Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния некоторых природных метоксипроизводных бензола на монооксигеназную систему печени и ее индукцию ксенобиотиками

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния некоторых природных метоксипроизводных бензола на монооксигеназную систему печени и ее индукцию ксенобиотиками"

РОССИЙСКАЯ академия медицинских наук

ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

На правах рукописи УДК 612.392: [577.158+547.622

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НЕКОТОРЫХ ПРИРОДНЫХ МЕТОКС1 ¡ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗОЛА НА МОНООКСИГЕНАЗНУЮ СИСТЕМУ ПЕЧЕНИ И ЕЕ ИНДУКЦИЮ КСЕНОБИОТИКАМИ

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I

у

Мойсва - 1996

Работа выполнена в лаборатория энзимологии питания Института питания РАМН.

Научный руководитель доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор

В. А. ТУТЕЛЬЯН

Официальные оппоненты

профессор, доктор биологических нате Г. А. ЯРОВАЯ профессор, доктор медицинских нате II. Н. МАРОККО

Ведущее учреждение - НИИ биомедииннскон химии РАМН

Защита диссертации •' ^ " 1996 г.

в "/У" часов на заседании диссертационного совета, шифр Д 001.02.01. при 11нституте питания РАМН (109240. Москва. Устышскин проезд, д. 2/14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института литания РАМН.

Автореферат разослан 1996 г.

V

ченыи секретарь

диссертационного совета ( \

кандидат медицинских наук [у ГУ\ В. М.Жмннченко

1. ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Интерес ксенобиохимии к щучешпо микросомальной монооксигеназной системы определяется той исключительной ролью, которую она выполняет в процессах биотрансформацин и детоксикации ксенобиотиков (Парк Д.В., 1973; Арчаков А.И., 1975; Archakov, Bachmanova, 1990). Центральным звеном монооксигеназной системы является гемопротеин цитохром Р-450. который может существовать в виде множественных форм, чем и обусловлена широкая субстратная специфичность системы (Мишин В.М.. Ляхович В.В., Ioannides, Parke,1990; Карузина И.И. и др., 1995). Важнейшим свойством монооксигеназной системы является индукция - способность обратимо повышать активность в ответ на поступление в организм ксенобиотиков, в основе которой лежит стимуляция синтеза определенных форм шггохрома Р-450 (Ляхович В.В., Цырлов И.Б.. 1981: Гуляева Л.Ф. и др., 1994: Connev, 1986:). В результате индукции повышается активность отдельных монооксигеназ, что ускоряет процессы детоксикации и способствует более быстрому выведению метаболитов из организма. Однако в ряде случаев, в частности, при индукции ме-тилхолантренового типа, могут синтезироваться нзоформы шггохрома Р-450. участвующие в бноактивизации некоторых ксенобиотиков до токсических и канцерогенных продуктов (Кобляков В.А.. 1990: Ioannides. Parke,1990). Функциональное состояние монооксигеназной системы является одним из наиболее информативных показателей биологического воздействия ксенобиотиков и может служить в качестве важнейшей характеристики в токсиколого-гигиенической оценке различных ксенобиотиков, в частности, контамииатов пищи и пищевых добавок.

Пищевые добавки транс-анетол (1-метокси-4-пропенилбензол) и эвгенол (2-метокси- 4-аллшсбензол) широко используются в качестве ароматизаторов в пшцевой промышленности (WHO. 1991, № 28). Источниками этих соединений являются эфирные масла таких растений как анис, фенхель, гвоздичное дерево, укроп, традиционно используемые в качестве вкусовых приправ ( Ворошилов

В.Н. и др.. 1951: Кретович В.А. 1964 ). Анетол применяют в производстве кондитерских и хлебобулочных изделий, ликеров, безалкогольных налитков, копченых колбас. Эвгенол находит применение при изготовлении мясных и рыбных консервов как пряное и ароматическое вещество. Оба соединения применяют в медицине: анетол входит в состав нашатырно-анисовых капель, укроп-нон воды, эвгенол применяют в стоматологической практике в составе лечебных паст, полосканий ( Ильин МЛ1., Суржин С.Н., 1963: Кудинов М.А.. 1986 ). Структурная близость этих соединений к таким канцерогенам как сафрол, нзо-сафрол. азерон и др., требует более тщательного подхода к их оценке, с учетом влияния на ферментные системы, участвующие в процессах детоксикации ксенобиотиков. тем более, что имеющиеся в литературе данные относительно воздействия этих веществ на микросомалъные ферменты немногочисленны и не вполне однозначны ( Gruebner е.а., 1972; Marcus. Lichtenstein, 1982 ).

