7, черные точки).

—О— SSE, зима, п = 9

—О— 3-4 дня после введения ДГТ, п = 4

—•— 5-7 после введения ДГТ, п = 5

—т— зима, на фоне серотонина, 10б М, п = 1

Рис. 7 Зависимость выраженности SSE в моносинаптических связях механосенсорных и гигантского плевральных нейронов от уровня серотонина

По оси абсцисс - время от начала эксперимента, по оси ординат - амплитуда моносинаптических ВПСП (за 1 принята амплитуда ответа за 2.5 мин до тетанизации). Стрелками отмечены пачки тетанизирующих стимулов. В каждой точке показана стандартная ошибка среднего, *** р < 0.001, ** р < 0.01, * р < 0.05

Был проведен один дополнительный зимний эксперимент, в котором тетанизацию нерва проводили через 30 мин после аппликации серотонина в концентрации 10"6 М. В этом случае мы наблюдали кратковременное возрастание амплитуды ВПСП {рис. 7, черные треугольники).

Таким образом, при низкой активности серотонинергической системы в ответ на низкочастотную тетанизацию 2-го кожного нерва возникает кратковременная депрессия моносинаптических возбуждающих входов на гигантский плевральный нейрон улитки. Увеличение уровня серотонина в ЦНС снижает этот эффект и даже приводит к появлению кратковременной потенциации. ВЫВОДЫ

1. В ЦНС брюхоногого моллюска Helix lucorum существуют СВ1-подобные рецепторные белки, специфически связывающие каннабиноидные лиганды. По молекулярному весу эти белки соответствуют гликозилированной форме СВ1-рецептора крысы, и специфически узнаваемые антителами, выработанными против человеческого СВ1-рецептора.

2. Полученное методом иммуногистохимии распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС сходно у двух близких видов улиток рода Helix и позволяет предположить участие каннабиноидных рецепторов в регуляции пищевого и оборонительного поведения улитки.

3. Впервые показана возможность функциональных изменений распределения СВ1-подобных рецепторов в ЦНС моллюсков.

4. Агонист каннабиноидных рецепторов анандамид вызывает синапс-специфическое снижение эффективности возбуждающей синаптической передачи в нейронной сети, опосредующей оборонительное поведение виноградной улитки.

5. Аппликация блокатора СВ1-рецепторов АМ251 не вызывает изменений эффективности синаптической передачи между механосенсорными и гигантскими плевральными нейронами, что свидетельствует об отсутствии тонического выделения эндоканнабиноидов в данных синаптических контактах.

6. Эндоканнабиноиды участвуют в регуляции долговременной пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения.

7. Низкочастотная тетанизация кожного нерва вызывает каннабиноид-зависимую, кратковременную, синапс-специфическую депрессию синаптической передачи от механосенсорных нейронов плеврального ганглия к Пл1 нейрону.

8. Выработка каннабиноид-зависимой и синапс-специфической депрессии синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки возможна только в осенне-зимний период и зависит от уровня активности серотонинергической системы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lemak M.S., Bravarenko N.I., Bobrov M.Y., Bezuglov V.V., Ierusalimsky V.N., Malyshev A.Y., Storozhuk M.V., Balaban P.M. Cannabinoid regulation in identified synapse of terrestrial snail. Eur J Neurosci. 2007 Dec; 26(11):3207-14.

2. Влияние эндоканнабиноидов на глутаматэргическую синаптическую передачу в ЦНС виноградной улитки Helix lucorum. Лемак М.С., Малышев А.Ю., Балабан П.М., Научная конференция молодых ученых ИВНДиНФ РАН, 2008, Москва

3. Endocannabinoids depress excitation of synaptic transmission in terrestrial snail Helix lucorum in the activity-depended manner. Lemak M.S., Malyshev A.Yu., Balaban P.M.; 11th ISIN Symposium on Invertebrate Neurobiology, 2007 August 25-29, Tihany, Hungary

4. Эндоканнабиноиды снижают эффективность возбуждающей синаптической передачи в ЦНС наземного моллюска Helix lucorum. Лемак М.С., Малышев А. Ю., Балабан П.М.; XX конгресс Физиологического общества имени И.П. Павлова, 0408 июня, 2007 г., Москва

5. Endocannabinoids modulate the efficacy of the exitatory monosynaptic connection in the terrestrial snail Helix lucorum. Lemak M.S., Malyshev A.Yu., Balaban P.M.; VIII East European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology, 2006 September 13-17, Kazan

к исполнению 26/10/2009 Исполнено 27/10/2009

Заказ №2180 Тираж 100 экз.

ООО «СМСА» ИНН 7725533680 Москва, 2й Кожевнический пер., 12 +7(495)604-41-54 www.cherrypie.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лемак, Мария Степановна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1. Эндоканнабиноидная регуляция в ЦНС млекопитающих.

1.1 Эндоканнабиноидные рецепторы, структура и распределение в ЦНС.

1.2 Эффекты анандамида, не связанные с СВ-рецепторами.

1.3 Принципы действия эндоканнабиноидной системы в ЦНС позвоночных животных.

2. Эндоканнабиноиды у беспозвоночных.

ГЛАВА II. Методы, использованные в работе.

Метод радиолигандного исследования связывания с полным насыщением.

Иммунохимическое окрашивание ЦНС улитки.

Вестерн-блот гибридизационный анализ.

Электрофизиологические эксперименты.

Глава III. Результаты и предварительное обсуждение.

Раздел 1. Каннабиноидные рецепторы в центральной нервной системе виноградной улитки.

1.1 Определение специфичности и параметров связывания синтетического агониста каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки.

1.2 Локализация каннабиноидных рецепторов в центральной нервной системе виноградной улитки.

1.3 Проверка специфичности иммуногистохимического окрашивания с помощью вестерн-блот анализа.

Раздел 2. Функциональная роль каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки.

2.1 Влияние анандамида, синтетического агониста каннабиноидных рецепторов, на эффективность синаптической передачи.

2.2 Влияние анандамида на долговременную фасилитацию глутаматергических входов.

2.3 Действие селективного блокатора каннабиноидных рецепторов АМ251 на эффективность синаптической передачи

Раздел 3 Участие эндогенных каннабиноидов в кратковременной пластичности синаптической передачи.

3.1 Вызванное деполяризацией подавление возбуждения.

3.2 Синаптически вызванное подавление возбуждения.

3.3 Сезонная выраженность синаптически вызванного подавления возбуждения в моносинаптических связях механосенсорных и гигантских плевральных нейронов.

3.4 Зависимость выраженности синаптически вызванного подавления возбуждения в моносинаптических связях механосенсорных и гигантских плевральных нейронов от уровня серотонина.

Глава IV. Обсуждение результатов.75'

1. Каннабиноидные рецепторы в центральной нервной системе виноградной улитки.

2. Каннабиноидная регуляция эффективности синаптической передачи.

2.1 Влияние анандамида.

2.2 Влияние антагониста каннабиноидных рецепторов АМ251.

2.3 Роль каннабиноидов в долговременной пластичности связей нейронной сети оборонительного поведения.

2.4 Кратковременная пластичность связей в нейронной сети оборонительного поведения.

2.5 Зависимость кратковременной каннабиноид-зависимой депрессии синаптической передачи от уровня серотонина.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Каннабиноидная регуляция в центральной нервной системе виноградной улитки"

В настоящее время механизмы эндоканнабиноидной регуляции синаптической передачи, обнаруженной относительно недавно в центральной нервной системе млекопитающих, подвергаются активному изучению. Сейчас является общепризнанным, что эндоканнабиноидная система играет важную роль в процессах обучения, памяти, пищевом и оборонительном поведении, нейропротекции (Капо et al., 2009; Хаспеков & Бобров, 2006). Открытие каждой новой медиаторной системы поднимает вопрос о ее эволюционном происхождении. Древность происхождения и распространение среди широкого числа таксонов может свидетельствовать о фундаментальной важности и универсальности данного механизма передачи сигнала в нервной системе. Таким образом, необходимо исследовать составляющие эндоканнабиноидной системы и их структурные и функциональные особенности у различных видов немлекопитающих позвоночных и беспозвоночных животных. Современные генетические исследования показали, что рецепторы, гомологичные каннабиноидным рецепторам (СВ-рецепторам) млекопитающих, найдены у всех классов не-млекопитающих позвоночных и имеют высокую степень сходства с человеческим СВ1 -рецептором (Elphick & Egertova, 2001). Среди беспозвоночных животных элементы эндоканнабиноидной системы описаны у кишечнополостных, иглокожих, двустворчатых моллюсков, плоских и кольчатых червей, но отсутствуют у насекомых и круглых червей (Salzet et al., 2000; McPartland & Glass, 2003). Несмотря на то, что у беспозвоночных найдены эндоканнабиноидные лиганды, ферменты гидролиза каннабиноидов и, в ряде случаев, CBl-подобные рецепторы, а также показано влияние экзогенных каннабиноидов на пищевое поведение гидры и оборонительное поведение планарий, очень мало известно о нейрофизиологических механизмах действия каннабиноидной системы у беспозвоночных животных. С этой точки зрения актуальным является исследование физиологической роли каннабиноидов в регуляции эффективности нервных связей у брюхоногих моллюсков, которые давно используются в качестве модельных объектов в нейрофизиологии для изучения корреляций между целостным поведением и контролирующими его нервными сетями (Gover & Abrams, 2009; Frost & Kandel, 1995). Одним из ярких примеров подобного использования является анализ нейронной сети, обеспечивающей рефлекс отдергивания жабры у морского моллюска аплизии (Frost & Kandel, 1995).

