Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли крингловых структур молекулы плазмина в процессе протеолитического разрушения фибринового сгустка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли крингловых структур молекулы плазмина в процессе протеолитического разрушения фибринового сгустка"

я <1

А К А Д 15 М И Я НАУК У К Р А И II Ы ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. В. 11АЛЛАДША

На правах рукописи

АНДРИАНОВ Сергей Иванович

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ КРИНГЛШЯ СТРУКТУР МОЛЕКУЛЫ Ш1АЗМИНА В ПРОЦЕССЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО РАЗРУШЕНИЯ ©1БРИНОВОГО СГУСТКА

03.00.04. - ОИОХИМИЯ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Киев - 1092

Габота выполнена в Институте биохимии им.А.В.Паллалина АН Украшш

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор кудинов С.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор СТРУКОВА С.М.

доктор медицинских наук НАПАЯН Л.П..

Ведушая организация: Киевский НИИ отоларингологии

им.А.С.КоломиЯченко МЗ Украины

Защита состоится " 2 & " ' 199^ г. в час

на заседании специализированного ученого совета Д 0! 6.07.01 в Институте биохимии им.А.В.Паллалина АН Украшш по адресу: 252601, Киев-30, ул.Леонтовича, 9

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " ¿г» _у^о-очЬ 199_2.г.

Учешй секретарь уп

специализированного совета /¿¿^ръ-^^ КИРСЕНКО О.В.

реюсийсш; _ : ■

■'""О О У;

" ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Как следует из названия, функция фибри-нолитической системы в организме заключается в ферментативном лизисе фибриновых сгустков в кровяном русле. Основным компонентом фиОринолитической системы является плазшшоган - неактивный предшественник активного фермента ~ плазмша. Натипный плазмшгоген практически на взаимодействует в кровяном русле с фибриногеном, однако, как только под действием тромбина фибриноген превращается в фибрин, плазмяногеи сорбируется на сгусткак и включается в тромб.

Взаимодействие плазминогепа с белками фябринолитичвской системы регулируется структурными образованиями молекула плазминоге-на, которые получили название - лизинсвязмванцие участки. Эти уча стки играют центральную роль в регуляции механизма фябринолиза, модель которого была в общем виде сформулирована в 1978 году (Wimen, Collen). Установлено, что дмзинсвязыващие участки расположены в N-концевой части молекул] плазминогена, которая представлена пятью гомологичными повторами, образувдами своеобразные трохпотло • ВЫ9 структуры (Castellino et al.,1931; Novolchatny ot а1.,19в-1). Подобные трелю тле ви а образования, кменуомые кршп'лши, были обнаружены у целого ряда белков систем гемокоагулящш и фибраполиэа. Во всех этих белках крютли выполняют специализированные функции белок-белкового и белок-лилидного взаимодействия.

Если роль лизинсвязыващих участков плазминогепа в процессах сорбции на полимерном фибрине и в последующей его активации t-PA (Hoylaerts et al., 1982), так жо как и в процессе пврви'пюго взаимодействия с о^-аптиплазмшом (Wiman et al., 1979) сомпений не вызывает (более того установлены конкретные участки связывания, несущие основную функциональную нагрузку в них), то сведения о роли лизинсвязывакхцих участков в осуществлении фибрииолатической функции плазмина носят противоречивый характер. О одной стороны, установлено, что оькарбоновые кислоты являются мощными антифнбршюли-тикаш и юс ингибиторный эффект связан с нарушением специфических взаимодействий плазмина с полимерным фибрином, обусловленных ли-зинсвязиваккциш участками фермента (ßuoza et al., 1986). С другой стороны, не было обнаружено существенных различий в скорости гидролиза и в продуктах деградации фибрина (Ney, Pizzo, 1902) при

протеолитическом воздействии плазмина и мшвшлазмина (низкомолекулярной формой плазмина, в структуре которого отсутствуют лизинсвя-зывающие участки парных четырех кринглов нативного фермента) на фпбриновый сгусток.

