Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кальциевая регуляция активности лизосомальных ферментов миокарда
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Кальциевая регуляция активности лизосомальных ферментов миокарда"
На правах рукописи
РОМАНОВ Борис Константинович
КАЛЬЦИЕВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ МИОКАРДА
03.00.04- Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Рязань - 2004
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Минздрава России»
Научный консультант - Заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Валентина Григорьевна Макарова
Официальные оппоненты:
- доктор медицинских наук, профессор Александр Александрович Терентьев
- доктор медицинских наук, профессор Дмитрий Романович Ракита
- доктор медицинских наук Андрей Владимирович Дмитриев
Ведущая организация:
- ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»
заседании Диссертационного Совета Д 208.084.01 при ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Минздрава России» (390026, РФ, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет» имени академика И.П.Павлова Минздрава России» (390026, РФ, г.Рязань, ул. Шевченко, д. 34)
Защита состоится
» декабря 2004 года в
п
часов на
Автореферат разослан «
» ноября 2004 года.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук, доцент
Е.А. Рязанова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В 1955 году бельгийский биохимик Кристиан де Дюв обнаружил парадоксальный факт увеличения ферментативной активности в размороженных гомоге-натах тканей. Изучение этого феномена легло в основу открытия нового вида ор-ганелл, впервые выявленных не морфологическими, а биохимическими методами исследования - лизосом (De Duve С, 1966).
Лизосомальные ферменты - это энзимы класса гидролаз, оптимум рН которых составляет 3,6-5,0 ("кислые гидролазы"), имеющие терминальный маннозный остаток, фосфорилированный по С-6 положению. Специфичные для маннозо-6-фосфата рецепторы мембран аппарата Гольджи селективно связывают такие гидролазы, а белок клатрин окружает их однослойными мембранными фрагментами, содержащими АТФ-зависимые протонные насосы, закисляющими матрикс образующихся лизосом (А.В. Дмитриев, 2000).
Основная функция кислых гидролаз - внутриклеточная деградация биомакромолекул, клеточных компонентов и бактерий (Р.Дин, 1981; ВАТутельян, 1990).
Методы изучения лизосом были впервые систематизированы в фундаментальных трудах отечественных и зарубежных биохимиков (А. А. Покровский, 1976; Р.Дин, 1981). Эти работы определили методическую базу для решения важных проблем, связанных с регуляцией лизосомальной активности при нарушениях синтеза и секреции лизосомальных ферментов в гепатоцитах. Значительный вклад в решение этих проблем был сделан отечественными исследователями (А.А.Покровский 1968; В.Г.Макарова, 1978; Б.Ф. Коровкин, 1982).
Проблема эффективной регуляции активности лизосомальных ферментов миокарда при таких тяжелых и распространенных патологических состояниях, как гипоксия, реоксигенация и ишемия, в том числе на фоне дислипидемии, стала ис-
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ библиотека
следоваться только в последние годы (П.В.Сергеев, 1991; НАСысолятина, 1991; Б.К.Романов, 1994; Е.Н.Винокурова, 1998; R.Lacave et al., 1999). Это связано с тем, что повреждение лизосомального аппарата миокарда длительное время считалось неуправляемым и необратимым процессом (В.Г.Нейлер, 1988).
Разрыв мембран лизосом возникает при многих патологических процессах в миокарде, определяя степень их тяжести и исход, но острые кислородде-фицитные состояния являются наиболее мощными факторами активации лизо-сомального аппарата, приводящими к необратимым повреждениям кардио-миоцитов (В.Г.Макарова, 1978; Wattiaux R., 1984; Маянская Н.Н., 1988; Б.К.Романов, 1994; Е.Н.Винокурова, 1998; В.А. Фомина, 2000).
При этих состояниях накопление недоокисленных продуктов и продуктов реперфузионной липопероксидации приводит к образованию аномальных водородных связей между фосфолипидами биомембран (В.А Фомина, 2000). Изменения в структуре лизосомальной мембраны ведут к ее разрыву и к массивному выходу лизосомальных ферментов в цитоплазму, что сопровождается аутолизом тканей - инфарктом (А.В. Дмитриев, 2000; Б.К.Романов, 2004).
Повреждение ткани миокарда лизосомальными ферментами обуславливает необратимый характер нарушений в кардиомиоцитах уже к 30-40 минуте полной ишемии. Реоксигенация миокарда и увеличение пула свободных жирных кислот в эти сроки приводит к длительному сохранению общей активности лизосомальных ферментов, и ее полному переходу в неседиментируемую фракцию, усугубляя процессы аутолиза (K.A.Reimer, 1981; Л.И.Ольбинская, 1986).
Уровень смертности от инфаркта миокарда в 2002 году достиг в России показателя 800 умерших на 100.000 населения, а смертность от сердечно-сосудистых заболеваний в целом превысила 50% от общего числа причин смерти. Эти совершенно неудовлетворительные показатели могут быть связаны в том числе и с тем, что используемые в настоящее время методы хирургического и лекарственного
(антиангинального) лечения и профилактики ишемии направлены только на восстановление кровотока и на снижение кислородного запроса миокарда, а имеющиеся методы метаболической терапии, направленные на усиление антиоксидант-ной защиты с целью профилактики водородных сшивок фосфолипидов лизосо-мальных мембран оказались эффективными только в условиях эксперимента и имеют вспомогательное значение в комплексе лечебных мероприятий (В.В.Гацура, 1993; В.А.Фомина, 2000; Б.К.Романов, 2004).
Поиск эффективных методов коррекции катаболической активности лизо-сом, способных замедлить или даже предотвратить развитие инфаркта миокарда, особенно актуально для Российской Федерации и других стран с ограниченными возможностями в области коронарной хирургии, но сдерживается отсутствием теоретической базы, способной ограничить поисковый скрининг областью эффективных и стабильных механизмов регуляции активности лизосомальных ферментов кардиомиоцитов (Е.Н.Винокурова, 1998; Б.К.Романов, 2004).
Исследования механизмов регуляции активности кислых гидролаз миокарда начались в 1980 г., и ведущим направлением вскоре стало изучение циклазной системы с методически доступным в то время количественным анализом уровня цАМФ в качестве мессенджера для гормональных и адренергических воздействий (Б.Ф.Коровкин, 1982; Г.А.Панченко, 1987; Н.А.Додонова, 1988; А.М.Кан, 1991), при этом в качестве регуляторов лизосомальной активности использовались адре-нергические лекарственные вещества (Н.А.Сысолятина, 1991).
Результаты этих исследования подтвердили участие циклазных процессов в регуляции стабильности лизосомальных мембран и ферментативной активности лизосом, однако были показаны и ограничения в возможностях реализации этого механизма, очерченные границами физиологических условий и начальными этапами процесса повреждения (П.В.Сергеев, 1991; Н.А.Сысолятина, 1991).
За пределами этих границ циклазная система регуляции лизосом начинала вести себя нестабильно, очевидно вследствие повреждения ферментных систем синтеза и деградации цАМФ, и поэтому не могла использоваться в качестве "инструмента" для предупреждения разрыва лизосомальных мембран в условях тяжелой патологии миокарда (П.В.Сергеев, 1995).
В 1988 году было сделано предположение о ключевой роли ионов кальция в процессе регуляции лизосомальной активности (В.Г.Нейлер, 1988).
Результаты первых исследований кальциевого механизма регуляции активности лизосомальных ферментов миокарда показали перспективность этого направления (Б.К.Романов, 1994; Е.Н.Винокурова, 1998), а появление необходимых биохимических методов исследования в этой области за последнее десятилетие -(проточно-инъекционный анализ ферментативной кинетики, метаболитов и ксенобиотиков в кардиомиоцитах и в сыворотке крови) создало реальные предпосылки к решению этой актуальной проблемы.
Цель работы
Решение проблемы стабилизации лизосомальных мембран миокарда посредством кальциевого механизма регуляции активности лизосомальных ферментов.
Задачи исследования
1. Установление наличия и характера корреляционной связи между уровнем ионизированного кальция в саркоплазме кардиомиоцитов с показателями активности лизосомальных ферментов миокарда в условиях нормоксии, и при постги-поксической реоксигенации, ишемии миокарда и дислипидемии.
2. Оценка влияния гипоксической гипоксии и последующей реоксигенации на содержание общего и ионизированного кальция в кардиомиоцитах и в сыворотке крови, и на показатели активности кислой фосфатазы, бета-галактозидазы и катепсина D в миокарде и сыворотке крови.
3. Изучение влияния острой тяжелой ишемии миокарда на содержание общего и ионизированного кальция в кардиомиоцитах и в сыворотке крови, и на показатели активности лизосомальных ферментов в миокарде и сыворотке крови.
4. Исследование динамики перераспределения показателей активности лизо-сомальных ферментов миокарда при острой ишемии миокарда.
5. Оценка влияния экпериментальной дислипидемии на кинетику лизосо-мальных ферментов миокарда при острой тяжелой ишемии миокарда и на возможности кальциевого механизма регуляции их активности.
6. Установление наличия и характера корреляционной связи между показателями активности лизосомальных ферментов миокарда и биохимическими показателями оценки его функционального состояния в условиях патологии.
7. Выявление возможностей взаимодействия дозозависимой кальциевой модуляции с циклазным механизмом стабилизации лизосомальных мембран.
8. Оценка стабильности кальциевого механизма регуляции активности лизо-сомальных ферментов миокарда в условиях экспериментальной патологии.
Научная новизна
Впервые изучено влияние Са2+-регулирующих средств - верапамила, дил-тиазема, дигоксина и азаклорзина на общую, неосаждаемую активность и коэффициент лабильности кислой фосфатазы, Р-галактозидазы и катепсина D в ткани миокарда, и общую активность этих ферментов в сыворотке крови.
Уточнено влияние Са2+-регулирующих средств на кальциевый пул в сыворотке крови и в кардиомиоцитах.
Впервые определены параметры лизосомальной активности миокарда в связи с изменениями уровня ионизированного кальция в миокарде при нормоксии, гипоксии, ишемии миокарда и дислипидемии.
Уточнены биохимические показатели газового и липидного состава крови и уровень малонового диальдегида в крови и в миокарде белых крыс в норме и при
экспериментальной патологии сердечно-сосудистой системы, как контрольные параметры оценки степени тяжести патологии.
Впервые установлена положительная корреляционная связь между уровнем ионизированного кальция в миокаде и коэффициентом лабильности лизосомаль-ных кислых гидролаз в ткани миокарда и общей активностью в сыворотке крови.
Впервые удалось показать наличие корреляционной связи между состоянием лизосомального аппарата и интенсивностью перекисного окисления липидов.
Показана временная динамика активности лизосомальных ферментов миокарда и стабильности лизосомальных мембран поврежденного тотальной ишемией миокарда и влияние на эту динамику Са2-регулирующих лекарственных средств.
Впервые оценен количественный эффект Са2-регулирующих средств на активность лизосомального аппарата миокарда, свидетельствующий о целесообразности использования в качестве метода ограничения лизосомальной активности кальциевого механизма регуляции по сравнению с циклазным.
Полученные результаты свидетельствуют о важной роли ионов кальция в опосредовании эффектов влияния антагонистов кальция и кардиотонических средств на функциональную активность лизосом миокарда, в частности, на активность лизосомальных ферментов и стабильность лизосомальных мембран.
Научно-практическая значимость
Результаты исследования позволяют решить актуальную для биохимии проблему стабилизации лизосомальных мембран миокарда посредством кальциевого механизма регуляции активности лизосомальных ферментов.
Разработка представления о роли кальциевого механизма регуляции функциональной активности кислых гидролаз в миокарде, как об эффективной дозоза-висимой системе будет способствовать направленному поиску оптимальных регуляторов уровня кальция в клетке в качестве лекарственных средств для ограничения аутолиза кардиомиоцитов при сердечно-сосудистой патологии.
Факт обнаружения положительной корреляционной взаимосвязи между уровнем ионизированного кальция и неседиментируемой активностью лизосо-мальных ферментов может стать отправной точкой для поиска возможных связей между этим мессенджером и другими, возможно еще более эффективными факторами регуляции лизосомальной активности.
Результаты исследования используются в лечебно-диагностическом процессе в Цен тральной Клинической Больнице Медицинского Центра Управления делами Президента России, в учебном процессе на кафедре биологической и биоорганической химии с курсом клинической лабораторной диагностики Рязанского государственного медицинского университета им. академика И.П. Павлова, и на кафедре фармакологии факультета фундаментальной медицины Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова в качестве примеров новых биохимических методов оценки динамики и степени завершенности патологического процесса, а также эффективности проводимой лекарственной терапии.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на Международной научно-практической конференции «Фармация и фармакология»» (Пермь, 1993 г.); на Российской конференции "Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы" (Санкт-Петербург, 1994 г.); на 5-м национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1995 г.); на конференции «Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов» (Рязань, 1995); на 1-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 1995 г.); на 8 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1998 г.); на Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Санкт-Петербург, 1999); на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001 г.); на тренингах учебного центра для конструкторов новых лекарственных средств (Нью-Дели, Индия, 2001, 2002).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 279 страницах машинописного текста и состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания методов исследования, данных собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и библиографического указателя, включающего 273 источника литературы, в том числе 171 источник отечественной и 102 источника зарубежной литературы. Диссертация иллюстрирована 30 таблицами, 27 диаграммами и 1 рисунком.
Материалы и методы исследования
1. Экспериментальные модели
Для решения поставленных задач, в качестве объектов нашего исследования, были использованы миокард и кровь 896 белых крыс-самцов (112 групп по 8 животных).
Выбор этого вида животных обусловлен структурной и биохимической идентичностью лизосомального аппарата миокарда у всех млекопитающих, включая человека (В.Р.Бауман, 1985).
Все животные были беспородные, половозрелые, с массой тела 130-150 г.
В качестве моделей экспериментальной патологии были использованы максимально жесткие способы воздействия на миокард, имитирующие все звенья патогенеза ишемической болезни сердца (В.А.Фомина, 2000; Б.К.Романов, 2002).
Модель острой гипоксической гипоксии вызывалась у животных путем экспозиции в барокамере с приточно-вытяжной вентиляцией, в которой в течение 6 часов создавалось разрежение воздуха, адекватное высоте 7500-8000 метров над уровнем моря (В.Г.Макарова, 1987; Б.К.Романов, 1994).
Модель ишемии миокарда крыс воспроизводили по методике К.А.Кетег й а1. (1981) в модификации Н.А.Сысолятиной (1991).
Экспериментальную гиперлипидемию у крыс индуцировали по методике, предложенной Arichi H. et al. (1982) в модификации Kimura Y. et al. (1982), и Л.Н.Сернова и др. (2000).
2. Средства разнонаправленной модуляции Са2+ баланса миокарда.
В качестве средств, разнонаправленно изменяющих уровень ионов кальция в кардиомиоцитах, использовали четыре зарегистрированных в Министерстве Здравоохранения Российской Федерации лекарственных препарата.
В качестве антагонистов кальция использовались два блокатора потенциал-зависимых медленных кальциевых каналов, имеющих различную степень сродства к структурным элементам миокарда - верапамил (тропный к рабочему миокарду и к клеткам проводящей системы) и дилтиазем (действующий на клетки кар-диомиоцитов и на гладкую мускулатуру сосудов сердца). Верапамил применялся дозозависимо и в разных лекарственных формах (внутрь и парэнтерально).
Для повышения уровня кальция в кардиомиоцитах использовали сердечный гликозид дигоксин (повышающий уровень Са2+ через угнетение Na+/K+ и последующую активацию Na+/Ca++ ионных насосов), и p-адренергический стимулятор азаклорзин (нонахлазин), повышающий уровень Са2+ через циклазные системы Дигоксин применялся дозозависимо, и в разных лекарственных формах (внутрь и парэнтерально).
Лекарственные формы, дозы препаратов и способы их применения:
Верапамила гидрохлорид (ICN-Октябрь; в таблетках, покрытых оболочкой по 80 мг, и в ампулах с 0,25% раствором по 2 мл) - вводили однократно за 8 часов до забоя внутрь (таблетки) в дозе 10 мг/кг в виде суспензии по зонду в 1 мл воды на 100 г веса и внутримышечно (раствор) в дозе 1 мг/кг (R.L. White, 1995).
Дилтиазем (Pliva - Хорватия; в таблетках по 60 мг) - вводили внутрь однократно в дозе 4 мг/кг в виде суспензии по зонду в 1 мл воды на 100 г веса за 8 часов до забоя (Giasson S., 1995).
Дигоксин (Lilly- Швейцария; в таблетках по 0,2 мг бета-ацетилдигоксина, и в ампулах по 1 мл 0,02% раствора бета-ацетилдигоксина) вводили однократно за 8 часов до забоя внутрь в виде суспензии по зонду в дозе 5 мг/кг (таблетки) в 1 мл воды на 100 г веса, и внутримышечно (раствор) в дозе 2,5 мг/кг. Использование таких высоких доз дигоксина обусловлено низкой видовой чувствительностью крыс к сердечным гликозидам, что связывается с фиксацией гликозидов в клетке преимущественно ядерно-мембранной фракцией миокарда (М.И.Миронова, 1977). Этот тип взаимодействия не коррелирует с биологической активностью сердечных гликозидов. У дигиталисо-чувствительных видов животных гликозиды связываются главным образом с микросомальной фракцией и интенсивность этого процесса хорошо коррелирует со степенью положительного инотропного эффекта (Е.Н.Винокурова, 1998).
Учитывая вышеизложенное, мы использовали дозу дигоксина, применяемую с учетом видовой чувствительности крыс (М.И.Миронова, 1977, И.Ф.Полякова, 1977; M.Kahonen, 1995).
Нонахлазин (таблетки азаклорзина по 30 мг) - вводили однократно за 8 часов до забоя внутрь в виде суспензии по зонду в дозе 2 мг/кг в 1 мл воды на 100 г веса (Н.В.Каверина, 1975; Н.А.Сысолятина, 1991).
В ходе проведения исследований были поставлены следующие серии экспериментов (по 8 животных в каждой из 112 серий):
1. Группа биологического контроля.
2. Препаратная группа - верапамил внутрь
3. Препаратная группа - верапамил парентерально
4. Препаратная группа - дилтиазем внутрь
5. Препаратная группа - дигоксин внутрь
6. Препаратная группа - дигоксин парентерально
7. Препаратная группа - нонахлазин внутрь
8. Модель экспериментальной патологии - «острая гипоксия»
9-14. Препараты (по перечню в сериях 2 - 7) + острая гипоксия
15. Модель - «острая ишемия миокарда» (15 минут ишемии)
16-21. Препараты + «острая ишемия миокарда» (15 минут ишемии)
22. Модель - «острая ишемия миокарда» (30 минут ишемии)
23-28. Препараты + «острая ишемия миокарда» (30 минут ишемии)
29. Модель - «острая ишемия миокарда» (45 минут ишемии)
30-35. Препараты + «острая ишемия миокарда» (45 минут ишемии)
36. Модель - «острая ишемия миокарда» (60 минут ишемии)
37-42. Препараты + «острая ишемия миокарда» (60 минут ишемии)
43. Модель - «острая ишемия миокарда» (90 минут ишемии)
44-49. Препараты + «острая ишемия миокарда» (90 минут ишемии)
50. Модель - «острая ишемия миокарда» (120 минут ишемии)
51-56. Препараты + «острая ишемия миокарда» (120 минут ишемии)
57. Модель - «экспериментальная дислипидемия» (гиперлипидемия)
58-63. Препараты + «экспериментальная дислпидемия»
64. Модель - «дислипидемия» + «острая гипоксия»
65-70. Препараты + «дислипидемия» + «острая гипоксия»
71. «Дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (15')
72-77. Препараты + «дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (15')
78. «Дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (30')
79-84. Препараты + «дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (30')
85. «Дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (45')
86-91. Препараты + «дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (45')
92. «Дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (60')
93-98. Препараты + «дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (60')
99. «Дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (90')
100-105. Препараты + «дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (90')
106. «Дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (120') 107-112. Препараты + «дислипидемия» + «острая ишемия миокарда» (120')
3. Биохимические методы исследования:
3.1. Пробоподготовка крови и гомогената миокарда
Крыс забивали под эфирным рауш-наркозом, при сохраненном дыхании и сердцебиении. Хирургическими ножницами рассекалась передняя брюшная стенка, кишечник выводился наружу марлевым тампоном. Обнажившийся брюшной отдел аорты пересекался ножницами. Кровь забирали в 2 пробирки:
1. В пробирку типа «Eppendorf» (с герметичной крышкой) забирали 1 мл крови для немедленной загрузки в анализатор газов крови.