Аналогом отдергивания жабры у аплизии является оборонительная реакция улитки Helix — втягивание головы и щупалец в раковину в ответ на болевой стимул. Сенситизация этого рефлекса коррелирует с длительной фасилитацией входов от кожного нерва на командные нейроны оборонительного поведения — гигантские идентифицированные нейроны париетальных и плевральных ганглиев, спайковые разряды в которых способны вызвать генерализованную оборонительную реакцию улитки (Максимова & Балабан, 1983; Balaban & Bravarenko, 1993; Захаров, 1992). Кроме того, в оборонительной нервной сети улитки идентифицированы механосенсорные нейроны, которые дают моносинаптические входы на командные нейроны оборонительного поведения, являются глутаматергическими и участвуют в формировании оборонительного поведения улитки (Malyshev & Balaban, 2002; Bravarenko et al., 2003), что позволяет детально исследовать регуляцию синаптической передачи в отдельных синаптических контактах, контролируя как пре- так и постсинаптический нейроны.

Таким образом, улитка Helix является очень удобным объектом для исследования роли каннабиноидной системы в регуляции синаптической передачи у беспозвоночных животных.

Цели и задачи исследования

Целью нашей работы являлось подтверждение существования эндогенной каннабиноидной системы в ЦНС брюхоногих моллюсков и ее структурно-функциональное описание. Для достижения данной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать параметры связывания синтетического агониста CBl-каннабиноидных рецепторов [3Н]СР-55,940 в препарате мембран нервной системы улитки Helix lucorum

2. Методом иммуногистохимии исследовать распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС двух видов улиток рода Helix

3. Определить влияние агониста СВ1-рецепторов анандамнда и антагониста АМ251 на эффективность возбуждающей синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum

4. При использовании анандамида и АМ251 исследовать участие эндоканнабиноидов в регуляции кратковременной и долговременной пластичности связей нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum

Научная новизна

Впервые описано наличие CBl-подобных рецепторов в нервной системе брюхоногих моллюсков, показано участие эндогенных каннабиноидов в регуляции кратковременной и долговременной пластичности синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum. Обнаружена новая форма кратковременной пластичности моносинаптической связи между механосенсорными и гигантскими нейронами оборонительного поведения: кратковременное каннабиноид-зависимое подавление возбуждающей передачи в результате низкочастотной стимуляции сенсорных входов (SSE). Показано, что сезонная активность серотонинергической системы является модулирующим фактором при выработке SSE.

Положения, выносимые на защиту

1. В центральной нервной системе наземной улитки Helix lucoriim содержатся белки, гомологичные каннабиноидным рецепторам первого типа млекопитающих.

2. Эндоканнабиноиды участвуют в регуляции пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения, снижая эффективность возбуждающей синаптической передачи.

3. Работа каннабиноидной системы подвержена сезонным изменениям и зависит от активности серотонинергической системы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Лемак, Мария Степановна

Выводы

1. В ЦНС брюхоногого моллюска Helix hicoriim существуют СВ1-подобные рецепторные белки, специфически связывающие каннабиноидные лиганды. По молекулярному весу эти белки соответствуют гликознлированной форме СВ1-рецептора крысы, и специфически узнаются антителами, выработанными против человеческого СВ1 -рецептора.

2. Полученное методом иммуногистохимии распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС сходно у двух близких видов улиток рода Helix и позволяет предположить участие каннабиноидных рецепторов в регуляции пищевого и оборонительного поведения улитки.

3. Впервые показана возможность функциональных изменений распределения СВ1-подобных рецепторов в ЦНС моллюсков.

4. Агонист каннабиноидных рецепторов анандамид вызывает синапс-специфическое снижение эффективности возбуждающей синаптнческой передачи в нейронной сети, опосредующей оборонительное поведение виноградной улитки.

5. Аппликация блокатора CBl-рецепторов АМ251 не вызывает изменений эффективности синаптической передачи между механосенсорными и гигантскими плевральными нейронами, что свидетельствует об отсутствии тонического выделения эндоканнабиноидов в данных синаптических контактах.

6. Эндоканнабиноиды участвуют в регуляции долговременной пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения.

7. Низкочастотная тетанизация кожного нерва вызывает каннабиноид-зависимую, кратковременную, синапс-специфическую депрессию синаптической передачи от механосенсорных нейронов плеврального ганглия к Пл 1 нейрону.

8. Выработка каннабиноид-зависимой и синапс-специфической депрессии синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки возможна только в осенне-зимний период и зависит от уровня активности серотонинергической системы.

Заключение:

1. Низкочастотная тетанизация кожного нерва вызывает каннабиноид-зависимую, кратковременную, синапс-специфическую, депрессию синаптической передачи от механосенсорных нейронов плеврального ганглия к Пл1 нейрону, аналогичную феномену синаптически вызванного подавления возбуждения.

2. Выработка SSE в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки возможна только в осенне-зимний период и зависит от уровня активности серотонинергической системы.

3. Механизм вызванного деполяризацией подавления возбуждения не участвует в регуляции эффективности синаптических контактов между механосенсорными и Пл1 нейронами плеврального ганглия.

Глава IV. Обсуждение результатов 1. Каннабиноидные рецепторы в центральной нервной системе виноградной улитки

Несмотря на то, что эндоканнабиноидная система является достаточно древней и ее элементы найдены еще у кишечнополостных, некоторые таксономические группы беспозвоночных, в частности, насекомые, по-видимому, лишены эндоканнабиноидной регуляции в ее классическом виде (Е1рЫск & Egertova, 2001; МсРа^кпё, 2004). Таким образом, первой задачей нашего исследования было выяснить, существуют ли в ЦНС брюхоногих моллюсков специфические места связывания каннабиноидов, и, по возможности, охарактеризовать их.

Для оценки наличия специфических мест связывания каннабиноидных лигандов в мозге используется метод радиолигандного связывания с насыщением. В качестве лигандов используются меченые тритием агонисты (анандамид, \\ШчГ-55212, СР-55,940) и антагонисты (8К141716А) каннабиноидных рецепторов. В нашей работе мы оценивали параметры связывания меченого тритием синтетического агониста СР-55,940. Кривая насыщения связывания агониста в препарате мембран имела колоколообразную форму, что подтвердило существование специфического связывания агониста в ЦНС улитки. Оценка параметров связывания с агонистом [3Н]СР-55,940 показала невысокую чувствительность предполагаемых рецепторов, так, константа диссоциации была примерно в 10 раз более высокой, чем в препарате мембран мозга крыс. Тем не менее, чувствительность мест связывания каннабиноидного радиолиганда вполне сравнима с параметрами, полученными на препаратах спермы морских ежей и препаратах тканей гидры. Ранее было показано, что иммуноциты мидий и нервная ткань пиявки содержат высокоаффинные места связывания анандамида (Stefano et al., 1996), однако Egertova (Elphick & Egertova , 2001) считает, что эти параметры могут быть завышены в результате использования нестандартной методики оценки параметров связывания радиолпганда.

Показано, что каннабиноидные рецепторы различных групп беспозвоночных, таких как моллюски (например, Mytilus sp.), кольчатые черви (например, Hirudo medicinalis), кишечнополостные, в частности, Hydra vulgaris, и иглокожие (Echinoidea), несмотря на различия в структуре последовательности, сходны по размерам и условиям функционирования с ферментами и рецепторами, описанными у млекопитающих (Salzet et al., 2000). В этот ряд укладываются и полученные нами результаты. По данным Вестерн-блот анализа специфически узнаваемый СВ1-антителами белок ЦНС улитки имеет молекулярный вес 64 кДа, такой же как и молекулярный вес гликозилированного каннабиноидного рецептора крысы (Song & Bonner, 1996). После обработки эндогликозидазой F молекулярный вес крысиного рецептора снижается до 53 кДа, что согласуется с весом чистого рецепторного белка морского ежа.

