Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение цитогенетических особенностей формирования адаптивных реакций в связи с активационными свойствами кальмодули у DROSOPHILA MELANOGASTER
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Изучение цитогенетических особенностей формирования адаптивных реакций в связи с активационными свойствами кальмодули у DROSOPHILA MELANOGASTER"
f •
о
г
Я; РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК.
со
, ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ Имони И. П. ПАВЛОВА
На правах рукописи
ТОКМАЧЕВА Елена Владимировна
ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ФОРМИРОВАНИЯ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ В СВЯЗИ С АКТИЕЛГЩОННЫМИ СВОЙСТВАМИ КАЛЬШДУЛИНА У ПИЗЗОРНИА МЕЬАЮЗАБТЕ!?
Специальности: 03.00.13 - физиология человека и животных 03.00.15 - генетика
■АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 1995
Работа выполнена в лабораториях генетики высшей нервной деятельности и сравнительной генетики поведения Института физиологии им. И. Е Павлова РАН
Научный руководитель - ведущий научный сотрудник лаборатории генетики ШД Института фиеиологии иы. И. П. Павлова, доктор биологических наук Б. В. Савватеева.
Официальные оппоненты:
1, Профессор, доктор биологических наук ЕЯ Шварцман (Государственный Шдагогкчеокий Университет, Санкт-Петербург)
2. Доктор биологических наук Е А. Емельянов (Институт физиологии им. И. Е Павлова РАН) '
Валдае учреждение: и_ R Сеченова
Защита состоится ". ^Cc^vjQyS 1995 года в 11°° час. на ЁаседаяиИ Диссертационного совета К 002.3Q. 01. Института физиодогил им. И. Е Павлова по адресу: 16903-1, Саню-Петербург, наб. Макарова, б. '
О диссертацией можно оенакомиться в библиотеке Института физиологии иы. И Е Павлова РАЕ
Автореферат разослан " ¿-¿fl'^Al 1995 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологичеашх наук
Э. А. Конеа
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Известно,-что формирование адаптивной реакции осуществляется на разных структурных уровнях организма, вкл чая генетический аппарат клетки. При этом, если ранее большая часть работ была посвящена регуляции экспрессии генов в процессе адаптации (Braam,Davis, 1990; Мамон,Куцкова-, 1993), то в последнее время уделяется большое внимание изучению цитогенетичоских характеристик, изменяющихся в ответ на различного рода внешние, воздействия и отражающих изменения функционирования хромосомного аппарата или пространственной организации хромосом в ядре (Медведева и др., 1995).
Изучение механизмов, при помощи которых генетический аппарат участвует в процессе адаптации организма к окружающей среде, высшей формой которой можно считать обучение, является одним из наиболее актуальных вопросов как физиологии, так и генетики.
Согласно концепции системной регуляции ведущее место в формировании • адаптивных реакций занимает нейроэндокринная система, которая оказывает регулирующее влияние на всех уровнях организма, включая генетические и цитогенетические процессы," по принципу обратной связи в соответствии с нуждами организма, требованиями окружающей среды и индивидуальным опытом (Лобс. ;ев, 1947; Пономарен-ко, 1970).
Б основе общих молекулярных механизмов регуляции функций нервной системы и состояния генетического аппарата лежит система внутриклеточных регуляторов (вторичных посредников), важным звеном которой, является белок-рецептор ионов кальция - кальмодулин (Kai»;. Ему отводится одно из ведущих мест .:: клеточной регуляции: КаМ -принимает участие в регуляции клеточного цикла (Anraku et al., 1991), митотических и мейотичес-ких /учений (Chafouleas et al., 1984; Vasserman, Smith, 1981), процессов расхождения и конденсации хромосом (Geiser et al., 1993). Доказано.участие системы цАШ-КаМ в процессах обучения (см. обзоры: Савватеева, 1991;' Tully, 1994). Имеются данные, позволяющие говорить об участии КаМ в процессах адаптации (Braam,Davis, 1990), в то же время о значении его генетически детерминированных акти* гционных свойств при формировании адаптивных реакций на хромосомном уровне в ответ на действие стресс-факторов известно немного (Медведева,Савватеева, 1991).
Удобным объектом исследования, позволяющим изучать генети-
ческие и физиологические процессы как в норме, так и при адаптивном ответе на стрессируквдю воздействия, является Drosophila melanogaster. Широкий спектр воздействия Са-КаМ регуляторной системы на различные процессы позволяет предположить следующее: если мутация затрагивает какие-либо функции внутриклеточных посредников, то можно ожидать возникновения изменений на различных уров-- кях структурно-функциональной организации.
Е Институте физиологии им. И. IL Павлова была создана коллекция тэмперзтуро-чувствительных мутантов дрозофилы с измененным метаболизмом вторичных посредников, опосредующих формирование адаптивных реакций, в том числе способность к обучению (Савватеева и др. , 1978), Наибольший интерес для нас представляли мутанты по гену agnostic. Гак, для мутанта agnts3 характерно изменение способности к обучению и увеличение активности КаМ-зависимий формы ФДЭ-1 за счет повасения активационных свойств КаМ.