2. Остаток крови (2-3 мл) забирали в стеклянную центрифужную градуированную пробирку для получения сыворотки, которую использовали для биохимических исследований. Сыворотку получали при 20-22°С, после отделения сгустка от стенок пробирки стеклянной палочкой и центрифугирования в настольной центрифуге ОПН-8 (Россия) при 3000 об./мин в течение 3 минут.
После забора крови рассекали диафрагму хирургическими ножницами, марлевым тампоном выводили миокард через разрез наружу, и затем отсекали его у основания. Предсердия отсекались, а полученный миокард желудочков быстро промывался от крови в теплом (37°С) изотоническом растворе хлорида натрия, высушивался на беззольной фильтровальной бумаге и взвешивался на электронных весах «OHAUS» (США).
Гомогенат готовили из ткани миокарда, после быстрого рассечения ножницами на мелкие части (не более 8 см3). Необходимое количество перемешанных кусочков немедленно гомогенизировалась до суспензированного состояния (60 секунд при 1500 об/мин) в гомогенизаторе «Diax 900» (США) с насадкой «06G»
(США) в 50 объемах 0,15 М ледяного (0-4°С) раствора NaCI. 500 мкл полученного исходного гомогената помещали в пластиковую центрифужную пробирку типа «Eppendorf». Гомогенат центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf 5403» (Германия) при 1500 g в течение 10 минут. Выход надосадка над безъядерной фракцией составлял 100 мкл. Другие 500 мкл исходного гомогената - 500 мкл помещали в пробирку типа «Eppendorf». Содержимое пробирок подвергали быстрому замораживанию до -70°С в морозильной установке «Sanyo» (Япония), затем пробирки загружали в ультразвуковую ванну «Сонар» (Россия) на 5 минут. После ультразвуковой деградации гомогенат центрифугировали при 4°С в напольной препаративной центрифуге «J-6M» (США) при 20000 g в течение 30 минут, надо-садок отфильтровывали на тефлоновом мембранном элюационном фильтре «Hamilton» (США) с диаметром отверстий 0,45 мкм. Выход надосадка гомогента составлял 100 мкл.
3.2. Определение активности лизосомальных ферментов.
Активность трех маркерных кислых гидролаз - кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2), Р-галактозидазы (КФ 3.2.1.23) и катепсина D (КФ 3.4.23.5) определяли в миокарде и в сыворотке крови на фотометре «HUMALYZER 2000» (Германия) по накоплению продуктов расщепления субстратов, рекомендованных в сборниках Дж. Дингла (1980); А.Дж. Баррет и М.Ф.Хит (1980), но с индивидуальным подбором оптимальных сроков инкубации (Н.А.Сысолятина, 1991; Б.К. Романов, 1994).
Активность кислой фосфатазы определялась по скорости расщепления глице-рол-2-фосфата («Sigma»). Спустя 60 минут после начала инкубации при 37°С в ацетатном буфере с рН 5,0 реакцию останавливали добавлением охлажденной до 0°С 10% трихлоруксусной кислоты и помещали пробу на 15 минут в холодильник при 4°С. Количественное определение конечного продукта ферментативного гидролиза - неорганического фосфора определяли в надосадочной жидкости (2 мл) после центрифугирования в настольной центрифуге ОПН-8 (Россия) при 3000
об./мин в течение 15 минут в кварцевой кювете (10 мм) на фотометре «HUMALYZER 2000» при длине волны 660 нм. Полумикрометод (с применением проточной кюветы фотометра «HUMALYZER 2000») в данном случае не использовали, поскольку трихлоруксусная кислота быстро повреждает силиконовые трубки прибора, приводя к их набуханию и слипанию стенок.
Активность Р-галактозидазы определялась полумикрометодом по скорости расщепления 4-нитрофенол-р-Б-галактопиранозида («Sigma») в течение 30 минут при 37°С в цитрат-фосфатном буфере с рН 4,0. После остановки реакции раствором глицина-щелочного с рН 10,8, пробирки центрифугировали в настольной центрифуге ОПН-8 (Россия) при 3000 об./мин в течение 10 минут.
Надосадок (500 мкл), содержащий нитрофенол, фотометрировали в проточной кювете фотометра «HUMALYZER 2000» при длине волны 420 нм.
Активность катепсина D определялась по скорости расщепления гемоглобина, 8% раствор которого на 8 М карбамиде предварительно инкубировали 2 часа в водяной бане при 60 °С, а затем разводили в 4 раза ацетатным буфером рН 3,6. После внесения фракции гомогената или сыворотки крови смесь инкубировали при 37 °С в течение 60 минут. Реакцию останавливали внесением охлажденной до 4°С 5% трихлоруксусной кислоты, затем для осаждения остатков гемоглобина и крупных белковых частиц пробы центрифугировали в настольной центрифуге ОПН-8 (Россия) при 3000 об./мин в течение 15 минут. Надосадок (2 мл) фотометрировали в кварцевой кювете (10 мм) фотометра «HUMALYZER 2000» при длине волны 280 нм.
Определяли следующие показатели активности указанных ферментов:
1. Неседиментируемая (неосаждаемая) активность ферментов - определялась в надосадке над безъядерным гомогенатом.
2. Общая активность ферментов - определялась в надосадке над лизосомаль-но-митохондриальной фракцией безъядерного гомогената после добавления де-
тергента (тритона Х-100, в конечной концентрации 0,1%), и после ультразвукового воздействия, полностью высвобождающего ферменты из связи с мембранами.
Для оценки функционального состояния лизосом, и степени повреждения ли-зосомальных мембран рассчитывали:
3. Коэффициент лабильности - показатель целостности лизосомальных мембран и степень связывания мембранно-матриксных лизосомальных ферментов, отражающий степень перехода общей активности ферментов в неседиментируе-мую фракцию - рассчитывали, как процентное отношение неседиментируемой активности к общей активности.
Для оценки уровня активности лизосомальных ферментов в крови, которая может увеличиваться при повреждении лизосом в тканях (с задержкой по времени, обусловленной транспортом в кровь), и может служить диагностическим и прогностическим критерием степени тяжести патологического процесса, определялась:
4. Общая активность лизосомальных ферментов в сыворотке крови.
Активность ферментов рассчитывалась в удельных единицах активности с
учетом содержания белка в соответствующей фракции гомогената или сыворотке крови (определяли на фотометре «HUMALYZER 2000» с набором на белок фирмы «HUMAN» (Германия) микробиуретовым методом) и выражалась в нанокатал на грамм белка (А.А.Покровский, 1976; Б.К.Романов, 2002):
где: А - активность (нанокатал/грамм белка); Ео - экстинкция опытной пробы; Ек - экстинкция контрольной пробы (без гомогената или сыворотки крови); К - молярный коэффициент конечного продукта распада; Т - время инкубации (мин); X - содержание белка в пробе = Ext * 33,3-
3.3. Количественный анализ Саморегулирующих средств. Концентрацию верапамила, дилтиазема, дигоксина и нонахлазина определяли в ткани миокарда и в сыворотке крови методом проточно-инъекционного анализа (ПИА) в градиентной системе «Stayer» фирмы Аквилон (Россия). Объем петли инжектора, в которую вводили пробу - 50 мкл. Градиент подвижной фазы образовывали на линии высокого давления, в колонке Phenomenex (модель LUNA С-18, размеры- 150x4,6 мм, диаметр пор - 5 (i) с октадецилом, в подвижной фазе - 1% водный раствор ортофосфорной кислоты (неорганический растворитель) и ацето-нитрил (органический растворитель), объем потока 1 мл в минуту, градиент давления от 300 до 100 атмосфер, температура колонки 15-25 градусов, длительность программы - 20 минут с изменением концентрации (градиента) ацетонитрила:
1. С 0 до 3 минуты - 10% (контроль «0» и первое «плато» градиента);
2. 3-6 минут-увеличение концентрации ацетонитрила с 10% до 25%;
3. С 6 по 8 минуту - 25% (второе «плато» градиента);
4. С 8 по 16 минуту - рост концентрации ацетонитрила с 25% до 65%;
5. С 16 по 20 минуту - 65% (третье «плато» градиента);
6. «Выход» из градиента - снижение концентрации ацетонитрила до 10%;
7. С 20 по 30 минуту- 10% (промывка колонки перед следующей пробой).
Калибровка проводилась методом внутреннего стандарта водными растворами анализируемых лекарственных средств. Анализ хроматограмм проводился в среде "Мультихром" (версия 2.0).
Верапамил, дилтиазем и нонахлазин выходили в виде монопиков. Дигоксин выходил в виде двух пиков:
1. На 4,17 минуте, при росте градиента концентрации ацетонитрила с 10% до 25% - выходила водорастворимая часть (гликон) - D-дигитоксоза;
2. На 10,8 минуте, при росте градиента концентрации ацетонитрила с 25% до 65% - жирорастворимая часть (агликон) стероидной структуры.
Соотношение концентраций (площадей под пиками) составило 17% и 83% для первого и второго пика соответственно.
Для количественной оценки использовали второй пик, поскольку он имел большую площадь, и на него не накладывались пики компонентов гомогената миокарда (Б.К.Романов, 1999).
3.4. Определение уровня кальция в крови и в миокарде.
Содержание общего (ионизированного и неиоинизированного) кальция в сыворотке крови определялось о-крезолфталеиновым методом на биохимическом анализаторе - фотометре «HUMALYZER 2000» с использованием стандартного набора жидких реактивов на кальций (200 мл на 400 тестов) фирмы «HUMAN» (Германия), по рекомендациям IFCC - Международной Федерации по Клинической Химии (А.И.Карпищенко, 1998).
Содержание общего кальция в надосадке лизосомально-митохондриальной фракции безъядерного гомогената миокарда определялось флуоресцентным методом на сканирующем флуориметре «Shimadzu-150» (Япония) при помощи хелата-тора кальция Quin-2 (Sigma, США) по методике A. Persechini (1996).
Содержание ионизированного кальция в сыворотке крови, а также в надо-садке лизосомально-митохондриальной фракции безъядерного гомогената миокарда определяли методом прямой потенциометрии на анализаторе «Экотест-120» (Россия) с применением ионселективных (на кальций) микроэлектродов модели «EasyLyte-2150» и референтных микроэлектродов модели «EasyLyte-2152» на мембране «2258» по калибраторам Auto-CAL-33-140 (внутреннему) и CAL-Set-33-120 (внешнему) фирмы Medica (А.И.Карпищенко, 1998; Б.К.Романов, 2002).
3.5. Анализ показателей газового состава и липидного баланса крови
Для контроля воспроизведения экспериментальных моделей и оценки характера течения и степени тяжести экспериментальной патологии проводили анализ газового состава крови, липидного баланса крови и интенсивности процесса липо-пероксидации в биомембранах кардиомиоцитов.
Исследование содержания газов в крови (рОг И рСОг) для оценки степени гипоксии производили на автоматическом биохимическом анализаторе «EasyBIoodGas» (Германия).
Липидный баланс, характеризующий характер и степень экспериментальной дислипидемии, оценивали по следующими показателями: общий уровень холестерина и триглицеридов, уровень холестерина липопротеидов высокой плотности и расчет уровня холестерина липопротеидов низкой плотности (по формуле Фри-вальда) и индекса атерогенности (по формуле А.Н.Климова). Исследование содержания в миокарде и крови МДА, а также общего холестерина (ОХ), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХЛПВП) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови проводилось на биохимическом анализаторе - фотометре "HUMALYZER 2000" с использованием диагностических наборов - готовых жидких реактивов фирмы "HUMAN" (Германия).
Для оценки степени повреждения лизосомального аппарата использовалось определение малонового диальдегида (МДА), накопление которого пропорционально степени вовлечения фосфолипидов биомембран в процесс угнетения ферментных и неферментных антиоксидантных систем. Концентрацию МДА в надо-садке лизосомально-митохондриальной фракции безъядерного гомогената и в сыворотке крови определяли по методу И.Д.Стальной (1977) в модификации В.А.Фоминой (2000).
4. Достоверность полученных данных и статистические методы.
Первичные экспериментальные данные хранились и обрабатывались на персональном компьютере «Intel Pentium® III Processor» в системе «Microsoft® WINDOWS® 98 RU OLC OEM» в едином файле формата «Microsoft® Excel®» из профессиональной версии офисного пакета «Microsoft® OFFICE PRO 7.0 W32 RU C/V CD». Все использованные программные продукты являются лицензионными и зарегистрированы (зарегистрированный пользователь - Романов Б.К.) в Информационном отделе Российского Инфоцентра Microsoft (регистрационный номер
87779). Данные заносились в файл из измерительных приборов посредством USB-портов (при ПИА), или по интерфейсу последовательной связи RS 232С (от остальных приборов). Все средства измерения имели свидетельства о государственной поверке на период проведения исследования.
Для расчетов среднего значения (М), средней ошибки (среднего отклонения) среднего значения (m), значение критерия t-распределения по Стьюденту и коэффициента корреляции использовали стандартные статистические функции «Microsoft® Excel®». Различие средних при числе вариант в группе (n=8), считали достоверным при t > 2,306, что соответствует вероятности (Р) безошибочного прогноза более, чем в 95%. Степень корреляции вариант в сравниваемых группах считали высокой при значении численного значения коэффициента корреляции, превышающего 0,5 (Г.Стентон, 1999).
Результаты исследования и их обсуждение
Моделирование экспериментальной патологии и назначение Са2+-регулирующих веществ сопровождалось достижением терапевтических дозировок средств в кардиомиоцитах, в частности 0,87+_0,02 мг/кг для верапамила и 27,96+_0,77 мкг/кг для дигоксина, и приводило к достоверным изменениям содержания ионизированного кальция в миокарде (рис. 1). Это указывает на оптимальный характер выбранных путей введения и дозировок примененных лекарственных средств, и на адекватность выбранных экспериментальных методик.
Ключевой проблемой исследования является кальциевый механизм регуляции активности лизосомальных ферментов посредством оценки влияния динамики уровня ионизированного кальция в миокарде на характер распределения общей активности лизосомальных ферментов между неосаждаемой и осаждаемой фракцией (коэффициент лабильности).
О*! 05 ми раго» рею* ым 1)Н! О) метро«
Примечание (здесь и на последующих рисунках): Вер - верапамил; Дил -дилтиазем; Диг - дигоксин; Нон - нонахлазин; ОГ - острая гипоксия; ИМ - ишемия миокарда; ДЛ - дислипидемия; * - достоверное различие с группой биологического контроля; ** - достоверное различие с соответствующей группой экспериментальной патологии.
Рис. 1. Содержание ионизированного кальция в кардиомиоцитах.
Коэффициенты лабильности кислых гидролаз коррелируют (рис. 2-4) с уровнем ионизированного кальция в клетках миокарда как в условиях нормоксии, так и при экспериментальной патологии и ее коррекции кальцийрегулирующими средствами (табл. 7-9).
м
Примечание - здесь и на последующих рисунках: К - корреляция вариант показателя с уровнем ионизированного кальция в миокарде, общей активностью фермента в сыворотке крови и уровнями малонового диальдегида в ткани миокарда и сыворотке крови; К* - корреляция вариант показателя с уровнем ионизированного кальция в миокарде.
Рис. 2. Коэффициент лабильности ¡З-галактозидазы кардиомиоцитов.
10 1 4 в 15 2 в час 13 30 « 60 вО 12В ИЛ + 1в 30 ВО во 1Ю
мггаг НЕМ М!*г шлг мгю Ы(Л1 »ООО 317 ОГ *ДП
рв! вв Ыи р«г о« Р" о» Ми рн о* матров
Рис. 3. Коэффициент лабильности кислой фосфатазы кардиомиоцитов.
10 1 л в 2« 2 в час ч- ао «е- W во 420* ИЛ ♦ 15' 30- 45' 60- 90* 1?0' мгмг мгЛсг ш1шг мм« г мг/яг MrtKi во DO 7 ОГ 'Д" 'А11 *ДО *ДП *ДЛ
os им per о« per о* */м per os w*tpo*
Рис. 4. Коэффициент лабильности катепсина D кардиомиоцитов.
Таблица 1.
Достоверность динамики коэффициента лабильности кислой фосфатазы, бе-та-галактозидазы, катепсина D и содержания ионов Са2+ в кардиомиоцитах при на-
значении кальцийрегулирующих средств.
Группы животных КФ КФ БГ БГ KD KD Са2* cV*
An Ли An Лм Л, AM Л> Am
% % % % % % % %
Группа контроля - - - . . - . -
Вер -10 мг/кг - per os -8,7* - -7,6* - -10* - -10* -
Вер- 1 мг/кг пар. -11* - -10* - -13* - -12* -
Дил -4 мг/кг - per os -5,1* - -4,1 - -6,8* - -6,4 -
Диг-5 мг/кг - per os 6,4* - 7,5* - 4,5* - 13* -
Диг-2,5 мг/кг пар. 4,0 - 5,2 - 2,1 - 15* -
Нон- 2 мг/кг - per os 8,7* - 9,9* - 6,7 - 17* -
Примечание - здесь и в последующих таблицах:
Вер - верапамил; Дил. - дилтиазем; Диг-дигоксин; Нон - нонахлазин; per os - введение внутрь; пар. - парентеральное введение; ОГ - острая гипоксия; И - ишемия (в минутах); Д - дислипидемия; КФ - кислая фосфатаза; БГ - бета-галактозидаза; KD - катепсин D; Са2+ - кальций; Л n - процентное отклонение от среднего значения в контрольной группе; - процентное отклонение от среднего значения в соответствующей группе модели экспериментальной патологии; * - различие достоверно.
Таблица 2.
Достоверность динамики коэффициента лабильности кислой фосфатазы, бе-та-галактозидазы, катепсина D и содержания ионов Са2+ в кардиомиоцитах при
острой гипоксии и назначении кальцийрегулирующих средств.
Группы животных КФ КФ БГ БГ KD KD Са1* Са
As лм AN Л„ Л„ Ли Л„ Лм
% % % % % % % %
(ОГ) - 6 часов 18* - 19* - 19* - 25* -
(ОГ) + Вер - per os 4,6 -и* 7,2 -9,9 2,7 -14* 2,9 -17 *
(ОГ) + Вер пар 0,3 -15* 0,9 -15* -1,5 -17* -0,5 -20*
(ОГ) + Дил - per os 6,1* -9,9* 6,6* -10* 4,2* -13* 4,7* -16*
(ОГ) + Диг - per os 20* 1,9 20* 0,9 18* -1,2 19* -4,5
(ОГ) + Диг пар. 27* 7,7* 29* 8,4 25* 4,5 24* -0,2
(ОГ) + Нон-per os 25* 5,9* 31* 9,8 23* 2,7 23* -1,4
Таблица 3.
Достоверность динамики коэффициента лабильности кислой фосфатазы, бе-та-галактозидазы, катепсина D и содержания ионов Са2+ в кардиомиоцитах при
острой ишемии миокарда и назначении кальцийрегулирующих средств.
