Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучения влияния фосфорилирования ЛЦ-2 миозина на характер взаимодействия актина и миозина в скелетной мускулатуре позвоночных методом поляризационной микрофлуориметрии

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучения влияния фосфорилирования ЛЦ-2 миозина на характер взаимодействия актина и миозина в скелетной мускулатуре позвоночных методом поляризационной микрофлуориметрии"

-»В ^ ^ ^ ^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.353,2

ЕФИЛЮВЛ Наталья Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ЛЦ-2 МИОЗИНА НА ХАРАКТЕР ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АКТИНА И МИОЗИНА В СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЕ ПОЗВОНОЧНЫХ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ МИ КРОФЛУОРИМЕТРИ и

03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биохимической цитологии и цитохимии в группе по изучению молекулярных механизмов клеточной подвижности Института цитологии РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук Ю. С. Боровиков.

Официальные опиопепты — доктор биологических наук, профессор В. И. Воробьев; доктор биологических наук А. Е. Антипенко.

Ведущее учреждение — Институт эволюционной физиологии и биохимии им. II. М. Сеченова РАН.

Защита состоится 1992 года в «/5» часов на

заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан

«2/> АгмТЯ&рЯ- 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук Л. Н. Писарева

© Институт цитологии РАН

*

РОССИЙСКАЯ

СУДАРСУРЭДНЛЯ 3

ВКбЛИУТЁКА ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В основе механизма мышечного сокращения лежит взаимодействие миозина с актином, сопровождаемое гидролизом ЛТФ. 13 скелетной мускулатуре позвоночных регуляция этого взаимодействия осуществляется тропонин-тропомиозиновым комплексом, ' ассоциированным с Ф-актшюм. Однако, наряду с основной системой в ■ регуляции принимают участие так называемые регуляторнне легкие цепи (ЛЦ-2), связангае с головкой миозина.

В мышцах позвоночных ЛЦ-2 миозина подвергается зависящему от Са2* и калъмодулина обратимому фосфорилированию, катализируемому специфическим ферментом -киназой легких • цепей.' В гладких мышцах такое фосфорилирование играет ключевую роль .в регуляции взаимодействия миозина с актином и в запуске мышечного сокращения. Напротив, в скелетной мускулатуре оно играет лишь модулирующую роль в регуляции сокращения. однако молекулярные механизмы этой модуляции не ясны, и ногне шаги в этом направлении являются актуальными.

Для выяснения механизмов такой модуляции необходима знать, как влияет фосфорилирование ЛЦ-2 но структурное состояние актина и миозина в процессе г^н^рации силы мышечным волокном. Адекватным методом для получения такой информации является метод поляризационной микрофлуорпметрии, позволягщий исследовать характер присоединен;!,! цпгогиготн? головок к актиновкм нитям (ориентацию и полкш^-ть присоединенных головок), а такке структурные изменения Ф-актина, приводящие к изменению относя ге^ыгг''' колтчета "включенных" мономеров актина с Боровиков Г?';5). Необходимо отметать, что иод "включенным" понимается таксо состояние актиновой нити, при котором происходит прочно- связывание с мнозиновой головкой и активация АТФазы миозина, Напротив, "выключенное" состояние характеризуется слабым связываний! с головкой и неспособностью активировать ЛТ1\-;зу сС11-»го-.^ 1сЬ ^ я! 1001; gr.-f.Tie щ п 1 1987).

Цель нестоящей работы состояла в исследовании влияния фос1|юрилировашя ЛЦ^З миозина на характер взаимодействия актина и миозина в скелетном мышечном волокне методом поляризационной микрофлуориметрии. Поэтому в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод получения глицеринизированных мышечных волокон кролика, содержащих фосфорилированные и дефосфорилированные ЛЦ-2 миозина.

2. Разработать способ определения степени- фосфорилирования ЛЦ-2 в мышечшх волокнах.

3. Исследовать влияние фосфорилирования ЛЦ-2 и Са2*" на структурное состояние Ф-актина и условиях изометрического сокращения, ригора и расслаблении мышечного волокна.

4. Изучить влияние фосфорилирования ЛЦ-2 и Оа** на амплитуду изометрического напряжения, развиваемого мышечным волокном при сокращении.

5. Исследовать влияние фосфорилирования ЛЦ-2 и Оа2'' на подвижность головки миозина при ригорном взаимодействии с Ф-актином глицеринизировашюго мышечного волокна.

Научная новизна и практическая значимость работы. Был предложен метод' получения глицеринизированных мышечных волокон, содержащих- фосфорилированные и дефосфоршмрованнпе . ЛЦ-2 миозина. Предложена модификация метода электрофореза в 8М мочевине. Она позволила точно определять степень фосфорилирования ЛЦ-2 в мышечном волокне, используя для этого более быстрый и менее трудоемкий метод.