Использование линии a?nts3 с известным биохимическим проявлением предоставляет уникальную возможность для изучения роли КаМ и влияния его активационных свойств 'на цитогенетические признаки как в корме, так и в процессе формирования адаптивных реакций в ответ на стрессорныа воздействия.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение влияния изменения активационных свойств КаМ, у мутантной линии agntsS на генетические процессы и цитогенетические характеристики, коррелирующие со способностью к формированию адаптивных реакций. В ходе работы были поставлены следующие задачи:
■ ' 1. Изучить роль С^КаМ регуляторной системы в процессах формирования адаптивных клеточных реакций на действие стресс-факторов, исследуя реакцию мутантной линии agnts3 на тепловой шок (ТШ), определяя', в качестве параметра состояния хромосомного аппарата, частоту нерасховдений и потерь половых хромосом.
2. Исследовать особенности регуляции клеточного цикла: оценить митотическую активность клеток головного нервного ганглия личинок и сопоставить ее с уже имеющимися данными об эмбриональной ts-летальности данной линии.
3. Оценить роль системы Са-КаМ в регуляции митотической активности клеток головного нервного ганглия личинок.
4.* Выявить специфичность действия мутации по гену agnostic, используя генетические модели, позволяющие анализировать влияние числа аллелей исследуемого локуса на изучаемые признаки.
Б. Проанализировать данные, полученные при изучении расхождения половых хромосом при.ТШ в связи с особенностями клеточных делений линии agnts3, сопоставив их для этого с данными, полученными при исследовании линии l(l)ts403, с дефектами з системе белков теплового шока (БТШ) и абиормальным расхождением хромосом.
6. Сопоставить полученные ранее для линии agnts3 данные об изменении активационных свойств КаМ с особенностями клеточных делений и обучения у данной линии.
Научная новизна работы. Впе'рвые показано влияние генетически детерминированных активационных свойств КаМ на пролифератигшую активность клеток головного нервного ганглия и расхождение половых хромосом в норме и при действии стресс-фактора (теплового шока). Продемонстрировано, что мутация по гену agnostic слияет на регуляцию клеточных делений. Выявленное изменение митотичесной активности клеток головного нервного ганглия в сочетании с ранее полученными данными о температуро-чувствительной эмбриональной и постэмбриональной летальности линии agnts2 позволяет предположить, что agnts3 можно отнести к разряду "митстических мутантов",' .у которых наблюдаются изменения клеточного цикла. Высказано предположение о влиянии изменения митотической активности клетс.ч головного нервного ганглия личинок на нейрогенег.
Практическая ценность работы. Создана удобная экспериментальная модель для анализа роли Сгг-КгМ регуляторной системы г организации адаптивных ответов на стресс, основанная ка специфических (КаМ-обусловленных) различиях дикого типа и мутанта agnts3 по пролиферативной активности в головном нервном ганглии личинок. Модель позволяет оценивать как действует тот или иной фактор, анализируя параметры клеточного цикла и поведение хромосом. Кроме того, результаты работы могут быть использованы при целенаправленном поиске эффективных средств повышения адаптивных возможностей организма путем изменения характеристик внутриклеточных регу-. ляторных систем.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на 1 Санкт-Петербургской городской конференции молодых ученых '"Механизмы регуляции физиологических функций", • С-Петербург. 1992; докладывались на нейробиологнче'ской конференции "fiei »е-Bra in-Behavior", Gottincen, 1993, на' симпозиуме "'Молекулярно-клеточные и генетические механизмы адаптивного поведения", С-Петербург, 1994, на научных лабораторных и меклабораторных-семинарах.
б
Сбьем работы. Диссертация изложена на 120 страницах, состоит из введения, 3 глав, заключения и выводов, содержит 10 таблиц и 10 рисунков. С. ¡сок литературы включает 158 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали мутантные линии Drosophila melanogas-ter: agnts3 (1-38,9; 11A7-B), характеризующуюся изменениями метаболизма вторичных посредников и способности к обучению (повышенной при 22°С и пониженной, при 29°С); l(l)ts403, с дефектами в системе белков теплового шока, и линию дикого типа Canton-S (CS), служившую контролем.
Для выявления специфичности действия мутации по гену agnostic на изучаемые признаки были использованы дополнительные генетические модели - линии : Df/CS и Df/agnts3, полученные в результате скрещивания самок балансерной линии UT/FW, у которой отсутствует район Х-хромосомы, содержащий ген agnostic (границы деле-ции Df( 1)112: 38,1+0,54"- 41,02+и,62), с самцами линий CS-и agnts3. • Таким образом, мы могли варьировать число аллелей иееле-дугмогс локуса и оценивать, каким образом это скажется на 'изучаемых признаках.
Для оценки состояния хромосомного аппарата в норме и при стрессе изучали процесс расхождения половых хромосом в мзйозе (определяя частоту возникновения нерасхоздений и потерь хромосом вследствие ТШ) и активность клеточных делений в митозе.