Группы животных КФ КФ БГ БГ KD KD Cas* Са1*
AN Ли AN Л„ AN Лм An Лм
% % % % % % % %
(И) -15' 225* - 235* - 223* • 227* -
(И) + Вер peros-15' 196* -8,8* 202* -9,8* 191* -10* 190* -11*
(И) + Вер пар-15' 189* -11* 187* -14* 182* -13* 188* -12*
(И) + Дил per os-15' 208* -5,2* 216* -5,5 202* -6,5* 199* -8,3
(И) + Диг per os-15' 246* 6,4* 248* 4,1 239* 5,0* 241* 4,3
(И) + Диг пар-15' 238* 4,1 245* 3,0 232* 2,7 232* 1,8
(И) + Нон-рег os-15' 254* 8,9* 250* 4.6 247* 7,5* 254* 8,4
(И)-ЗО' 257* 9,8* 261* 7,9* 253* 9,2* 325* 30*
(И) + Вер per os-30' 225* -8,8* 228* -9,3* 219* -9,5* 278* -11*
(И) + Вер пар -30' 218* -11* 220* -12* 211* -12* 274* -12*
(И) + Дил per os-30' 238* -5,2* 240* -5,8* 231* -6,0* 289* -8,3
(И) + Диг per os-30' 280* 6,4* 282* 5,8* 272* 5,5* 343* 4,3
(И) + Диг пар -30' 271* 4,1 274* 3,5 264* 3.2 332 1,8
(И) + Нон - per os-30' 288* 8.9* 291* 8,3* 281* 8,0* 360* 8,4
(И)-45' 258* 0,5 261* -0,1 254* 0,4 423* 23*
(И) + Вер "ег os-45' 227* -8,8* 229* -8,8* 220* -9,5* 368* -10*
(И) + Вер пар -45' 219* -11* 221* -И* 213* -12* 361* -12*
(И) + Дил per os-45' 239* -5,2* 242* -5,2* 233* -5,9* 379* -8,3
(И) + Диг per os-45' 281* 6,4* 284* 6.4* 274* 5,6* 445* 4,3
(И) + Диг пар -45' 273* 4,1 275* 4,1 266* 3,3 432* 1,8
Группы животных КФ КФ БГ БГ KD KD CaJ" Ca2+
An Ли An Лм An AM An Am
% % % % % % % %
(И) + Нон - per os-45' 290* 8,9* 293* 8,9* 283* 8,1* 467* 8,4
(И)-бО' 261* 0,6 263* 0,6 256* 0,7 423* 0,0
(И) + Вер per os-60' 229* -8,8* 231* -8,8* 222* -9,5* 372* -9,7*
(И) + Вер пар.-бО' 221* -11* 223* -И* 215* -12* 361* -12*
(И) + Дил per os-60' 242* -5,2* 244* -5,2* 235* -6,0* 379* -8,3
(И) + Диг per os-60' 284* 6,4* 286* 6,4* 276* 5,6* 445* 4,3
(И) + Диг пар.-60' 275* 4,1 278* 4,1 268* 3,3 432* 1,8
(И) + Нон - per os-60' 283* 6,2* 285* 6,2* 275* 5,3* 467* 8,4
(И)-90' 277* 4,5* 279* 4,5* 273* 4,5* 425* 0,4
(И) + Вер per os-90' 244* -8,8* 246* -8,8* 237* -9,5* 365* -12*
(И) + Вер пар.-90' 235* -11* 238* -11* 229* -12* 361* -12*
(И) + Дил per os-90' 257* -5,2* 259* -5,2* 250* -6,0* 379* -8,7
(И) + Диг per os-90' 295* 4,7* 297* 4,7* 287* 3,8* 445* 3,9
(И) + Диг пар.-90' 288* 3,0 291* 3,0 281* 2,1 432* 1,4
(И) + Нон-per os-90' 287* 2,8 290* 2,8 280* 2,0 467* 8,0
(И)-120' 277* 0,0 279* 0,0 273* 0,2 422* -0,5
(И) + Вер per os-120' 244* -8,8* 246* -8,8* 237 -9,7* 365* -11*
(И) + Вер пар.-120' 235* -И* 238* -11* 229* -12* 361* -12*
(И) + Дил per os-120' 257* -5,3* 259* -5,3* 250* -6,2* 379* -8,2
(И) + Диг per os-120' 298* 5,7* 301* 5,7* 291* 4,6* 442* 3,7
(И) + Диг пар.-120' 291* 3,8 294* 3,8 284* 2,7 432* 1,9
(И) + Нон-per os-120' 285* 2,1 287* 2,1 278* 1,1 460* 7,2
Таблица 4.
Достоверность динамики коэффициента лабильности кислой фосфатазы, бе-та-галактозидазы, катепсина D и содержания ионов Са2+ в кардиомиоцитах при экспериментальной дислипидемии и назначении кальцийрегулирующих средств.
Группы животных КФ КФ БГ БГ KD KD tV Ca1*
An Ам AN А„ An AM An Am
% % % % % % % %
Дислипидемия (Д) 1.3 - 5,6 - 2,3 - 0,1
(Д) + Вер per os -9,2* -10* -8,1* -13* -11* -13* -11* -11*
(Д) + Вер пар. -11* -12* -11* -15* -13* -15* -12* -12*
(Д) + Дил per os -5,4* -6,6* -4,4 -9,5* -7,1* -9,2* -6,7 -6,8
(Д) + Диг per os 6,5* 5,2* 7,6* 1,9 4,6* 2,3 4,7 4,6
(Д) + Диг пар. 3,8 2,5 5,0 -0,6 2,0 -0,3 2,6 2,5
(Д) + Нон-per os 8,8* 7,4 11* 5,0 6,9 4,5 6,3 6,2
Таблица 5.
Достоверность динамики коэффициента лабильности кислой фосфатазы, бе-та-галактозидазы, катепсина D и содержания ионов Са2+ в кардиомиоцитах при острой гипоксии на фоне дислипидемии и назначении кальцийрегулирующих
средств.
Группы животных КФ КФ БГ БГ KD KD Са Са
AN Ам An Ач An AM An Am
% % % % % % % %
(Д)+(ОГ) 22* 3,7 24* 3,9* 23* 3,2* 25* 0,3
(Д)+(ОГ) + Вер per os 4.7 -14* 7,2 -13 2,8 -17* 3,2 -17*
(Д)+(ОГ) + Вер пар. -0.1 -18* 0,2 -19* -1,9 -20* -0,6 -20*
(Д)+(ОГ) +■ Дил per os 6,7* -13* 7,1* -13* 4,8* -15* 5,4* -16*
(Д)+(ОГ) + Диг per os 20* -1,5 21* -2,2 18* -4,0 19* -5,0
(Д)+(ОГ) + Диг пар. 27* 3,8 27* 2,6 25* 1,2 26* 1,0
(Д)+(ОГ) + Нон-per OS 25* 2,3 32* 6.4 23* -0,2 22* -2.0
Таблица 6.
Достоверность динамики коэффициента лабильности кислой фосфатазы, бе-та-галактозидазы, катепсина D и содержания ионов Са2+ в кардиомиоцитах при
острой ишемии миокарда на фоне дислипидемии.
Группы животных КФ An % КФ Ам % БГ An % БГ Ам % KD An % KD AM % Са!* An % Са5* Am %
(Д)+(И)-15' 226* - 234* - 226* - 223* -
(Д)+(И) + Вер per os-15' 197* -8,8* 199* -10* 192* -11* 193* -9.3
(Д)+(И) + Вер пар.-15' 189* -11* 195* -12* 184* -13* 183* -12*
(Д)+(И) + Дил per os-15' 209* -5,2* 214* -6,0 203* -7,0* 203* -6.1
(Д)+(И) + Диг per os-15' 246* 6,4* 251* 4,9 240* 4,4 240* 5,2
<Д)+(И) + Диг пар-15' 240* 4,3 246* 3,7 233* 2,4 234* 3,2
(Д)+(И) + Нон-per os-15' 243* 5,2* 243* 2,5 236* 3,3 239* 5,0
(ДЖИ)-ЗО' 257* 9,6* 228* -1,8 253* 8,5* 320* 30*
(Д)+(И) + Вер per os-30' 225* -8,8* 227* -0,2 219* -9,6* 281* -9,3
(Д)+(И) + Вер пар -30' 218* -11* 220* -2,6 211* -12* 268* -12*
(Д)+(И) + Дич per os-30' 238* -5,2* 240* 3,7 231* -6,1* 295* -6.1
(Д)+(И) + Диг per os-30' 280* 6,4* 282* ^ 16 272* 5,4* 342* 5,2
(Д)+(И) + Диг пар -30' 271* 4,1 274* 14 264* 3,1 334* 3,2
(Д)+(И) + Нон-per os-30' 288* 8,9* 291* 19 281* 7,9* 341* 5,0
(Д)+ (И)-4«' 258* 0,5 261* 9,9 255* 0,4 412* 22*
(Д)+<И) + Вер per os-45' 227* -8,8* 229* -8,8* 220* -9,6* 369* -8,3
(Д)+(И) + Вер пар -45' 219* -11* 221* -11* 213* -12* 353* -11*
(Д)+(И) + Дил per os-45' 239* -5,2* 242* -5,2* 233* -6.1* 386* -5,1
(Д)+(И) + Диг per os-45' 281* 6,4* 284* 6,4* 274* 5,5* 444* 6,3
Группы животных КФ КФ БГ БГ KD KD Са!* Сяи
AN Ам AN А„ AN Am An Am
% % % % % % % %
(Д)+(И) + Диг пар -45' 273* 4,1 275* 4,1 266* 3,2 434* 4,3
(Д)+(И) + Нон-per os-45' 290» 8,9* 292* 8,9* 283* 8,0* 443* 6,1
(Д>+ (И)-бО' 260* 0,6 262* 0,6 256* 0,4 417* 1,1
(Д)+(И) + Вер per os-60' 229* -8,8* 232* -8,3* 222* -9,4* 371* -9,0
(Д)+(И) + Вер пар -60' 221* -11* 223* -11* 215* -12* 353* -12*
(Д)+(И) + Дил per os-60' 242* -5,2* 243* -5,2* 235* -5,9* 386* -6,1
(Д)+(И) + Диг per os-60' 284* 6,4* 286* 6,4* 276* 5,7* 444* 5,2
(Д)+ (И) + Диг пар -60' 275* 4,1 277* 4,1 268* 3,4 434* 3,2
(Д)+ (И) + Нон-per os-60' 287* 7,4* 289* 7,4* 280* 6,7* 443* 5,0
(Д)+ (И)-90' 277* 4,5* 279* 4,5* 273* 4,8* 415* -0,5
(Д)+(И) + Вер per os-90' 244* -8,8* 248* -8,0* 237* -9,6* 369* -8,8
(Д)+(И) + Вер пар.-90' 235* -11* 237* -11* 234* -11* 351* -12*
(Д)+(И) + Дил per os-90' 257* -5,2* 259* -5,2* 250* -6,1* 386* -5,6
(Д)+(И) + Диг per os-90' 298* 5,7* 300* 5,7* 291* 4.7* 444* 5,7
(Д)+(И) + Диг пар -90' 292* 4,1 294* 4,1 285* 3,1 434* 3,8
(Д)+(И) + Нон-per os-90' 299* 5,8* 301* 5,8* 291* 4,8 443* 5,5
(Д)+ (И)-120' 277* 0,2 279* 0.2 275* 0,4 416* 0,3
(Д)+(И) + Вер per OS-120' 243* -9,0* 245* -9,0* 237* -10* 369* -9,0
(Д)+(И) + Вер пар.-120' 235* -11* 237* -11* 228* -12* 353* -12*
(Д)+(И) + Дил per os-120' 257* -5,4* 259* -5,4* 250* -6,5* 388* -5,4
(Д)+(И) + Диг per os-120' 299* 5,6* 301* 5,6* 288* 3,7 444* 5,5
(Д)+(И) +Диг пар-120' 288* 2,8 290* 2,8 280* 1,6 434* 3,5
(Д)+(И) + Нон-per os-120' 288* 2,8 290* 2.8 283* 2,3 440* 4,6
и
Mlftr utfur МГ/КГ МГ/КГ МГ/КГ МГ/КГ $000 МГЛГ МГ/ИГ МЙ«Г МЙ«Г uiftr ыг/кг
per 08 а/м peros peros в.'м peros метров рас os »'м peros peros s/м peros
ОГ ОГ ОГ ОТ ог ог
Рис. 5. Динамика общей активности кислой фосфатазы в сыворотке крови.
м
MKai/л 1
250,0 -
иг/иг мг/кг Mrtur иг)кг urírr мг/кг BQ00 мг(кг мг/кг мг1кг мг*кг Mrtur мг/кг poros >/м paros peros t/м peros метров per os »/м peros peros 4u peros
ór ór or or or or
Рис. 6. Динамика общей активности бета-галактозидазы в сыворотке крови.
и
икат/л
Mf/«r ur/nr Mrtur Mrtur ur/nr Mrtur gooo Mrtur Mrtur Mr/«r Mrt*r urJKr Mrtur peros Hu peros peros ifM peros uerpciBperos >/m peros peros »/M peros
or or or or or oV
Рис. 7. Динамика общей активности катепсина D в сыворотке крови.
Таблица 7.
Корреляция коэффициента лабильности кислой фосфатазы в миокарде крыс с общей активностью кислой фосфатазы в крови (ОА-к), уровнем ионизированного кальция в миокарде (Са2+-м), парциальным давлением кислорода (О2), и уровнем малонового диальдегида в крови (МДА-к) и миокарде (МДА-м)._
№ Группы животных (п=8) Коэффициент ко рреляции
ОА-к о2 МДА-к МДА-м
1 Биологический контроль 0,82 0,58 -0,06 0,56 0,58
2 Верапамил-10 мг/кг (per os) 0,84 0,93 -0,21 0,45 0,93
3 Верапамил-1 мг/кг (в/мышечно) 0,83 0,47 -0,02 0,57 0,47
4 Дилтиазем-4 мг/кг (per os) 0.87 0,60 -0,07 0,68 0,65
5 Дигоксин-5 мг/кг (per os) 0,87 0,76 -0,13 0,44 0,64
6 Дигоксин-2,5 мг/кг (в/мышечно) 0,75 0,81 -0,06 0,63 0,90
7 Нонахлазин-2 мг/кг (per os) 0,89 0,56 -0,18 0,72 0,73
8 Острая гипоксия (ОГ) - 6 часов 0,89 0,89 -0,53 0,97 0,76
9 (ОГ) + Верапамил per os 0,85 0,74 -0,67 0,71 0,64
10 (ОГ) + Верапамил пар. 0,89 0,98 -0,70 0,69 0,98
11 (ОГ) + Дилтиазем per os 0,92 0,97 -0,56 0,58 0,97
12 (ОГ) + Дигоксин per os 0,61 0,65 -0,64 0,57 0,48
13 (ОГ) + Дигоксин пар. 0,90 0,87 -0,48 0,70 0,71
14 (ОГ) + Нонахлазин-рег os 0,93 0,72 -0,86 0,63 0,63
Таблица 8.
Корреляция коэффициента лабильности бета-галактозидазы в миокарде крыс с общей активностью кислой фосфатазы в крови (ОА-к), уровнем ионизированного кальция в миокарде (Са2+-м), парциальным давлением кислорода (О2), и уровнем малонового диальдегида в крови (МДА-к) и миокарде (МДА-м).
№ Группы животных (п=8) Коэффициент ко рреляции
ОА-к о2 МДА-к МДА-м
1 Биологический контроль 0,83 0,61 -0,14 0,57 0,61
2 Верапамил-10 мг/кг (per os) 0,67 0,73 0,04 0,55 0,63
3 Верапамил-1 мг/кг (в/мышечно) 0,82 0,75 0,02 0,45 0,75
4 Дилтиазем-4 мг/кг (per os) 0,82 0,57 0,01 0,74 0,32
5 Дигоксин-5 мг/кг (per os) 0,87 0,64 0,02 0,82 0,59
6 Дигоксин-2,5 мг/кг (в/мышечно) 0,77 0,40 -0,16 0,57 0,48
7 Нонахлазин-2 мг/кг (per os) 0,58 0,72 -0,11 0,70 0,88
8 Острая гипоксия (ОГ) - 6 часов 0,89 0,76 -0,55 0,54 0,76
9 (ОГ) + Верапамил per os 0,85 0,90 -0,56 0,69 0,90
10 (ОГ) + Верапамил пар. 0,89 0,92 -0,47 0,68 0,92
11 (ОГ) + Дилтиазем per os 0,92 0,71 -0,79 0,65 0,71
12 (ОГ) + Дигоксин per os 0,60 0,51 -0,66 0,86 0,51
13 (ОГ) + Дигоксин пар. 0,90 0,85 -0,46 0,60 0,85
14 (ОГ) + Нонахлазин-рег os 0,87 0,71 -0,53 0,63 0,63
Таблица 9.
Корреляция коэффициента лабильности катепсина Б в миокарде крыс с общей активностью кислой фосфатазы в крови (ОА-к), уровнем ионизированного кальция в миокарде (Са2+-м), парциальным давлением кислорода (О2), и уровнем малонового диальдегида в крови (МДА-к) и миокарде (МДА-м).
№
Группы животных (п=8)
ОЛ-к
Коэффициент ко
Са -м
рреляции
Oi
МДА-к
Биологический контроль
0,80
0,54
0,03
0,46
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13
14
Верапамил-10 мг/кг (per os)
0,84
0,72
0,04
0,45
Верапамил-1 мг/кг (в/мышечно)
0,84
0,37
-0,07
0,57
Дилтиазем-4 мг/кг (per os)
0,87
0,57
-0,13
0,38
Дигоксин-5 мг/кг (per os)
0,87
0,72
-0,26
0,44
Дигоксин-2,5 мг/кг (в/мышечно)
0,75
0,80
0,38
0,43
Нонахлазин-2 мг/кг (per os)
0,62
0,59
-0,15
0,60
Острая гипоксия (ОГ) - 6 часов
0,53
0,63
-0.67
0,97
(ОГ) + Верапамил per os
0,52
0,64
-0,60
0,71
(ОГ) + Верапамил пар.
0,89
0,88
-0,46
0,69
(ОГ) + Дилтиазем per os
0,92
0,79
-0,54
0,58
(ОГ) + Дигоксин per os
0,61
0,68
-0,48
0,57
(ОГ) + Дигоксин пар.
0,47
0,77
-0,36
0,70
(ОГ) + Нонахлазин-per os
0,87
0,71
-0,48
0,63
Для идентификации звеньев механизма кальциевой регуляции активности лизосомальных ферментов кардиомиоцитов необходимо использовать имеющиеся сведения о мессенджерах, являющихся метаболическим окружением регуляторной системы «ионы кальция - кислые гидролазы» в миокарде.
Универсальным принципом передачи информации в клетке, как наследственной, так и оперативно регулирующей и управляющей, является обязательность ее трансдукции (преобразования). Для наследственной (внутренней) информации о синтезе лизосомальных ферментов общеизвестны как сам факт трансдукции, так и ее этапы: транскрипция - процессинг пре-мРНК - трансляция на рибосомах шероховатого ЭПР - посттрансляционная модификация энзима (Б.Ф.Коровкин, 1980; Т.М. Lincoln, 1982; В.И. Кулинский, 1997; S.P.Srinivas, 2002).
Для передачи информации путем кальциевого механизма внешние этапы трансдукции во многом удалось выяснить только в последние годы (В.И. Кулин-ский, 1997).
Существуют два основных механизма трансдукции внешнего сигнала в клетку. При первом (вариант I) гидрофобный фактор (стероидные гормоны, ти-реоидные гормоны, жирорастворимые витамины) проникает через плазматическую мембрану, а затем через цитозоль (последнему, очевидно, способствуют транспортные рецепторы цитозоля) в ядро, где образует комплекс с ядерными рецепторами и в результате изменяет матричные синтезы (А.А.Терентьев, 1995).
При втором фактор-рецепторный комплекс образуется на наружной поверхности плазматической мембраны. Это вызывает либо быстрое открытие ионного канала и вход ионов в клетку (вариант На), либо включение систем вторичных посредников - протеинкиназ, приводящих к медленным изменениям метаболизма и функций клеток (вариант Нб ).
Два механизма (I и Пб ) приводят к «поздним» эффектам - изменениям процессов, которые регулируются ядром клетки. Эти способы трансдукции используются для медленной перестройки метаболизма, они занимают достаточно много времени, и в отличие от механизма На не могут определять течение острой патологии. Известно четыре системы передачи внешнего сигнала в цитозоль по механизму На (А.А.Терентьев, 1995).