Целью работы явилось исследование роли участков связывания, расположенных в кринглах тяжелой цепи молекулы плазмина, в разрушении структуры фибринового сгустка. Для решения этой проблемы ставились следующие задачи:

1. Получить, очистить и охарактеризовать плазмив и его активные формы - Вал354-плазмин, Вал442-плазмин и Лиз530- плазмин, содержите различный набор кринглов тяжелой цепи нативного фермента.

2. Сравнить эффективность действия плазмина, Валэ54-плазмина, Вал442-плазмина, Лиз530-плазмина и трипсина при разрушении структуры фибринового сгустка.

3. Изучить влияние 6-аминогексановой кислоты, конкурирующей с фибрин(оген)ом за лизинсвязываицие участки плазмин(оген)а на про-цэсс растворения полимерного фибрина исследуемыми ферментами.

4. Установить характерные особенности гидролиза фибринового сгустка плазмином, его протеолитическими формами и трипсином.

Научная_новизна_работы. Установлено, что эффективность фибрй-нолитического действия плазмина при разрушении фибриллярной основы фибринового сгустка определяется участками взаимодействия, локализованными в кринглах 4 и 5 тяжелой цепи молекулы фермента. Эта закономерность проявлялась как в опытах In vitro, так и на модели гифемы в системе In vivo. Если роль участка Кб в процессе протео-литической деградации полимерного фибрина плазмином отмечалась и другими исследователями (Ney, Pizzo, 1982), то полученные нами результаты о гораздо более эффективном разрушении фибриллярной основы фибринового сгустка плазмином по сравнению с миниплазмином и о важной роли ß этом процессе участка крингла 4 являются принципиально новыми.

Состав продуктов деградации, присутствующих в плазминовом ги-дролизате полимерного фибрина в момент времени, соответствующий времени полулизиса сгустка, указывает на то, что разрушение фибринового сгустка плазмином представляет собой направленный процесс, суть которого заключается в расщеплении фибринового волокна на

крупные надмолекулярный частицы фибрилл.

Теоретическое jijrgaKTH43c^^ Полученные ре-

зультаты позволяют функционально оценить и топографически локализовать участки связывания плазмина, определяющие эффективность процесса протеолитической деградации фибриллярной основы фибрино-вого сгустка, и объясняют механизм эффективного фиоршголитического действия плазмина по сравнению с другими протеолитическими ферментами. Совокупность полученных дашшх способствует целенаправленному, теоретически обоснованному поиску ферментных препаратов, обладающее мощпым фибрлнолитическим потещиалам пролонгированного действия в условиях in vivo.

Апробация работы. Основные результаты и отдельные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллин, 1987), на научном семинаре Совета молодых исследователей Института биохимии им. A.B. Палладина АН Украины (Киев, 1989), на VI Украинском биохимическом съезде (Киев,1992), на совместном семинаре отделов химии и биохимии ферментов, структуры и функции белка и молекулярной иммунологии Института биохимии им. A.B. Палладина АН Украины (Киев, 1992).

Й¥бликацииг По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсувдення, изложенных в 4 главах, заключения, выводов, списка основной использованной литературы (186 источников). Работа иллюстрирована 14 рисунками И 6 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

®5;Плазшноген человека выделяли из фракции плазмы крови Ш2 з по Кону методом аффинной хроматографии на лизин-сефарозе 4Б (Caetellino, Powel,1981 ).

Аффаннохроматографическую Форму 11_плазминогена выделяли из препарата Лиз-плазминогена по методу, предложенному (Brookway, Са-etellino, 1972), с небольшими модификациями.

Вал442~Ш1азминоген (миниплазминоген) получали протеолизом Лиз-плазминогена свинной панкреатической эластазой фирмы "Sigma"

(США) (Sottrup-Jenuen et al.,1973) в присутствии контрикала (Германия), с последующей гель-фильтрацией 1'идролизата на сефадексе Г-75 и аФ1ипшой хроматографией на лмзин-сефарозе.

Валдс^-шшзмииоген получали ограниченным протеолизом аффишю-хроматогрзфической формы II Лиз-плазминогена свшшой панкреатической эластазой фирмы "sigma" (США) в присутствии контрикала (Германия). Гидролизат последовательно Фракционировали на Лиз-сефарозе градиентом б-амшюгексановой кислоты (6-АГК), с последующей гель-фильтрацией на сефакрило С-200 (Powell, Castüllino, 1901).