Для изучения мктотичрской активности клеток головного нервного ганглия и.анализа митотических хромосом использовали личинок дрозофилы третьего возраста, которых отбирали в соответствии с физиологическим тестом (Rensing, Hardeland, 1S72).
Определение частоты потерь и нерасхождений половых хромосом при TllL. Девственных самок исследуемых-линий подвергали температурному. воздействию в ультратермостате U-10 в течение 1 часа при 37°С и 29°С и индивидуально скрещивали с 2 самцами генотипа waB. ¡Ьоизволчли подсчет регулярных и исключительных особей в первом поколении скрещивания, полученном после 3-дневной кладки. Регулярные самки имел фенотип В/+ (глаза бобовидные красные), а регулярные самцы - фенотип дикого т1ша (круглые красные глаза). Появление самок дикого типа (XXY) указывало на произошедшее «¿расхождение Х-хромосом, появление самцов w*B (Х0)( глаза полссо-чидные абрикосового цвета) могло указывать как на нераехождение,
1 I
так и на потерю хромосом. Частоту появления исключительных особей оценивали как отношение числа исключительных самок или самцов к числу регулярных самок плюс число исключительных самцов (}&мое и др., 1990). Для ка;?когс варианта опыта было сделано по пять пов-торностей. В одной повторном;■■ анализировали потомство 25 самок. Статистическую обработку проводили с помощью г,-критерия Стьэдента при Р< 0,05. Для гетерогенных выборок использовали V-преобразование Фишзра. В среднем, в одном варианте опыта для каждой линии было проанализировано от 2 до 4 тысяч мух.
Приготовление и анализ препаратов митотических хромосом из нервных ганглиев личинок дрозофилы. При изучении митотической активности клеток головного нервного ганглия препараты готовили по методике Гатти (Gatti et al., 1974) в нашей модификации.
Нерзные ганглии личинок третьего возраста выделяли в физиологическом растворе Эфрусси-Бидла, в течение 4-5 минут обрабатывали 1 7. раствором цитрата натрия и переносили на предметное стекло £ каплю 45 % уксусной кислоты, где их измельчали при помощи микропипетки. Препараты зысушвали на воздухе. Окраску проводили з течение 10-15 минут in situ - капая акридин орэ.нкевык в концентрации 0,05 мг/мл на препарат. Препараты ополаскивали дистиллированной водой, заключали в физиологический раствор и заклеивали лаком.
Анализ препаратов проводили с помощью люмшшсцентнсго микроскопа "Люмам - Р2" при увеличении хЮОО. Величину митотического индекса (Ж) рассчитывали как отношение числа деляшихия ядер на препарате к общему их числу. Для определения МИ анализировали 10 препаратов для каждой линии в одном варианте опыта, при этом учитывали не менее 1000 ядер на препарат. Для оценки достоверности различий ме?еду линиями, а такие меэду. контролем и опытом, применяли одно - и ДЕухфакторный дисперсионный анализ с построением доверительных интервалов по методу Шеффе (Афифи, Эйзен, 1982).
Для изучения действия икгибитош кальмодулина на митотичес-кую активность отпрепарированные нервные ганглии предварительно обрабатывали трифторперазином (10"3М) в течение 20 минут, после чего препараты готовились по описанной выше методике.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние теплового дюка на частоту нерасховдений и потерь половых хромосом у самок Р. nelanogaster линии agntsS
Удобной моделью для выявления влияния различных систем клеточной регуляции на состояние хромосомного аппарата является не-расховдение половых хромосом в результате действия стресс-факторов на самок дрозофилы. Эга модель широко применяется в генетическим исследованиях. В частности, сна была использована при изучении сктеми БТШ в коррекции повреждений, вызываемых тепловым шоком (Мамон и др., 1990). Мы использовали эту модель в целях изучения роли вторичных посредников в формировании адаптивных реакций на действие Till на хромосомном уровне.
В данной части работы мы учитывали частоту возникновения исключительны;: особей в потомстве самок линии agnts3, подвергшихся температурному воздействию, которая отражала частоту нераехолще-ний и потерь половых хромосом в редукционном делении ооцитов. Использовали воздействие температурой 29вС и 3?°С в течение одного часа. Температурное воздействие 37С'С вызывает в клетке события, характерные для реакции ТШ, в частности, нарушения в функционировании хромосомного аппарата. Температура 29°С была выбрана б связи с тем, что она является критической для развития линии agnts3. Для выявления различий между мутантной и контрольной линиями в качестве контрольной использовали линию дикого типа CS.
Для выявления специфичности действия мутации по гену agnostic на частоту нерасхолздений и потерь хромосом использовали линии, имеювде нехватку по данному району: DF/agnt.s3 и Df/CS. В данном случае, имело место варьирование дозы гена, так как му-тантная'аллель (для Df/agnts3) или аллель дикого типа (для Df/CS) находилась в компаунде с аллелью, имеющей делецию по гену agnostic. Использование хромоссм с делецией по району, содержащему изучаемый локус помогает выявить специфичность действия мутации и способствует пониманию действия продукта гена дикого типа.