Через систему цАМФ действуют амины, пептиды, белки, простагландины I и Е, которые образуют комплексы со специфическими рецепторами и через G-белки активируют или ингибируют аденилатциклазу, образующую цАМФ из АТФ. цАМФ вызывает диссоциацию зависимой от него протеинкиназы А на регу-ляторную и каталитическую субъединицы. В результате последняя активируется и фосфорилирует многочисленные белки-исполнители. Это увеличивает, например, распад гликогена и жира, синтез катехоламинов и глюкокортикостероидов, со-
кращение сердца, расслабление гладких мышц. Поэтому цАМФ часто рассматривают как сигнал голода и стресса, который может быть полезен только до момента срыва компенсаторных процессов.
Вторая система - цГМФ образуется двумя гуанилатциклазами. Мембранный фермент активируется натрийуретическими гормонами (без участия G-белков), а растворимый (цитозольный) - монооксидами. цГМФ активирует протеинкиназу G, но, кроме того, изменяет активность других белков, включая ионные каналы, увеличивает выделение мочи и №+, расслабляет гладкие мышцы (А.А.Терентьев, 1995).
Третья система, система тирозинкиназ - это протеинкиназы, фосфорили-рующие в белках остатки тирозина (а не серина или треонина, как другие проте-инкиназы). Эта система отличается от остальных отсутствием вторичного посредника. Различают рецепторные тирозинкиназы, расположенные в плазматической мембране и являющиеся частью рецептора или сопряженные с ним, и нерецептор-ные (или клеточные). Эта система включается в действие факторов роста клеток, цитокинов и инсулина, опосредуя их цитозольные эффекты (А.А.Терентьев, 1995).
Последняя, четвертая система трансдукции, это новый, описанный в 1990-е годы класс - класс неорганических регуляторов, проявляющих свойства иногда межклеточных, а иногда внутриклеточных регуляторов. Это - N0, который вызывает расслабление гладкой мускулатуры венозных сосудов и регулирует процессы апоптоза, и ионы кальция, являющиеся фактором, регулирующим функции миокарда в условиях гипоксии и ишемии (В.Г.Нейлер, 1988; В.И. Кулинский, 1997).
Кальциевая система регуляции тесно связана с G-зависимой системой фос-фолипаз С, которые из фосфатидилинозитидов клеточных биомембран образуют два вторичных посредника: инозитол-3-фосфат и диацилглицерид, а из фосфати-дилхолина - только диацилглицерид. Инозитолтрифосфат увеличивает поступление в цигозоль кардиомиоцитов Са2+ - как внутриклеточного из саркоплазматиче-
ского ретикулума, так и межклеточного через медленные кальциевые каналы. Комплекс Са2+ с его рецептором кальмодулином активирует многие цитозольные ферменты либо прямо, либо через кальмодулиновую протеинкиназу. Диацилгли-церид при наличии Са2+ активирует протеинкиназу С. Таким образом, в этой системе функционируют три вторичных посредника, две протеинкиназы и кальмоду-лин. Ее стимуляция модулирует функции ионных каналов, способствует распаду гликогена, фосфолипидов и белка, активирует секрецию разных желез, выделение гормонов, вызывает сокращение гладких мышц и агрегацию тромбоцитов.
Нет сомнений, что сигнал-трансдукторных систем на самом деле гораздо больше. Так, в конце 1990-х гг. были открыты новые вторичные посредники: це-рамид, фосфатидная кислота, цАДФ (циклоаденозиндифосфат)-рибоза и 5'-АМФ (аденозинмонофосфат). Возможно, что изучение связанных с ними сигнал-трансдукторных систем сможет открыть новые перспективы регуляции лизосо-мальной активности.
Изложенные данные не исчерпывают возможных механизмов и уровней кальциевой регуляции. Регуляция кальциевого механизма осуществляется напрямую Са2+-мобилизующими факторами (сердечные гликозиды, катехоламины через альфа-1-адренорецепторы), либо косвенно - через цАМФ-зависимые факторы (ка-техоламины через бета-адренорецепторы, в частности нонахлазин, и глюкагон), а также Са2+-ограничивающими факторами (антагонисты кальция, и в частности -блокаторы кальциевых каналов),.
Общее для обоих механизмов (прямого и непрямого) - первичный регуля-торный сигнал в клетке возникает в рецепторах плазматической мембраны и затем трансдуцируется в изменение цитозольной концентрации вторичного мессендже-ра - Са2+ (и / или цАМФ).
Их влияние на лизосомы является вторичным - в результате воздействия на лизосомальную мембрану (действие на мембран-связанные лизосомальные фер-
менты) и проникновения через нее в матрикс - действие на растворимые матрикс-ные кислые гидролазы.
Конкретные механизмы этих процессов следующие: для Са2+ существует постоянный обмен через биомембраны: вход в матрикс лизосомы за счет энергии мембранного потенциала, и выход назад в саркоплазму в обмен на №+ или Н+ за счет энергии, связанной с различиями рН.
Рис. 8. Кальциевый механизм регуляции перераспределения активности ли-зосомальных ферментов миокарда.
При этом повышение концентрации Са2+ активирует как минимум три лизо-сомальных фермента миокарда - кислую фосфатазу, бета-галактозидазу и катеп-
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ
библиотека
С. Петербург Ф» М ю
син Б (табл. 1-9), сопровождаясь пропорциональным увеличением активности этих ферментов в сывортоке крови (рис. 5-7).
При достижении избытка Н+ внутри лизосом вход кальция ограничивается и активность лизосомальных ферментов снижается (А.В.Дмитриев, 2000).
В результате описанных процессов (рис. 8) цитозольный сигнал - изменение внутриклеточной и внутрилизосомальной концентрации Са2+ - трансдуцируется в лизосомальный ответ (Б.К.Романов, 2004), что и вызывает множественные изменения функций этих субклеточных частиц.
Необходимо обратить внимание на важную особенность: ионы Са2+ могут действовать не только через специализированные рецепторные белки типа каль-модулина, а возможно, прямо, как на лизосомальные ферменты как матрикса, так и лизосомальной мембраны. Возможно также участие в этом процессе еще не известного посредника. Это существенно отличается от классических механизмов, описанных для цитозоля эукариот. В то же время у прокариот нет обычных рецеп-торных белков (кальмодулина и протеинкиназы А) для ионов Са2+, а цАМФ действует через внутриклеточный цАМФ-рецепторный белок.
Эту аналогию можно рассматривать как еще один важный факт в пользу кальциевого механизма регуляции активности лизосомальных ферментов, как более универсального и стабильного по сравнению с циклазным.
В процессе эволюции это происходило разновременно: рецепторный белок цАМФ есть уже у дрожжей, а система транспорта Са2+ развивается только у позвоночных. В этом случае млекопитающие имеют наиболее широкие возможности для выбора метода регуляции функций лизосом: 1) выбор фактора регуляции ли-зосомальной активности, 2) выбор одного из его рецепторов, 3) выбор вторичного посредника
Вероятно, регуляция функций лизосом не ограничивается рассмотренными факторами воздействия и вторичными посредниками, поскольку: 1) как Са2+-
модифицирущих, так и цАМФ-зависимых регуляторов очень много; 2) биосинтезы (особенно матричные), ионный транспорт (особенно №+ и К*) и мышечная работа сердца - основные пути расхода энергии, поэтому их регуляторы должны стимулировать и энергообеспечение.
Очевидно, что обеспечить стабильную работу системы регуляции лизосо-мальной активности может только такая система, основной передатчик которой может дозозависимо работать в широком диапазоне условий (от физиологической нормы до терминальных состояний), не меняя при этом своих свойств.
Основываясь на характере полученных корреляционных отношений между концентрацией кальция и показателями функциональной активности лизосом миокарда в различных условиях (табл. 7-9), можно сделать предположение, что в максимальной степени этим условиям отвечает кальциевая система регуляции, являющаяся более стабильной по сравнению с системами цАМФ и цГМФ, но менее изученной, вследствие сложностей, связанных с определением чрезвычайно малых количеств внутриклеточных ионов кальция ^.Р^пшуав, 2002).
Универсальность кальциевой мессенджерной системы и ее максимальная эффективность по сравнению с другими системами в отношении регуляции состояния лизосомальных мембран (Ф.З.Меерсон, 1989; 8.Р.8гт1уав, 2002), создает предпосылки для лизосомотропного использования лекарственных средств, разнонаправленно изменяющих внутриклеточный уровень ионов кальция.
Поскольку при назначении блокаторов кальциевых каналов - верапамила и дилтиазема в эффективных дозах, приводящих к статистически значимому снижению ионов кальция в ткани миокарда (на 10,3-12,2% при назначении верапамила, и на 6,4% при назначении дилтиазема), изменение уровня ионов Са2+ в высокой степени коррелирует с изменением темпов перехода активности лизосомальных ферментов в неседиментируемую фракцию, изменением степени стабильности ли-зосомальных мембран и общей активностью кислых гидролаз в крови (рис. 5-7).
Указанные обстоятельства позволяют сделать предположение об активном участии кальциевого механизма в активации лизосомального аппарата. Избыточное накопление кальция вследствие активации фосфолипаз и процессов перекис-ного окисления липидов, может приводить к дестабилизации лизосомальных мембран и выходу в цитозоль кислых гидролаз, в том числе протеиназ и липаз, усугубляющих повреждение клеточных мембран.
Таким образом, можно сделать заключение, что поступление в клетки кальция сопровождается высвобождением лизосомальных ферментов. Изменение кальцийрегулирующими лекарственными средствами активности лизосомального аппарата в миокарде может быть опосредовано их влиянием на три процесса:
1) На депонирование кальция в саркоплазматическом ретикулуме;
2) На депонирование кальция в митохондриях и в самих лизосомах;
3) На транспорт кальция по потенциалзависимым медленным каналам.
Саркоплазматический ретикулум содержит два варианта кальциевых депо -
продольные и терминальные цистерны, контактирующие с цистернами Т-системы кардиомиоцитов. 90% белковых компонентов мембраны сар ко плазматического ретикулума приходится на Са2+-АТФазу, остальные 10% белков представлены кальциевыми каналами. Са2+-АТФаза, регулируемая протеолипидом фосфоламба-ном, закачивает кальций в ретикулум. В ретикулуме кальций связывается с белками - кальсеквестрином и Са2+-связывающим белком, расположенными рядом с Са2+-каналами. При активации Са2+-канала происходит увеличение размеров его фильтрующего участка от 0,35 до 0,37 нм, что обеспечивает быстрый (50-300 мс) выход ионов кальция в цитоплазму. Соединения, окисляющие и алкилирующие SH-группы белков, образующих кальциевый канал, вызывают активное удаление кальция из депо. К лекарственным средствам, увеличивающим уровень ионов кальция в кардиомиоцитах за счет выброса его из саркоплазматического ретику-лума, относятся сердечные гликозиды (N.S.Dhalla, 1987; A.R.Kumar, 2001).
Митохондрии и лизосомы способны депонировать физиологически избыточное количество ионов кальция. В свою очередь, эти органеллы расположены в клетке именно в тех ее частях, где наиболее активно происходят локальные изменения концентрации кальция. Кальцийдепонирующая система митохондрий и ли-зосом неактивна при физиологическом уровне кальция в цитозоле (0,2-1,0 мкМ), но при повышении его уровня способна быстро удалить избыток ионов кальция. Быстрое удаление кальция из митохондрий и лизосом происходит в результате формирования во внутренней мембране митохондрий и в одинарной мембране ли-зосом неселективных пор (РТР), проницаемых для низкомолекулярных веществ, в том числе и для кальция. Поры образуются под действием фермента пролил-цис-транс-изомеразы. Этот фермент может быть заблокирован, что будет препятствать выходу кальция ^^аввоп, 1995).
Возможно, что топически первый этап механизма регуляции лизосомальной активности миокарда реализован именно на данном этапе кальциевого транспорта.
Внеклеточные ионы кальция поступают в цитозоль по кальциевым каналам двух типов: потенциалзависимым и рецепторуправляемым (З^шввоп, 1995)..
Потенциалзависимые Са2+-каналы находятся в плазматической мембране биоэлектрически активных клеток (нейроны, миокард, скелетные и гладкие мышцы). Они активируются только при деполяризации, обеспечивая кратковременное поступление кальция в клетку.
Рецепторуправляемые Са2+-каналы обеспечивают длительное поступление ионов кальция в клетку. Они выявлены в клетках, не обладающих способностью к формированию биоэлектрического потенциала, и связаны с мембранными рецепторами гормонов, цитокинов и нейротрансмиттеров. Различают три типа рецеп-торуправляемых каналов: 1) Са2+-канал и рецептор образованы одним молекулярным комплексом, кинетические свойства канала определяются структурной орга-
низацией рецептора, 2) Са2+-каналы и рецепторы объединены небелковым посредником, 3) Са2+-канал и рецептор связаны G-белком (Н.Таррег, 2002).
Са2+-каналы 2-го типа взаимодействуют с кальцийдепонирующими органел-лами посредством водорастворимого вторичного посредника ^Ш), стабилизируемого циклоспорином А и антимикотическими азолами (клотримазол и др.). Са2+-каналы 3-го типа управляются G-белком, индуцирующим образование инозитол-1,4,5-трифосфата, который стимулирует выход в цитозоль ионов кальция из эндо-плазматического ретикулума (J.A.Baгnes, 2002).
Можно предположить, что механизм реализации второго (посттранспортного) этапа кальциевой регуляции активности лизосомального аппарата может быть связан с тем, что изменение концентрации ионов кальция в цитоплазме кардио-миоцитов, и, как следствие этого - во внутреннем компартменте лизосом (через РТР-поры) приводит к изменению активности катепсинов, например, катепсина D (J.A.Baгnes, 2002).
По всей видимости, именно катепсины изменяют интенсивность ограниченного протеолиза лизосомальных мембран, и могут не только регулировать степень высвобождения кислых гидролаз из связи с мембранами, но и определяют активность матриксных ферментов, таких, как в-галактозидаза, а также ферментов, имеющих смешанную (мембранно-матриксную) локализацию, например, кислой ДНК-азы и кислой фосфатазы.
Изменяя кальцийрегулирующими лекарственными средствами уровень внутриклеточного кальция, можно обратимо изменять степень проницаемости ли-зосомальных мембран для мембраносвязанных и матриксных кислых гидролаз.
Учитывая то, что эффекты кальциевой регуляции активности лизосомаль-ных ферментов миокарда могут являться ключевым фактором, участвующими в обеспечении сохранения жизнеспособности тканей сердца в условиях патологии -дефицита кислорода и т.д., метаболические эффекты лекарственных средств,
уменьшающих уровень ионизированного кальция в цитоплазме (антагонистов кальция) могут быть использованы для увеличения продолжительности периода времени, в течение которого жизнеспособность тканей миокарда при инфаркте может быть сохранена без наступления необратимых изменений.
Выводы
1. Концентрация ионов кальция в кардиомиоцитах положительно коррелирует с коэффициентом лабильности мембранно-матриксных и матриксных лизо-сомальных ферментов миокарда в условиях гипоксии, ишемии и дислипидемии.
2. Острая гипобарическая гипоксия с последующей реоксигенацией увеличивает содержание ионизированного кальция в кардиомиоцитах, что сопровождается перераспределением активности кислых гидролаз миокарда в пользу неосаж-даемой фракции.
3. Прекращение поступления кислорода в миокард приводит к увеличению концентрации ионов кальция в саркоплазме кардиомиоцитов вплоть до 45 минуты острой тотальной ишемии сердца.
4. Острая ишемия миокарда подавляет общую активность кислых гидролаз миокарда, перераспределяя ее в пользу неседиментируемой фракции в период с 15 по 30 минуту кислородного голодания.
5. Дислипидемия не изменяет кинетику кислых гидролаз миокарда при назначении кальцийрегулирующих средств на фоне гипоксии и ишемии миокарда.
6. Общая активность кислой фосфатазы, бета-галактозидазы и катепсина D в сыворотке крови при гипоксии положительно коррелирует с уровнем ионов кальция в миокарде и коэффициентом лабильности этих ферментов в кардиомио-цитах, и может являться диагностическим и прогностическим критерием при комплексной оценке тяжести и динамики патологического процесса.
7. Дозозависимое увеличение концентрации ионизированного кальция в кардиомиоцитах ускоряет необратимый переход общей активности лизосомаль-ных ферментов в неседиментируемую фракцию.
8. Медикаментозное ограничение накопления ионов кальция в кардиомио-цитах является фактором регуляции активности лизосомальных ферментов - кислой фосфатазы, бета-галактозидазы и катепсина Б в условиях экспериментальной патологии сердца.
Практические рекомендации
1. Определение активности кислой фосфатазы, бета-галактозидазы и катепсина Б в сыворотке крови может быть использовано в качестве лабораторно-диагностического критерия комплексной оценки динамики активности лизосо-мальных ферментов в миокарде.
2. Для регуляции процесса перехода активности кислой фосфатазы, р-галактозидазы и катепсина Б в неседиментируемую фракцию у экспериментальных животных (белые крысы) в условиях нормоксии, острой гипоксической гипоксии, острой тотальной ишемии миокарда и экспериментальной дислипидемии, возможно использование кальцийрегулирующих кардиотропных лекарственных средств, разнонаправленно изменяющих содержание ионизированного кальция в саркоплазме кардиомиоцитов:
а) Антагонистов кальция (блокаторов потенциал- зависимых кальциевых каналов), снижающих содержание ионизированного кальция в миокарде и уменьшающих коэффициент лабильности кислых гидролаз :
- верапамил - однократное пероральное введение в виде суспензии в дозе 10 мг/кг или однократное внутримышечное введение в дозе 1 мг/кг за 8 часов до исследования;
- дилтиазем - однократное пероральное введение в виде суспензии в дозе 4 мг/кг за 8 часов до исследования.
б) Средств, увеличивающих содержание ионизированного кальция в миокарде и увеличивающих коэффициент лабильности кислых гидролаз:
- дигоксин - однократное пероральное введение в виде суспензии в дозе 5 мг/кг или однократное внутримышечное введение в дозе 2,5 мг/кг за 8 часов до исследования;
- нонахлазин (азаклорзин) - однократное пероральное введение в виде суспензии в дозе 2 мг/кг за 8 часов до исследования.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Влияние ланикора и верапамила на уровень эндогенного карнитина и активность лизосомальных ферментов при гипоксической гипоксии // Фармация и фармакология: Тез. докл. Междунар. науч.-практ. конф. (Пермь, 19-21 апреля 1993 г.).- Пермь, 1993.- С.98.- (Совм.с: В.Г.Макарова, К.В.Савилов).
2. Влияние верапамила на активность лизосомального аппарата миокарда при гипоксической гипоксии // Пути формирования и коррекции физического состояния организма: Сб. науч. тр. Ряз. ГМУ.- Рязань, 1994.-Т.2.- С.80-82.
3. Возможности фармакологической регуляции активности лизосомаль-ного аппарата миокарда при гипоксической гипоксии / Рязан. гос. мед. ун-т им. акад. И.П.Павлова. М, 1994. - 10 с- Деп. в ВИНИТИ 02.02.94, 302-В94.
4. Изменение активности лизосомальных ферментов миокарда крыс при гипоксии на фоне действия верапамила / Рязан. гос. мед. ун-т им. акад. И.П.Павлова. М., 1994. - 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 02.02.94, 303-В94.
5. Блокада кальциевых каналов кардиомиоцитов, как возможный фактор, предупреждающий повреждение лизосомального аппарата в условиях острой ги-побарической гипоксической гипоксии // Современные аспекты экспериментальной и клинической фармакотерапии: Сб. науч. тр.- Рязань, 1996. - С. 26-28.-(Совм.с: В.Г.Макарова).
6. Новое направление фармакологической коррекции токсического поражения // Современные аспекты экспериментальной и клинической фармакотерапии: Сб. науч. тр.- Рязань, 1996. - С. 78-79. - (Совм.с: В.Г.Макарова, В.В.Орлов,
A.В.Беляев).
7. Перспективы применения методов биологической терапии в кардиологии // Современные аспекты экспериментальной и клинической фармакотерапии: Сб. науч. тр.- Рязань, 1996. - С. 38-39. - (Совм.с: С.В.Романова).