Методом поляризационной микрофлуориметрии и тензометрии впервые показано, что увеличение амплитуды . изометрического сокращении, вызванное фодфоршшрованием ЛЦ-2 миозина, коррелирует о увеличением относительного количества "включенных" мономеров актина.

Впервые показано, что фосфорилированив 'ЛЦ-2 уменьшает число "включенных" мономеров в Ф-актине при расслаблении мышечного волокла.

' В исследованиях, проведенных на моделях мышечшх

волокон, впервые было показано, что ^сформирование ЛЦ-2 оказывает влияние на конформацию молекулы миозина.

Материалы работы доказывают, что фосфорйлирование ЛЦ-2 миозина играет модулирующую роль в процессе взаимодействия актина и миозина, влияя на конформацию как одного, так и другого бежа.

Таким образом, проведенные исследования расширяют обпдае представления о механизмах регуляции . актин-мпозинового взаимодействия.

Апробация работы. Результаты работы были представлены: на конференции "Молекулярные механизмы и энергетика подвижности" стран-участниц СЭВ по II направлению, г.Братислава,ЧССР, 1985г.; на 15 Европейском симпозиуме "Мышца и подвижность", г.Монпелье, Франция, 1986 г; на 7, Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия биологической подвижности", г.Пущино, 1987г. VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц г.Тбилиси, 1989 г. Работа отмечена премией АН СССР и Польской АН 1989-1990 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работТ

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит"из 1'в£д^й7ГГ~обзора" литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения, яяклпчэния шводои и списка литератур;«. Работа изложена на страшных, включая ¡н.сункоп и I таблицу.

материалы II метил,!

Обт-'-гг нсследо^тпия. Работа проводилась на г.Ш10рт1йЗирор'ш?шГюетв'пго х волоки** (т. рчояч) кролика. В работе ясподьяовплчсч как целн° олппо'ппи гли1юр10ч»г".'ропашш'3 г-лчокиа, тмг. и "теновце" толокна, т.е. волокна из которнх кубирятолыга экптрзгмровш'ч белки толст)« иитоЛ и комплекс. Т'яшл

НОЛСЖНЧ <•' ГфЖЯГ -^>7 ЛПШ«П. Чзпь ?КГ:1;°|\ТМ0Н !ИП

н(опо."п."п на глчн»] ш'-риро^нпнх ммкичпнх ткмюкпчх,

содержащих полностью фосфорилированные ЛЦ-2 (степень фосфорилироьашя 98±2%). Дашше модели получали при активации эндогенной 1шназы в процессе 'тлицеринизации, добавляя к раствору ЛТФ и Ca2' (Лебедева и др. 1987).

Препарата миозина и тяжелого меромиозина (ТММ) из скелетных мышц кролика, с фосфорилированными и. дефосфорилировашшми ЛЦ-2 были получены по методу польских авторов (StepkowaWi et al 1985).'

Препараты ферментов киназы и фосфатазы легких цепей из скелотных мышц кролика получали но описанным ранее методам

( lluunal 1у 1985; Horßan et al 1976).

В рядо экспериментов проводил^ реконструкцию тонких нитей, добавляя к Ф-актину теневого волокна тропонин и тропомиозин (Borovikov, Gusev 1983). ТрОПОШШ И ТрОПОМИОЗИН получали ПО методу Грейзера И Гергели (Graser, Gergely 1071).

Контроль за качеством белковых препаратой и определение белкового состава мышечных волокон осуществляли методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (Laemnii Ю70)в вертикальном блоке размером .100x83x0,5 мм.

Для определения степени фосфорилиррвания ЛЦ-2 миозина в препаратах белка и в мышечных волокнах использовали модификацию метода электрофореза в ПААГ в -присутствии 8 M мочевины, предложенного Перри и Перри <perrie, Perry 1970) с последующей денситомётрией гелей. Степень фосфорилирования ЛЦ-2 миозина расчитывали по формуле:

Х-р ' I00% + £4> •

где s.. _D и- sm. - площади пиков фосфорилированной и

J1U I Ли ;

дефосфорилированной ЛЦ-2.

Измерение характеристик ' поляризованной флуоресценции мышечного волокна осуществляли с помощью поляризационного микрофлуориметра. .(Иоффе и др. 1974). Собственную, триптофановую, флуоресценцию теневых волокон, декорированных ТММ, возбуждали в области 297±5 нм и регистрировали при

320-380 нм. Для теневых мышечных волокон, Ф-актин которых был модифицировал родамин-фаллоидином, флуоресценцию возбуждали в области 47Э±5 нм, а регистрировали при 500-600 нм. Флуоресценцию теневых волокон, декорированных. ТММ, модифицированным I,5-1аеоаыэ, возбуждали при 365+5 нм, а регистрировали в области 500-600 нм.