Выли получены следующие результаты (см. табл.1). В контроле (без воздействия) все 4 линии не различаются неаду собой, частота спонтанною возникновения нерасхождений и потерь половых хромосом практически равна'нуля. При воздействии 29 °С различия между линиями также не были выявлены. Очевидно, что 1 часовое температурное воздействие (29°С) является недостаточным для возникновения заметных нарушений в функционировании хромосомного аппарата. При воздействии 37°С у линий CS и Df/Со наблюдалось достоверное повышение частоты появления исключительных особей по сравнению с контролем, причем у линии СЗ наблюдалось только иовыкение частоты
Таблица 1
. Частота возникновения неключптельных самцоз в норме и при температурных воздействиях (в %)
линия . сз - адт^З ' РГ/СЗ РУа^З
контроль о 0,05 0,05 0,17
1=29 °С 0,09 0,03 0,08 0,11
1=37°с 0,39 * 0,08 0,41** 0,19
Частота возникновения исключительных самок в норме и при температурных воздействиях (в %)'
дигттшт_СБ_а^З_РГ'СЗ 1У/а§П5ГЗ
кошроль о 0 0,03 0,14
1=29 °С 0,05 0 0 0,11
И37°С 0,10 ' 0,12 0,31** 0,16
* - Различия между контролем и температурным воздействием 37"С для лот,и С5 достоверны (Р<0.05);
** - Различия между контролем и температурным воздействием 37"С для линии ОГ/СЯ достоверны (Р<0.05).
Таблица 2
Мшотеческий индекс в клетеах головного нервного ханглия личинок дрозофилы (в %) .
линия_СЭ_РГ/СЗ__з^З_Р^а^З 1(1)Ы03
%. .1,8 ±0,12 1,51 ±0,12 3,23±0,,1б* 2,92±0,1б** 1.05±0,10#
* - Различия Между линиями С5 и а^ГБЗ достоверны (Р<0.05);
** - Различия между линиями ОС/СБ и ГЖ^шЗ достоверны (Р<0.05);
# - Различия между линиями СЙ и 1С! ^403 достоверны (Р<0.05).
. ю
исключительных самцсв, тогда как у линии Df/CS увеличивалась частота появления исключительных как самцов, так и самок. Это может быть связана с том, чго здесь существует зависимость от дозы гена. По- видимому, этот генотип оказывается менее устойчивым к действию ТШ и использование гетерозиготы, имеющей одну аплель с делецией по изучаемому гену, в данном случае, подчеркивает фено-з'ипическое проявление признака. Для лиш agnts3 различия между контролем и опытом не, наблюдалось, также как' и для линии Df/agnts3, чгс подтверждает специфичность действия мутации по гену agnostic.
Тот факт, что частота возникновения исключительных особей у линии, мутантной по гену agnostic, не увеличивается при ТШ в отличие от контрольной лигши дикого типа, представляет особий интерес, так как в данном случае мутаций является "положительной" в адаптивном смысле, поскольку, несмотря на действие ТШ, частота возникновения нерасхождений или потерь половых хромосом не повышается.
Одной из возможных причин нарушения расхождения хромосом при •Till Mo:tsr служить повреждение аппарата клеточного деления и изменение нормальной структуры хроматина. ТШ может вызывать изменение конформационных свойств хромосомных белков, что в свою очередь может привести к хромзтидным и хромосомным слипаниям (Тихомирова и др., 1984). Б связи г этим, можно предположить, что у нашего ьутанта при ТШ межхромосомкые агрегаты, мешающие расхождению хромосом, не образуются или быстро ликвидируются. Однако, не вполне понятно каким образом зто могло бы происходить. Существует предположение, согласно которому, в восстановлении повреждений, индуцированных ТШ и приводящих к слипанию хромосом, могут принимать участке белки теплозого шока (БТШ) (Камин, Куцкова, 1993) . Тог факт, что БШ семейства 70КД несут КаМ-связывающий домен (Stevenson,Calderwood, 1990) и что КаМ способен связываться с некоторыми белкам!!, входящими в состав цитоскелета, позволяет предположить, что Наблюдаемая у мутанта пониженная по сравнению с контролем частота возникновения исключительных особей, отражащая частоту возникновения нерасхождений и потерь половых хромосом, может быть связана с генетически детерминированными особенностями метаболизма вторичных посредников, присущих этой линии, а именно, с измененными свойствами КаМ, Кроме того, если исходить иэ предположения, что для КаМ линии agnts3 характерно повышенное сродс-
тво к ионам Са^ССавЕатеева, 1991), можно ожидать, что это приведет к более эффективной и быстрой регуляции концентрации внутриклеточного Са2+, которая повышается после ТШ (Calderwood, 1987). Повышение концентрации Са~+посе ТШ инактквирует Í4PF (maturation promoting factor), фактор, необходимый для нормальной конденсации хромосом и регуляции клеточного цикла, что может сказываться и на расхождении хромосом. Можно предположить, что мутантный КаМ. более эффективно связывая Са2+, способствует понижению его концентрации в процессе восстановления после ТШ, пригодя тем самым к реактивации MPF и, как следствие, к восстановлению нормальной конденсации хромосом и нормализации процессов, происходящих вс время деления клетки.