К числу широко распространенных загрязнителей окружающей Среды, обладающих способностью индуцировать микросомалъные ферменты, относятся полихлорированные дифенилы. Эти соединения устойчивы к воздействию экологических факторов, способны накапливаться в животных тканях и по ходу пищевых цепей, проникать через плацентарный барьер и передаваться с грудным молоком потомству, что представляет потенциальную опасность для человека (Тутельян В .А.. Лашнева Н.В.. 1983: WHO. 1993 ).

Несмотря на интенсивные исследования биологических эффектов поли-хлорированных дифенилов. многие вопросы остаются невыясненными, в частности. касающиеся ответной реакции системы шггохрома Р-450 на повторные воздействия этих ксенобиотиков, а также на их поступление в организм в комбинации с другими химическими соединениями, встречающимися в пищевых продуктах.

Все выше изложенное определяет актуальность изучения способности поступающих с пищей природных метоксипроизводных бензола индуцировать определенные молекулярные формы цитохрома Р-450, а также оказывать влияние на метаболизм и конечные эффекты других ксенобиотиков.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является изучение функционального состояния монооксигеназной системы на экспериментальной модели иодострого воздействия транс-анетола и эвгенола в ин-тактных и индуцированных смесью полихлорированных дифенилов - соволом-микросомах печени крыс, а также оценка биологических эффектов пишевых добавок на основе метокснпроизвояных бензола.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи:

1. Изучить функциональное состояние монооксигеназной системы печени при воздействии транс-анетола и эвгенола в зависимости от доз и длительности воздействия.

2. Изучить состояние системы цитохрома Р-450 при многократном воздействии полихлорированных дифенилов.

3. Изучить влияние метоксипроизводных бензола на индукцию цитохро-ма Р-450 полихлорированными дифенилами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Изучено состояние щггохром P-450-содержашей монооксигеназной системы печени при воздействии пишевых добавок транс-анетола и эвгенола. Дана характеристика влияния транс-анетола на микросомальные ферменты в условиях in vitro и in vivo, и при комбинированном поступлении с полихлорированными дифенилами.

Установлено, что транс-анетол in vitro ингибирует моноокснгеназные реакции. a in vivo вызывает индукцию микросомальных ферментов, степень которой зависит от доз ¡i длительности поступления в организм. Впервые показано, что транс-анетол способен оказывать модифицирующее действие на индукцию монооксигеназной системы другими ксенобиотиками: при сочетанном введении транс-анетола и совола. индуцирующее действие транс-анетола практически не вьивляется. а индуцирующий эффект совола снижается по сравнению с действием одного совола. Комбинированное поступление данных соединений привошгг к усилению их гепатотоксического действия.

Показано, 'по минимальный уровень транс-анетола, вызывающий нн-дукиию монооксигеназной системы печени крыс в подостром эксперименте, составляет 50 яг/кг массы тела в день.

Впервые в условиях лодострого эксперимента исследовано состояние системы шггохрома Р-450 при многократном воздействии сравнительно невысоких доз совола н получены новые доказательства выраженности и стойкости изменений монооксигеназной системы печени в данных условиях.

Изучение активности микросомальных ферментов под воздействием эвгенола выявило лишь наличие тенденции к повышению скорости окисления некоторых субстратов.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке регламентов содержания метоксипроизводных бензола в пищевых продуктах, с учетом возможности поступления их в организм в сочетании с другими ксенобиотиками.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы доложены на Международной конференции "Цитохром Р-450: Структура н функции, биотехнолопи и экологические аспекты'' (Москва, 1991): на межвузовской конференции ".Актуальные проблемы медицины и образования" (Актюбинск. 1992): на конференции "Экология и охрана здоровья' (.Актюбинск. 1993): на научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава АкГМИ (.Актюбинск. 1994).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссерташш опубликовано 4 печатных работы.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на Э6 страницах машинописного текста, содержит 1 б таблиц, и рисунков и состоит из введения, обзора .нггературы, описания собственных исследований, включающего материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения и списка цитируемой литературы, содержащего 46 отечественных п 35 зарубежных легочников.