Регистрировали четыре интенсивности поляризованной флуоресценции: хг„, „х^, „I „, где значки слова от I обозначают параллельное и перпендикулярное направления плоскости поляризации возбуждающего света относительно оси волокна, а те же значки справа - направление плоскости поляризации света флуоресценции. Анализ экспериментальных данных проводили согласно математической модели (Тг^паг, Непс1е1зоп 1975; Уапа^аа, Оопаиа 1970) как ОПИСаНО ранее (Како1 еъ а1 1887). Расчитывали значения '[>ъ Р„, *д э1пг0 и н, где и р|Ь 7 степени поляризациии * уголы между осью Ф-актина и осцилятором поглощения д и излучения е; <» - угол между осью волокна и осью Ф-актипп; ц-относительное количество хаотически расположению флуорофоров.

Для измерения изометрического напряжения, развиваемого волокном при сокращении (при 10 мкМ, и 0,6 мкМ свободного Са7+) использовали установку, состоящую из датчика напряжения (моханотрон типа 6Мх9Б), мостовой и усилптелпюП схем, а также самописца с усилителем для регистрации напряжения. Исследовались пучки, состоящие из 2-3 волокон. Пучок волокон закреплялся на держателях уотанолкн расстояние между которыми составляло 2,Г' тлтл. , "

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 11 ИХ ОПСЛУЗДВНИВ

I. Влияние рн " иошгай силы па амплитуду напряжения,

развиваемого глпцершто^овптты^ГТот'гочу^пл еатяшон,

В литературе последних лет накоиленп данные о топ, что отклонение рН и ионной силы раствора, омывающего волокна, от

физиологических значений оказывает влияние на активное и ригорное напряжение, развиваемое демембранизированными и глицвринизированными волокнами (Robertson, Kerrik 1876; Thames et al 1974; Julian, Moss 1881; Л9ДН6В И Др. 1982; 1983; Proohniewics-Hakayaiia et al 19Ö3).

В связи с атим мы попытались исследовать, как влияет Рн и ионная сила на параметры поляризованной флуоресценции Ф-актина в глицеринизированном мышечном волокне. Одновременно регистрировали амплитуду напряжения при переходе мышечного волокна из расслабления в ригор.

При переходе глицеринизированного мышечного волокна из расслабленного состояния в ригор , изменяются параметры поляризованной флуоресценции триптофанилов (Рх, Р„ и Рц/Pj.) и мышечное волокно генерирует напряжение (рис.,1). Уменьшение ионной силы и подщелачивание ригоризующэго раствора увеличивают амплитуду максимального напряжения, развиваемого волокном, и делают изменения поляризационных параметров ярко выраженными. Так, уменьшение ионной силы ригоризукхцего раствора с i-i=Q,I4 до р=0,07 в два раза увеличивает амплитуду напряжения, развиваемого волокном. Во столько же раз изменяется разница между величиной Рц/Pj. трипгофановой флуоресценции ригорного и расслабленного волокна (рисЛА). Изменение pH с В до 8 увеличивает амплитуду ригорного напряжения и разницу между флуоресцентными характеристиками на 20% (рисЛБ). Ранее было показано, что изменения величины Рц/Р^ триптофановой флуоресценции, происходящие при ригоризации, отражают преимущественно изменения структурного состояния Ф-актина, вызванные ' образованием в волокне актомиозинового ригорного комплекса (Боровиков 1985). Отсюда большие изменения Р„/РХ1 наблюдаемые при уменьшении м и подщелачивании ригоризугацего раствора можно объяснить изменениями структурного состояния Ф-актина. Ьти результаты подтверждаются опытами . по изучению поляризованной флуоресценции родамин-фаллоидина, специфически связанного с Ф-актином глицеризиройанного мышечного волокна, а также

модельными экспериментами проведенными на теневых мышечных волокнах при связывании ТММ (Боровиков и др. 1986).

Рис. I. Зависимость параметров триптофановой флуоресценции . (I) и амплитуды напряжения (2), развиваемого ' глицеридазиропанным мышечным волокном при ригоризации, от ионной силы (А) и рН (Б) омывающего раствора.

По оси абсцисс - время, мин; по оси ординат: слева - Рм/Рх, отн. ед., справа - напряжение, отн. ед., I, ill - ригоризирумцие раствори с м=0,14 и 0,07 (А) и рН-6 и 8 (К) соответственно; и, iv -расслабляющие растворы с м--0,14 и 0,07 (А) и рН=В и 8 (Б) соответственно. Каждая точка на кривой I-1 среднее из 50 измерений, вертикальные черточки-95$ ныв доверительные интервалы.

Изменения поляризационных параметров триптофановой и родамин-фаллоидановой флуоресценции при образовании ригорного комплекса мо:кно объяснить такими конформационннми изменениями Ф-актина, которые приводят к уменьшению угла ориентации осцилляторов излучения (*Е) флуорофоров в актине^

В соответствии с представлениями о том, что мономеры актина находятся, по крайней мере, в двух различных структурно-функциональных состояниях: "включенном" и "выключенном", а переход во "включенное" состояние сэпрововдается уменьшением (Боровиков 1985), можно сделать вывод, что уменьшение иошюй силы и подщелачивание ригоризующего раствора увеличивают относительное количество ''включенных", мономеров актина.