Любая медиаторная регуляторная система в ЦНС состоит из ферментов синтеза и деградации медиатора, аппарата транспортировки или освобождения и аппарата рецепции медиатора. Среди беспозвоночных эндоканнабиноидная система была описана у животного с одной из наиболее примитивных нервных систем Hydra vulgaris (De Petrocellis et al., 1999). В нервной ткани гидры содержались эндоканнабиноиды: 2-арахидоноилглицерол (2-АГ) и анандамид, а также предшественник анандамида (NArPE) и фермент деградации анандамида (FAAH, гидролаза амидов жирных кислот). Кроме того, анандамид, 2-АГ и FAAH были найдены в иммуноцитах и нервных ганглиях трех видов пиявок, в частности, Hirudo medicinalis, а также показана колокализация FAAH-подобных ферментов и СВ1 иммунореактивности (Matías et al., 2001). В тканях нескольких видов моллюсков, в частности, Mytilus galloprovincialis, также было показано наличие физиологических количеств анандамида и фермента, подобного FAAH (Sepe et al., 1998). Тем не менее, практически нет данных, касающихся распределения и плотности каннабиноидных рецепторов в центральной нервной системе моллюсков. В нашей работе мы сосредоточились на исследовании локализации каннабиноидных рецепторов с помощью иммуногистохимического окрашивания.

Поскольку каннабиноидные рецепторы моллюсков не описаны, мы опирались на исследования структуры каннабиноидных рецепторов других беспозвоночных: медицинской пиявки и гидры. Было показано, что секвенированный участок рецептора пиявки (153 аминокислоты от N-конца, включающие 3-й трансмембранный домен) сходен на 49% с человеческим и на 47% с крысиным рецептором 1-го типа (Stefano et al., 1996). По другим данным, сходство с человеческим рецептором составляет 58% (McPartland & Glass, 2003). Особенно интересно, что этот участок содержит высококонсервативные последовательности, расположенные между аминокислотами 1-97 и 128-153, гомологичные человеческому каннабиноидному рецептору 1-го типа на 80% и 58% соответственно (Stefano et al., 1996). Кроме того, в ЦНС пиявки присутствуют нейроны, иммунореактивные к антителам, выработанным к N-концу человеческих каннабиноидных рецепторов, что показывает принципиальную возможность использования человеческих антител к каннабиноидным рецепторам для окраски ЦНС беспозвоночных. В нашей работе мы использовали три типа антител, выработанных к разным участкам человеческого каннабиноидного рецептора. Наиболее результативными оказались антитела кролика, выработанные к синтетическому пептиду 3-го цитоплазматического домена СВ1-рецепторов человека, которые выкрашивали в центральных ганглиях наземной улитки определенные группы клеток и области нейропиля, причем распределение этих групп было сходно у двух близких видов улиток рода Helix, что является дополнительным свидетельством в пользу специфичности связывания антител.

В ЦНС улитки Helix lucorum иммунореактивные клетки и нейропиль обнаруживались во всех ганглиях, в основном, представляли собой мелкие неидентифицированные нейроны. Наибольшее количество им муноре активных клеток и волокон содержалось в церебральных и плевральных ганглиях.

В буккальных ганглиях иммуногистохимически выкрашивались по три парные клетки в основании глоточного нерва, а также некоторое количество нервных отростков, уходящих в глоточный нерв и одну из ветвей церебробуккальной коннективы. Часть иммунореактивных волокон оставалась внутри ганглиев. В церебральных ганглиях выкрашивались три группы клеток и большое количество волокон, которые как оставались в церебральных ганглиях, так и уходили в цереброплевральные и церебробуккальную коннективы. Буккальные ганглии в ЦНС виноградной улитки регулируют поедание пищи. В церебральных ганглиях расположены крупные нейроны, модулирующие пищевое поведение, в частности,осуществляющие выбор между пищевой и оборонительной программами поведения. Одним из ярких эффектов, оказываемых каннабиноидами на поведение человека и других млекопитающих, является СВ1-рецептор зависимая стимуляция аппетита (Pagotto et al., 2006; Di Marzo V., 2005). Из беспозвоночных животных на гидре было показано, что агонист СВ-рецепторов вызывает снижение пищевого ответа, заключающегося в открывании и закрывании рта в ответ на непосредственную близость добычи или аппликацию глутатиона (De Petrocellis et al., 1999). Физиологическая активность эндоканнабиноидов была изучена в основном на ГАМК-эргической и, в меньшей степени, глутаматергической, синаптической передаче (Mackie, 2006). Согласно распределению и морфологии большая часть нейронов, иммунореактивных к СВ1-антителам, является ГАМК-ергическими (Капо et al., 2009). Интересно, что полученное нами распределение иммунореактивных к СВ1-антителам нейронов и волокон в ЦНС виноградной улитки частично совпадает с распределением ГАМК-ергических нейронов у вида Н. aspersa (Ierusalimsky & Balaban , 2001). Возможно, что и у моллюсков эндоканнабиноидная система играет определенную роль в регуляции ГАМК-ергической передачи. Так как у Helix ГАМК вовлечена в запуск пищевой активности (Bravarenko et al., 2001), можно предположить участие каннабиноидов в регуляции пищевого поведения улитки, осуществляемого через ГАМК-ергическую медиаторную систему.

Как упоминалось выше, в мозге млекопитающих СВ1 -рецепторы расположены в основном на мембранах тормозных нейронов, однако в мозжечке, гиппокампе, зубчатой извилине, базальных ядрах и церебральной коре СВ1 -рецепторы экспрессируются также глутаматергическими нейронами, хотя и в значительно меньшем количестве (Mackie, 2006; Капо et al., 2009). Для виноградной улитки не существует иммунохимических данных о распределении глутаматсодержащих нейронов, однако функционально было показано, что гигантские оборонительные нейроны несут не-NMDA глутаматные рецепторы (Коршунова, автореферат, 2004, Никитин и др., 2000), а моносинаптические входы от механосенсорных нейронов плеврального ганглия на гигантские нейроны оборонительного поведения плеврального и париетального ганглиев являются глутаматергическими

Bravarenko et al., 2003). По нашим данным, в плевральном ганглии расположен пул мелких CBl-иммунореактивных клеток, который частично перекрывается с областью расположения механосенсорных нейронов. Кроме того, хотя тела идентифицированных нейронов оборонительного поведения не несут мест связывания СВ1-антител,. CBl-иммунореактивные нейриты плеврального ганглия оплетают тело гигантского плеврального оборонительного нейрона. Подобное распределение CBl-иммунореактивности показано в мозжечке и гиппокампе: неокрашенные клетки Пуркинье и пирамиды, соответственно, окутаны массой иммунореактивных волокон (Straiker & Mackie, 2005). Интересно, что в педальных ганглиях выкрашивается пара одиночных клеток и нервные волокна, расположенные в ростромедиальной области, где находится группа серотонинергических нейронов, модулирующих эффективность синаптических связей в сети оборонительного поведения улитки. Таким образом, исходя из распределения CBl-иммунореактивности в плевральных и педальных ганглиях, мы можем предположить, что каннабиноиды вовлечены и в регуляцию работы нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки.

В целом, мы можем заключить, что, во-первых, в ЦНС брюхоногого моллюска Helix lucormn существуют СВ1 -подобные рецепторные белки, специфически связывающие каннабиноидные лиганды, соответствующие по молекулярному весу гликозилированной форме СВ1-рецептора крысы, и специфически узнаваемые антителами, выработанными против человеческого СВ1-рецептора. Во-вторых, полученное методом иммуногистохимии распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС в сопоставлении с литературными данными позволяет предполагать участие СВ1-подобных рецепторов в регуляции пищевого и оборонительного поведения брюхоногих моллюсков.

2. Каннабиноидная регуляция эффективности синаптической передачи

2.1 Влияние анандамида

Следующей задачей нашей работы была проверка гипотезы о функциональной активности СВ1-подобных рецепторов, найденных в ЦНС виноградной улитки. В качестве агониста каннабиноидных рецепторов мы использовали анандамид, эндогенный каннабиноидный лиганд, который синтезируется в нервной системе как позвоночных, так и беспозвоночных животных (Sugiura et al., 1997; Sepe et al., 1998), и является одним из двух наиболее распространенных и универсальных эндоканнабиноидов.