2. МАТЕРИАЛЫ 1Г МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ В экспериментах использовали растущих н половозрелых крыс - самцов линии Внстар с исходной массой 60 - 250 г. В качестве индуктора монооксиге-назной системы печени применяли совол - смесь поли хлорированных дифени-лов отечественного производства, в однократной дозе 20 или 50 мг/кг, трансанетол вводили в дозах 50: 250 или 500 мг/кг/дн.. эвгенол - 250 или 500 мг/кг. Все препараты вводили с помощью зонда интрагастрально в виде растворов в кукурузном масле из расчета 2 мл/кг массы тела по схемам (см. табл. 1).

Животных забивали декашгтацией через 24 часа после последнего введения транс-анетола или эвгенола.

Таблица 1.

Схема введения транс-анетола, эвгенола и совола в экспериментах лабораторным животным

.Ve Сроки Условия экспериментов

i серии экспериментов

1 7 дней [т-Ан (50: 250 или 500 мг/кг), ежедневно

2 i 23 дней ! 5 раз в неделю т-Ан (50 или 250 мг/кг/дн.), за 5 : дней до забоя - одноюэатно совол. 50 мг/кг

3 60 дней : совол (50 мг/кг) 1 раз в неделю 5 недель, на 17-й 1 ! день после последнего введения совола - т-Ан (250 •: иг/кг), ежедневно. 8 дней

4 40 дней совол (20 или 50 мг/кг) 1 раз в неделю в течение 5 недель

5 3 дней , эвгенол (250 или 500 мг/кг;, ежедневно

Для изучения влияния транс-анетола in vitro на скорость монооксигеназ-ных реакций использовали микросомы печени ннтактных крыс и индуцированных однократным введением совола (50 мг/кг) за 5 дней до забоя.

Микросомальную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования на ультрацентрифуге "Beckman-L5" из постмитохондри-альной фракции (10 000 g 15 мин.) при !05 000 g в течение 60 мин. В изолированных микросомах определяли содержание белка по методу (Lowry е. а.. 1951), шггохромов Р-450 и in по методу (Omura. Sato. 1964), на двухлучевом спектрофотометре "Hitachi-557". Реакции О-деэтилироваиия 7-этоксикумарина и 7-этоксирезоруфина оценивали по скорости образования продуктов реакции

гидроксикумарнна к гидроксирезоруфина соответственно, определяемых на спектрофлуориметре ''Hitachi - MP - 43А" (Lake. 1987). Скорость О-деметшш-рования п-нигроанизола определяли по количеству образующегося п-нитро-фенола. спектрофотометрически на СФ-26 (Карузнна И.И. и др.. 1979). При определении транс-анетол-О-деметилазной активности измеряли количество образующегося формальдегида по методу (Nash, 1953).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение влияния транс-анетола in vitro на скорость монооксигеназных реакций

Результаты исследований изменения активностей п-нитроанизол -0-де-метилазы и 7-этоксккумарин-О-деэтилазы под влиянием транс-анетола в реакциях in vitro представлены на рис.1.

Введение препарата в инкубационную среду приводит к резкому снижению скорости окисления п-нитроаншола на 80-85% по сравнению с контролем в интактных микросомах и на 84-91% в микросомах печени крыс, индуцированных соволом.

Наблюдается значительное подавление активности 7-этоксикумарин-О-деэтилазы (на 39: 71 и 86% - в интактных, и на 35; 74 и 820/о - в нндуцированных микросомах) под воздействием транс-анетола а конечных концентрациях 0,1: 0.5 и 5 иМ соответственно.

Полученные данные об ингибирующем действии транс-анетола in vitro на метаболизм других ксенобиотиков, согласуется с имеющимся в литературе (Marcus, Lichtenstein, 1982).

Можно полагать, что подавление активности микросомальных монооксигеназ является следствием способности транс-анетола связываться с активными центрами цитохрома Р-450. Поскольку сам транс-анетол является субстратом моно-оксигеназной системы, его ингибирующий эффект на окисление других липо-фильных соединений, по-видимому, может быть обусловлен конкуренцией за каталитически активные центры монооксигеназ. Нельзя исключить и возмож-

ностн его влияния на физико-химические характеристики микросомальных мембран, в частности, на свойства их ттидносо компонента.