Таким образом, в работе обнаружена .корреляция между. амплитудой напряжения, развиваемого волокном при ригоршации, и характером конформационных изменений Ф-актипа, индуцируемых образованием AM комплекса.

Рассмотренная выше работа позволила .найти ту модель аксшримонта, которая помогла раскрыть роль фосфорилирования ДЦ-2 миозина ь сокращении скелетной мускулатуры. В частности, показать его влияние как на амплитуду напряжения, развиваемого мышечным волокном, так и на конформационные изменения Ф-актина и мнозина при сокращении.

2. Влияние фосфорилирования ЛЦ-2 миозина на характер ~юЩюрма1даошшх перестроек Ф-актина и амплитуду изометрического напряжения.волокна при сокращении

В экспериментах. использовали глицериниризированные мышечные волокна (m. psoas) кролика, содержащие полностью фосфорилирорашше ЛЦ-2 миозина (98±2Ж). Такие волокна инкубировали 30 минут при 20°С в растворе, содержащем 10мМ иа-пцотат, БОмМ Трис-iici рН 7,Б и неочищенный препарат фосфатазы легких цепей миозина, полученный из скелетных мышц кролика. После инкубации степень фосфорилирования ЛЦ-2 в волокнах составляла менее Ъ%. Электрофорез такого препарата в присутствии додецнл сульфата натрия показал, что белковый сосгаи и молярные отношения белков глицеринизированного волокна но изменяются.

Расслабленно волокна осуществляли в растворе с низкой

ионной силой, следующего состава 50 мМ (4»С12, 5 мМ АТФ, б мМ ЭГТА, 10 Ш Трис-ацетатный буфер рН 7,0. Для сокращения использовались растворы, которые в отличие от расслабляющего содержали либо низкие (0,6 мкМ), либо высокие (10 мкМ) концентрации свободного Са1*.

Фосфоршшрование ЛЦ-2 миозина и Са2" оказывает влияние на амплитуду изометрического напряжения, развиваемого волокном при сокращении (рис.2 и 3). В присутствии низких и

Рис. 2 Характерные кривые напряжения, развиваемого пучком . ■ мышечных волокон при сокращении в зависимости от • фосфорилирования ЛЦ-2 и концентрации кальция. +Р - волокна с фосфорилированными ЛЦ-2 миозина; -Р -волокна с дефосфорилированными ЛЦ-2 миозина; С -сокращение; Рас - расслабление; По ос!п абсцисс -время, сек; по оси ординат: - напряжение, отн. ед..

высоких концентраций Са2+ напряжение, развиваемое волокнами, содержащими фосфорилированные ЛЦ-2 выше напряжения,

развиваемого волокнами с И 1Э±П%, соответственно

дефосфорилированными ЛЦ-2 на (рис.ЗА)..

37±9%

-Со

+Са

Рис.3. Зависимость амплитуды изометрического напряжения при сокращении волокна от фосфори-лирования ЛЦ-2 миозина : (А) и от концентрации ,Са2" (Б).

; -Са - концентрация кальция 0,6 мкМ; +Са -концентрация кальция 10 мкМ; заштрихованные столбики - ' волокна с фосфорилированными ЛЦ-2 миозина;незаштрихованные 'столбики - волокна с дефосфоршшрованными ЛЦ-2 миозина. Каждое среднее !значение получено . в результате 14 измерений.

-Са

-Со

+ Са

+ Со

Влияние дефосфорилирования на амплитуду было обратимо. Добавление к дефосфорилированным волокнам раствора, содержащего АТФ, Са2*, кальмодулин и киназу ЛЦ-2 восстанавливало амплитуду напряжения '. на 70-80%. Следует отметить, что зависимость амплитуды изометрического сокращения волокон от фосфорилирования ЛЦ-2 миозина была Показана Перс^ЧИНИ С Соавторами (РегвесЫги а1 1885)

только при низких концентрациях Са2*. В нашей работе слабо

выраженная зависимость амплитуды напряжения от фосфорилирования ЛЦ-2 наблюдалась и в присутствии высоких концентраций Са2'. Кроме того, нами было замечено, что волокна содержащие' фосфорилированные ЛЦ-2 развивают большую амплитуду напряжения при низких концентрациях Са2", чем при высоких (рис.2 и ЗБ) в среднем на 21±8%, тогда- как увеличение концентрации Са2+не вызывает изменений амплитуды напряжения при сокращении для волокон с дефосфорилировашшми ЛЦ-2 (рис.ЗБ). Эти два отличия, по-видимому, обусловлены тем, что в наших экспериментах использовались растворы' с низкой ионной силой (50 мМ кс1)• Это то условие, при котором можно ожидать наиболее заметного влияния фосфорилировзшм ЛЦ-2 на актин-миозиновое взаимодействие.