Как было описано выше, каннабиноиды могут принимать участие в регуляции как пищевого, так и оборонительного поведения. Для исследования функциональной роли СВ1-подобных рецепторов мы выбрали синаптически связанные нейроны, входящие в хорошо изученную нейронную сеть, вовлеченную в реализацию оборонительного поведения. В данной нейронной сети были выделены и морфологически и функционально идентифицированы четыре основные группы нейронов. Это группы сенсорных, моторных, премоторных (гигантстких) интернейронов и модуляторных нейронов (Балабан & Захаров, 1992; Balaban, 2002). На рис.21 схематично обозначены некоторые элементы оборонительной сети. Сенсорные нейроны (обозначены серым и оранжевым цветом) расположены в плевральном ганглии. Эти нейроны были выделены по следующим критериям: латентность их ответа на стимул, вызывающий оборонительную реакцию, приближается к интервалу времени, необходимому для проведения нервного стимула от анализатора в ЦНС; их рецептивное поле ограничено; амплитуда ВПСП в интернейроне линейно зависит от количества потенциалов действия в предполагаемой сенсорной клетке, а спайковый ответ зависит от интенсивности стимула. В таких клетках не наблюдается спонтанной спайковой активности, а разряд этих клеток не коррелирует с движениями животного на полуинтактном препарате. Внутриклеточная стимуляция единичной клетки никогда не вызывает поведенческой реакции (Balaban, 2002). Часть этого нейронного пула образует моносинаптические связи с гигантскими интернейронами (Malyshev & Balaban, 2002). Эти механосенсорные нейроны (обозначены оранжевым цветом), по-видимому, участвуют в осуществлении оборонительного ответа виноградной улитки, активируя интернейроны оборонительного поведения (Пл1, ПаЗ и Па2), и являются глутаматергическими (Bravarenko, 2003).

Анандамид вызывал достоверное, но небольшое по величине снижение амплитуды глутаматергических ВПСП и смешанных возбуждающих ВПСП по сравнению с эффектами, описанными ранее на срезах мозга крыс (Капо et al., 2002). С одной стороны, это согласуется с нашими данными о невысокой плотности и низкой чувствительности CBl-подобных рецептров улитки к каннабиноидным лигандам. С другой стороны, если принять во внимание, что эффект аппликации анандамида растянут во времени (максимальное снижение амплитуды ВПСП достигается только через 15 мин от момента добавления агониста в ванночку), возможно, что анандамид не прямо подавляет выброс медиатора, а увеличивает скорость привыкания ВПСП. Не исключено, что механизм этого эффекта не связан с активацией CBl-подобных рецепторов, а реализуется, например, при прямом кожа механ ос ен сорные нейроны плеврального ганглия канал

Са' каналы mGlii рецепторы (?) не-NMDA тута мятные пторы #

NMDA & рецепторы ^

S? Д?

С В1-подобные рецепторы mGlu рецепторы (7)

5-НТ, рецепторы се рот они н rop^i7) ' NMDA Са w СО М ¡¡Jr

•Г не-NMDA

7 hi J глутаматные рецепторы

Са змвндзмида 2+

5-НТ, рецепторы

Пл1 нейрон У сер сггони нерги ческий проекционный нейрон педального ганглия

Рис. 21 Гипотетическая схема эндоканнабиноидной регуляции между нейронами оборонительной нервной сети улитки Helix lucorum. Пояснения в тексте. взаимодействии анандамида с кальциевыми каналами или калиевыми каналами. Так, показано, что анандамид в субмикромолярных концентрациях прямо блокирует кальциевые каналы Т-типа и калиевые ТАБЮ-каналы (Ьогоуауа, 2009; Мат§ге1 & а1, 2001). Однако, мы обнаружили, что снижение амплитуды суммарных ВПСП является синапс-специфичным, так, при стимуляции одних и тех же входов и одновременной регистрации в Пл1 и ПаЗ нейронах оборонительного поведения, амплитуда ВПСП снижалась только в Пл1 нейроне, что свидетельствует в пользу рецептор-зависимого механизма действия анандамида.

2.2 Влияние антагониста каннабиноидных рецепторов АМ251

АМ251 является высокоэффективным селективным антагонистом СВ1-рецепторов млекопитающих, с К^ около 10"8 М. Соответственно, АМ251 используется для блокады СВ1-рецепторов в наномолярных концентрациях. Тем не менее, при использовании фармакологических агентов, разработанных для млекопитающих, на препаратах моллюсков рекомендуется апплицировать вещества в значительно более высоких дозах из-за возможных различий в строении рецепторов, и, соответственно, чувствительности и эффективности связывания лигандов. Поэтому, мы использовали АМ251 в микромолярном диапазоне. Однако, есть данные, что в микромолярных концентрациях данный антагонист способен подавлять базальную активность ингибиторных в-белков на пресинаптических мембранах за счет перекрестных взаимодействий с аденозиновыми А1 рецепторами, что может ошибочно интерпретироваться как блокада тонического выделения эндоканнабиноидов (Баутатеп а1., 2003).

В наших экспериментах аппликация АМ251 не вызывала достоверных изменений амплитуды ВПСП. Таким образом, в исследуемой нервной сети нет оснований предполагать тоническую активность эндоканнабиноидов, а АМ251 в микромолярных концентрациях не проявляет на препарате улитки ни свойств обратного агониста, ни перекрестных взаимодействий с какими-либо другими медиаторными системами.

2.3 Роль каннабиноидов в долговременной пластичности связей нейронной сети оборонительного поведения

Наиболее простой и хорошо изученной поведенческой моделью обучения улитки Helix luconim является сенситизация - долговременное усиление оборонительного ответа (втягивания омматофоров) на тактильные стимулы после болевого раздражения (электрического шока) (Balaban & Bravarenko, 1993). Нейрональным коррелятом сенситизации в сети оборонительного поведения является долговременная фасилитация суммарных ВПСП в гигантских оборонительных нейронах в ответ на тетанизирующее раздражение сенсорных входов (Захаров, 1992, Malyshev A.Yu., 2002; Zakharov et al., 1995).

В нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки, было описано девять индивидуально идентифицируемых гигантских интернейронов (Иерусалимский и др., 1992) На этих клетках конвергируют стимулы от механорецепторов, хеморецепторов, фоторецепторов и терморецепторов. Внутриклеточная активация этих клеток на полуинтактном препарате и препарате изолированной нервной системы, приводит к активации мотонейронов. Спайковый разряд, вызванный внутриклеточной стимуляцией одного из командных интернейронов, вызывает скоординированную оборонительную реакцию (специфичную для данного нейрона), а спайковый разряд на болевые стимулы неизменно предшествует или совпадает с оборонительной реакцией. Внутриклеточная гиперполяризация одной из этих клеток элиминирует в оборонительной реакции (при предъявлении оборонительного стимула) тот ее компонент, который появлялся при внутриклеточной активации этой клетки. (Балабан & Захаров, 1992; Balaban & Bravarenko, 1993).

Из девяти гигантских интернейронов большинство экспериментаторов выбирали для своих исследований шесть - Па2 и ПаЗ, попарно расположенные в левом и правом париетальном ганглиях и Пл1 - расположенные в левом и правом плевральных ганглиях. Гигантские интернейроны Па2, ПаЗ и Пл1 функционально подобны. На рис.21 ПаЗ нейроны обозначены салатовым цветом, Пл1 нейроны -голубым цветом.

Мы обнаружили, что нанесение серии высокочастотных стимулов по кожному нерву вызывает значительное увеличение ответов на тестирующую стимуляцию по тому же нерву как в плевральных, так и в париетальных оборонительных нейронах. Анандамид вызывал снижение величины и укорочение долговременной фасилитации ВПСП также в обоих нейронах. Возможно, противоречие с изложенными выше данными о синапс-специфическом влиянии анандамида на амплитуду суммарных ВПСП объясняется участием "третьих" нейронов в процессе формирования долговременной фасилитации. В серии работ, выполненных в нашей лаборатории, было показано, что для выработки долговременной фасилитации необходима активация серотонинергических модуляторных нейронов, расположенных в ростромедиальной области педальных ганглиев (Zakharov et al., 1995; Балабан & Захаров, 1992, на рис.21 серотонинергические нейроны обозначены зеленым цветом). Учитывая вышеприведенные иммуногистохимические данные о расположении в ростромедиальной области СВ-иммунореактивного нейропиля и отдельных СВ-иммунореактивных клеток, возможно ослабление фасилитации за счет ингибирующего воздействия анандамида на модуляторные серотонинергические нейроны. Кроме того, анандамид способен прямо ингибировать потенциалзависимые кальциевые и натриевые каналы на мембране пре- и постсинаптических нейронов (Ьогоуауа et а1., 2009).