2. Изучение митотической активности клеток головного нервного ганглия личинок Drosophila melanogaster линии agts3 Во второй части работы изучали митотическую активность клеток .головного нервного ганглия личинок, используя, как и в первой ее части, дополнительные генетические модели - линии с делецкей по тому району Х-хромосомы, в котором локализован ген agnostic: Df/CS и Df/agnts3.
Было установлено, что при пермиссивной для линии agnts3 температуре 22°С у нее наблюдалось достоверное увеличение Ш по сравнению с контрольной .линией CS. Подобные данные были получены при сравнении линий, несущих мутантную аллель или аллэль дикого типа в компаунде с аллелью, имеющей делецию по гену agnostic, ми у линии Df/agr\ts3 был достоверно выше, чем у Df/CS, при этом, Ш agnts3 практически не отличался от МИ Df/agnts3 , то же наблюдалось для пары CS и Df/CG. Также, как и в аналогичной ситуации для предыдущего опыта , эти данные являлись своеобразным контролем и указывали на то, что наблюдаемое повышение МИ вызывается именно в результате действия данной мутации, причем, даже одной дозы гена достаточно для воспроизведения наблюдаемого аффекта. Полученные данные по всем исследуемым линиям представлены в таблице 2.
Повышение МИ у линии agntsS можно объяснить следующим образом. Из литературных данных известно, что увеличению пролифера-тивной активности клеток способствует низкое содержание цАМФ (Pardee et al. , 1978). Падение уровня цАМФ происходит в результате изменения активности ферментов синтеза и распада циклических нуклеотидов: .за счет увеличения активности ФДЗ или понижения ак-
тизности АЦ (Ney et al., 1969; Allen .et al., 1971). Тот факт, что у липки a¡rnts3 ранее было обнаружено повышение активности ФДЭ, особенно ее НаМ-зависимой формы ФДЭ-1 (Савватеева, 1991), позволяет предположить понгазние уровня цАМФ у данной линии, что могло бы объяснить увеличение МИ, как следствие повышения пролифератив-яой активности клеток головного нервного ганглия личинок. Таким образом, наши данные подтверждают цепочку, связывающую циклические нуклеотиды.с событиями клеточного цикла:
1'лМ +|[ Ca*0"'']—* j активности —! содержания —»- пролиферация 1 ФДЭ * цАМФ
Тот ¿акт. что у линии aents3 наблюдается изменение МИ, позволяет выдвинуть предположение, что она относится к числу так называемых "митотических" мутантов, так как обладает теми признаками, .которые считаются типичными для мутантов по клеточному циклу. А именно, проявлением одного из двух летальных фенотипов: эмбриональная летальность на стадии яйца, в том случае, если оно отломано самкой, гомозиготной по данной мутации, или летальность на поздних личиночных стадиях и на стадии куколки непосредственно для гомозиготной особи (Gomes «t al., 1993). Для нашего темлера-туро-чуБствительного мутанта при действии 29°С наблюдаются именно такие летальные фенотипы, в тех случаях, когда температурное воздействие совпадает с критическими стадиями эмбрионального и пос-тэ:лбрионал.ъного развития. Подобное температурное воздействие (которое не является летальным для имаго), вероятно, влияет на активность ферментов метаболизма цАМФ, что пагубно сказывается на клеточных делениях, сопровождающих процессы роста и может приводить к возникновению нарушений в структурах, подобных имагиналь-ным дискам, необходимых для перехода от стадии личинки к куколке. Это, в свою очередь, приводит к летальности, вследствие невозможности преодоления этого этапа развития. Тот факт, что летальность у agnts3 проявляется и на стадиях эмбрионального развития, и при переходе к стадии куколки, позволяет предположить, что продукт экспрессии гена, затронутого мутацией agntsS необходим как для реализации программы развития на личиночных стадиях, так и для осуществления метаморфоза.
С другой стороны, у всех мутантов по клеточному циклу наблюдаются изменения в поведении и морфологии хромосом в нейробластах личинок третьего возраста Так, например, для нейробластов личинок некоторых митотических мутантов характерно увеличение митоти-
*
ческого индекса, чрезмерная конденсация хромосом, растянутые и запаздывающие во время анафазы хроматиды (Glover, 1989; Axton ?t al., 1990). В нашем случае, мы можем говорить только о повышении Ш, как предположительном свидетельстве того, что изучаемая нами мутация затрагивает клеточный цикл.