8. Влияние верапамила, дилтиазема, дигоксина и азаклорзина на активность лизосомальных ферментов и пероксидный статус при острой гипоксии, острой тотальной ишемии миокарда и экспериментальной дислипидемии // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Материалы Все-росс. науч. конф. с Междунар. участием (Санкт-Петербург, 2-5 июня 1999 г.).-СПб., 1999.-С. 130-131.
9. Влияние верапамила и нифедипина на содержание кальция в миокарде крыс при острой гипоксии // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Материалы Всеросс. науч. конф. с Междунар. участием (Санкт-Петербург, 2-5 июня 1999 г.).- СПб., 1999. - С. 130. - (Совм.с
B.Г.Макарова, К.В.Савилов).
10. Методика оценки активности лизосомальных ферментов миокарда // Проблемы экологии и развития пчеловодства в России: Материалы науч.-практ. конф. Росс. Акад. с/х наук (Рыбное, 25-27 августа 1999 года).- Рыбное, 1999. - С. 28.
11. Пробоподготовка гомогената миокарда для биохимического исследования // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Материалы Всеросс. науч. конф. с Междунар. участием (Санкт-Петербург, 2-5 июня 1999 г.).- СПб., 1999. - С.130-131.
12. Экспериментальное моделирование острой гипоксической гипоксии, острой тотальной ишемии миокарда и экспериментальной дислипидемии на белых крысах-самцах // Проблемы экологии и развития пчеловодства в России: Материалы науч.-практ. конф. Росс. Акад. с/х наук (Рыбное, 25-27 августа 1999 года).-Рыбное, 1999.-С. 27.
13. Влияние блокатора кальциевых каналов верапамила на активность ли-зосомальных ферментов миокарда при гипоксической гипоксии. // Биохимия на рубеже XXI века: Межрегион, сб. науч. тр. / Отв.ред.проф.В.Г.Макарова.- Рязань, 2000.- С. 95-97.- (Соавт.: А.И.Лобанова).
14. Влияние верапамила на активность лизосомальных ферментов при гипоксической гипоксии // Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний: Тез. докл. науч. конф. с Междунар. участием.- СПб., 2000. - С. 560. - (Совм.с В.Г.Макарова, Л.Г.Чугунова).
15. Фармакологическая регуляция активности лизосомальных ферментов (обзор литературы) // Биохимия на рубеже XXI века: Межрегион, сб. науч. тр./ Отв.ред.проф.В.Г.Макарова.- Рязань, 2000.- С. 55-59. - (Совм.с В.Г.Макарова, А.ИЛобанова, А.К.Пунякин).
16. Анализ кардиотропных лекарственных средств методом градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии // Актуальные вопросы здоровья населения Центра России: Сб. научн. тр. РязГМУ.- Рязань, 2000.- С. 50-52. -(Совм.с: В.Г.Макарова, Т.А.Кузьмина).
17. Активность лизосомальных ферментов в миокарде крыс при острой гипоксической гипоксии // Человек и лекарство: Тез.докл. VIII Росс. Нац. конгр. (Москва, 2-6 апреля 2001 г.).- М., 2001. - С. 468.
18. Активность лизосомальных ферментов в миокарде крыс при острой тотальной ишемии миокарда // Человек и лекарство: Тез.докл. VIII Росс. Нац. конгр. (Москва, 2-6 апреля 2001 г.).- М., 2001. - С. 468.
19. Активность ПОЛ в миокарде крыс при экспериментальной дислипи-демии // Человек и лекарство: Тез.докл. VIII Росс. Нац. конгр. (Москва, 2-6 апреля 2001 г.).-М., 2001,-С. 468.
20. Activity of lysosomal enzymes and their inhibitors in experimental myocardial ischemia//Learning Perspective. (New Delhi).- 2001.-Vol. 1. Is.5. - P. 2
21. Effects of calcium on lysosomal activity // Learning Perspective. (New Delhi).-2001.-Vol. l.Is.6.-P. 2
22. Влияние кальцийрегулирующих лекарственных средств на активность лизосомальных ферментов миокарда // Росс, медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова.- 2002.- № 3-4.- С.12-19. - (Совм.с: В.Г.Макарова).
23. Лекарственная регуляция лизосомальной активности ишемизирован-ного миокарда // Росс. мед. журн.-2002.-№ 6. - С. 36-39.
24. Методика определения активности кислых гидролаз // Росс, медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова.- 2002.- № 3-4.- С. 130-131. - (Совм.с: В.Г.Макарова).
25. Ca-dependent regulation of lysosomal in rats hearts // Learning Perspective. (New Delhi).- 2002.- Vol. 2. Is.4. - P. 2.
26. Global Progressive Pathways // Learning Perspective. (New Delhi).- 2002.-Vol. 2. Is.4. - P. 6
27. Лекарственная регуляция активности лизосомальных ферментов миокарда // Росс, медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова.- 2003.- № 1-2.- С.75-82.
28. Регуляция лизосомальной активности миокарда // Росс, медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова.- 2003.-№ 1-2.- С.174-183.
29. Активность лизосомальных ферментов - новый диагностический и прогностический критерий оценки степени повреждения кардиомиоцитов // Росс, медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова.- 2004,- № 1-2.- С. 155-163.
30. Кардиотропные антиишемические (антиангинальные) лекарственные средства// Росс, медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова.- 2004.- № 1-2,- С. 186192.
31. Методика количественного определения кардиотропных средств в кардиомиоцитах и в крови методом проточно-инъекционного анализа // Росс, ме-дико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова.- 2004.- № 1-2.- С. 128-132.
Учебно-методические работы:
32. Лекарственные средства, регулирующие функции исполнительных органов и систем / Под ред. д.м.н., проф. В.Г. Макаровой.- Рязань: «Инф. технологии», 1999. - 34 с. - (Соавт.: Д.Г.Узбекова, Е.Н.Якушева, М.В.Семенченко).
33. Лекарственные средства, влияющие на функции исполнительных органов и систем / Под ред. д.м.н., проф. В.Г. Макаровой.- Рязань: Рязмедуниверси-тет, 2000. - 64 с. - (Соав.: Д.Г.Узбекова, Е.Н.Якушева, М.В.Семенченко).
34. Кардиотонические средства // Фармакология: Учеб.для вузов / Под ред. д.м.н., проф. Р.Н.Аляутдина. - М., 2004: - Гл.18.- С. 262-269.
35. Антиаритмические средства // Фармакология: Учеб.для вузов / Под ред. д.м.н., проф. Р.Н.Аляутдина. - М., 2004: - Гл.19.- С. 270-280.
36. Средства, применяемые при недостаточности коронарного кровообращения // Фармакология: Учеб.для вузов / Под ред. д.м.н., проф. Р.Н.Аляутдина. - М., 2004: - Гл.20.- С. 281-292.
122
Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Романов, Борис Константинович
Основные условные обозначения и сокращения
Введение .—.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .-.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Экспериментальные модели.—.
Модель острой гипоксической гипоксии.
Модель острой тотальной ишемии миокарда.
Модель экспериментальной гиперлипидемии
2.2. Средства разнонаправленной модуляции Са баланса —
2.3. Биохимические методы исследования.
2.3.1. Пробоподготовка крови и гомогената миокарда.
Пробоподготовка крови.
Получение исходного гомогентата миокарда.
Получение безъядерного гомогената миокарда
Получение лизосомально-митохондриальной фракции
2.3.2. Определение активности лизосомальных ферментов
2.3.3. Количественный анализ Са2+-регулирующих средств
2.3.4. Определение уровня кальция в крови и в миокарде
2.3.5. Анализ газового состава, липидного баланса крови и ПОЛ
Анализ газового состава (рОг и рСОг) крови
Определение концентрации малонового диальдегида
Определение показателей липидного обмена
2.4. Статистические методы анализа.
Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ
3.1. Влияние кальций-регулирующих лекарственных средств на показатели активности лизосомальных ферментов миокарда белых крыс в условиях нормоксии.
3.2. Влияние кальций-регулирующих лекарственных средств на показатели активности лизосомальных ферментов миокарда белых крыс при острой гипоксической гипоксии
3.3. Влияние кальций-регулирующих лекарственных средств на показатели активности лизосомальных ферментов миокарда белых крыс при острой тотальной ишемии
3.4. Влияние кальций-регулирующих лекарственных средств на показатели активности лизосомальных ферментов миокарда белых крыс при экспериментальной дислипидемии и при острой гипоксической гипоксии на фоне экспериментальной дислипидемии.
3.5. Влияние кальций-регулирующих лекарственных средств на показатели активности лизосомальных ферментов миокарда белых крыс при острой тотальной ишемии на фоне экспериментальной дислипидемии
Таблицы.
Диаграммы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Кальциевая регуляция активности лизосомальных ферментов миокарда"
Актуальность проблемы
В 1955 году бельгийский биохимик Кристиан де Дюв обнаружил парадоксальный факт увеличения ферментативной активности в размороженных гомогенатах тканей. Изучение этого феномена легло в основу открытия нового вида органелл, впервые выявленных не морфологическими, а биохимическими методами исследования - лизосом (De Duve С., 1966).
Лизосомальные ферменты - это энзимы класса гидролаз, оптимум рН которых составляет 3,6-5,0 ("кислые гидролазы"), имеющие терминальный ман-нозный остаток, фосфорилированный по С-6 положению. Специфичные для маннозо-6-фосфата рецепторы мембран аппарата Гольджи селективно связывают такие гидролазы, а белок клатрин окружает их однослойными мембранными фрагментами, содержащими АТФ-зависимые протонные насосы, закисляющими матрикс образующихся лизосом (Дмитриев А.В., 2000).
Основная функция кислых гидролаз - внутриклеточная деградация биомакромолекул, клеточных компонентов и бактерий (Тутельян В.А., 1990).
Методы изучения лизосом были впервые систематизированы в фундаментальных трудах отечественных и зарубежных биохимиков (Покровский А.А., 1976; Дин Р., 1981).
Эти работы определили методическую базу для решения важных проблем, связанных с регуляцией лизосомальной активности при нарушениях синтеза и секреции лизосомальных ферментов в клетках печени - гепатоцитах. Значительный вклад в решение этих проблем был сделан отечественными исследователями (Покровский А.А., 1968; Макарова В.Г., 1978; Коровкин Б.Ф., 1982).
Проблема эффективной регуляции активности лизосомальных ферментов миокарда при таких тяжелых и распространенных патологических состояниях, как гипоксия, реоксигенация и ишемия, в том числе на фоне дислипидемии, стала исследоваться только в последние годы (Сергеев П.В., 1991; Сысолятина Н.А., 1991; Романов Б.К., 1994; Винокурова Е.Н., 1998;Lacave R., 1999).
Это связано с тем, что повреждение лизосомального аппарата миокарда длительное время считалось неуправляемым и необратимым процессом (Decker R.S., 1980; Нейлер В.Г., 1988).
Разрыв мембран лизосом возникает при многих патологических процессах в миокарде, определяя степень их тяжести и исход, но острые кислород-дефицитные состояния являются наиболее мощными факторами активации лизосомального аппарата, приводящими к необратимым повреждениям кар-диомиоцитов (Макарова В.Г., 1978; Wattiaux R., 1984; Маянская Н.Н., 1988; Романов Б.К., 1994; Винокурова Е.Н., 1998; Фомина В.А., 2000).
При этих состояниях накопление недоокисленных продуктов и продуктов реперфузионной липопероксидации приводит к образованию аномальных водородных связей между фосфолипидами биомембран (Фомина В.А., 2000).
Изменения в структуре лизосомальной мембраны ведут к ее разрыву и к массивному выходу лизосомальных ферментов в цитоплазму, что сопровождается аутолизом тканей - инфарктом (Дмитриев А.В., 2000; Романов Б.К., 2004).
Повреждение ткани миокарда лизосомальными ферментами обуславливает необратимый характер нарушений в кардиомиоцитах уже к 30-40 минуте полной ишемии.
Реоксигенация миокарда и увеличение пула свободных жирных кислот в эти сроки приводит к длительному сохранению общей активности лизосомальных ферментов, и ее полному переходу в неседиментируемую фракцию, усугубляя процессы аутолиза (Reimer К.А., 1981; Ольбинская Л.И., 1986).
Уровень смертности от инфаркта миокарда в 2002 году достиг в России показателя 800 умерших на 100.000 населения, а смертность от сердечнососудистых заболеваний в целом превысила 50% от общего числа причин смерти.
Эти совершенно неудовлетворительные показатели могут быть связаны в том числе и с тем, что используемые в настоящее время методы хирургического и лекарственного (антиангинального) лечения и профилактики ишемии направлены только на восстановление кровотока и на снижение кислородного запроса миокарда, а имеющиеся методы метаболической терапии, направленные на усиление антиоксидантной защиты с целью профилактики водородных сшивок фосфолипидов лизосомальных мембран оказались эффективными только в условиях эксперимента и имеют вспомогательное значение в комплексе лечебных мероприятий (ГацураВ.В., 1993; Фомина В.А., 2000; Романов Б.К., 2004).
Поиск эффективных методов коррекции катаболической активности ли-зосом, способных замедлить или даже предотвратить развитие инфаркта миокарда, особенно актуально для Российской Федерации и других стран с ограниченными возможностями в области коронарной хирургии, но сдерживается отсутствием теоретической базы, способной ограничить поисковый скрининг областью эффективных и стабильных механизмов регуляции активности лизосомальных ферментов кардиомиоцитов (Винокурова Е.Н., 1998; Романов Б.К., 2004).
Исследования механизмов регуляции активности кислых гидролаз миокарда начались в 1980 г., и ведущим направлением вскоре стало изучение цик-лазной системы с методически доступным в то время количественным анализом уровня цАМФ в качестве мессенджера для гормональных и адренергиче-ских воздействий (Коровкин Б.Ф., 1982; Панченко Г.А., 1987; Додонова Н.А., 1988; Кан A.M., 1991), при этом в качестве регуляторов лизосомальной активности использовались адренергические лекарственные вещества (Сысолятина Н.А., 1991).
Результаты этих исследования подтвердили участие циклазных процессов в регуляции стабильности лизосомальных мембран и ферментативной активности лизосом, однако были показаны и ограничения в возможностях peaлизации этого механизма, очерченные границами физиологических условий и начальными этапами процесса повреждения (Сергеев П.В., 1991; Сысолятина Н.А., 1991).
За пределами этих границ циклазная система регуляции лизосом начинала вести себя нестабильно, очевидно вследствие повреждения ферментных систем синтеза и деградации цАМФ, и поэтому не могла использоваться в качестве "инструмента" для предупреждения разрыва лизосомальных мембран в ус-ловях тяжелой патологии миокарда (Сергеев П.В., 1995).
В 1988 году было сделано предположение о ключевой роли ионов кальция в процессе регуляции лизосомальной активности (Нейлер В.Г., 1988).
Результаты первых исследований кальциевого механизма регуляции активности лизосомальных ферментов миокарда показали перспективность этого направления (Романов Б.К., 1994; Винокурова Е.Н., 1998), а появление необходимых биохимических методов исследования в этой области за последнее десятилетие - (проточно-инъекционный анализ ферментативной кинетики, метаболитов и ксенобиотиков в кардиомиоцитах и в сыворотке крови) создало реальные предпосылки к решению этой актуальной проблемы.
Цель работы.
Решение проблемы стабилизации лизосомальных мембран миокарда посредством кальциевого механизма регуляции активности лизосомальных ферментов.
Задачи исследования.
1. Установление наличия и характера корреляционной связи между уровнем ионизированного кальция в саркоплазме кардиомиоцитов с показателями активности лизосомальных ферментов миокарда в условиях нормоксии, и при постгипоксической реоксигенации, ишемии миокарда и дислипидемии.
2. Оценка влияния гипоксической гипоксии и последующей реоксигенации на содержание общего и ионизированного кальция в кардиомиоцитах и в сыворотке крови, и на показатели активности кислой фосфатазы, бета-галактозидазы и катепсина D в миокарде и сыворотке крови.
3. Изучение влияния острой тяжелой ишемии миокарда на содержание общего и ионизированного кальция в кардиомиоцитах и в сыворотке крови, и на показатели активности лизосомальных ферментов в миокарде и сыворотке крови.
4. Исследование динамики перераспределения показателей активности лизосомальных ферментов миокарда при острой ишемии миокарда.
5. Оценка влияния экпериментальной дислипидемии на кинетику лизосомальных ферментов миокарда при острой тяжелой ишемии миокарда и на возможности кальциевого механизма регуляции их активности.
6. Установление наличия и характера корреляционной связи между показателями активности лизосомальных ферментов миокарда и биохимическими показателями оценки его функционального состояния в условиях патологии.
7. Выявление возможностей взаимодействия дозозависимой кальциевой модуляции с циклазным механизмом стабилизации лизосомальных мембран.
8. Оценка стабильности кальциевого механизма регуляции активности лизосомальных ферментов миокарда в условиях экспериментальной патологии.
Научная новизна.
Впервые изучено влияние Са2-регулирующих средств - верапамила, дилтиазема, дигоксина и азаклорзина на общую, неосаждаемую активность и коэффициент лабильности кислой фосфатазы, Р-галактозидазы и катепсина D в ткани миокарда, и общую активность этих ферментов в сыворотке крови.
Уточнено влияние Са -регулирующих средств на кальциевый пул в сыворотке крови и в кардиомиоцитах.
Впервые определены параметры лизосомальной активности миокарда в связи с изменениями уровня ионизированного кальция в миокарде при нор-моксии, гипоксии, ишемии миокарда и дислипидемии.
Уточнены биохимические показатели газового и липидного состава крови и уровень малонового диальдегида в крови и в миокарде белых крыс в норме и при экспериментальной патологии сердечно-сосудистой системы, как контрольные параметры оценки степени тяжести патологии.
Впервые установлена положительная корреляционная связь между уровнем ионизированного кальция в миокаде и коэффициентом лабильности лизосомальных кислых гидролаз в ткани миокарда и в сыворотке крови.
Впервые удалось показать наличие корреляционной связи между состоянием лизосомального аппарата и интенсивностью перекисного окисления липидов.
Показана временная динамика активности лизосомальных ферментов миокарда и стабильности лизосомальных мембран поврежденного тотальной ишемией миокарда и влияние на эту динамику Са -регулирующих лекарственных средств.
Впервые оценен количественный эффект Са -регулирующих средств на активность лизосомального аппарата миокарда, свидетельствующий о целесообразности использования в качестве метода ограничения лизосомальной активности кальциевого механизма регуляции по сравнению с циклазным.
Полученные результаты свидетельствуют о важной роли ионов кальция в опосредовании эффектов влияния антагонистов кальция и кардиотониче-ских средств на функциональную активность лизосом миокарда, в частности, на активность лизосомальных ферментов и стабильность лизосомальных мембран.
Научно-практическая значимость.
Результаты исследования позволяют решить актуальную для биохимии проблему стабилизации лизосомальных мембран миокарда посредством кальциевого механизма регуляции активности лизосомальных ферментов.
Разработка представления о роли кальциевого механизма регуляции функциональной активности кислых гидролаз в миокарде, как об эффективной дозозависимой системе будет способствовать направленному поиску оптимальных регуляторов уровня кальция в клетке в качестве лекарственных средств для ограничения аутолиза кардиомиоцитов при тяжелых формах часто встречающейся сердечно-сосудистой патологии.
Факт обнаружения положительной корреляционной взаимосвязи между уровнем ионизированного кальция и неседиментируемой активностью лизосомальных ферментов может стать отправной точкой для поиска возможных связей между этим мессенджером и другими, возможно еще более эффективными факторами регуляции лизосомальной активности.
Результаты исследования используются в лечебно-диагностическом процессе в Центральной Клинической Больнице Медицинского Центра Управления делами Президента России, в учебном процессе на кафедре биологической и биоорганической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова», и на кафедре фармакологии факультета фундаментальной медицины Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова в качестве примеров новых биохимических методов оценки динамики и степени завершенности патологического процесса, а также эффективности проводимой лекарственной терапии.
Апробация работы.