А.С. Пивоваровым с соавторами был исследован тип рецепторов к серотонину, на мембране командных интернейронов Ра2 и РаЗ (Ргуоуагоу & №Б1:га1;оуа, 2003). Было показано, что антагонисты рецепторов 5-НТ1 типа - КА}Ч-190 и метиотепин уменьшают вызванный ацетилхолином входящий ток в данные командные интернейроны. Тогда как антагонисты рецепторов 5-НТ2, 5-НТЗ и 5-НТ4 типа - ЬУ-53.857, 1С8-205.930 и 802-205.557 соответственно, не оказывают существенного влияния. Поэтому, рецепторы к серотонину на мембране сомы командных интернейронов Ра2 и РаЗ были определены как модуляторные 5-НТ1 серотониновые рецепторы. Анандамид способен снижать способность серотонина связываться со своими рецепторами, в частности, 5-НТ1 типа (Вга1ёа е1 а1., 2007; Оъ е1 а1., 2002). Возможные пути действия анандамида показаны на рис.21 черными стрелками (сплошные линии — эндогенный анандамид, сплошные и пунктирные линии - экзогенный, апплицированный в эксперименте, анандамид).

Долговременную фасилитацию ВПСП в ПаЗ нейронах можно вызвать не только тетанической стимуляцией входов, но и высокочастотной внутриклеточной стимуляцией постсинаптического нейрона (Балабан и др., 1995; Ма1узЬеу et а1, 1997). Мы обнаружили, что внутриклеточная тетанизация Пл1 нейрона не вызывала долговременных изменений амплитуды ВПСП в Пл1 нейроне, одртако после аппликации блокатора каннабиноидных рецепторов АМ251 амплитуда ВПСП возрастала и оставалась выше контрольной в течение более чем 30 мин. По-видимому, внутриклеточная активация плеврального нейрона оборонительного поведения вызывала выделение эндоканнабиноидов, препятствующих развитию долговременной фасилитации ВПСП в этом нейроне.

2.4 Кратковременная пластичность связей в нейронной сети оборонительного поведения

Кратковременная пластичность играет важную роль в анализе сенсорной информации, селекции важности поступающих стимулов, участвует в процессах внимания и кратковременной памяти, локомоторной активности (Zucker & Regehr, 2002; Citri & Malenka, 2008).

Несмотря на то, что различные формы долговременной пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum изучены довольно подробно, кратковременные изменения синаптической эффективности, длящиеся секунды и минуты, практически не исследованы. Одной из причин является свойственное этим синапсам привыкание ВПСП, скорость которого увеличивается с увеличением частоты тестирующей стимуляции, из-за чего ранее использовали длительные, от 2,5 до 20 мин, межстимульные интервалы, которые сводили привыкание к минимуму, но не позволяли увидеть кратковременные изменения амплитуды ВПСП. Хотя при увеличении частоты стимуляции амплитуда ВПСП падает быстрее (до 60% к 3-4 стимулу), она стабилизируется примерно к 10-му стимулу. Таким образом, если подбирать синапсы с изначально большой амплитудой ВПСП, можно регистрировать ВПСП с достаточно хорошим соотношением сигнал/шум при относительно высокой частоте стимуляции (1/30 с).

Эндоканиабиноидная система участвует в нескольких формах кратковременной депрессии возбуждающей синаптической передачи. В целом по механизму реализации их можно разделить на Са2+-зависимые и рецептор-зависимые. Кальций-зависимой формой кратковременной депрессии является описанное практически во всех отделах мозга, участвующих в эндоканнабиноидной регуляции (в частности, в мозжечке, гиппокампе, стволе мозга, гипоталамусе, миндалине и т.д.), так называемое вызванное деполяризацией подавление возбуждения (DSE: depolarization induced suppression of excitation). DSE заключается в индукции синтеза эндогенных каннабиноидов в постсинаптической терминали в ответ на повышение уровня внутриклеточного Са, вызванного кратковременной (1-10 с) деполяризацией до 0 мВ мембраны постсинаптического нейрона, и затем также кратковременном (порядка нескольких минут) ретроградном подавлении активности возбуждающих, обычно глутаматергических, входов (Kreitzer & Regehr, 2001; Straiker & Mackie, 2005). В наших экспериментах мы использовали в качестве триггера входа кальция в постсинаптический нейрон деполяризующие ступеньки тока длительностью 15 с, которые вызывали высокочастоные спайковые разряды. Как было показано ранее, во время подобных пачек потенциалов действия в нейрон входит значительное количество ионов Са2+. Мы не обнаружили значимых изменений амплитуды ВПСП в ответ на деполяризацию. Возможно, что в исследуемых синапсах одного повышение уровня внутриклеточного кальция может быть недостаточно для инициации синтеза эндоканнабинопдов, либо протокол стимуляции не вызывает достаточного входа кальция непосредственно в области синапса.

Не менее широко распространена в мозге рецептор-зависимая форма DSE, которая включает в себя кратковременную депрессию, вызываемую активацией метаботропных глутаматных рецепторов. Эта форма DSE не требует повышения уровня постсинаптического кальция, однако дополнительной вход ионов Са2+ усиливает величину депрессии по механизму кальций-сопряженного высвобождения ЭК.

Обе вышеописанные формы кратковременной депрессии возбуждающих входов вызываются либо искусственной деполяризацией постсинаптической мембраны, либо аппликацией агонистов соответствующих рецепторов. Возник вопрос, какие физиологические условия необходимы, чтобы вызвать каннабиноид-зависимую кратковременную депрессию? В мозжечке, а позднее и в базальных ядрах и стволе мозга была описана ещё одна форма кратковременной каннабиноидной регуляции синаптической передачи — синаптически вызванное подавление возбуждения (synaptically evoked suppression of excitation, SSE). В мозжечке повторная стимуляция параллельных волокон с различной частотой (от 2 до 50 Гц, 5-50 стимулов) вызвала как гомосинаптическую кратковременную депрессию тех же входов, так и гетеросинаптическую депрессию входов от лазающих волокон, которая блокировалась антагонистами СВ1-рецепторов. В мозжечке механизмом S SE является кальций-ассоциированный mGlu-рецептор-зависимый синтез эндоканнабиноидов (Maejima et al., 2005).

Мы обнаружили, что низкочастотная тетанизация 2-го кожного нерва, содержащего в том числе и отростки механо сенсорных плевральных нейронов, вызывает кратковременное, продолжительностью около 2 мин, снижение амплитуды моносинаптических ВПСП в гигантском плевральном интернейроне, которое дозозависимо блокировалось антагонистом СВ1 -рецепторов

АМ251. Полученные данные свидетельствуют об участии эндогенных каннабиноидов в кратковременной синапс-специфической регуляции глутаматергической моносинаптической связи между механосенсорными нейронами плеврального ганглия и гигантскими интернейронами плеврального и париетального ганглиев. Мы можем предположить, что найденный нами феномен является аналогом обнаруженного в мозжечке крыс синаптически вызванного подавления возбуждения.

2.5 Зависимость кратковременной каннабиноид-зависимой депрессии синаптической передачи от уровня серотонина

Мы обнаружили, что каннабиноид-зависимая SSE в нейронной оборонительной сети улитки вырабатывается в только в осенне-зимний период, а в весеннее-летней серии экспериментов низкочастотная стимуляция кожного нерва вызвала даже тенденцию к потенциации. Было показано, что одним из важных модуляторных факторов в нервной системе улитки, участвующих в том числе и в сезонных изменениях, является серотонин (Hiripi L, Salänki J., 1973; Шевелкин и др., 1997; Малышев и др., 1997; Solntseva & Nikitin, 2008). Кроме того, известно, что модуляторные серотонинергические нейроны как получают афферентные входы через 2-й кожный нерв, тетанизация которого вызывает SSE, так и сами дают отростки в этот нерв. Подтверждением участия серотонина в модуляции SSE являются результаты экспериментов, проведенных в летний период на животных, у которых активность серотонинергической системы подавлена введением нейронотоксина 5,7-ДГТ. У этих животных низкочастотная стимуляция кожного нерва вызывала SSE с теми же параметрами, что и в «осенне-зимних» экспериментах. Кроме того, с этими данными согласуется и т

91 зимний» эксперимент, в котором аппликация экзогенного серотонина подавляло выработку SSE. На препарате мембран мозжечка крыс было показано, что серотонин подавляет связывание некоторых синтетических каннабиномиметиков (агонистов WIN 55,212-2 и HU 210, но не СР-55,940) с СВ1-рецепторами (Devlin & Christopoulos, 2002). Таким образом, при высокой активности серотонинергической системы в весеннее-летний период отсутствие SSE можно объяснить двумя синергическими эффектами серотонина: уменьшением чувствительности СВ1-подобных рецепторов к каннабиноидным лигандам и потенцирующим действием серотонина на механосенсорные входы гигантских нейронов оборонительного поведения (Шевелкин и др., 1997, Zakharov et al., 1995; Balaban et al., 2001).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лемак, Мария Степановна, Москва

1. Балабан П.М., Захаров И.С. Обучение и развитие: общая основа двух явлений. М.: Наука, 1992.