в

о

¡4

CJ

О

S я

н

■х <

100

50

! 2,5

10

г-Ан (цМ)

100

50

lb

0,1 0,5

» 10

т-Ан (цМ)

Рис. 1. Влияние транс-анетола in. vitro на скорость метаболизма некоторых субстратов в микросомах печени интактных-Q- и индуцированных соволом крыс

А - О-деметилирование п-шггроанизола; В - О-дезтилирование 7-этокси-

кумарина

3.2. Изучение влияния транс-анетола на активность ионооксигеназной системы в зависимости от доз

Согласно данным о состоянии монооксигеназной системы печени крыс, получавших транс-анетол в течение 7 дней (табл.2), доза 50 мг/кг/дн. не вызывает существенных изменений активности микросомальных ферментов. Не изменяется содержание микросомального белка и цитохрома Р-450. При введении дозы 250 мг/кг отмечается некоторое увеличение активности О-деэтилазы 7- тгоксирезоруфина. У крыс, ежедневно получавших транс-анетол в дозе 500 мг/кг, наблюдается достоверное увеличение содержания щггохромов Р-450 и в? , сопровождающееся значительным ускорением О-деметшшрования транс-

анетола. Повышение скорости окисления п-нитроанизола недостоверно, однако, существенно (в 2,2-2,4 раза) возрастают скорости О-деэтилирования 7-этоксикумарина и 7-этоксирезоруфина.

Эти данные свидетельствуют о том. что транс-анетол в высоких дозах индуцирует монооксигеназную систему печени крыс.

Таблица 2.

Активность монооксигеназной системы в микросомах печени _крыс, получавших различные дозы транс-анетола_

Плшитгл, кокгршъ трамс-инетол мУкг/дн.

| 50 | 250 : £00

Цитохром Р-450» 10,47 г 0,581 12.83 ±1.351 9.58 ± 0,82' 13,50 - 0.95*

Цитохром В 5* 8,37 т 0.601 10.74 г 0.841 8.11 г 0,321 12.08 г 3.68*

О-демепиирование п-НА6 20.94 ± 3.171 20.42 ± 1.661 20.69 ± 2.07 1 26.68 ± 0.84

О-деметилирование т-Ан» 6,96±1.041 8.14 + 1.381 9,05 ± 0,851 12.55 :0.56«

О-деэтишгрование 7-ЭК6 12.65 =1,891 13.07 ± 2.021 12.77 ± 3.01 ! 27.36 = 4.64«

О-деэтилирование 7-ЭР6 0.511 = 0.0451 0.557 ± 0.0271 0,846 ± 0.1244 1,230 ± 0,059»

Белок, мг/г печени 14.80 ± 1.151 17.34 = 0.461 16.10 ±0.85! 17.20 - 0.72

Примечание: Средние данные (М+га) из 5 - 6 опытов: х - р < 0,05;

а - нмоль/г печени: б - нмоль/ мин/г печени.

При совместных исследованиях (Лашнева Н.В. и др., 1991) установлено, что изменение состояния монооксигеназной системы носит обратимый характер. длительность его индуцирующего действия сопоставима с эффектом фенобарбитала. При этом отмечается повышение активности как шггохром Р-4501А-. так ¡1 шггохром Р-4502В-зависимых монооксигеназ. л. сухи по выявленным изменениям системы цитохрома Р-450, можно полагать, что транс-анетол оказывает на монооксигеназную систему печени индуцирующее действие смешанного типа, для которого характерна стимуляция синтеза форм цитохрома Р-450. специфичных как для фенобарбиталового, так и для метилхолантренового типа индукции (Оие^епс!! е.а.. 1982).

Таким образом, индукция шгеросомальных монооксигеназ является одним из наиболее чувствительных показателей биологического действия трансанетола.

3.3. Изучение подострого действия транс-анетола и его влияния на индуцирующий эффект полихлорированных дифенилов

Изменения активности системы цитохрома Р-450 при подостром воздействии транс-анетола характеризуются увеличением скорости отдельных монооксигеназных реакций. При дозе 50 мг/кг/дн. более чем в 1.5 раза по сравнению с контрольным уровнем повышается активность О-деэтилазы 7-тгокси-резоруфнна. Доза 250 мг/кг вьиывает повышение скорости практически всех субстратов, за исключением л-шпроанизола ( рис.2 ). Примечательно, что в микросомах печени крыс, получавших транс-анетол в дозах 50 и 250 мг/кг, значительно усиливается О-демепстгрование самого транс-анетола, что свидетельствует о повышении скорости основного пути метаболизма и по всей вероятности. способствует ускорению его выведения из органшма.