3. Влияние трифторпераэина на мш-отическую активность клоток •
головного нервного ганглия личинок линии agntsS . Поскольку ген, мутантная аллель которого приводит к характерным для линии agnts3 эффектам, до сих пор не клонирован, к продукт его экспрессии неизвестен, возникает необходимость использования других экспериментальных подходов, подтверждающих тот факт, что в основе наблюдаемых изменений может лежать увеличение активационной способности КаМ. В связи с этим, мы проверял;: аффект действия ингибитора КаМ на митотическую активность клеток головного нервного ганглия личинок, применяя для этой цели триф-торпераеин (ТФГ1), ингибитор, использовавшийся ранее в биохимических исследованиях (Переслени, 1986). Предполагалось, что исгамш-эуя ТФП в правильно подобранной концентрации, можно воздействовать на активационпые свойства Kabi, что в свою очередь вызовет изменение активности ФДЭ-1, и проверить, как это скажется про-лиферативной активности клеток головного нервного ганглия личинок. Действительно, после воздействия ингибитором в концентрации 10"1 М в течение 30 минут на нервные ганглии личинок мутантной и' контрольной линий, различия, наблюдаемые в контроле мевду обеими линиями нивелировались, при этом величина Ш у линии agnts3 понижалась примерно в три раза (3,23 + 0,16X - до и 1,13 + 0,11% -после-обработки ТФП). Таким образом, было установлено, что наблюдаемое изменение иролиферативной активности клеток головного нервного ганглия личинок непосредственно связано с особенностями метаболизма вторичных посредников линии agnts3, и, в первую очередь, с повышением аетивационных способностей КаМ.
4. Влияние особенностей клеточного деления на протекание
генетических процессов у дикий agnt?3 и i(l)ts403 Установление того факта, что у линии agnts3 затронута регуляция клеточного цикла, открывает возможность для обсуждения связи мехду протеканием генетических процессов и особенностями кле: точных делений данной линии.
Повышенный уровень митотической активности у линии agnts3 ПОЭЕОЛЯ5Т предположить, что время .прохождения отдельных стадий клеточного цикла сокращается, вероятно, это справедливо не только для митотических, но и для мейотических делений. В зтом случае, уменьшение времени конъюгации хромосом уменьшало бы вероятность образования нежелательных мекхромосомных связей, которые могут возникать, к примеру , при стрессовых воздействиях. Кроме того, если предположить, согласно аберрационной гипотезе Тихомировой (Тихомирова, 1965), что в основе механизма нерасхождения хромосом может лежать возникновение разрывов и обменов между хроматидами, то уменьшение длительности конъюгации может приводить к понижению вероятности образования хроматидных разрывов и обменов, так как по некоторым данным, увеличение частоты кроссинговера может быть обусловлено именно повышенной длительностью хромосомной конъюгации (Lucchcsi, Suzuki, 1958; Барабанова, 1985). Таким образом, особенности клеточных делений линии agnts3 могли бы объяснить пониженную по сравнению с контролем частоту возникновения нерасхождения половых хромосом при действии ТШ.
В поль&у таких предположений свидетельствует тот факт, что у линии 1(1)403, характеризующейся дефектами ь системе БТШ, наблюдается обратная ситуация. У данной линии в результате действия ТШ наблюдалось увеличение- частоты нерасхождений и потерь хромосом (Мамон и др. ,1990). Для того, чтобы проверить, являются ли верными наши предположения о существовании возможной корреляций между скоростью «.легочных делений и частотой возникновения нерасходце-ния хромосом, вызванных ТШ, мы определяли митотический индекс в клетках головного нервного ганглия личинок у линии 1(1)403 таким же образом как и у линии a$;nts3. Било установлено, что МИ у 1(1) 403 достоверно ниже чем у контрольной линии СS (см. табл. 2). Таким образом, для лилии 1(1)403 мы наблюдаем ситуацию , противоположную по сравнение с исследуемым нами мутантом, то есть в данном случае, повышение_ частоты нерасхождения половых хромосом мосле ТШ могло бы, согласно нашей гипотезе, объясняться увеличением длительности конъюгации, что, однако, требует дополнительных экспериментальных доказательств.
Б. Веяние клеточных делений на морфологические корреляты обучения у мутантов с измененными метаболизмом вторичны:: посредников и способность» к обучению
Полученные нами данные о влиянии мутации по гену agnostic а а регуляцию клеточного цикла представляют интерес и в связи с объяснением причин измененной у мутантов agntsS способности к обучению, тем более что существуют данные о связи успешности обучения-с морфологией ответственных за него структур ( у млекопитаюанх и насекомых (Schweiler,Lipp, 1981; Bailing, 1S87), которые укагива-ют на зависимость морфологических коррелятов обучения от параметров клеточного цикла. Согласно литературным данным, можно предположить, что в основе обусловленных генотипом морфслсгических различий в структуре некоторых образований мозга, леляг различия в митотической активности, которые могут ■ влиять; на такие- параметры как размер, число и плотность распределения нейронных .? л а зонтов. Действительно, число нейронов, образующихся в любой части мозга может определяться рядом факторов, а именно, длтеллюс7г;о пролиферативного периода, продолжительностью клеточного цикга и числом клеток •■ предшественников из которой образуется популяция нейронов (Коуэн, 1982). Распределение клзток также связано с особенностями их клеточных делений: клетки' одной зоны мозга образуются одновременно, и ко времени завершения их делания в :<аздой области мозга имеется характерное распределение' клеток. Та мм образом, предполагается влияние длительности клеточных циклов и отдельных их стадий на иейрогенез.