2. Балабан Ü.M., Браваренко Н.И., Воронин JI.JL, Гусев П.В. Длительная потенциация в центральной нервной системе виноградной улитки после внутриклеточной тетанизации. Доклады Академии наук. 343(4): 563566, 1995.

3. Захаров И.С. Оборонительное поведение виноградной улитки. ЖВНД 42(6): 1156-70, 1992.

4. Иерусалимский В.Н., Захаров И.С., Палихова Т.А., Балабан

5. П.М. Нервная система и картирование нейронов брюхоногого моллюска Helix lucorum L. Журн. Высш. Нерен. Деят. 42(6): 1075-1089, 1992.

6. Коршунова Т.А. Кальцийзависимые формы пластичности в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 2004.

7. Максимова O.A., Балабан П.М. Нейронные механизмы пластичности поведения. М. Наука. 1983. 126 с.

8. Малышев А.Ю., Браваренко Н.И., Пивоваров A.C., Балабан

9. П.М. Влияние уровня серотонина на постсинаптически индуцированную потенциацию ответов нейронов улитки. ЖВНД 47(3): 553-62, 1997.

10. Никитин В.П., Козырев С.А., Шевелкин A.B. Антагонисты NMDA-рецепторов глутамата избирательно влияют на синаптические механизмы ноцицептивной сенситизации у улитки. ЖВНД. 50(3): 686-96, 2000.

11. Хаспеков Л.Г., Бобров М.Ю. Эндогенная каннабиноидная система и ее защитная роль при ишемическом и цитотоксическом повреждении нейронов головного мозга . Нейрохимия 23: 85—105, 2006.

12. Шевелкин А.В., Никитин В.П., Козырев С.А., Самойлов М.О., Шерстнев В.В. Серотонин имитирует некоторые нейрональные эффекты ноцицептивной сенситизации у виноградной улитки. ЖВНД 47(3): 532542, 1997.

13. Adams IB, Martin BR. Cannabis: pharmacology and toxicology in animals and humans. Addiction 91: 1585-1614, 1996.

14. Albrecht MA, Colegrove SL, Friel DD. Differential regulation of ER Ca2+ uptake and release rates accounts for multiple modes of Ca2+-induced Ca2+ release. J Gen Physiol. 119(3): 211-33, 2002.

15. Angarano MB, McMahon RF, Schetz JA. Cannabinoids inhibit zebra mussel (Dreissena polymorpha) byssal attachment: a potentially green antifouling technology. Biofouling. 25(2): 127-38, 2009.

16. Ashton JC, Friberg D, Darlington CL, Smith PF. Expression of the cannabinoid CB2 receptor in the rat cerebellum: an immunohisto-chemical study. Neurosci Lett 396: 113-116, 2006.

17. Acosta-Urquidi J, Chase R. The effects of delta9-tetrahydrocan-nabinol on action potentials in the mollusc Aplysia. Can J Physiol Pharmacol. 53(5): 793-8, 1975

18. Balaban PM. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci Biobehav Rev. 26(5): 597-630, 2002.

19. Balaban P, Bravarenko N. Long-term sensitization and environmental conditioning in terrestrial snails. Exp Brain Res. 96(3): 487-93, 1993.

20. Balaban P.M., Korshunova T.A., Bravarenko N.I. Postsynaptic calcium contributes to reinforcement in a three-neuron network exhibiting associative plasticity. Eur J Neurosci. 19(2):227-33, 2004.

21. Balaban PM, Bravarenko N1, Maksimova OA, Nikitin E, Ierus-alimsky VN, Zakharov IS. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol Learn Mem. 75(1): 30-50, 2001.

22. Berdyshev, E.V. Inhibition of sea urchin fertilization by fatty acid ethanolamides and cannabinoids. Comp. Biochem. Physiol. 122: 327 -30, 1999.

23. Bisogno T, Berrendero F, Ambrosino G, Cebeira M, Ramos JA, Fernaudez-Ruiz JJ, Di Marzo V. Brain regional distribution of en-docannabinoids: implications for their biosynthesis and biological function. Biochem Biophys Res Commun. 256(2): 377-80, 1999.

24. Bisogno T, Maurelli S, Melck D, De Petrocellis L, Di Marzo V.

25. Biosynthesis, uptake, and degradation of anandamide and palmitoyleth-anolamide in leukocytes. J Biol Chem. 272(6): 3315-23, 19976.

26. Bisogno T, Ventriglia M, Milone A, Mosca M, Cimino G, Di Marzo V. Occurrence and metabolism of anandamide and related acyl-ethanolamides in ovaries of the sea urchin Paracentrotus lividus. Biochim Biophys Acta. 1345(3): 338-48, 1997a.

27. Braida D, Limonta V, Malabarba L, Zani A, Sala M. 5-HT1A receptors are involved in the anxiolytic effect of Delta9-tetrahydrocannabinol and AM 404, the anandamide transport inhibitor, in Sprague-Dawley rats. Eur J Pharmacol. 555(2-3): 156-63, 2007.

28. Bravarenko N.I., Korshunova T.A., Malyshev A. Y., P. M. Balaban. Synaptic contact between mechanosensory neuron and withdrawalinterneuron in terrestrial snail is mediated by 1-glutamate-like transmitter. Neuroscience Letters. 341: 237-40, 2003.

29. Brenowitz SD, Best AR, Regehr WG. Sustained elevation of dendritic calcium evokes widespread endocannabinoid release and suppression of synapses onto cerebellar Purkinje cells. J Neurosci 26: 68416850, 2006.

30. Brown SM, Wager-Miller J, Mackie K. Cloning and molecular characterization of the rat CB2 cannabinoid receptor. Biochim Biophys Acta 1576: 255-264, 2002.

31. Caterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen-Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum AI, Julius D. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288(5464):306-13, 2000.

32. Chang MC, Berkery D, Schuel R, Laychock SG, Zimmerman AM, Zimmerman S, Schuel H. Evidence for a cannabinoid receptor in sea urchin sperm and its role in blockade of the acrosome reaction. Mol ReprodDev 36(4):507-16, 1993.

33. Chevaleyre V, Castillo PE. Heterosynaptic LTD of hippocampal GABAergic synapses: a novel role of endocannabinoids in regulating excitability. NeuronSS: 461-472, 2003.

34. Dnrszon A, Beiträn C, Felix R, Nishigaki T, Trevino CL. Iontransport in sperm signaling. Dev Biol. 240(1): 1-14 2001.

35. Devane WA, Dysarz FA 3rd, Johnson MR, Melvin LS, Howlett

36. AC. Determination and characterization of a cannabinoid receptor in rat brain. Mol Pharmacol. 34(5): 605-13, 1988.

37. Devane WA, Hanus L, Breuer A, Pertwee RG, Stevenson LA, Griffin G, Gibson D, Mandelbaum A, Etinger A, Mechoulam R. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science 258: 1946-1949, 1992.

38. De Petrocellis L, Melck D, Bisogno T, Milone A, Di Marzo V.

39. Finding of the endocannabinoid signalling system in Hydra, a very primitive organism: possible role in the feeding response. Neuroscience 92(1): 377-87, 1999.

40. Di Marzo V, De Petrocellis L, Bisogno T, Melck D. Metabolism of anandamide and 2-arachidonoylglycerol: an historical overview and some recent developments. Lipids. 34 Suppl: S319-25? 1999.

41. Di Marzo V, Matias I. Endocannabinoid control of food intake and energy balance. Nat Neurosci 8: 585-589, 2005.

42. Elphick MR, Egertova M. The neurobiology and evolution of cannabinoid signalling. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei 356: 381— 408, 2001.

43. Felder CC, Joyce KE, Briley EM, Mansouri J, Mackie K, Blond

44. O, Lai Y, Ma AL, Mitchell RL. Comparison of the pharmacology and signal transduction of the human cannabinoid CB1 and CB2 receptors. Mol Pharmacol 48: 443-450, 1995.