После однократного введения совола ( рис.2 ) интактным животным, общее содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени практически удваивается. Достоверно возрастают скорости О-деметилирования транс-анетола и п-нитроанизола. в 1.6 и 2,2 раза соответственно, активность О-деэтилазы 7-этоксикумарина увеличивается в 3.2 раза и наиболее значительно, в 8,7 раза, повышается скорость окисления 7-этоксирезоруфина ( по сравнению с соответствующими величинами в контроле).

Обнаруженное у получавших совол крыс увеличение скорости метаболизма транс-анетола и 7-этоксирезоруфина согласуется с представлением о смешанном типе его индуцирующего действия и дополняет сведения об индуцируемых им монооксигеназных активностях. Обращает на себя внимание, что из всех изученных реакций, у индуцированных соволом животных, наиболее резко возрастает скорость окисления 7-этоксирезоруфина, субстрата, специфичного для цитохрома р-4501А1. Высокая степень индукции 7-этоксирезоруфин - 0-де-этилазной активности может указывать на значительное увеличение содержания этой изоформы цитохрома Р-450 и ее пропорции в составе микросомально-го белка.

О

■00 .

500 —

Рис,

| •. ' I т-Ан 250 мг/кг

ИИИИ Совол 50 мг/кг

ШШШ. т-Ан(50)+совол

ШШШ т-Ан(250)+совол

х - р < 0,05 к I 2 3 4 5

2. Влиянне подосгрого воздействия транс-анетола на активность ио-нооксигеназной системы и ее индукцию соволом

1 - Цитохром Р-450

2 - демепилрование п-НА

3 - деметилирование т-Ан

4 - дезтилирование 7-ЭК

5 - дезтилирование 7-ЭР

J контроль

3 т-Ан 50 мг/кг

При введении совола крысам, получавшим транс-анетол в дозе 50 мг/кг/дн.. индуцирующий эффект совола существенно не изменяется ( см. рис.2 ). В то же время, при дозе 250 мг/кг не наблюдается достоверного прироста шггохрома Р-450 и значительно снижается степень индукции п-шпроанизо -0-деметилазной и 7-этоксикумарин - 0-деэтилазной активностей по отношению к одному соволу. Что касается 7-этоксирезоруфин - О-деэтилазы, то ее активность при комбинированном воздействии транс-анетола и совола не отличалась от таковой при введении только совола.

Необходимо отметить, что при комбинированном поступлении трансанетола (250 мг/кг) и совола наблюдались значительные индивидуальные различия изменений параметров монооксигеназной системы. По-видимому, отсутствие достоверного увеличения общего содержания цитохрома Р-450 можно объяснить этим фактом, хотя у некоторых крыс степень индукции была довольно значительной. Следует обратить внимание и на тот факт, что при комбини-

рованном введении препаратов, собственный индушгрующий эффект трансанетола практически не выявлялся.

Полученные результаты свидетельствуют о способности транс-анетола оказывать влияние на индукцию монооксигеназной системы печени полихло-рированными дифениламн, причем, степень изменений индуцирующего эффекта совола зависит от дозы транс-анетола. В свою очередь, совол оказывает модифицирующее влияние на биологические эффекты транс-анегола. Изучение различных параметров, характеризующих состояние монооксигеназной системы показывает, что 7-этоксирезоруфин - О-деэтилазная активность может служить высоко чувствительным тестом как при оценке биологического действия совола. так и при оценке транс-анетола.

3.4. Изучение действия транс-анетола после многократного поступления совола

На модели многократного воздействия совола изучен характер изменении моноокснгеназных активностей в зависимости от доз совола. Согласно имеющимся данным ( Тутельян В.А., Лаптева Н.В., 1987), однократная доза совола 20 мг/кг является пороговой, вызывающей достоверный прирост общего содержания шгтохрома Р-450 в печени крыс.

Таблица 3. Влияние многократного введения совола на активность монооксигеназной системы печени крыс.