Лиз-плазмин, Вал35^-плазмин и миниплазмин получали активацией соответствующих форм плазмгаюгена стрептокиназой (Швейцария) (И1-гоап, 1977).

Лиз&30-плазмин (микроплазмин) получали автолизом плазмина с последующей овинной хроматографией на лизин-сефзрозе и соевый ингибитор трипсина софарозе (Wu et al., 19S7).

Трипсин - бил использован коммерческий препарат фирмы "Spopha" (Чехословакия).

Фибриноген наделяли из оксалатной крови быка вцсаливанием сульфатом натрия (Болицер и соавт.,1972).

Мономерний фибрин получали из обработанного a-тромбином фирмы "Calblochem" (США) фибриногена в присутствии контрикала и п-хлор-меркурий бензойной кислоты, после растворения образовавшегося

сгустка в 20 мМ уксусной кислоте (Pozdnjakowa et al.,1979).

124 US

___1;меченний_мономд^тй_фи^ин получали .добавлением 1-ме-

ченного фибриногена в исходный раствор фибриногена перед его обработкой a-тромбином. Фибриноген иодировали Na125l с помощью хлорамина Т (Но Conachey, Dixon,1980).

(ПААГ) проводили в трис-ацетатной системе в присутствии 0,1Ж ДС-натрия. Электрофоретичес-кую подвижность активных ферментов определяли с помощью ДС-натрия электрофореза в ПААГ, содержащего 0,1Х желатину фирмы "Serva" (Германия) (Heusoen, Dowble, 1980).

Щ20тешштическ^ю_ак;гйш^ оценивали по их способ-

ности гидролизовать казеин (по Гаммерстену) (Robbins, Sunmaria, 1979).

ШШЯ_полулизиса__сгустка определяли спектрофотометрически,

измаряя уменьшение поглощения при 350 нм (Bouvier et al.,1975, Ма-когоненко и сотр., 1987).

йенситометриЕовагае_гелей проводили с помощью uitrosoan laser densitometer 1KB.Перерасчет данных денситометра производили на Integrator 2221-001 1KB.

измеряли на счетчике

"Gamma 5500" (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнение фибринолитических потенциалов плазмина, его производных форм и трипсина в процессе разрушения фибриллярной структуры сгустка.

Роль участков связывания плазмина в процессе протеолитическо-го разрушения фибриллярной основы фибршгового сгустка оценивали, используя натнвный фермент, ряд его низкомолекулярных форм, содержащих различный набор кринглов тяжелой цепи плазмнна (Рис.1), и трипсин.

Рис.1. Схематическое изображение молекулы плазминогена и его протеолитически производных низкомолекулярных форм:

1. Лиз7у-плазмип (плазмин);

2. Вал354-плаз!лш;

3. Вал442-Плазмин (митшлаз-мин);

4. Лиз&30-ш1азюш (микроплаз-мин).

Для достижения поставленной целя наиболее информативным, с нашей точки зрения, является метод определения времени полулизиса Зибринового сгустка /з). основанный на изменении мутности среды в ходе образования и протеолитиче ского разрушения фибргаювого сгустка. Использование данного методического подхода позволило исследовать эффективность тромболйтического действия различных форм плазмина и трипсина в ходе осуществления наиболее вйхчого в физиологическом отношении процесса - разрушение фибриллярной основа сгустка.

Обнаружено, что при одинаковой протеолитической активности (по казеину) скорости растворения фибртшового сгустка плазмшюм, Вал^-плазмином, миниплазмином и микроплазмином соотносятся как 40,3:38,0:4,6:1,0 (таблица 1). На основании анализа состава кринг-лов в исследованных формах плазмина было заключено, что участки кринглов 4 и б плазмина играют основную роль в процесса разрушения структуры фиОрипового сгустка. Результаты о более эффективном фиО-ринолитическом действии плазмина по сравнению с миниплазмином и о роли участка К4 в этом процессе являются принципиально новыми и находятся в противоречии с данными литературы.

Таблица 1.