Материалы диссертации были доложены на Международной научно-практической конференции «Фармация и фармакология»» (Пермь, 1993 г.); на Российской конференции "Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы" (Санкт-Петербург, 1994 г.); на 5-м национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1995 г.); на конференции «Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов» (Рязань, 1995); на 1-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 1995 г.); на 8 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1998 г.); на всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Санкт-Петербург, 1999); на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001 г.); на тренинге учебного центра для создателей новых лекарственных средств (Нью-Дели, Индия, 2002).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ, в том числе 5 учебно-методических работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 279 страницах машинописного текста и состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания методов исследования, данных собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 273 источника литературы, в том числе 171 источник отечественной и 102 источника зарубежной литературы.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Романов, Борис Константинович
ВЫВОДЫ
1. Концентрация ионов кальция в кардиомиоцитах положительно коррелирует с коэффициентом лабильности мембранно-матриксных и матриксных лизосомальных ферментов миокарда в условиях гипоксии, ишемии и дислипидемии.
2. Острая гипобарическая гипоксия с последующей реоксигенацией увеличивает содержание ионизированного кальция в кардиомиоцитах, что сопровождается перераспределением активности кислых гидролаз миокарда в пользу неосаждаемой фракции.
3. Прекращение поступления кислорода в миокард приводит к увеличению концентрации ионов кальция в саркоплазме кардиомиоцитов вплоть до 45 минуты острой тотальной ишемии сердца.
4. Острая ишемия миокарда подавляет общую активность кислых гидролаз миокарда, перераспределяя ее в пользу неседиментируемой фракции в период с 15 по 30 минуту кислородного голодания.
5. Дислипидемия не изменяет кинетику кислых гидролаз миокарда при назначении кальцийрегулирующих средств на фоне гипоксии и ишемии миокарда.
6. Общая активность кислой фосфатазы, бета-галактозидазы и катепсина D в сыворотке крови при гипоксии положительно коррелирует с уровнем ионов кальция в миокарде и коэффициентом лабильности этих ферментов в кардиомиоцитах, и может являться диагностическим и прогностическим критерием при комплексной оценке тяжести и динамики патологического процесса.
7. Дозозависимое увеличение концентрации ионизированного кальция в кардиомиоцитах ускоряет необратимый переход общей активности лизосомальных ферментов в неседиментируемую фракцию.
8. Медикаментозное ограничение накопления ионов кальция в кардиомиоцитах является фактором регуляции активности лизосомальных ферментов - кислой фосфатазы, бета-галактозидазы и катепсина D в условиях экспериментальной патологии сердца.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Определение активности кислой фосфатазы, бета-галактозидазы и катепсина D в сыворотке крови может быть использовано в качестве лабораторно-диагностического критерия комплексной оценки динамики активности лизосомальных ферментов в миокарде.
2. Для регуляции процесса перехода активности кислой фосфатазы, Р-галактозидазы и катепсина D в неседиментируемую фракцию у экспериментальных животных (белые крысы) в условиях нормоксии, острой гипоксической гипоксии, острой тотальной ишемии миокарда и экспериментальной дислипидемии, возможно использование кальцийрегулирующих кардиотропных лекарственных средств, разнонаправленно изменяющих содержание ионизированного кальция в саркоплазме кардиомиоцитов: а) Антагонистов кальция (блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов), снижающих содержание ионизированного кальция в миокарде и уменьшающих коэффициент лабильности кислых гидролаз :
- верапамил - однократное пероральное введение в виде суспензии в дозе 10 мг/кг или однократное внутримышечное введение в дозе 1 мг/кг за 8 часов до исследования;
- дилтиазем - однократное пероральное введение в виде суспензии в дозе 4 мг/кг за 8 часов до исследования. б) Средств, увеличивающих содержание ионизированного кальция в миокарде и увеличивающих коэффициент лабильности кислых гидролаз
- дигоксин - однократное пероральное введение в виде суспензии в дозе 5 мг/кг или однократное внутримышечное введение в дозе 2,5 мг/кг за 8 часов до исследования;
- нонахлазин (азаклорзин) - однократное пероральное введение в виде суспензии в дозе 2 мг/кг за 8 часов до исследования.
Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Романов, Борис Константинович, Рязань
1. Агаджанян Н.А. Функции организма в условиях гипоксии и гиперкап-нии / Н.А. Агаджанян, А.И. Елфимов. - М.: Медицина, 1986. - 272 с.
2. Алиев М.А. Адаптационно-электролитные изменения в условиях горной экосреды (1600-3200 м.) / М.А.Алиев, Г.А.Захаров // 4-я конференция физиологов республик Средней Азии и Казахстана. Алма-Ата, 1976. -С. 163-164.
3. Амиров Н.Ш. Активность лизосомальных ферментов слизистой оболочки желудка у крыс при экспериментальном язвообразовании / Н.Ш.Амиров, Н.И.Белостоцкий // Бюл. эксперим. биологии и медицины.- 1987. Т. 104, N 10. - С. 445-447.
4. Антипенко А.Е. Метаболизм миокарда при различных функциональных состояниях / А.Е.Антипенко, М.И.Калинский, С.Н. Лызлова. Екатеринбург, 1992. - 216 с.
5. Антонова И.Н. Адаптация к прерывистой гипоксии как фактор повышения стабильности клеточных мембран / И.Н.Антонова, М.М. Середенко // Hypoxia Medical J. 1994. - N 2. - С. 44.
6. Артемьева Г.Б. Антиоксидантное действие пармидина при атеросклерозе / Г.Б.Артемьева, Д.Р.Ракита, В.Я.Гармаш // Биооксиданты: Тез.Докл. III Всесоюз.конф.-М., 1989.-Т.2.-С.114.
7. Артемьева Г.Б. Коррекция пармидином процессов липопероксидации у больных ИБС / Г.Б.Артемьева // Ишемическая болезнь сердца и артериальные гипертензии. Рязань, 1992.-С.98-102.
8. Архипенко Ю.В. Влияние адаптации к периодической гипоксии на Са -насос саркоплазматического ретикулума сердца и его устойчивость кэндогенным повреждающим факторам / Ю.В.Архипенко, Т.Г.Сазонтова, И.И.Рожицкая // Кардиология. 1992.-Т. 32, N 6. - С. 57-59.
9. Архипова О.Г. Методы исследования в профпатологии: Руководство для врачей / О.Г.Архипова. М.: Медицина, 1988. - С. 120-121.
10. Бабков В.Я. Нарушение метаболизма коллагена и проницаемости лизосомальных мембран при сахарном диабете и попытка их коррекции / В.Я.Бабков // Здравоохранение Белоруссии. 1981. - N 11. -С. 28-30.
11. И. Бауман В.Р. Латентность лизосомальных ферментов миокарда при экспериментальной патологии сердца / В.Р.Бауман, О.Я.Пупеле, И.А. Ки-енкас // Кровообращение. 1985. - Т. 18, N 2. - С. 3-7.
12. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1998.-704 с.
13. Бударин Л.И. Физическая химия и фармакология сердечных гликозидов / Л.И.Бударин, Н.И.Сахарчук, И.С.Чекман. Киев, 1985. - 200 с.
14. Булычев А.Г. Лизосомотропные агенты как регуляторы активности лизосомальных гидролаз / А.Г. Булычев А.Г., О.А. Ассиновская, Е.Г. Семенова // Вопр. мед. химии. 1987. - Т. 33, N 5. - С. 20-24.
15. Бурлакова Е.Б. Влияние антиоксидантов на изменение состава липидов лизосом печени крыс после термического ожога / Е.Б. Бурлакова, Т.Л. Заец, Н.И. Дубинская // Патол. физиология и эксперим. терапия 1984. -N5.-С. 13-17.
16. Василенко В.Х. Миокардиодистрофия / В.Х.Василенко, С.Б.Фельдман, Н.К.Хитров. М.: Медицина, 1989. - 272 с.
17. Веллс В.В. Метаболическая регуляция активности лизосом // Лизосомы и лизосомные болезни накопления: Пер. с англ. / Под ред. Д.В. Калла-хана. М., 1984. - С. 32-47.
18. Виноградов В.М., Гипоксия как фармакологическая проблема / В.М. Виноградов, Ю.Ю.Урюпов // Фармакология и токсикология. 1985. - Т. 48, N 1. - С. 9-20.
19. Винокурова Е.Н. Активность лизосомальных ферментов и состояние электролитного баланса миокарда при острой и хронической гипокси-ческой гипоксии в условиях действия целанида и сензита: Дис.канд. биол.наук / Е.Н. Винокурова.-Рязань, 1998.-159 с.
20. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков. М.: Наука, 1972. - 252 с.
21. Вовк В.И. Динамика изменений электролитного баланса и некоторых параметров сократительной активности миокарда при адаптации к прерывистому действию высотной гипоксии: Дис.канд. биол. наук / В.И.Вовк. Кишинев, 1980. - 152 с.
22. Гарновская М.Н. Циклические нуклеотиды / М.Н.Гарновская. Минск, 1982.-269 с.
23. Гацура В.В. Фармакологическая коррекция энергетического обмена ишемизированного миокарда / В.В.Гацура. М.: Антекс, 1993. - 254 с.
24. Гринстейн Б. Наглядная биохимия: Пер.с англ. / Б. Гринстейн, А. Грин-стейн. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2000. - 119 с.
25. Громашевская Л.Л. Теоретические и практические аспекты изучения множественных форм ферментов / Л.Л. Громашевская // Тез. IV Всесо-юз. симпоз. по медицинской энзимологии. Алма-Ата, 1983.-С. 81-83.
26. Давитая Г.Ш. О некоторых особенностях взаимодействия прос-тагландинов с лизосомами в процессе канцерогенеза / Г.Ш. Давитая // Биол. науки. М., 1989.-12 с.
27. Денисенко П.П. Влияние некоторых антигипоксантов на содержание циклических нуклеотидов в различных структурах мозга в условиях нормо- и гипоксии / П.П. Денисенко, Е.Ю. Полтавченко // Бюл. экспе-рим. биологии и медицины. 1985.- Т. 99, N 4. - С. 426-427.
28. Дж. Дингл (ред.) Лизосомы. Методы исследования: Пер. с англ. / Дж.Дингл.- М.: Мир, 1980. 342 с.
29. Джафаров А.И. Перекисное окисление липидов в наружных и внутренних мембранах митохондрий при аноксии / А.И. Джафаров, Н.М.Магомедов, Э.М. Кулиева // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1985. - Т. 100, N 10. - С. 433-435.
30. Дин Р. Процессы распада в клетке / Р.Дин. М.: Мир, 1981. - 120 с.
31. Дмитриев А.В. Биохимия лизосомальных кислых гидролаз / А.В.Дмитриев // Биохимия на рубеже XXI века.: Межрегион, сб.науч.тр / Отв.ред.проф.В.Г.Макарова. Рязань, 2000. - С. 121-129.
32. Додонова Н.А. Влияние фуросемида, новурита, гипотиазида и этакри-новой кислоты на лизосомы интактных почек крыс в опытах in vitro / Н.А. Додонова // Фармакология и токсикология. 1988. - Т. 51, N 3. - С. 125.
33. Долгов В.В. Лабораторная диагностика нарушений обмена липидов: Пособие для врачей / В.В.Долгов, В.Н.Титов, М.Г.Творогова.- Тверь, 1999.-55 с.
34. Жалко-Титаренко В.Ф. Водно-электролитный обмен и кислотно-основное состояние в норме и при патологии / Жалко-Титаренко В.Ф.Киев: Здоровье, 1989. 200 с.
35. Каверина Н.В. Нонахлазиновый препарат для лечения ишемической болезни сердца / Н.В.Каверина, Г.А.Маркова, Г.Г. Чичканов // Кардиоло-ГИЯ.-1975.- № 7. С.43-48.
36. Каган В.Е. Кальций и перекисное окисление липидов в мембранах и микросомах сердца / В.Е. Каган, В.М. Савов, В.В.Диденко // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1983. - Т. 95, N 4. - С. 46-48.
37. Калинский М.И. Влияние 3,5-АМФ-зависимой протеинкиназы на выход катепсина D из лизосом скелетных мышц и сердца крыс при физической нагрузке / М.И.Калинский // Укр. биохим. журн. 1984. - Т. 56, N 4.-С. 408.
38. Кан A.M. Активность кислых гидролаз миокарда при действии гидрокортизона / А.М.Кан, А.И.Матюшин // Фармакология и токсикология. -1982.-Т. 45, N 1.-С. 21-24.
39. Кан A.M. Влияние половых стероидов на активность лизосомальных ферментов сердца / А.М.Кан, А.И.Матюшин // Пробл. эндокринологии.- 1991. Т. 37, N 1. - С. 53-54.
40. Капелько В.И. Влияние гипоксии и ишемии на ионный транспорт и сократительную функцию сердечной мышцы: Обзор / В.И.Капелько //
41. Бюл. Всесоюз. кардиол. науч. центра АМН СССР. 1981. - Т. 4, N 1. - С. 103-110.
42. Карапетян Р.Г. Влияние кардиоактивных препаратов на протеолитиче-скую активность сердечной мышцы крыс / Р.Г. Карапетян, Т.Н. Акопян,
43. A.И. Оганесян // Вопр. мед. химии. 1990. - N 3. - С. 54-57.
44. Карпищенко А.И. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы): Справочник / Под ред. А.И.Карпищенко. СПб.: Интермедика, 2001.- 544 с.
45. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник / Под ред. А.И.Карпищенко. -СПб.: Интермедика, 1998. 408 стр.
46. Касавина Б.С. Влияние экспериментального гипертиреоза на функциональное состояние лизосомальных мембран и структурную организацию роговицы кролика / Б.С. Касавина, Т.В. Ухина, В.А. Миронов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1983. - N 6. - С. 17-20.
47. Кобылянский JI.H. Влияние адреналина на функциональное состояние лизосом печени, активность гидролаз в сыворотке крови крыс при тяжелой механической травме / JI.H. Кобылянский // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1983. - N 3. - С. 22-25.
48. Кобылянский JI.H. Влияние ацетилхолина на функциональное состояние лизосом печени и почек крыс при тяжелой механической травме / JI.H. Кобылянский // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1983. - Т. 95, N 4. - С. 27-30.
49. Кожевников Ю.Н. О перекисном окислении липидов в норме и патологии / Ю.Н. Кожевников // Вопр. мед. химии. 1985. - Т. 31, N 4. - С. 17.
50. Колб В.Г. Справочник по клинической химии / В.Г.Колб,
51. B.С.Камышников.- Минск, 1982. С. 121-125.
52. Колчинская А.З. О классификации гипоксических состояний / А.З. Кол-чинская // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1981. - N 4. - С. 310.
53. Коровкин Б.Ф. Активность кислых гидролаз и проницаемость мембран лизосом кардиомиоцитов и гепатоцитов при экспериментальных состояниях / Б.Ф. Коровкин, Э.Д. Полякова, Н.С. Стволинская // Вопр. мед. химии. 1987. - Т. 33, N 5. - С. 33-38.
54. Коровкин Б.Ф. Липосомы и ц-АМФ в стабилизации мембран лизосом / Б.Ф. Коровкин, В.И.Государский, К.К.Зайцева // Вопр. мед. химии. -1980. Т. 26, N 3. - С. 403-406.
55. Коровкин Б.Ф. Циклазная система и активность лизосомных ферментов в норме и при патологии / Б.Ф.Коровкин // Вестн. АМН СССР. 1982. -N 9.- С. 69-74.
56. Короленко Т.А. Катаболизм белка в лизосомах / Т.А. Короленко. Новосибирск, 1990. - С. 89-122.
57. Короленко Т.А. Биохимические аспекты лизосомотропизма / Т.А. Короленко. Новосибирск, 1983. - С. 117.
58. Короленко Т.А. Эффект однократного введения хлорохина на активность протеиназ лизосом клеток печени крыс / Т.А.Короленко, Е.В.Рукавишникова, А.Б. Пупышев // Вопр. мед. химии. 1990. - Т. 36, N6.-С. 20-23.
59. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А.Кочетов. -М., 1980.-С. 223-224.
60. Кременецкая Т.В. Взаимодействие карнитина и инсулина в регуляции активности лизосомальных ферментов поврежденного миокарда: Авто-реф. дис. канд. биол. наук / Т.В.Кременецкая. Рязань, 1996. - 24 с.
61. Кулинский В.И. // Успехи биол. химии. 1997. - Т. 37. - С. 171-209.
62. Лизенко Е.И. Липидный состав и липолитические ферменты лизосом / Е.И.Лизенко // Усп. совр. биологии. 1982. - Т. 94, N 1. - С. 94-110.
63. Литвинов B.C. Повреждаемость лизосом как прогностический показатель повреждения печени при гипоксии / В.С.Литвинов, А.Б.Пупышев // Фармакологическая коррекция гипоксических состояний. Гродно, 1980.-Ч. 1.-С. 105-106.
64. Луговой В.И. Влияние стероидных гормонов на стабильность изолированных лизосом в условиях замораживания / В.И.Луговой, Л.П. Кравченко // Вопр. мед. химии. 1980. - Т. 26, N 5. - С. 620-623.
65. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетические механизмы формирования гипоксических состояний и подходы к их фармокологической коррекции / Л.Д.Лукьянова // Фармакологическая коррекция гипоксических состояний: Сб. тр. НИИ фармакологии АМН СССР. М., 1989. - С. 11-44.
66. Лукьянова Л.Д. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние / Л.Д.Лукьянова, Б.С.Балмуханов, А.Т. Уголев. М.: Наука, 1982. - 301 с.
67. Мазур Н.А. Основы клинической фармакологии и фармакотерапии в кардиологии / Н.А.Мазур. М.: Медицина, 1988. - 296 с.
68. Макарова В.Г. Биохимические аспекты действия карнитина и ряда других биогенных веществ при гипоксических состояниях: Дис.д-ра мед. наук / В.Г.Макарова. Рязань, 1987. - 278 с.
69. Макарова В.Г. Влияние кальцийрегулирующих лекарственных средств на активность лизосомальных ферментов миокарда / В.Г.Макарова, Б.К.Романов // Рос. медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова. 2002. -№ 3-4 - С. 12-19.
70. Макарова В.Г. Возрастные особенности изменений активности лизосомальных ферментов печени при адаптации организма к гипоксии и гипербарической оксигенации / В.Г.Макарова // Патол. физиология и экс-перим. терапия. 1978. - N 1. - С. 29-33.
71. Макарова В.Г. Изменения электролитного состава крови у больных ишемической болезнью сердца / В.Г.Макарова, Р.А.Лиферов.- Рязань, РязГМУ, 2000.- 85 с.
72. Макарова В.Г. Методика определения активности кислых гидролаз / В.Г.Макарова, Б.К.Романов // Рос. медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова.- 2002. № 3-4. - С.130-131.
73. Макарова В.Г. Фармакологическая регуляция активности лизосомальных ферментов (обзор литературы) / В.Г.Макарова, Б.К.Романов, А.И.Лобанова // Биохимия на рубеже XXI века.: Межрегион, сб.науч.тр / Отв.ред.проф.В.Г.Макарова. Рязань, 2000. - С.55-59.
74. Маньковская И.Н. Особенности реализации механизмов перекисного окисления липидов при прерывистой гипоксической тренировке / И.Н. Маньковская // Hypoxia Medical J. 1993. - N 4. - С. 9-12.
75. Матвеева И.В. Изменения активности протеолитических ферментов поврежденного миокарда при сахарном диабете: Автореф. дис. канд. мед. наук / / И.В.Матвеева. М., 1992. - 21 с.
76. Маянская Н.Н. Лизосомы и регенерация / Н.Н. Маянская // Современные проблемы регенерации. Йошкар-Ола, 1982. - С. 135-142.
77. Маянская Н.Н. Некоторые механизмы вовлечения лизосом в процессы тканевого повреждения / Н.Н.Маянская, Л.Е.Панин, Ю.А.Николаев // Вопр. мед. химии. 1990. - N 6. - С. 5-8.
78. Медведев Ю.В. Гипоксия и свободные радикалы в развитии патологических состояний организма / Ю.В.Медведев, А.Д. Толстой. М.: ООО «Терра-Календер и Промоушн», 2000. - 232 с.