45. Frost WN, Kandel ER. Structure of the network mediating siphon-elicited siphon withdrawal in Aplysia. JNeurophysiol. 73(6): 241327, 1995.

46. Freund TF, Katona I, Piomelli D. Role of endogenous cannabin-oids in synaptic signaling. Physiol Rev 83: 1017-1066, 2003.

47. Gaoni Y, Mechoulam R. Isolation, structure and partial synthesis of an active constituent of hashish. J Am Chem Soc 86: 1646-1647, 1964.

48. Gerard C, Mollereau C, Vassart G, Parmentier M. Nucleotide sequence of a human cannabinoid receptor cDNA. Nucleic Acids Res 18: 7142, 1990.

49. Gerdeman GL, Ronesi J, Lovinger DM. Postsynaptic endocan-nabinoid release is critical to long-term depression in the striatum. Nat Neurosci 5: 446-451, 2002.

50. Gover TD, Abrains TW. Insights into a molecular switch that gates sensory neuron synapses during habituation in Aplysia. Neitrobiol Learn Mem. 92(2): 155-65,2009.

51. Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative in vitro autoradiographic study. J Neurosci 11: 563-583, 1991.

52. Hiripi L, Salanki J. Seasonal and activity-dependent changes of the serotonin level in the C.N.S. and heart of the snail (Helix pomatia L.). Comp Gen Pharmacol. 4(15):285-92, 1973.

53. Hohmann AG, Suplita RL, Bolton NM, Neely MH, Fegley D, Mangieri R, Krey JF, Walker JM, Holmes PV, Crystal JD, Duranti A, Toiitini A, Mor M, Tarzia G, Piomelli D. An endocannabinoid mechanism for stress-induced analgesia. Nature 435: 1108-1112, 2005.

54. Howlett AC. Pharmacology of cannabinoid receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 35: 607-634, 1995.

55. Jimenez-Del-Rio M, Daza-Restrepo A, Velez-Pardo C. The cannabinoid CP55,940 prolongs survival and improves locomotor activity in Dro-sophila melanogaster against paraquat: implications in Parkinson's disease. Neurosci Res. 61(4): 404-11, 2008.

56. Julian MD, Martin AB, Cuellar B, Rodriguez De Fonseca F, Navarro M, Moratalla R, Garcia-Segura LM. Neuroanatomical relationship between type 1 cannabinoid receptors and dopaminergic systems in the rat basal ganglia. Neuroscience 119: 309—318, 2003.

57. Kano M, Ohno-Shosaku T, Hashimotodani Y, Uchigashima M, Watanabe M. Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission. Physiol Rev. 89(1): 309-80, 2009.

58. Katona I, Urban GM, Wallace M, Ledent C, Jung KM, Piomelli D, Mackie K, Freund TF. Molecular composition of the endocannabin-oid system at glutamatergic synapses. JNeurosci 26: 5628-5637, 2006.

59. Kawamura Y, Fukaya M, Maejima T, Yoshida T, Miura E, Watanabe M, Ohno-Shosaku T, Kano M. The CB1 cannabinoid receptor is the major cannabinoid receptor at excitatory presynaptic sites in the hippocampus and cerebellum. J Neurosci 26: 2991-3001, 2006.

60. Kishimoto Y, Kano M, Endogenous cannabinoid signaling through the CBj receptor is essential for cerebellum-dependent discrete motor learning. J Neurosci 26: 8829-8837, 2006.

61. Kreitzer AC, Carter AG, Regehr WG. Inhibition of interneuron firing extends the spread of endocannabinoid signaling in the cerebellum. Neuron 34: 787-796, 2002.

62. Kreitzer AC, Regehr WG. Cerebellar depolarization-induced suppression of inhibition is mediated by endogenous cannabinoids. J Neurosci 21 : RC174, 2001.

63. Lehtonen M, Reisner K, Auriola S, Wong G, Callaway JC.

64. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylgly-cerol in nematodes. Chem Biodivers. 5(11):2431-41, 2008.

65. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1): 265-75, 1951.

66. Lozovaya N, Min R, Tsintsadze V, Burnashev N. Dual modulation of CNS voltage-gated calcium channels by cannabinoids: Focus on CBI receptor-independent effects. Cell CalciumA6(3): 154-62, 2009.

67. Mackie K. Cannabinoid receptor homo- and heterodimeriza-tion. Life Sci 77: 1667-1673, 2005.

68. Mackie K. Mechanisms of CBI receptor signaling: endocannabin-oid modulation of synaptic strength./«/1 J Obes 30 Suppl 1: SI9-23, 2006.

69. Maejima T, Hashimoto K, Yoshida T, Aiba A, Kano M. Presynaptic inhibition caused by retrograde signal from metabotropic glutamate to cannabinoid receptors. Neuron 31: 463-475, 2001.

70. Maingret F, Patel AJ, Lazdunski M, Honore E. The endocan-nabinoid anandamide is a direct and selective blocker of the background K(+) channel TASK-1. EMBO J. 20(1-2): 47-54, 2001

71. Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Involvement of the endocannabinoid system in drug addiction. Trends Neurosci 29: 225-232, 2006.

72. Malyshev A.Y., Balaban P.M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87: 2364-71, 2002.

73. Malyshev A., Bravarenko N., Balaban P. Dependence of synaptic facilitation postsynaptically induced in snail neurones on season and serotonin level. Neuroreport, 8(5): 1179-82, 1997.

74. Marsicano G, Lutz B. Expression of the cannabinoid receptor CB1 in distinct neuronal subpopulations in the adult mouse foreb-rain. Eur J Neurosci 11: 4213-4225, 1999.

75. Marsicano G, Wotjak CT, Azad SC, Bisogno T, Rammes G, Cascio MG, Hermann H, Tang J, Hofmann C, Zieglgansberger W, Di Marzo V, Lutz B. The endogenous cannabinoid system controls extinction of aversive memories. Nature 418: 530-534, 2002.

76. Matsuda LA, Bonner TI, Lolait SJ. Localization of cannabinoid receptor mRNA in rat brain. J Comp Neurol 327: 535-550, 1993.

77. Matsuda LA, Lolait SJ, Brownstein MJ, Young AC, Bonner

78. TI. Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNAJVa/wre 346: 561-564, 1990.

79. Matias I, Bisogno T, Melck D, Vandenbulcke F, Verger-Bocquet M, De Petrocellis L, Sergheraert C, Breton C, Di Marzo V, Salzet M.

80. Evidence for an endocannabinoid system in the central nervous system ofthe leech Hirudo medicinalis. Brain Res Mol Brain Res. 87(2): 145-59 2001.

81. Matyas F, Yanovsky Y, Mackie K, Kelsch W, Misgeld U, Freund TF. Subcellular localization of type 1 cannabinoid receptors in the rat basal ganglia. Neuroscience 137: 337-361, 2006.

82. McFarland MJ, Porter AC, Rakhshan FR, Rawat DS, Gibbs RA, Barker EL. A role for caveolae/lipid rafts in the uptake and recycling of the endogenous cannabinoid anandamide. J Biol Chem 279: 41991-41997, 2004.

83. McCIean, D.K., Zimmerman, A.M. Action of delta9-tetrahy-drocannabinol on cell division and macromolecular synthesis in division-synchronized protozoa. Pharmacology 14: 307 21, 1976.

84. McPartland JM, Glass M. Functional mapping of cannabinoid receptor homologs in mammals, other vertebrates, and invertebrates. Gene. 312: 297-303, 2003.

85. McPartland JM. Phylogenomic and chemotaxonomic analysis of the endocannabinoid system. Brain Res Brain Res Rev. 45(1): 18-29, 2004.

86. Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature 365: 61—65, 1993.

87. Nunez E, Benito C, Pazos MR, Barbachano A, Fajardo O, Gonzalez S, Tolon RM, Romero J. Cannabinoid CB2 receptors are expressed by perivascular microglial cells in the human brain: an immuno-histochemical study. Synapse 53: 208-213, 2004.

88. Ohno-Shosaku T, Maejima T, Kano M. Endogenous cannabinoids mediate retrograde signals from depolarized postsynaptic neurons to presynaptic terminals. Neuron 29: 729-738, 2001.

89. Onaivi ES. Neuropsychobiological evidence for the functional presence and expression of cannabinoid CB2 receptors in the brain. Neuropsychobiology 54: 231-246, 2006.