Время полу лизиса фибринового сгустка плазмшюм, его протеолитчес-кими производными и трипсином

ФЕРМЕНТ t./о.мин

5,3 ± 0,4 5,6 + 0,3 48,4 + 4,1 212,2 ± 16,2 146,8 + 15,7

Концентрация мономерного фибрина составляла 0,2 мг/мл, казеинолитическая активность ферментов - 0,007 к.е./мл

При сравнении тромболитического действия плазмина и минипла-змина на модели гифемы (у кроликов) было установлено, что терапевтический эффект плазмина в два раза более выражен, чем у миниплаз-мина (таблица 2). Суммарная доза препарата миниплазмина необходимая для полного рассасывания тромбов оказалась на 15-20% выше, чем для плазмина. Этот результат указывает на важную роль участк(ов)а. фр^-мента К1-4 плазмина в тромболитическом процессе в системе in vivo. Наблюдаемое сближение тромболитических потенциалов плазмина и миниплазмина на модели гифемы по сравнению с их фибринолитичес-кими потенциалами в системе in vitro, обусловлено наличием в системе in vivo факторов, отсутствующий в "чистой" системе. Одним из наиболее мощных таких факторов является си-антиплазмин, который

Плазмин

ВалЗБ4-плазмин

Мшшплазмин

Микроплазмин

Трипсин

ингибирует плазмин со значительно более высокой скоростью, чем ми-ниплазмин (йоЬЫпз вt а1., 1981). Если бы шшзмин и миниплазмин с одинаковой скоростью растворяж полимерный фибрин, то присутствие дополнительных агентов, которые угнетали бы в большей степени один из ферментов^отразилось бы на разности их фибринолитических потенциалов в пользу другого, но не наоборот. Поскольку даже в присутствии ингибиторов плазшш является более мощным фибринолитиком, чем миниплазмин, то это свойство ила: мина (что ш и наблюдали в "чистой" системе) должно в еще большей степепи проявиться при отсутствии ингибирувдих агентов.

Таблица 2.

Динамика рассасывания экспериментальной гифемы при тромболитичес-ком воздействии препаратов плазмина и миниплазмина.

Тромболи—^ЖЛЬныя глаз леченный глаз , Суммарная доза

тический количе- время рас- количе- время рас- необходимая для

агент' ство сасывания ство сасывания полного расса-

опытов гифемы опытов гифемы сыващ:я сгустка

(сутки) (сутки) ( к.е. )

Плазшш 5 18,6 + 2,6 5 12,0 + 1,4 4Ю

Миниплазмин 5 18,6+1,6 б 15,0+1,7 497

Возникает вопрос, насколько специфично гидролитическое действие плазмина на полимерный фибрин, важны ли ЛСУ при гидролизе пла-змином других белковых субстратов и, в частности, фибриногена. Обнаружено, что по образованию ТХУ-неосаадаемых тирозинсодеряащих пептидов фкбриногенолитические акт1шности плазмина, Вал354~, Вал442~' Лиз5зо"плазшша я трипсина соотносились как 0,9 : 1 : 1 : 0,5 : 0,6, соответственно. Разница фибринолитических потенциалов для данных ферментов по сравнению с фибриногенолитическями является очень существенной. Т.е. участки кринглов 1-4 не определяют скорость гидролиза фибриногена плазмином, а высокая эффективность фибринолитического действия плазмина и Уа1354-шшзмина, по сравнению. с микроплазмином и миниплазмином реализуется только в процессе разрушения природного субстрата - полимерного фибрина.

2. Влшишо 6-аминогексановой кислоты на скорость разрушения полимерного фибрина плазмином, его производными формами и трипсином.

Изучая влияние 6-АГК на процесс разрушения структуры полимерного фибрина плазмином, его производными и трипсином.установлено , что 1 мМ 6-АГК (таблица 3) угнетает скорость гидролиза фибрина плазмином в 8,5, а миниплазмшюм в 3 раза. Следовательно, нарушение специфических взаимодействия ферментов с субстратом, опосредованных лизинсвязнваюодеми участками плазмлна, приводит к снижению его способности эффективно разрушать макроструктуру фибринового сгустка. Как и ожидалось, время гидролиза фибрина микроплазминои й трипсином практически не изменилось, что указывает на отсутствие ингибирующего действия анти$мбринолитика, в данной концентрации, по активному центру исследованных ферментов.