Показатель однократная доза совола мг/кг

0 20 50

Цитохром Р-4501 12.64+0.89 42,3814,00* 57,S0±3,27X

Цитохром Bsa 10.60±0,91 24.45il.231 25.79+0,95*

О-деметилирование п-НА 5 10,41+0,87 25,46±1,23х 38,07+1,06 х

О-деэтилирование 7-ЭК 5 29,68+2,27 188,30+9,251 251,50±5,05х

О-деэтилирование 7-ЭР в 0,51±0,04 5.90±1,33х 6,07±0,06х

Белок, мг/г печени 12,404,52 18,50М,45 16,30Ю,98

Примечание: Средние данные (М±т) из 5 - 6 опытов: х - р< 0.001:

а - [шоль/г печени; б - нмоль/мин/г печени.

Как видно из табл.3, многократное введение совола вызывает резкую, зависимую от дозы индукцию микросомальных ферментов. Через 4 дня после последнего введения совола в дозе 20 мг/ кг , содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени возрастает в 3,8 раза, скорость О-деметилирования п-нитроаншола - в 2.5; О-деэтилировання 7-этоксикумарина - в 6,3: а 7-этокси-резоруфина - почта в 12 раз.

При однократной дозе совола 50 мг/ кг уровень цитохрома Р-450 повышается в 4,6 раза, а скорости деалкшшрования п-нигроанизола и 7-этоксикумарина в 3,7 и 8,5 раза соответственно, по отношению к контролю. Для 0-деэтилазы 7-ттоксирезоруфнна, в отличие от других показателей, не отмечается зависимости между выраженностью индукции и дозой совола, степень прироста скорости окисления 7- этоксирезоруфина при обеих дозах практически одинакова, в го же время, через 3 недели после прекращения введения совола она значительно возрастает, по сравнению со скоростью, регистрируемой через 5 дней после последнего введения совола (рис. 3).

Таким образом, многократное поступление совола в организм в сравнительно невысоких дозах, вьпывает дозозависимое повышение активности цитохрома Р-450, более выраженное, чем при однократном введении, что, скорее всего, является проявлением кумуляции полихлорированных дифенилов в организме ( Крятов И. А.. 1991 ).

У индуцированных соволом крыс, получавших и не получавших трансанетол, активность монооксигеназной системы печени существенно различалась. В микросомах печени крыс, получавших транс-анетол, изменения содержания цитохрома Р-450 и О-деметилирования п-нитроаннзола (относительно контрольного уровня ) оказались недостоверными, степень индукции 0-деэтилазы 7-этоксикумарина - несколько ниже, чем под воздействием одного совола. И лишь степень прироста активности 7-этоксирезоруфин - 0-деэтилазы у обеих групп животных существенно не отличалась (рис. ЗБ ). Как показали совместные исследования ( Лашнева Н.В. и др.. 1991 ). сходный характер изменений состояния МОС печени наблюдаеггся и в случае воздействия

транс-анетола на крыс, предварительно индуцированных соволом путем однократного введения дозы 50 мг/ кг. Различия касаются лишь степени индукции отдельных монооксигеназ.

Рис.3. Влияние многократного введения совола и последующего воздействия т-Ан на активность МОС печени крыс

1 - Цнтохром Р-450 3 - О-деэтилирование 7-ЭК

2 - О-деметилнрованне п-НА 4 - О-деэтилнрование 7-ЭР

А - через 4 дня после последнего введения совола Б - через 25 дней после последнего введения совола

т-Ан | 1 совол | | совол + т-Ан ЧШШШ

х-р <0,05

Следовательно, введение транс-анетола через 2 недели после многократного воздействия совола приводит к модификации эффекта смеси полихлориро-

ванных дифенилов на монооксигеназную систему печени крыс. Под влиянием транс-анетола выраженность индукции изученных моногеназных активностей уменьшается, за исключением 7-этоксирезоруфин - О-деэтилазной. Индуцирующее действие транс-анетола в условиях предварительного воздействия совола практически не выявляется.

Что касается изменений в микросомах печени крыс под воздействием одного транс-анетола, то после введения препарата наблюдается значительная стимуляция скорости окисления 7-этоксирезоруфина и тенденция к повышению скорости окисления для других субстратов. Следует отметить, что в этом эксперименте к моменту введения транс-анетола крысы достигали возраста 3-3,5 мес., т.е., в отличие от предыдущих опытов, исследования проводили на половозрелых животных.