Информацию о структурном состоянии Ф-актина при взаимодействии с миозином, содержащим фосфоршгарованше и дефосфорилированше ЛЦ-2, получали при изучешш поляризованной флуоресценции _ родамин-фаллоидина,

специфически связанного с актином.

При изометрическом сокращении мышечных волокон, содержащих фосфорилированные, либо 'дефосфорилированше легкие цепи миозина уменьшается $Е и возрастает значение зз.пге (рис.4).- Наиболее заметные изменения этих параметров происходят при сокращении волокон, содержащих фосфорилированные ЛЦ-2 в присутствии низких концентраций свободного Са2*(0,6 мкМ). В этом эксперименте * уменьшается на 3,3% и Я1п го увеличивается на 68%. Наоборот, при сокращении волокон, содержащих дефосфорилированше ЛЦ-З при тех же концентрациях Са24" изменений I- и гЛп2о не, обнаружено. В присутствии высоких концентраций Саг+(10мкМ) сокращение волокон, содержащих дефосфорилировашше ЛЦ-2, сопровождается падением значешй на 2,6% и слабо выраженным увеличением в\п2в (на 13%), тогда как при сокращении волокон, содержащих фосфорилированнне легкие цепи при тех же концентрациях Са2* вызывает увеличение как «Е (на 1,5), так и в1пгв (на 46%). Следовательно, * при

изометрическом сокращении изменения «Е и вхп*6 зависят от степени фосфорилирования ЛЦ-2 миозина и от концентрации СЭг\ Эффект фосфорщмрования больше при низких, чем при высоких концентрациях этого иона.

41|Н".....А..........7...........

Зависимость 2-

S

С

(Б)

-Со ЮОхР -Со 0*Р +С0 ЮОкР +Са Охр

0.15

0.1

0.05

sin' е

-Со 100*Р -Со 0«Р tCa 100*Р +Са ОхР

РИС.4. (А) И мышечного волокна,

специфически окрашенного родамин-фаллоидином, при сокращении от фосфо-;рилирования ЛЦ-2 миозина и от концентрации Саг*.

-Са - концентрация !кальция 0,6 мкМ; +Са -,концентрация кальция Ю мкМ; 0%Р - . ТММ с де-'фосфорилированными ЛЦ-2; 100%Р - ТММ с фосфо-рилированными ЛЦ-2; заштрихованные столбики -расслабление; незаштри-хованные 'столбики сокращение. Каждое среднее значение получено в результате Б5 измерений.

Поскольку уменьшение значений *Е и (или) увеличение значений sin*6 отражают тагаю конформационные перестройки Ф-актина, которые сопровождаются увеличением в тонких нитях относительного количества "включенных" мономеров актина (КакоХ et al 1967), то можно предположить, что при переходе мышечного волокна из . расслабленного состояния в изометрические сокращение, фосфорилироваше ЛЦ-2 и Са** оказывают влияние на количество "включенных" мономеров

актина. В присутствии низких концентраций Са2* фосфорилирование ЛЦ-2 существенно увеличивает, а в присутствии высоких концентраций Са2* не . оказывает влияния нз количество "включенных" мономеров актина.

В состоянии расслабления значения • з1п2в для волокон, содержащих фосфорилированные цепи, заметно ниже значений соответствующего параметра . волокон, содержащих дефосфорилированные ЛЦ-2 (рис.4). По-видимому, в состоянии расслабления фосфорилированиа ЛЦ-2 уменьшает количество "включенных" мономеров актина в тонких нитях.

Сопоставлений данных по влиянию фосфорилирования ЛЦ-2, на амплитуду сокращения и число "включенных " мономеров актина позволяет сделать вывод о существовании корреляции между этими двумя характеристиками.

Глицеринизированное мышечное волокно является довольно сложной сократительной системой и поэтому следующим этапом работы было изучение более простой модельной системы состоящей из регулируемого актина теневого волокна и тяжелого меромиозина, содержащего фосфорилированные . или дефосфорилированные ЛЦ-2.

3. Влияние фосфорилирования ЛЦ-2 миозина на структурное состояние регулируемого Ф-актина при образовании комплекса с ТММ

Для выяснения механизмов модулирующего влияния фосфорилирования ЛЦ-2 на актин-миоззшовое взаимодействие необходимо знать, каково взаимоотношение фосфорилирования ЛЦ-2 миозина и тропонин-тропомиозиновой системы (белков, регулирующих взаимодействие актина и миозина в скелетной, мускулатуре). Информацию о структурном "состоянии регулируемого Ф-актина при моделировании ригорного комплекса актин- фосфорилированный или дефосфорилированный ТММ, получали при изучении степени поляризации триптофановой флуоресценции Ф-актина.