С другой стороны, известно, что морфологические изменения мозга коррелируют со способностью к обучению. Так, например, у млекопитающих (крыс и мыгаей) выявлены генетически детерминирован? ные сдвиги на уровне анатомических особенностей мозга, коррелирующие со способностью к образованию условного рефлекса. Согласно, одной из гипотез, важнее значение может иметь число нейронов: разное число нейронов и соответствующее им неодинаковое число нервных связей может определять различный уровень функциональной активности определенных отделов центральной нервной системы и, в' конечном итоге, обуславливать ту или иную способность к обучению (Лопатина, Пономаренко, 1987). Наряду с этим существуют дачные о связи; успешности обучения с морфологией ответственных за него структур у насекомых. Было показано,, что з обеспечении процесса обучений' на ольфакторные стимулы у мутантов дрозофилы принимали участие грибовидные тела, в состав которых входят отростки клеток Кеяьсна (Heisenberg et al., 1985). Их число варьирует у мутантов дрозофилы, .различающихся по спссос-ности к обучении, к которым от-
1б:
носятся, например, такие мутанты, как dunce и rutabaga (Balling et al. , 1987). Принимая ьо внимание все перечисленные выше факты, шжно предположить, что изменение морфологии и числа нейронных элементов, отвечающих за обучение и память, может возникать в результате изменения длительности циклов клеточного деления и их отдельных стадий, и, з свою очередь, приводить к изменению способности к обучению.
В нашем случае, можно предположить, что повышение МИ также вызвано изменением длительности отдельных стадий митоза. Измененная митотическая активность клеток головного нервного ганглия личинок могла бы сказываться на нейрогеневе личинок исследуемой линии, приводя к каким-либо изменениям в структуре нервных ганглиев. В связи с тем, что более 90Z нейронов, образующихся во время личиночных стадий, сохраняется в вентральной нервной системе имаго (Truman, Bate, 1987), можно предположить, что изменения, формирующиеся в личиночных ганглиях, способны сохраняться и у взрос-, лых мух, приводя к изменению их способности к обучению при пермиссивных условиях.
Полученные нами данные также свидетельствуют о связи генетически детерминированных особенностей метаболизма вторичных посредников с изменением пролиферативной активности линии agnts3. В литературе описаны данные, свидетельствующие о том, что под контролем вторичных посредников, регулирующих клеточный цикл, находятся и морфологические корреляты обучения. Подтверждением этому служат изменения строения грибовидных тол, структур, участвующих в процесса обучения у дрозофилы, у мутантов с измененным метаболизмом вторичных посредников: дефектными КаМ-зависимой АЦ у rutabaga и ФДЭ-П у dunce (Technau 1984; Bailling et al. , 1987).
Нельзя не отметить также'тот факт, что в последнее время было показано, что многие мутанты, дефектные по способности к обучению, отличаются не только измененным метаболизмом вторичных посредников, но и имеют определенные изменения в регуляции клеточного цикла. Tsji, у мутантов dunce и rutabaga проявляются дефекты не только'в нейрогенезе, приводящие к нейроанатомическим структурным нарушениям, но и в эмбрио- и оогенезе. Предполагается, что некоторые дефекты развития, наблюдаемые у гомозиготы по dunce, являются следствием нарушений, происходящих при метаморфозе (Bellen et al.', 1 1S87), которые, в свою очередь, могут быть вызваны мито-тическими дефектами, возникающими при развитии структур, необхо-
димых для прохождения этой стадии. Еще одним примером могут служить мутанты по гену РР1, изоэнзима протеинфосфатазы 1, фермента, необходимого для дефосфорилированмя белков после оганчания деления клетки, которое осуществляется также при участии вторичных посредников. Этот мутант характеризуется измененной способностью к обучению (Asztalos et al., 19S3) и, вместе с тем, всеми признаками типичными для мутанта по клеточному циклу (Axton et al., 1990), то есть изменениями, свидетельствующими о нарушении нормального прохождения через клеточный цикл.
Таким образом, к тему факту, что мутанты, дефектные по метаболизму вторичных посредников, характеризуются измененной способностью к обучению, добавляется еще один, а именно, то, что, эти мутанты отличаются нарушениями эмбрионального и поетэмбрионально-го развития, вызывающимися, по всей видимости, изменениями в процессах клеточного деления. Б нашем случае, изменение активацион-цых свойств КаМ у мутантов по гену agnostic, приводят? к увеличению митотической активности,. могло бы способствовать возникновению морфологических изменений нервных ганглиев из-за изменения длительности стадий клеточного деления и скорости выхода из пролиферации, что частично объясняло бы наблюдающееся .у данного мутанта изменение способности к обучению.
ВЫВОДЫ
Изучение влияния изменения активационных сеойств КаМ у ку-тантной линии agnts3 на генетические процессы и цитогенетичесете характеристики, коррелярующиз со способностью к формированию адаптивных реакций позволило установить следующее:
1. Мутация по гену agnostic влияет на формирование адаптивных клеточных реакций на хромосомном уровне, а именно, стрессиру-кщее воздействие теплового тока у линии agntsS не приводит к характерному для стресса и других повреждающих воздействий повышению частоты керасховдений и потер! половых' хромосом в отличие от контрольной линии CS.