Таким образом, при комбинированном воздействии транс-анетола и по-лихлорированных дифенилов характер изменений параметров монооксигеназ-ной системы отличается от такового при их раздельном введении. Учитывая. 410 использованная в экспериментах доза совола 50 мг/кг, как было показано ранее является умеренно индуцирующей, можно было ожидать повышения активности монооксигеназ после введения другого индуктора даже при сходном механизме индуцирующего действия ( Лаптева Н.В., Тутельян В.А., 1984 ). Отсутствие такого повышения при комбинированном воздействии изучаемых веществ и наблюдаемое уменьшение отдельных монооксигеназных активностей, возможно, обусловлено конкуренцией за места связывания с внутриклеточными рецепторами ( ба^е, 1990 ). В то же время, нельзя исключить, что в основе обнаруженных изменений могут лежать и другие механизмы. Не исключена возможность, что под влиянием комбинированного воздействия смеси полихлориро-ванных дифенилов и транс-анегола могла индуцироваться именно та изоформа цитохрома Р-450. которая окисляет данные соединения до высокореакгивных производных, способных оказывать повреждающее действие на мембраны и мембраносвязанные ферменты эндоплазматического ретикулума. Можно также предположить, что в случае введения транс-анетола индуцированным животным в условиях стимуляции монооксигеназной системы наблюдается его уско-

репное выведение га организма за счет усиления метаболизма, в том числе, и по неосновному пути - с образованием эпоксидов ( Ба^БСег е.а., 1984 ). В этом случае, воздействие эпоксидов могло привести к повреждениям или частичной инактивации цитохрома Р-450.

Необходимо отметить, что во всех экспериментах при комбинированном поступлении в организм транс-анетола ( 250 мг/кг ) и совола имеет место усиление гепатотоксического действия изучаемых соединений. При гистологических исследованиях в печени наблюдаются выраженные структурные нарушения, вплоть до массивных очагов некротизации гепатоцитов.

3.5. Изучение действия эвгенола на активность микросомальных ферментов в зависимости от доз

Экспериментальные данные об шменениях функционального состояния

монооксигеназной системы печени представлены в табл.4. Наблюдаемое ускорение реакции О-деэтилирования 7-этокснрезоруфнна до 123% при дозе 250 мг/кг и повышение скорости О-деэтилирования 7-эгоксикумарина до 113 "/о. а 7-этоксирезоруфина до 149 % при дозе 500 мг/кг при расчете на 1 г печени оказались недостоверными. Не изменяется достоверно содержание шггохромов Р-450 и В5 , не отличается от контрольного уровня скорость О-деметилирования п-нитроанизола. Однако при расчетах на 1 мг белка н нмоль цитохрома Р-450 повышение активности 0-деэтилазы 7-этоксирезоруфина является достоверным (р<0.05).

Следует указать, что в этом эксперименте также использовались половозрелые крысы-самцы.

Возможно, что отсутствие выраженного индуцирующего эффекта на мо-нооксигеназную систему печени при воздействии эвгенола, являющегося структурным аналогом транс-анетола, связано с различиями в строении молекул изучаемых соединений, так как известно, что между молекулярной структурой ксенобиотика и его способностью к индукции существует определенная взаимосвязь ( Ляхович В.В., Цырлов И.Б.. 1981 ).

Таблица 4. Влияние эвгенола на активность монооксигеназной системы печени крыс

Показатель эвгенол мг/кг/дн.

контроль 250 500

Цитохром Р-450» 0,78610,028 0,821+0,051 0.83610,059

Цитохром Bsa 0,753+0,037 0,850+0,061 0,867+0,029

О-деметилирование п-НА .б 0,81410,067 0,860+0,049 30,84610,093

О-деэтилирование 7-ЭК 6 1.35010,245 1,411+0.204 1.58910,306

О-деэтилирование 7-ЭР б 0,03310,03 0,04310,006 0,055±0,07*

Примечание: Средние данные (М±т) из 6 опытов; х - р< 0,05; в остальных случаях р>0,05; а - нмоль/мг белка; б - нмоль/мин/мг белка.

Таким образом, при изучении воздействия метоксипроизводных бензола и поли хлорированных дифенилов на монооксигеназную систему установлено, что изменения активности цитохрома Р-450 при комбинированном воздействии отличаются от эффектов, наблюдаемых при раздельном поступлении в организм изучаемых соединений.