Значение Рх теневого волокна, содержащего регулиремый Ф-актин больше, чем Р„, а отношение Рх/Р„ > I. Декорирование регулируемого' Ф-актина фосфорилированным или

дефосфорклированным ТММ вызывает Са2*-зависимые изменения параметров триптофановой флуоресценции Ф-актина (рис.5). При

Рис.5. Влияние присоединения дефосфори-лированного (1,2) и фосфорилированного (3,4) ТММ к регулируемому Ф-актину при низкой (1,3) и высокой (2,4) концентрации ионов Са на степень • поляризации Р (А) и величину Рх/Р|| (Б) триптофановой флуоресценции теневого мышечного волокна. На рис. А заштрихованные столбики соответствуют Рх, а пустые - Рц. Каждое среднее значение получено в результате 60 измерений.

1 2 3 4

•

низкой концентрации Са2* связывание фосфорилированного ТММ. вызывает увеличение Р„, уменьшение Рх и отношения Рх/Рц, а дефосфорюшрованного приводит к .увеличению отношения Рх/Рц. Тогда как при высокой концетрации ионов Са2* присоединение фосфорилированного ТММ увеличивает значение Рх/Р«. а дефосфоршшрованного уменьшает Рх/Ря. Ранее было показано,

Б > ^ I4!

4 4

что величина Р^/Рц триптофановой флуоресценции теневого волокна создается триптофановыми остатками Ф-актина, преимущественно ориентированными перпендикулярно оси актиновой нити. С другой стороны, триптофановые• остатки тропонша и ТММ расположены практически изотропно, а тропомиозин не содержит триптофана (Уапзе1с1а е! а1 1974; в^И 1980; Вогоу1коу, Оиэеу 1983). ПОЭТОМУ набЛЮДЭвМЫО

изменения величины Р^/Р» триптофановой флуоресценции отвечают конформационным изменениям Ф-актина, вызванным присоединением ТММ. Таким образом, зависимость этих конформационных изменений от концентрации Са2* отличается для фосфорилированного и дефосфорилированного ТУМ (било обнаружено противоположное направление изменений). Оказалось, что наши результаты не отличаются по характеру наблюдаемых изменений -от данных полученных на теневых мышечных волокнах в отсутсвии Тн-Тм комплекса (Боровиков и др. 1986; Како1 а1 1987). Это позволяет предположить, что Тн-Тм комплекс не оказывает влияния на состоят« актина при образовании, ригорного комплекса - регулируемый Ф-актин-ТММ. По-видимому, характер такого взаимодействия определяется структурным состоянием головки, которое в свою очередь зависит от фосфорилирования ЛЦ-2 и связывания ими Саг\

.4. Влияние фосфорилирования ЛЦ-2 на структурное состояние головки миозиновой молек^Сш при присоединении к Ф-актину

Эксперименты проводили на теневых волокнах, в которых Ф-актин является основным • компонентом. Ф-актин в волокне декорировали 1,5-1аеоанз-ТММ с фосфорилированными или дефосфоршшровэнными ЛЦ-2.

Ранее было показано, что характер взаимодействия головок миозиновых молекул, модифицированных 1,5-1аеоакз с актиновыми нитями, определяет значения параметров Р„ и Р^, причем величина Р„ позволяет судить об ориентации, а

■ величина Рх- о подвижности головок миозина в мышечном ВОЛОКНе (Borejdo, Putnan 1977; Tregear, Mendelson 187S; Wilson, Mendefson 1983).

Оказалось, что значения Pj_ и Рй, и вычисленные величины ' углов $А, ®Е и число неориентированных флуорофоров (ы) зависят от степени фосфоралирования ЛЦ-2 тяжелого меромиозина и от типа иона (Садили Ife2*) связанного с ТММ при образовании ригорного комплекса с Ф-актином (табл; I).

Таблица I

Зависимость величин $л, #Е и ы поляризованной флуоресценции

1,5- iaedaus«связанного с головкой . миозина,от фосфорилирования ЛЦ-2 и концентрации Ca г при образовании ригорного комплекса с Ф-актином теневого волокна. Обозначения: -р ,+р - 1,5 iaedans-TMM с дефосфорилированными и фосфорилированными ЛЦ-2 , связанный с Ф-актином в мышечном ВОЛОКНе; -Са -1мМ ЕОТА, +Са - O.ImM СаС12

Условия Рх , ри $ А i Е И

~Са -О.ООбЮ.ООЗ 0.416+0.007 48.0±0.2 42.6+0.1 0.38+0.02

-р ................Ш5±г...... .............Ш.5.?..........

+Са -0.041+0.004 0.424+0.004 48.4+0.1 43.1+0.1 0.27+0.01

(80) (80)

■ -Ca +Са -0.060+0.003 .. (68) -0.056±0.002 (70) 0.385±0.004 ..............(68).......... 0.370+0.005 (70) 58.5+0.4 51.4+0.4 46.3±0Л 45.9±0.1 0.12+0.01 0.16+0.01

Значения sin е, характеризующие гибкость тонких нитей, вычислялись на основе экспериментов (Kakoi et al 1987) и составили 0.53, 0.068 и 0.060, 0.060 для комплекса Ф-актин-дефосфорилированннй и фосфорилированный ТММ в присутствие egta или caciz соответственно. Количество измерений указано в скобках.