2. Мутация по гену agnostic, влияющая на функционирование системы вторичных посредников и на обучение, затрагивает, также, регуляцию клеточного цикла, приводя к увеличению митотической активности клеток головного нервного ганглия личинок у линии agnts3 по сравнению с контрольной линией CS. Сопоставление ранее полученных данных об эмбриональной и постзмбрионалыюй летальности
«
¿.инки agnts3 с данными о влиянии мутации по гену agnostic на клеточные деления указывает на тс, что agnts3 относится к числу му-тантоЕ по клеточному циклу. ,
3. Установленное повышение митотического индекса связано с генетически детерминированными особенностями метаболизма вторичных' посредников данной линии, а именно, с изменением активацион-ных свойств калъмодулииа, так как использование его ингибитора трифторперазина приводит к исчезновению различий в митотической активности мутантней и контрольной линий.
4. Специфическое действие мутации по гену agnostic на изучаемы« прианаг:и было подтверждено на примере линий Df/СЬ' и Df/a^rits3, имеющих делецию ло данному локусу: при изучении влияния числа аллелей иседудуемого локуса, было показано, что даже одной догы гена достаточно для воспроизведения эффекта, наблюдаемого для линий CS и agnts3 соответственно.
Б. Сравнение данных о частоте нерасховдений и потерь половых хромосом, иядуцируемых тепловым шоком , у исследуемой линии agntsS и линии I(l)ts4ü3, характеризующейся дефектами в системе белков теплоього шока, позволило предположить, что наблюдаемый для каждой из этих линий эффект может Сыть связан с особенностями их клеточных делений.
6. Сопоставление полученных ранее для линии agnts3 данных об изменении-активационных свойств КаЫ с особенностями клеточных делений и обучения этой линии позволило предположить, что на уровне контроля вторичными посредниками клеточного цикла шжет осуществляться регулирующее влияние генов на морфофункциональные характеристики нервней системы, коррелирующие со способностью к обучению.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ. ПО ТЕ1ЛЕ ДИССЕРТАЦИИ-
1. Медведева А. В. , Переслеш А. И. , Токмачевн Е. В. .Тюлькова Е. И. TS--мутации agnostic в изучении роли вторичню: посредников при стрессовых воздействиях у дрозофилы // В материалах съезда ЕОГиС. Минск. 199?:. С. 07.
'¿. Токмачева ?.. В. , Медведева А. В. , Савватеева Е. Е. Влияние теплового шока на расхождение хромосом у ta-мутанта- дроаофилы с измененной активность*) калъмодулииа // В сб. "Механизмы регуляции физиологических функции". С-Петербург. 1992. С. 105.
3. Токмачева Е. В. - Влияние теплового шока на расхождение
Х-хромосом у ts-мутанта дрозофилы с измененной активностью кгль-модулина // В сб. кратких научных сообщений "Экоген-4". Томск. 1994. С. 21.
4. Медведева А. В., Токмачева Е. R , Савватеева Е. В. , Корпиц;-кий Е С. Особенности организации генома -розофилы у мутантов с изменениями метаболизма вторичных посредников и .способности к Обучению // Физиол. »урн. 1995. Т. 81. N 8. С.
5. Токмачева ,Е. В. Изучение митотической активности клеток головного нервного ганглия личинок ts-мутанта дрозофилы с измененной способностью к оиучению и повышенными активациоиным'н свойствами кальмодулина//Журн. ВИД. 1995. T.V&.ßt-rn. 3. C,56£-Jjfi
6. Savvateeva Е., Peresleny I., Peresleny A. , Tokmacheva E. , Medvedeva A., Sharagina L Behavioral and biochemical effects of the agnostic gene mutations // J.'of Neurogenet; 's. 1993. V. 8. N 4. P. 247.
7. Savvateeva E., Peresleny I., 3eresleny A. , Tokmacheva E. , Medvedeva A. , Sharagina L. Analysis of the agnostic locus controlling cAMP metabolism, behavior and cytogenetic processes in Drosophila // In Proc. of the 21th Göttinnen Neurobiologie Conference "Gene-Brain-Behavior". Gottingen. 1993. P. 814.
АОЗТ "Текст", С-Пб, ул. Карбышева, 7 Î? 0 7 95 Зак. ТЖ
- Токмачева, Елена Владимировна
- кандидата биологических наук
- Санкт-Петербург, 1995
- ВАК 03.00.13
- Генетический полиморфизм мультилокусных маркеров и генных последовательностей ДНК в природных популяциях Drosophila melanogaster Северной Евразии
- Изучение генетической гетерогенности высокоинбредных линий Drosophila melanogaster
- hobo-элемент как фактор нестабильности генома Drosophila melanogaster в клетках генеративных и соматических тканей
- Изменения в геноме у дрозофилы, ассоциированные с отбором по адаптивно важному признаку "половая активность самцов"
- Характеристика белков центральной нервной системы в линиях Drosophila melanogaster, селектированных на изменение уровня двигательной активности