Показано, что транс-анетол в опытах in vitro ингибирует реакции окислительного метаболизма ксенобиотиков, а в условиях in vivo обнаружена его способность оказывать индуцирующее действие на цитохром Р-450. Индуцирующий эффект выявляется как при кратковременном( 7-8 дней ), так и более длительном ( 28 дней ) воздействии, имеет дозозависимый характер и сопровождается повышением общего содержания цитохрома Р-450, а также увеличением скорости монооксигеназных реакций, в том числе, 0-демеггилирования самого транс-анетола. Минимальный уровень, вызывающий индукцию монооксигеназной системы печени крыс в подостром эксперименте - 50 мг/кг массы тела в день.

При изучении влияния эвгенола показано наличие тенденции к повышению скорости окисления 7- этоксикумарина и достоверное повышение 7-этокси-резоруфин - О-деэтилазной активности.

Следовательно, индукция микросомальиых монооксигеназ является одним ш наиболее чувствительных показателен биологического действия природных метоксипроизводных бензола.

4. ВЫВОДЫ:

1. Моноокснгеназная система печет« крыс отвечает на воздействие природных метоксилроговодных бензола, транс-анетола (1-метокси - 4-пропенил-бензола ) и эвгенола ( 2-метокси - 4-ашшлбензола) повышением активности отдельных монооксигеназ. Судя по выявленным изменениям активностей монооксигеназ, можно полагать, что транс-анетол вызывает индуцирующий эффект смешанного типа, для которого характерна одновременная индукция изоформ шггохрома Р-450, принадлежащих к семействам как Р-4501А, так и Р-4502В. Эвгенол достоверно повышает лишь активность 7-этоксирезоруфин - 0-деэтилазы, изоформы цитохрома семейства Р-4501А.

2. Впервые дана характеристика влияния транс-анетола на индукцию системы цитохрома Р-450 полихлорированными дифешшами. Показано дозоза-висимое изменение активности микросомальных ферментов при комбинированном поступлении транс-анетола и совола в организм, сопровождающееся снижением общего содержания цитохрома Р-450 и уменьшением скорости О-деалкилирования п-нитроанизола, транс-анетола и 7-этоксикумарина ( по сравнению с воздействием одного совола).

3. Выявлен антагонистический характер проявления сочетанного воздействия транс-анетола и полихлорированных дифенилов на монооксигеназную систему печени крыс, причем, выраженность взаимного влияния зависит от дозы транс-анетола. Показано, что под влиянием совола индуцирующий эффект транс-анетола снижается, вплоть до полного подавления при дозе транс-анетола 50 мг/кг/дн. В свою очередь, степень индукции цитохрома Р-450 соволом значительно снижается под воздействием транс-анетола ( 250 мг/кг/дн. ), что выражается в снижении уровня цитохрома Р-450 и активности 0-деалкилаз. за исключением 0-деалкилазы 7-этоксирезоруфнна. активность которой повышается

примерно до одного уровня как под влиянием только совола, так и при комбинированном воздействии изучаемых соединений.

4. Установлено, что при комбинированном воздействии транс-анетола ( 250 мг/кг ) и поли хлорированных дифенилов имеет место усиление гепато-токсического действия этих соединений ( по сравнению с эффектами при раздельном поступлении ), хар актер из уещееся выраженными структурными нарушениями в печени, вплоть до массивных очагов некротизации гепатоцитов.

5. Впервые получены данные о состоянии монооксигеназной системы печени при многократном воздействии совола. Показано, что ответная реакция системы цитохрома P-4S0 при подостром воздействии совола в умеренно индуцирующих дозах сопровождается дозозависимым повышением уровня цито-хромов Р-450 и B5 и увеличением скорости окисления 7-этоксикумарина и п-нитроанизола. Но наиболее резко по сравнению с контрольным уровнем, независимо от доз, повышается активность 7-этоксирезоруфин - 0-деэтилазы. Полученные результаты свидетельствуют о значительном повышении активности микросомальных ферментов при многократном поступлении совола в организм, по сравнению с однократным, что может бьггь следствием кумуляции полихло-рированных дифенилов в организме.

6. Рекомендовано использовать изучение состояния монооксигеназной системы при токсиколого-гигиенической оценке и регламентации пищевых добавок и конгаминатов в пищевых продуктах и объектах окружающей среды, с учетом вероятности сочетанного поступления их в организм.