Рассмотрим сначала, какое влияние оказывает Са2+ на образование ригорного комплекса актин-дефосфорилированный

ТММ. Оказалось, что значешш Р„ и величины углов фд и выше в присутствии Са2*. В предыдущих работах было показано, что при увеличении концентрации Са2" в комплексе Ф-нктии-ТММ изменяется ориентация мономеров актина (Borovi.no'/ е 1. а! 1982). однако эти изменения происходили в сторону уменьшения углов. Учитывая эти данные, можно предположить, что Са2' изменяет расположение головки миозина относительно осе II мономера актина и вызывает заметное уменьшение подвижности головки миозина. Об этом свидетельствует уменьшение величины N в присутствии Са2".

Наоборот, образовашю комплекса эктин-фосфорилирояашшй_ ТММ в присутствии Са2' приводит к уменьшению Рх, Р,, , углов *д и $Е и увеличению н. Это свидетельствует о противоположных изменениях ориентации и об увеличении подвижности головки.

Интересно отметить, что наибольшие значения углов а> и ®Е и наименьшие значения N наблюдались при образовании ригорного комплекса. > Ф-актян-фосфорилировашгой ТТМ в отсутствие Са2'. Поскольку увеличение углов ®д и

уменьшение н, соответствует сильному связыванию мономора актина с головкой и "включению" актиновой нити (вогоуНюу, Како1 1991), то можно считать, что фосфорилирование ЛД-2 в отсутствии Са2' оказывает на конформацию головки изменения, которые при контакте с актином вызывают "включение" айтиновой нити и образование сильной формы связывания. Подобное наблюдается и при - образовании комплекса Ф-актин-дефосфорилированный ТММ, но в меньшей степени. Соответственно, образование слабой формы связывания и "выключение" тонкой нити наблюдается при связывании Ф-актина с дефосфорилированным ТММ в отсутствии Са2'. Необходимо отметить, что Са2' в значительно меньшей степени влияет на подвижность фосфорилированной головки, а скорее на ее ориентацию, при этом, по-видимому, она образует все зко сильную форму связывания с актином.

В заключение следует отметить, что полученные данные

могут служить подтверждением участия двух актин-связывающих участков миозина в механизмах сокращения скелетной мускулатуры кролика (Боровиков и др. 1981;' Боровиков, Левицкий 1984; БЪеркомвк! еЬ а1 1985).

Пока невозмогао указать конкретную роль фосфорилирования ЛЦ-2 в функционировании скелетных мышц. Однако имеющиеся к настоящему времени данные литературы и' результаты нашей работы доказывают, что фосфорилирование ■ЛЦ-2 играет модулирующую роль при сокращении скелетной мускулатуры. Причем оно оказывает влияние на структурное состояние как миозиновой головки, так и актиновой нити и тем самым на характер взаимодействия этих белков, что приводит к увеличению напряжения, развиваемого волокном при низких концентрациях 0аг*. На основании полученных результатов и данных литературы может быть предложен механизм модулирующего участия фосфорилирования ЛЦ-2 в регуляции сокращения.

ЛЦ-2 располагаются в головке - миозиновой молекулы на фрагменте 20 кДа в области шарнира между головкой и стержневой часть» молекулы. Причем N-конец очень подвижен и но никоторым данным расположен недалеко от sh-I.su-2 групп (Ьог5пп;-1. »п. п1 1990). В области этих групп был обнаружен гидрофобный сайт связывания С актином (ВигиИЛ еЬ а) 1987). По-видимому, при фосфорилированни ЛЦ-2 они изменяют свою конформацню и тем самым оказывают влияние на структурное состояние головки, в частности на гидрофобный сайт связывания актина, что и приводит к .увеличению сродства миозина к актину. I'г,: с.".<зяпа е1 а1 19В7). а также увеличению количества существенных для . генерации силы "включенных" мономеров актина. Это приводит к тому, что при низких концентрациях Со2' волокно развивает большую амплитуду изометрического напряжения. В живой мышце ото ярикшие, по-1<ндимому,' имеет место на начальных этапах актпншшп сокращения.

вывода

1. Для изучения влияния фосфорилирования' ЛЦ-2 на актин-мпозиновое взаимодействие разработан метод получения глигьршшзированных скелетных мышечных волокон кролика с заданной степенью фосфорилировai-шя легких цепей миозина.

2. Предложен-.! модификация метода электрофореза в присутствии , 8 М мочевины, которая позволяет оценить степень фосфорилирования ЛЦ-2 миозина в мышечном волокне.

3. Методом поляризационной микрофлуориметрии показано, что фосфорилированне ЛЦ-2 изменяет характер взаимодействия миозина с актином. Причем в последнем происходят заметные изменения конформации.