79. Меерсон Ф.З. Адаптация к стрессорным ситуациям и физическим нагрузкам / Ф.З.Меерсон, М.Г.Пшенникова. М., 1988. - С. 60-67.
80. Меерсон Ф.З. Кардиопротекторные эффекты адаптации к иммобилиза-ционным стрессам и гипоксии / Ф.З. Меерсон, И.Ю. Малышев, А.В. За-мотринский // Кардиология. 1992. - Т. 32, N 5. - С. 43-48.
81. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца / Ф.З.Меерсон. М.: Медицина, 1984. - 272 с.
82. Меерсон Ф.З. Предупреждение срессорных повреждений организма ан-тиоксидантами и бета-блокатором индералом / Ф.З.Меерсон, В.И.Павлова, Э.Н.Коробейникова // Вопр. мед. химии. 1980. - Т. 26, N 6.-С. 827- 831.
83. Мертвецов Н.П. Множественные формы тирозинаминотрансферазы в клетках печени крыс и их роль в гомеостазе клетки / Н.П.Мертвецов // Вопр. мед. химии. 1981. - Т. 27, N 2. - С. 154-166.
84. Метелица В.И. Справочник кардиолога по клинической фармакологии / В.И.Метелица. М.: Медицина, 1987. - С. 222-232.
85. Миронова М.И. Видовая чувствительность к сердечным гликозидам: Обзор литературы / М.И.Миронова, Т.И.Буленков // Фармакология и токсикология. 1977. - Т. 40, N 5. - С. 630-636.
86. Михайлов И.Б. Na-K-АТФ-аза как рецептор экзогенных и эндогенных сердечных гликозидов / И.Б.Михайлов // Фармакология и токсикология. 1988. - Т. 51, N 3. - С. 116-118.
87. Михайлов И.Б. Эндогенные дигиталисоподобные вещества и сердечные гликозиды: факты и гипотезы / И.Б. Михайлов // Фармакология и токсикология. 1990. - Т. 53, N 5. - С. 75-78.
88. Моисеев B.C. Применение антагонистов кальция в клинике внутренних болезней / В.С.Моисеев, А.И.Ивлева, Л.М.Акопян // Терапевт, арх. -1987.-Т. 59, N3.-С. 132-138.
89. Мосолов К.В. Механизмы контроля протеолиза / К.В.Мосолов // Успехи биол. химии. 1988. - Т. 28. - С. 125-144.
90. Нейлер В.Г. Кальций и повреждение кардиомиоцитов / В.Г.Нейлер, М.Дж.Дейли // Физиология и патофизиология кардиомиоцитов / Под ред. Н. Сперелакиса. М., 1988. - Т. 2. - С. 555-578.
91. Нил М.Дж. Наглядная фармакология: Пер.с англ. / Под ред. М.А.Демидовой. 2-е изд., испр. - М.: Гэотар-МЕД, 2001. - 104 с.
92. Ольбинская Л.И. Коронарная и миокардиальная недостаточность / Л.И.Ольбинская, П.В.Литвицкий. М.: Медицина, 1986. - 272 с.
93. Орлов Л.Л. Сократительная функция и ишемия миокарда / Л.Л.Орлов, А.М.Шилов, Г.Е. Ройтберг. М.: Наука, 1987. - 247 с.
94. Остапчук Н.А. Активность лизосомальных ферментов при лекарственных поражениях печени / Н.А.Остапчук // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1989. - Т. 108, N 10. - С. 447-449.
95. Панин Л.Е. Лизосомы: Роль в адаптации и восстановлении / Л.Е.Панин, Н.Н.Маянская. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1987. - 198 с.
96. Панченко Г.А. Влияние стабилизации мембранных лизосом кардиомиоцитов на сократительную функцию и ультраструктуру миокарда при некоторых патологических состояниях: Автореф. дис. канд. мед. наук / Г.А.Панченко. Москва, 1987. - 16 с.
97. Панченко Л.Ф. Лабилизация мембранных структур лизосом миокарда в условиях адаптации к высотной гипоксии / Л.Ф.Панченко, Ф.З.Меерсон, О.Н. Любимцева // Структуры и функции биологических мембран. М., 1971.-С. 103-110.
98. Петренко Н.А. Влияние фуросемида на активность лизосомальных ферментов ишемизированных почек крыс и процессы перекисного окисления: Автореф. дис. канд. мед. наук / Н.А.Петренко. Уфа, 1993. - 20 с.
99. Петрунь Н.М. Метаболические структурные изменения в органеллах клеток коркового слоя почек при ишемии / Н.М. Петрунь,
100. Е.И.Кримкевич, А.Т. Носова. М., 1985. - Деп. в ВИНИТИ, 01.02.1985. -N611-85.
101. Пичхадзе Г.М. Влияние метионина, ретинола, токоферола и пи-ридоксина на активность некоторых ферментов лизосом печени у крыс с моделью антракозы / Г.М. Пичхадзе // Фармакология и токсикология. -1988.-Т. 51, N3.-С. 127.
102. Погожева А.В. Влияние разбалансировки жирового состава рациона на липолитическую активность и стабильность мембран лизосом различных тканей крыс / А.В.Погожева, Л.Г.Пономарева, Л.И.Авреньева // Вопр. питания. 1982. - N 4. - С. 45-48.
103. Покровский А.А. Лизосомы / А.А.Покровский, В.А.Тутельян. М.: Наука, 1976.-382 с.
104. Покровский А.А. Современные методы в биохимии / А.А.Покровский, А.И.Арчаков. М.: Медицина, 1968. - 218 с.
105. Полякова И.Ф. Влияние целанида на липиды миокарда / И.Ф.Полякова // Третий съезд фармакологов УССР: Тез. докл. Винница, 1977. - С. 140-141.
106. Прусаченко В.К. Влияние изадрина и анаприлина на проницаемость лизосомальных мембран ишемизированного миокарда / В.К. Прусаченко // Фармакология и токсикология. 1981. - N 4. - С. 417-419.
107. Пылова С.И. Активность аденилатциклазы и содержание ц-АМФ в ткани мозга собак при клинической смерти и в постреанимационном периоде / С.И.Пылова, В.А.Ткачук // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1985. - Т. 100, N 10. - С. 422-424.
108. Романов Б.К. Активность лизосомальных ферментов новый диагностический и прогностический критерий оценки степени повреждения кардиомиоцитов / Б.К.Романов // Рос. медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова - 2004. -№ 1-2. - С. 155-163.
109. Романов Б.К. Активность лизосомальных ферментов в миокарде крыс при острой гипоксической гипоксии / Б.К.Романов // Тез.докл. VIII Рос. Нац. конгр. «Человек и лекарство» (г.Москва, 2-6 апреля 2001 г.). М., 2001.-С. 468.
110. Романов Б.К. Активность лизосомальных ферментов в миокарде крыс при острой тотальной ишемии миокарда / Б.К.Романов // Тез.докл. VIII Рос. Нац. конгр. «Человек и лекарство» (г.Москва, 2-6 апреля 2001 г.). -М., 2001.-С. 468.
111. Романов Б.К. Активность ПОЛ в миокарде крыс при экспериментальной дислипидемии / Б.К.Романов // Тез.докл. VIII Рос. Нац. конгр. «Человек и лекарство» (г.Москва, 2-6 апреля 2001 г.). М., 2001. - С. 468.
112. Романов Б.К. Биохимия лизосомальных кислых гидролаз / Б.К.Романов // Сб.тез. юбил. науч. конф. «50 лет университета: научные итоги и перспективы». Рязань, 2000. -Ч. 1. - С. 121-122.
113. Романов Б.К. Влияние блокатора кальциевых каналов верапамила на активность лизосомальных ферментов миокарда при гипоксической гипоксии / Б.К.Романов, А.И.Лобанова // Биохимия на рубеже XXI века.: Межрегион, сб.науч.тр. Рязань, 2000. - С. 95-97.
114. Романов Б.К. Влияние верапамила на активность лизосомального аппарата миокарда при гипоксической гипоксии / Б.К.Романов // Пути формирования и коррекции физического состояния организма: Сб.науч.тр. Рязань, 1994. - Т 2. - С. 80-82.
115. Романов Б.К. Влияние дигоксина и верапамила на электролитный баланс и активность лизосомальных ферментов миокарда при гипоксической гипоксии: Дис. канд. мед. наук / Б.К.Романов. Рязань, 1994. - 159 с.
116. Романов Б.К. Возможности фармакологической регуляции активности лизосомального аппарата миокарда при гипоксической гипоксии / Б.К.Романов; Рязан. гос. мед. ун-т. Рязань, 1994. - 10 с. - Деп. в ВИНИТИ 02.02.94, № 302-В94.
117. Романов Б.К. Изменение активности лизосомальных ферментов миокарда крыс при гипоксии на фоне действия верапамила / Б.К.Романов; Рязан. гос. мед. ун-т. Рязань, 1993. - 7 с. - Деп. в ВИНИТИ 02.02.94, № 303-В94.
118. Романов Б.К. Кардиотропные антиишемические (антиангинальные) лекарственные средства / Б.К.Романов // Рос. медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова. 2004. - С. 186-192.
119. Романов Б.К. Ланикор и верапамил в профилактике метаболических нарушений миокарда при острой гипоксии / Б.К.Романов, К.В.Савилов // Тезисы докл. IV Российского национального конгресса "Человек и лекарство". Москва, 1997. - С. 109.
120. Романов Б.К. Лекарственная регуляция лизосомальной активности ишемизированного миокарда / Б.К.Романов // Рос. мед. журн. 2002. -№ 6. - С. 36-39.
121. Романов Б.К. Методика количественного определения кардиотропных средств в кардиомиоцитах и крови методом проточно-инъекционного анализа / Б.К.Романов // Рос. медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова. 2004. - № 1-2.-С. 128-132.
122. Романов Б.К. Методика оценки активности лизосомальных ферментов миокарда / Б.К.Романов // Материалы науч.-практ. конф. Рос. акад. с/х наук «Проблемы экологии и развития пчеловодства в России» (Рыбное, 25-27 августа 1999 г.).- Рыбное, 1999. С. 28.
123. Рязанова Е.А. Влияние гормонов щитовидной железы на активность катепсина Д и кальпаинов нормального и поврежденного миокарда: Авто-реф. дис. канд. биол. наук /Е.А.Рязанова. Смоленск, 1990. - 24 с.
124. Савилов К.В. Роль эндогенного карнитина в механизме действия ряда кардиотропных средств при нормо- и гипоксии: Дис. канд. мед. наук / К.В.Савилов. Рязань, 1994. - 125 с.
125. Савченкова JI.B. Возможные механизмы антиоксидантного действия блокаторов кальциевых каналов при гипоксическом синдроме / JI.B.Савченкова, Е.М.Дзубан, В.Д. Лукьянчук // Эксперим. и клинич. фармакология 1996. - Т. 59, N 2. - С. 53-55.
126. Сакс В.А. Биохимия нормального и ишемизированного кардиомиоцита: современное состояние исследований / В.А. Сакс, Е.А. Конорев, Р.А. Григорянц // Кардиология. 1992. - Т. 32, N 3. - С. 82-91.
127. Самойлов М.О. Реакции нейронов мозга на гипоксию / М.О.Самойлов. -Л: Наука, 1985.- 190 с.
128. Саратиков А.С. Современная концепция антифлогистического действия НПВС (обзор литературы) / А.С.Саратиков, Т.П.Прищеп // Фармакология и токсикология. 1982. - Т. 45, N 2. - С. 133-138.
129. Свидерская Е.В. Модулируемое ц-ГМФ и ц-АМФ связывание кальция сарколеммой миокарда при циркуляторной гипоксии / Е.В.Свидерская, А.Е.Антипенко, С.Н.Лызлова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1986.-Т. 102, N 10.-С. 417-419.
130. Северин Е.С. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / Е.С.Северин, А.Я.Николаев.-М.:ГЭОТАР-МЕД, 2001. 448 с.
131. Сергеев П.В. Бета-адренергические средства и лизосомы миокарда / П.В.Сергеев, Н.А.Сысолятина // Эксперим. и клинич. фармакология. -1993.-Т. 56, N 1. С. 65-66.
132. Сергеев П.В. Влияние практолола и атенолола на активность лизосомальных ферментов миокарда желудочков крыс / П.В.Сергеев, Н.А.Сысолятина // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1991. - Т. 112, N 11.-С. 490-492.
133. Сергеев П.В. Плазматическая мембрана клетки-мишени и стероидные гормоны: начало спора или его завершение? / П.В.Сергеев, А.С.Духанин, Н.Л.Шимановский // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1995. - Т. 120, N 10. - С. 342-348.
134. Сергеев П.В. Стероидные гормоны и лизосомы / П.В Сергеев., Т.В.Ухина, Н.С. Чермных // Вопр. мед. химии. 1987. - Т. 33, N 5. - С. 60-65.
135. Сперелакис Н. Физиология и патофизиология сердца: В 2 т.: Пер. с англ. / Под ред. Н.Сперелакиса. М.: Медицина, 1990. - Т. 1-2.
136. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д.Стальная Т.Г.Гаришвили // Современные методы в биохимии. М.,1977. - С.66-68.
137. Сысолятина Н.А. Влияние бета-адренергических средств на лизосомы миокарда: Автореф. дисс.д-ра мед. наук / Н.А.Сысолятнина. М., 1991.-38 с.
138. Сысолятина Н.А. О действии бета-адреномиметиков на степень повреждения лизосомальных мембран и гликогенфосфорилазную активность в миокарде желудочков морских свинок / Н.А.Сысолятнина // Фармакология и токсикология. 1988. - Т. 51, N 2. - С. 59-61.
139. Сысыкин А.А. Сравнительные мембраностабилизирующие эффекты антикальциевых препаратов / А.А.Сысыкин, В.К.Петров // Тез. докл. IV Рос. нац. конгр. "Человек и лекарство". М., 1997. - С. 297.
140. Сытник С.И. Комплексное использование а-адреноблокаторов и антагонистов кальция в этиопатогенетической терапии сердечно-сосудистых заболеваний / С.И. Сытник, С.Л.Денисов // Эксперим. и клинич. фармакология. 1993. - Т. 56, N 4. - С. 26-30.
141. Терентьев А.А.//Биохимия. М.} 1995. - Т. 60. - С. 1923-1952.
142. Тутельян В.А. Лизосомы в деятельности клетки. Физиология и патология / В.А.Тутельян, А.В.Васильев // Вестн. АМН СССР. 1990. - N 2. -С. 14-21.
143. Тутельян В.А. Современные представления о биогенезе лизосомальных белков в норме и при патологии / В.А.Тутельян, Д.В.Гуткин, А.В.Васильев // Вопр. мед. химии. 1992. - Т. 38, N 2. - С. 4-13.
144. Федоров Н.А. Циклические нуклеотиды и их аналоги в медицине / Н.А.Федоров, М.Г.Радуловацкий, Г.Е.Чехович. М.: Медицина, 1990. -192 с.
145. Фомина В.А. Клинико-экспериментальное исследование гиполипиде-мической и противоишемической активности маточного молочка и апикомпозиций с его включением: Дисс.канд.мед.наук / В.А.Фомина. -Рязань, 2000.- 152 с.
146. Фролов В.А. Лизосомы миокарда / В.А.Фролов // Проблемы патологии в эксперименте и клинике. Львов, 1984. - Т. 6. - С. 88-89.
147. Хитров Н.К. Адаптация сердца к гипоксии / Н.К.Хитров, B.C.Пауков. -М.: Медицина, 1991. 237 с.
148. Чекман И.С. Na-K-АТФ-аза, как объект воздействия кардиотропных средств / И.С.Чекман // Эксперим. и клинич. фармакология. 1992. - Т. 55,N2.-С. 65-68.
149. Чекман И.С. Биохимическая фармакодинамика / И.С.Чекман. Киев, 1991.
150. Чекман И.С. Магний в медицине / И.С.Чекман, Н.А.Горчакова, С.Я.Николай. Кишинев, 1992. - 103 с.
151. Чекман И.С. Справочник по клинической фармакологии и фармакотерапии / Под ред. И.С.Чекмана, А.П.Пелещука, О.А.Пятака. Киев: Здоровье, 1986. - 733 с.
152. Яхнина Д.Н. Возможный механизм защитного действия а-токоферола при экспериментальной гипоксии / Д.Н. Яхнина // Вопр. мед. химии. -1980.-Т. 26,N1.-С. 88-91.
153. Abe S. Ultracytochemical studies on the effects of cyclic AMP on the lysosomal system in hepatic cells of mice / S. Abe, K. Ogawa // Biomedical Res. 1980. - V. 1, N 10. - P. 47-58.
154. Acosta D. Ischemic myocardial injury in cultured heart cells: in situ lysosomal damage / D.Acosta, M. Puckett, R. Mc Millan // Separat. Experient. 1978. -V. 34. - P. 1388-1392.
155. Acosta D., Injury produced by free fatty acids to lysosomes and mitochondria in cultured heart muscle and endothelial cell / D. Acosta, D. Wenzel // Atherosclerosis. 1974. - V. 20, N 3. - P. 417-426.
156. Amenta J. S. Mechanisms of protein turnover in cultured fibroblasts. Differential inhibition of two lysosomal mechanisms with insulin and NH4C1 / J. S.Amenta, S.C.Brocher// Exp. Cell. Res. 1980. - V. 126, N 1. - P. 167-174.
157. Arichi H. Effects of stilbene components of the roots of Polygonum cuspida-tum Sieb. et Zucc. on lipid metabolism / H. Arichi, Y. Kimura, H. Okuda // Chem Pharm Bull (Tokyo). 1982. - Vol.30, N 5. - P. 1766-1770.
158. Aronson N.N. Effects of glucagon and insulin on liver lysosomes / N.N. Ar-onson // Life Ssi. 1980. - Vol. 27, N 2 . - P. 95-104.
159. Baccino F. Levels of proteolytic activities and cell protein degradation / F. Baccino, M. Messina, M. Musi // Acta biol. med. Germ. 1981. - Vol. 40, N 10-11.-P. 1249-1258.
160. Baglioni T. Influence treatment on two intestinal lysosomal hydrolases in young rats / T. Baglioni, A. Locatelli, P. Sartorelli // Ital. J. Biochem. 1978. -V. 27, N1.-P. 1-10.
161. Ballard F.J. Regulation of intracellular protein degradation by insulin and growth factors / F.J. Ballard, S.E. Knowless, G.L. Francis // Univ. Halle. -Wittenberg. 1981. - N 66. - S. 21-22.
162. Barbarino F. The protective effect of verapamile, nifedipine and chlorpro-mazine in CC14-induced acute liver lesions / F. Barbarino, E. Toganel, C. Brilischi//WorldCongr. Gastroenterol. Abington, 1 990. - Abstr. 2. - P. 225.
163. Barratt A.G. Cathepsin D: the lysosomal aspartatic proteinase / A.G. Barratt // Protein degradation in health and desease. Amsterdam, 1980. - P. 37-50.
164. Barry M.A. Endonuclease activation during apoptosis: the role of cytosolic Ca and pH / M.A. Barry, A. Eastman // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1992. V. 186, N 2. - P. 782-789.
165. Betteridge A. Effect of phospholipase A on somatotropin synthesis / A. Bet-teridge, M. Wallis // Biochem. Soc. Trans. 1979. - V. 7, N 2. - P. 420-421.
166. Bolognani L. Polar lipids extraction from rat primary lysosomes and their possible role in regulating lysosomal hydrolases / L. Bolognani, A. Giuliani, T. Suman // Basis and Appl. Histochem. 1982. - V. 26, N 3. - P. 209-216.
167. Carafoli E. Intracellular calcium homestasis / E. Carafoli // Ann. Rev. Bio-chem. 1987. - V. 56. - P. 395-433.
168. Carbonin P.U. Cardiac electrogenesis and metabolism / P.U.Carbonin, M. Di Gennaro, R. Valle // Acta Med. Romana. 1980. - V. 18, N 1. - P. 145-157.
169. Clusin W.J. Reduction of ischemic depolarization by the calcium channel blocker diltiazem / W.J. Clusin, M. Buchbinder, A.K. Ellis // Circ. Res. -1984.-V. 54, N 1. P. 10-20.