90. Osborne NN, Pentreath VW. Effects of 5,7-dihydroxytryptamine on an identified 5-hydroxytryptamine-containing neurone in the central nervous sytem of the snail Helix pomatia. Br J Pharmacol. 56(l):29-38, 1976.

91. Oz M, Zhang L, Morales M. Endogenous cannabinoid, anandam-ide, acts as a noncompetitive inhibitor on 5-HT3 receptor-mediated responses in Xenopus oocytes. Synapse. 46(3): 150-6, 2002.

92. Pagotto U, Marsicano G, Cota D, Lutz B, Pasquali R. The emerging role of the endocannabinoid system in endocrine regulation and energy balance.Endocr Rev 27: 73—100, 2006.

93. Palkovits M, Harvey-White J, Liu J, Kovacs ZS, Bobest M, Lovas G, Bago AG, Kunos G. Regional distribution and effects of postmortal delay on endocannabinoid content of the human brain. Neuroscience 152(4): 1032-9, 2008.

94. Pamplona FA, Takahashi RN. WIN 55212-2 impairs contextual fear conditioning through the activation of CB1 cannabinoid receptors. Neurosci Lett397: 88-92, 2006.

95. Piomelli D. The molecular logic of endocannabinoid signalling. Nat Rev Neurosci. 4(11): 873-84, 2003.

96. Rawls SM, Rodriguez T, Baron DA, Raffa RB. A nitric oxide synthase inhibitor (L-NAME) attenuates abstinence-induced withdrawal from both cocaine and a cannabinoid agonist (WIN 55212-2) in Planaria. Brain Res. 1099(1): 82-7, 2006.

97. Pivovarov A.S., Nistratova V.L. Modulatory serotonin receptors on the soma of command neurons in edible snail. Bull Exp Biol Med. 136(2): 114-6, 2003.

98. Robinson L., McKillop-Smith S., Ross N.L., Pertwee R.G., Hampson R.E., Piatt B., Riedel G. Hippocampal endocannabinoids inhibit spatial learning and limit spatial memory in rats. Psychopharmaco-logy 198: 551-563, 2008.

99. Rodriguez-Martin I., de Velasco E.M., Rodriguez R.E. Characterization of cannabinoid-binding sites in zebrafish brain. Neurosci Lett. 413(3): 249-54, 2007.

100. Rossato M., Ion Popa F., Ferigo M., Clari G., Foresta C. Human sperm express cannabinoid receptor Cbl, the activation of which inhibits motility, acrosome reaction, and mitochondrial function. J Clin Endocrinol Metab. 90(2): 984-91, 2005.

101. Savinainen JR, Saario SM, Niemi R, Jarvinen T, Laitinen JT.

102. An optimized approach to study endocannabinoid signaling: evidence against constitutive activity of rat brain adenosine A1 and cannabinoid CB1 receptors. Br J Pharmacol. 140(8): 1451-9, 2003. .

103. Safo P.K., Regehr W.G. Endocannabinoids control the induction of cerebellar LTD. Neuron 48: 647-659, 2005.

104. Salzet M., Breton C., Bisogno T., Di Marzo V. Comparative biology of the endocannabinoid system possible role in the immune response. Eur J Biochem. 267(16): 4917-27, 2000.

105. Samarova E.I., Bravarenko N.I., Korshunova T.A., Gulyaeva N.V., Palotas A., Balaban P.M. Effect of beta-amyloid peptide on behavior and synaptic plasticity in terrestrial snail. Brain Res Bull. 67(1-2): 40-5, 2005.

106. Sepe N., De Petrocellis L., Montanaro F., Cimino G., Di Marzo

107. V. Bioactive long chain N-acylethanolamines in five species of edible bivalve molluscs: possible implications for mollusc physiology and sea food industry. Biochim. Biophys. Acta 1389: 101 11, 1998.

108. Schuel H., Burkman L.J. A Tale of Two Cells: Endocannabinoid-Signaling Regulates Functions of Neurons and Sperm. Biol Reprod. 73(6): 1078-86, 2005.

109. Schinid HH, Schmid PC, Natarajan V. N-acylated glycerophos-pholipids and their derivatives. Prog Lipid Res. 29(1): 1-43, 1990.

110. Schmid PC, Krebsbach RJ, Perry SR, Dettmer TM, Maasson JL, Schmid HH. Occurrence and postmortem generation of anandamide and other long-chain N-acylethanolamines in mammalian brain. FEBS Lett. 375(1-2): 117-20, 1995.

111. Schuel, H., Chang, M.C., Berkery, D., Schuel, R., Zimmerman, A.M., Zimmerman, S. Cannabinoids inhibit fertilization in sea urchins by reducing the fertilizing capacity of sperm. Pharmacol. Biochem. Be-hav. 40: 609 15, 1991.

112. Song ZH, Bonner TI. A lysine residue of the cannabinoid receptor is critical for receptor recognition by several agonists but not WIN55212-2. Mol Pharmacol 49: 891-896, 1996.

113. Solntseva SV, Nikitin VP. Serotonin and NMDA glutamate receptor antagonists selectively impair the reactivation of associative memory in the common snail. Neurosci Behav Physiol. 38(7):687-936 2008.

114. Starowicz K, Nigam S, Di Marzo V. Biochemistry and pharmacology of endovanilloids. Pharmacol Ther. 114(1): 13-33,2007.

115. Stefano, G.B., Liu, Y. & Goligorsky, M.S. Cannabinoid receptors are coupled to nitric oxide release in invertebrate immunocytes, microglia, and human monocytes. J. Biol. Chem. 271, 19238 42, 1996.

116. Stefano, G.B., Salzet, B. & Salzet, M. Identification and characterization of the leech CNS cannabinoid receptor: coupling to nitric oxide release. Brain Res. 753, 219 24, 1997.

117. Straiker A, Mackie K. Depolarization-induced suppression of excitation in murine autaptic hippocampal neurones. J Physiol 569: 501517, 2005.

118. Straiker A, Mackie K. Metabotropic suppression of excitation in murine autaptic hippocampal neurons. J Physiol 578: 773-785, 2007.

119. Sugiura T, Kondo S, Sukagawa A, Nakane S, Shinoda A, Itoh K, Yamashita A, Waku K. 2-ArachidonoylgIycerol: a possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain. Biochem Biophys Res Commun 215: 89-97, 1995.

120. Tian X, Guo J, Yao F, Yang DP, Makriyannis A. The conformation, location, and dynamic properties of the endocannabinoid ligand anandamide in a membrane bilayer. J Biol Chem 280: 29788-29795, 2005.

121. Tsou K, Brown S, Sanudo-Pena MC, Mackie K, Walker JM. Immunohistochemical distribution of cannabinoid CB1 receptors in the rat central nervous system. Neuroscience 83: 393-411, 1998.

122. Varma N, Carlson GC, Ledent C, Alger BE. Metabotropic glutamate receptors drive the endocannabinoid system in hippocampus. J Neurosci 21: RC188, 2001.

123. Varvel SA, Lichtman AH. Evaluation of CBi receptor knockout mice in the Morris water mazq. J Pharmacol Exp Ther 301: 915-924, 2002.

124. Veale EL, Buswell R, Clarke CE, Mathie A. Identification of a region in the TASK3 two pore domain potassium channel that is criticalfor its blockade by methanandamide. Br J Pharmacol. 152(5): 778-86, 2007.

125. Vehovszky A., Kemenes G., Hiripi L. and Hernadi L. Reversible effect of 5,6-DHT treatment on Helix: a combined behavioral, electrophysiological and biochemical study. Symposia Biologica Hungarica 36: 403-9, 1988.

126. Wager-Miller J, Westenbroek R, Mackie K. Dimerization of G protein-coupled receptors: CB1 cannabinoid receptors as an example. Chem Phys Lipids 121: 83-89, 2002.

127. Wilson RI, Nicoll RA. Endogenous cannabinoids mediate retrograde signalling at hippocampal synapses. Nature 410: 588-592, 2001.

128. Yazulla S, Studholme KM, Mcintosh HH, Deutsch DG. Immuno-cytochemical localization of cannabinoid CB1 receptor and fatty acid amide hydrolase in rat retina. J Comp Neurol. 415(1): 80-906 1999.

129. Zakharov I.S., Ierusalimsky V.N., Balaban P.M. Pedal serotonergic neurons modulate the synaptic input of withdrawal interneurons in Helix. Invertebrate Neurosciencel: 41-52, 1995.

130. Zygmunt PM, Petersson J, Andersson DA, Chuang H, Sorgard M, Di Marzo V, Julius D, Hogestatt ED. Vanilloid receptors on sensoiy nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature. 400(6743): 452-7, 1999.