4. Показано, что в ригорном октомиозиновом комплексе структурная организация (ориентация) и подвижность головки, содержащей фоефоршшрованные и дефосфорилироввнные ЛЦ-2, различаются и зависят от типа иона (Саа* или Mg2*), связанного с головкой.

5. При изометрическим сокращении мышечного волокна фосфорилированне ЛЦ-2 в присутствии низких (0,6 мкМ) концентраций са1* увеличивает, а в присутствии высоких концентраций (10 мкМ) не оказывает влияния на количество "включенных" мономеров актина.

6. В расслабленном состоянии фосфорилированне ЛЦх-2 уменьшает количество "включенных" мономеров актина.

7. Обнаружена корреляция между . увеличением амплитуды напряжения, развиваемого волокном при сокращении, увеличением степени:, фосфорилирования ЛЦ-2 миозина и количеством "включенных" мономеров актина.

Список работ по теме диссертации

I. D.S2czesna, Yu.S.Borovikov, H.N.Lebedeva, I.Kakol. Effect of Ca and myosin light chain phosphorylation on the interaction of heavy-meromyosin with requlated f-actin. // В

сб.-."Молекулярные механизмы и энергетика подвижности." 0.49.(1985).

2. Borovikov Yu.S., Wrotek M., Aksenova H.B., Lebedeva H.N., Kako] I. Effect of phosphorylation light chains of myosin кnd F-itotiri interaction. // Abstr. 15-th Eur. congr. "Muscle and Mobility." p.30 (1966).

3. Боровиков Ю.С., Лебедева H.H., Карандашов Э.А., , Полшцук Б.В., Кириллина В.П., Леднев В.В. ix. Влияние рН и ионной силы раствора на на конформационные перестройки Ф-актина, •ивдуцировашшо связыванием тяжелого' меромиозина. //' Патологии. I98G. Т.28, N 4, С 451-454.

4. Боровиков Ю.С., Лебедева Н.Н. Амплитуда напряжения разливаемого глицеринизированннм мышечным волокном _ при ригоризяции, зависит от характера структурных перестроек Ф-штша, индуцированных ' образованием актомиозинового комплекса. // Цитология. 1987. Т.29, n 10, C.II92-II95.

5. ЛоОодепа Н.И., Вротек М., Шувалова А.А., Конколь И., Боролшсо» Ю.О. Получение глицеришзированных мышечных коликой с фосфорилированными легкими цепями миозина. // I[¡полоши, Т.29, и 8, с. 973-975 (1987).

G. P.-.c2f!Biia П., Borovikov Yu.S., Lfebedeva N.N., Kakol I. IWtovi of phosphorylation of myosin light chains on in t.r; гэс I. i oriuf heavy me L'omyosin with requlated F-actin in F'hoi:i. fitirp. // Experientia v.43, n.2, p. 194-196 (1987).

7. Лобадова H.li., БротекМ., Конколь И., Боровиков Ю.О. ч.тгаит.1 .fmя j к'ршафопшщя рогуляторных легких цепей миозина ля лпрпкуиц ииаимидойствия актина и миозина в скелетной )•!,','i-'i v.b1;",';1^ кролика. // Труда 7-го Всеросийского симпозиума и оиихпмпя биологической подвижности". Пущино, iijir'pa il'CV (тояисы). • !'i.i'.i;iK'.'v Yu.S., Wcotelt М.,.Aknenova И . В . , Lebedeva N.N., ]. !цГ luenur; of lift Mid Cs bound to 1,5-IAEDANS labeled plior.ph'.iry l n t. oil 4nd f("t>honpliory lsted heavy metomyosin complex ■;i».ii };-;.г tin on ! 'О I r i ~:piJ f bjorenopnce of the f luoropliore .

rm~ l-V or. t$U?S. .72 3, H Z. P 409—'112 f. ъ."ф-;1;ш-у.п ¡'i.e., Врогек M., Аксенова H.F., Лебедева H.H., Чопкачь К. (шшеие Ся на подвижность головки миозина в коми-

лексе Ф-актин -ТММ. // Биохимия. 1988. Т.53, н I, С 97-100.

10. Боровиков Ю.С., Вротек М., Лебедева Н.Н., Конколь И. Влияиие фосфорилирования легких цепей миозина и Са2* на конформацию Ф-актина при' сокращении скелетных мышц // Биохимия. 1989. Т.54,'n I, С I62-J66. ■

11. Borovikov Yu.S., Wrotek М.( Lebedeva N . N . , Kakol I. Some properties of glycerinated skeletal muscle fibres contaning phosphorylated myosin. // Gen.Physiol.,Biophys 1989. V.8, P 569-578.

12. Ефимова Н.Н., Боровиков Ю.С. Влияние фосфорилирования легких цепей миозина и ионной силы на актин-миозиновое взаимодействие при расслаблении мышечного волокна. // vi Всесоюзная конференция по биохимии мышц. Тбилиси, 1989 (тезисы).