170. De Duve C. Function of lysosomes / C. De Duve, R. Wattiaux // Ann. Rev. Phisiol. 1966. - V. 28. - P. 435-492.
171. Decker R.S. Lysosomal alteration in hypoxic and reoxygenated hearts: 1. Ul-trastructural and cytochemical changes /R.S. Decker, K. Wildenthal // Amer. J. Patol. 1980. - V. 98, N 2. - P. 425-444.
172. Dhalla N.S. Irreversible damage to sarcolemmal Ca2+-transport in myocardial ischemia / N.S. Dhalla, I.M.C. Dixon, R.E. Beamish // Biomed. Biochim. Acta. 1987. - Vol. 46, N 8-9. - P. 505-511.
173. Dowd D.R. Evidense that glucocorticoid and cyclic AMP-induced apoptotik pathways in lymphocytes share distal events / D.R. Dowd, R.L. Miesfeld // Mol. Cell. Biol. 1992. - Vol. 12, N 8. - P. 3600-3608.
174. Drozdz M. Effect of anti-inflammatory steroids on the activity of selected lysosomal hydrolases in serum of rats with experimental liver fibrosis / M. Drozdz, K. Olczuk, E. Kucharz // Exp. Clin. Endocrinol. 1983. - Vol. 82, N l.-P. 111-114.
175. England P.J. The effect of hypoxia on the phosphorylation of contractile and other proteins in perfused rat heart challenged by isoprenaline / P.J. England, E.G. Krause // Biomed. Biochim. Acta. 1987. - V. 5. - P. 369-380.
176. Fagbemi О. Antiarrhythmic actions of meptazinol, a partial agonist at opiate receptors, in acute myocardial ischaemia / O. Fagbemi, K.A. Kane, I. Lepran // Br J Pharmacol. 1991. - Vol. 78. - N 3. - P. 455-460.
177. Ferrans V. Ultrastructural pathology of the heart / Ed. B.F.Trump, R.T.Jones // Diagnostic electron microscopy. New York, 1983. - P. 19-473.
178. Fleckenstein A. Calcium antagonism in heart and smooth muscle: experimental facts and therapeutic prospects. Monograph / A. Fleckenstein, Ed.by J. Wiley.-New York, 1983.
179. Fleckenstein A. Characteristics of calcium blockers / A. Fleckenstein, G. Fleckenstein-Grun // Physiol. New York, 1988. - Vol. 1. - P. 475-502.
180. Garnieri C. Role of oxygen in the cellular damage induced reoxygenation of hypoxic heart / C. Garnieri, F. Flamingi, C. Calderera // J. Mol. Cell. Cardiol. 1980.-Vol. 12.-P. 797-808.
181. Giasson S. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of clentiazem and dilti-azem in closed-chest anesthetized dogs / S. Giasson, D. Garceau, W. Homsy // Cardiovasc-Drugs-Ther. -1995. Vol. 9. - N 5. - P. 685-692.
182. Goldstone A. Synthesis and turnover of lysosomal glycoproteins. Relation to the molecular heterogeneity of the lysosomal enzymes / A. Goldstone, H. Koenig // FEBS Lett. 1974. - Vol. 39, N 2. - P. 176-181.
183. Hayase К. Effect of amino acids on lysosomal proteolytic activities in rat levers / K. Hayase, A. Yoshida // Agr. Biol. Chem., Tokyo. 1980. - Vol. 40, N 10.-P. 2501-2503.
184. Henning R. Membrane lipids of rat liver lysosomes prepared by free-flow electrophoresis / R. Henning, H. Heidrich // Biochim. Biophys. Acta. 1974.- Vol. 345. P. 326-335.
185. Hopgood M.F. Stimulation by glucocorticoids of protein degradation in hepatocyte monolayers / M.F. Hopgood, M.G. Clark, F.J. Ballard // Biochem. J. 1981.-Vol. 196, N 1. - P. 33-40.
186. Janero D.R. Protection of cardiac membrane phospholipid against oxidative injury by calcium antagonists / D.R. Janero, B. Burohardt, R. Lopez // Biochem. Pharmacol. 1988. - Vol. 37, N 21. - P. 4197-4203.
187. Jenkins A. The starvation induced increase in muscle protein degradation is non-lysosomal origin / A. Jenkins, M. Whittaker, P. Schofleld // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. - Vol. 86, N 4. - P. 1014-1019.
188. Kahonen M. Plasma digoxin immunoreactivity and arterial potassium relaxation after quinapril therapy in hypertensive rats / M. Kahonen M, P.A. Doris, H. Makynen // J-Pharmacol-Exp-Ther. 1995. Vol. 275, N 2. - P. 832-837.
189. Kaneko M. Depression of heart sarcolemmal Cf2+-pump activity by oxygene free radicals / M. Kaneko, R. Beamish, N. Dhalla // Amer. J. Physiol. 1989.- Vol. 256, N 2. Pt. 2. - P. 368-375.
190. Keech M. Effects of membrane labilising agents and hyperthermia on the activation of lysosomal enzymes in cultured cells / M. Keech, E. Wills // Life Sci. 1981. - Vol. 29, N 13. - P. 1333-1339.
191. Khatter J.C. Digitalis cardiotoxicity: cellular calcium overload a possible mechanism / J.C. Khatter, S. Navaratnam, B. Nero // Basis Res. Cardiol. -1989. Vol. 84, N 6. - P. 553-563.
192. Kimura Y. Effects of black substances in crude black sugar on carbohydrate and lipid metabolism of rats / Y. Kimura, H. Ohminami, H. Arichi // Yaku-gaku Zasshi. -1982. Vol. 102, N 7. - P. 666-669.
193. Knop M. Vacuolar-lysosomal proteolysis: proteases, substrates, mechanisms / M. Knop, H. Schiffer, S. Rupp // Curr. Opin. Cell. biol. 1993. - Vol. 5, N 6. - P. 990-996.
194. Koltai M. The possible mechanism of protection induced by dexamethasone against sudden death due to coronary ligation in conscious rats / M. Koltai, I. Lepran // Br J Pharmacol. 1996. - Vol. 79, N 2. - P. 327-329.
195. Kotoulas O.B. The effects of cyclic 3,5-AMP on the lysosomes of newborn rats hepatocytes / O.B. Kotoulas // J. Ultrastruct. and Mol. Struct. Rez. -1986. Vol. 97, N 1-3. - P. 210-215.
196. Lamers J.M.J. Calcium transport systems in cardiac sarcolemma and their regulation by the second messengers cyclic AMP and calcium-calmodulin / J.M.J. Lamers // Gen. Physiol. Biophys. 1985. - Vol. 4. - P. 143-154.
197. Levine S. N. Exercise cenditioning increases rat myocardial calcium uptake / S. N. Levine, G. Kanasewitz // J. Appl. Physiol. 1986. - Vol. 60, N 5. - P. 1673-1679.
198. Lincoln T.M. On the role of the cAMP and cGMP dependent proteinkinases in cell function / T.M. Lincoln, J.D. Corbin // J. Cycl. Nucl. Rez. 1996. -Vol. 4, N 1. - P. 3-14.
199. Lippman R. Application of chemiluminescent probes in investigating lysosomal se nsitivity to superoxyde versus suspected radical scavengers / R. Lippman, A. Agren, M. Uhlen // Mechanisms of Ageing and Development. -1981.-Vol. 17, N3.-P. 283-287.
200. Loegering D. Effect of exercise, hypoxiaand epinephrine on lysosomes and plasma enzymes / D. Loegering, M. Bonin, J. Smith // Exp. and Mol. Pathol.- 1975. Vol. 22, N 2. - P. 242-251.
201. Lundquist I. Effect of fasting in islet lysosomal enzyme activities and the in vivo insulin response to different secretagogues / I. Lundquist, R. Lovdahl // Hormone and Metabol. Res. 1983.-Vol. 15, N1.-P. 11-15.
202. Мак I.T. Temporal relation ship of free radical-induced lipid peroxidation and loss of latent enzyme activity in highly enriched hepatic lysosomes / I.T. Мак, H.P. Misra, W.B. Weglicki // J. Biol. Chem. 1983. - Vol. 258, N 22. -P. 3733-3738.
203. Marcos A. Effect of protein malnutrition on lysosome organs in immunized rats / A. Marcos, E. Munoz, M.T. Unzaga // Cienc. biol. 1981. - Vol. 6, N 1.- P. 77-80.
204. Mc Crath J. Altered myocardial electrolyte content of high altitude expozed rats / J. Mc Crath, R. Bullard // Amer. J. Physiol. 1970. - Vol. 219. - P. 374377.
205. Mc Crath J. Myocardial electrolytes in hypobaric hypoxia / J. Mc Crath, L. Martin // Int. J. Biometeor. 1977. - Vol. 21, N 2. - P. 157-164.
206. Miller S. Inhibition by glucocorticoids of endocytosis in a macrophage-like cell line / S. Miller, G. Melnykovych // J. Cell. Biochem. 1982. - Vol.18, N 4.-P. 423-431.
207. Minyailenko T.D. Severe hypoxia activates lipid peroxydation in the rat brain / T.D. Minyailenko, V.P. Pozharov, M.M. Seredenko // Chem. Phys. Lipids. 1990. - Vol. 55, N 1. - P. 25-28.
208. Mortimore G.E. Lysosomal pathways in hepatic protein degradation: regulatory role of amino acids / G.E. Mortimore, A.R. Poso // Fed. Proc. 1984. -Vol. 43, N5.-P. 1289-1295.
209. Nakagawa H. A new protease in hog thyroid lysosomes. II. A partial purification and characterisation of leupeptin-sensitive protease / H. Nakagawa, Y. Endo, S. Ohtaki // Acta endocrinol. 1981. - Vol. 88, N 3. - P. 390-395.
210. Nayler W.G. The role of calcium in the ischemic myocardium / W.G. Nayler // Amer. J. Pathol. 1981. - Vol. 102, N 2. - P. 262-270.
211. Neely J. Metabolic products and myocardial ischemia / J. Neely, D. Fewray // Amer. J. Pathol. 1981. - Vol. 102. - P. 282-291.
212. Persechini A. Different mechanisms for Ca2+ dissociation from complexes of calmodulin with nitric oxide synthase or myosin light chain kinase / A. Persechini, H.D. White, K.J. Gansz // J-Biol-Chem. 1996. - Vol. 271, N1.- P. 62-67.
213. Pfeifer C.J. Reserpine-induced gastric ulcers: protection by lysosomal stabilization due to zinc / C.J. Pfeifer, C.H. Cho, A. Cheema // Eur. J. Pharmacol.- 1980. Vol. 61, N 4. - P. 347-354.
214. Pontremoli S. Interaction of rabbit liver cathepsin M and fructose-1,6-bisphosphatase converting enzyme with their endogenous inhibitors / S. Pontremoli, E. Melloni, F. Salamino // Arch. Biochem. Biophys. 1984. -Vol. 228, N 2. - P. 460-464.
215. Pontremoli S. Localization of two lysosomal proteinases on the external surface of the lysosomal membrane / S. Pontremoli, E. Melloni, M. Michetti // Biochem. Biophys. Rez. commun. 1982. - Vol. 106, N 3. - P. 903-909.
216. Poole-Wilson P. Mechanism of cell death in heart muscle after hypoxia or ischemia / P. Poole-Wilson // Myocardial ischemia and protection. NewY-ork, 1983.-P. 123-130.
217. Poole-Wilson P.A. Calcium out of control / P.A. Poole-Wilson, D.P. Harding, P.V.Sourdillon // J. Molec. Cell. Cardiol. 1984. - Vol. 16, N 2.-P. 175-187.
218. Ravichandran L.V. Alterations in the heart lysosomal stability in isoproterenol induced myocardial interaction in rats / L.V.Ravichandran, R. Puvanakrishan, K.T. Joseph // Biochem. 1990. - Vol. 22, N 2. - P. 387396.
219. Reeves J. P. T he m echanism о f 1 ysosomal a cidification / J. P. Reeves // Lysosomes in Biology and Pathology. Eds. J. T. Dingle, R.T. Dean. North Holland - Amsterdam, 1984. - Vol. 7. - P. 175-199.
220. Reimer KA. Effect of coronary occlusion site on ischaemic bed size and collateral blood flow in dogs / K.A. Reimer, R.E. Ideker, RB. Jennings // Car-diovasc. Res. 1981 Vol. 15, N 11. - P. 668-674.
221. Reimer KA. Energy metabolism in the reversible and irreversible phases of severe myocardial ischemia / K.A. Reimer, RB. Jennings // Acta Med. Scand. Suppl. 1981. - N 651. - P. 19-27.
222. Reinhard R.A. Clinical correlates of the molecular and cellular actions of magnesium on the cardiovascular system / R.A. Reinhard // Amer. Heart J. -1991.-Vol. 121, N5.-P. 1512-1513.
223. Rokosova B. The effect of lysosomal enzymes on the proliferation of aortic smooth muscle cells and fibroblasts / B. Rokosova, J.P. Bentley // Pathol. Biol. 1980. - Vol. 28, N 8. - P. 493-500.
224. Romanov B.K. Activity of lysosomal enzymes and their inhibitors in experimental myocardial ischemia / B.K.Romanov // Learning Perspective.- 2001. -Vol. 1, N 5. P. 2.
225. Romanov B.K. Effects of calcium on lysosomal activity / B.K.Romanov // Learning Perspective.- 2001. Vol. 1, N 6. - P. 2.
226. Ruegg J.C. International Sensit Symposium / J.C. Ruegg, G. Pfitzer // Genf.-NewYork.- 1985.-N7.-P. 127-134.
227. Samarel A.M. Rabbit cardiac immunoreactive cathepsin D content during starvation-induced atrophy / A.M. Samarel, E.A. Ogunro, A.G. Ferguson // Amer. J. Physiol. 1981. - Vol. 240, N 2. - P. 222-228.
228. Schwinger R.H.G. Different negative inotropic activity of Ca-antagonists in human myocardial tissue / R.H.G. Schwinger, M. Bohm, E. Erdman // Klin. Wochenshr. 1990. - Vol. 68, N 16. - P. 797-805.
229. Shwartz A. Calcium antagonists: Review and perspective on mechanism of action / A. Shwartz // Amer. J. Cardiol. 1989. - Vol. 64, N 17. - P. 3-9.
230. Spath G. Magnesium in der kardiologe eine herausforderung zu neuen Unter-sichungeh / G. Spath // Wein. med. Wschr. 1988. - Vol. 138, N 15/16. - P. 382-415.
231. Suman T. Contribution to the study of regulation of acid hydrolases in rat liver lysosomes by cross inhibition / T. Suman, N. Ripamonti, A. Giuliani // Ital. J. Biochem. 1979. - Vol. 28, N 6. - P. 494-496.
232. Szajerka G. The effect of Cortisol on rabbit red cell acid phosphatase isoen-symes/ G. Szajerka, J. Kwiatkowska//Mol. and Cell. Biochem. 1984. -Vol. 59, N 1-2.-P. 183-186.
233. Szego C.M. Mechanism of hormone action: parallels in receptormediated signal propagation for steroid and peptide effectors / C.M. Szego // Life Sci. 1984. - Vol. 35, N 24. - P. 2383-2396.
234. Tanaca J. Release of acid phosphatase from lysosomal membranes by ca-thepsin D / J. Tanaca, M. Himerno, K. Kato // J. Biochem. 1992. - Vol. 52. -P. 543-556.
235. Thyagarajan K. Lysosomal stability of different tissues under nutritional strees / K. Thyagarajan, J. Surekha, M. Rao // Intern. J. Vitamin. Nutrit. Res. 1974. - Vol. 44, N 2. - P. 234-245.
236. Timour Q. Calcium channal modulatores and susceptibility to ischemic ventricular fibrillation: Modification of cellular calcium overload / Q. Timour // Arch. Int. Pharmacodyn. et Ther. 1992. - Vol. 315. - P. 30-46.
237. Tischler M.E. Is regulation of proteolysis associated with redox-state changes in rat skeletal muscle? / M.E. Tischler // Biochem. J. 1980. - Vol. 192, N 3. -P. 963-966.
238. Traynor J.R. Phospholipase A2 activity of lysosomal origin secreted by polymorphonuclear leukocytes during phagocytosis or on treatment with calcium / J.R. Traynor, K.S. Anthi // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - Vol. 665, N3.-P. 571-577.
239. Trocha P.J. Variation in cyclic nucleotide levels and lysosomal enzyme activities in the irradiated rat / P.J. Trocha, G.N. Catravas // Radiat. Res. -1980. Vol. 83, N 3. - P. 658-667.
240. Upmann C. Determinaciones de la activated de la fosfatasa acida lysosomal en homogeneizados de higados de ratas tratadas con catecholaminas e ipro-niazida / C. Upmann // Rev. CENIC Cienc. biol. 1974. - Vol. 5, N 2. - P. 13-23.
241. Vasdev S.C. Effect of hypoxia in vitro on phospholipid composition of isolated mitochondria and lysosomes of rabbit heart / S.C. Vasdev, K.J. Kako // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharm. 1980. - Vol. 27, N 3. - P. 599-602.
242. Wallinberg A. Differential blocade of agonist and depolarization induced 45 Ca2+ influs in multiple muscle cells / A. Wallinberg, C. Cauvin, Th. Lategan // Amer. J. Physiol. 1989. - Vol. 25, N 4, Pt. 1. - P. 607-611.
243. Wattiaux R. Effects of ischemia on lysosomes / R.Wattiaux, S. Wattiaux-De Coninck // Internat. Rev. Exper. Pathology / Eds.: Richter G., Epstein M. -New York., 1984. Vol. 26. - P. 85-107.
244. Weglicki W.B. Changes in lipid composition of Triton-filled lysosomes during lysis. Association with activation acid-active lipases and phospholipases / W.B.Weglicki, R.S.Ruth, K. Owens// Biochim. Biophys. Acta. 1974. -Vol. 337, N 1.-P. 145-152.
245. Weglicki W.B. Enhanced lysosomal phospholipid degradation and lysophos-pholipid production due to free radicals / W.B.Weglicki, B.F.Dickens, I.T. Мак // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. - Vol. 124, N 1. - P. 229235.
246. Weissmann G. Corticosteroids and membrane stabilization / G. Weissmann // Circulation. 1976. - Vol. 53, N 3 (Suppl. 1). - P. 171-172.
247. Wells W.W. Phosphorylation of lysosomal membrane components as a possibly regulatory mechanism / W.W.Wells, C.A. Collins // Lysosomes in Biology and Pathology / Eds.: Dingle J.T., Dean R.T., Sly. W. Amsterdam, 1984.-Vol. 7.-P. 119-141.
248. Whang K. Magnesium deficiency: Patogenesis, prevalence and clinical implication / K. Whang // Amer. Med. J. 1987. - Vol. 89 (Suppl. 3). - P. 2429.
249. White R.L. Effects of calcium on mitochondrial NAD(P)H in paced rat ventricular myocytes / R.L.White, B.A. Wittenberg // Biophys-J. 1995. - Vol. 69,N6.-P. 2790-2799.1. С 279,
250. Younes М. Lipid peroxidation and lysosomal enzyme release induced by vanadate in vitro / M.Younes, M.Albrecht, C.-P. Siegers // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmac. 1984. - Vol.43, N 3. - P. 487-497.
-
Романов, Борис Константинович
-
доктора медицинских наук
-
Рязань, 2004
-
ВАК 03.00.04
- Активность лизосомальных ферментов и состояние электролитного баланса миокарда при острой и хронической гипоксической гипоксии в условиях действия целанида и сензита
- Влияние препарата "милдронат" на активность лизосомальных ферментов и некоторые другие биохимические показатели в миокарде и головном мозге белых крыс-самцов в условиях острой и хронической гипоксической гипоксии
- Влияние фармакологических средств с антигипоксической и антиоксидантной активностью на функциональное состояние миокарда у собак с экспериментальными катехоламиновыми некрозами сердечной мышцы
- Морфофункциональные изменения миокарда животных под действием биологически активных веществ
- Эффекты и механизмы действия сероводорода на сократительную функцию миокарда лягушки