Таблица 3.

Влияние б-аминогексановой кислоты на скорость гидролиза полимерного фибрина плазмином, миниплазмшюм, микроплазминои и трипсином.

ФЕРМЕНТ

Нлазмин Миниплазмин Микроплазмин Трипсин

присутствии 1 мМ 6-АГК

45,3 ± 3,8 144,6 + 13,8 208,в + 18,4 153,2 ± 16,1

отношение Ь1/2 с 1 мМ 6-АГК к без 6-АГК'

8,54 2,98 0,98 1,04

Условия эксперимента аналогичны приведенным в таблице 1.

Характер зависимости сгустка плазмипом от концетрации

6-АГК (рис. 2) указывает на участие в процессе разрушения фибринового сгустка афишных центров ферлента, обладающих различным сродством к 6-АГК. Экспоненциальный характер зависимости времени гидролиза сгустка является своего родя предпосылкой, указывающей на то, что определяющие скорость фибринплитического процесса специфи-

чески9 взаимодействия формонта с твердофазным субстратом осуществляются более чем по одному участку связывания. Для миниплазмина, сродство которого к фибрину определяется участком крингла 5, наблюдается линейное увеличение времени гидролиза полимерного субстрата. В области концентраций антифибринолитика до (100 мкМ), насыщающих высокоаффинный участок связывания, локализованный в К1-3 плазмина, наблюдается слабое ингибировоние фнбринолитического процесса. Концентрации 6-АГК, насыщающие участки плазмина промеяуточ-ного и низкого сродства к антифибринолитику, заметно увеличивали время полулизиса.

Полученные результаты позволяют заключить, что взаимодействия плазмина с фибрином, определяющие зФ1ективность фибринолитического процесса, опосредованы участками, которые располоаены в К 4 и К5

Рис. 2. Зависимость времени полулизиса фибрпнового сгустка плазмином ( 1 ) и мшгипляпмшом ( 2 ) от концентрации С-ямлаого-ксановой кислоты. Казегаголити-ческая активность плазмина сос-' тавляла 0,007 к.е./мл, мютипла-змина - 0,07 к.е./мл.

моле улы фермента.

у\

Ё т

Г J

а.' -2 ■

[П-АШ .10

3. Особенности протеолитического разрушения структуры полимерного фибрина плазмином, миниплаэмином, мякроплазмшюм и тршсшом.

Для выяснения механизма протеолитического действия Лил77-, Вал442-, Лиз530-плазмша и трипсина при разрушении Фибрилл 1рной структуры сгустка был изучен количественный состав фракций гидро-лизатов фибрина (ряс. 3) в момент времени, соответствующий времени полулизиса сгустка для каждого из ферментов. ■ .

В плаэминоЕом и миниплазминовом гидролгеатах (фибрина но долю Фракции, содержащей и X,-фрагмент фибрина, приходилось сбответ-ствонно 63% и 58% радиоактивности от нанесенной на электрофорети-ческий трек (таблица 4). Переход в раствор индивидуальных молекул

нативного фибрина и его X,-фрагмента в ходе протеолитической деградации сгустка представляется маловероятным"процессом. На стадии образования X,- и даже ^-фрагментов фибрина при гидролизе плазми-ном (БЪеп et а1.,1977) на было обнаружено признаков разрушения и изменения эластичности (жесткости) сгустка. Столь высокое содержание в момент времени полулизиса молекул нативного фибрина и его фрагментов, потенциально способных (с учетом количества ^-фрагмента на их долю приходится около 80 % радиоактивности) сохранять фибриллярную структуру сгустка, свидетельствует о том, что разрушение полимерного фибрина плазманом осуществляется за счет вычленения из структуры фибринового волокна крупных надмолекулярных фибриллярных частиц.

4-У

М Ао 1

ыа^ы» - х

«-.' - • - _ ,, Рис. 3. Электрофореграммц:

• 1 ' о а - исходаого фибрина и его ги-

- "г^ёо кда дролизатов; б - шкроплазмином, _ низкомолекуляр- в _ плазмином, г - миниплазми-

, ная ®Ракция ном, д - трипсином, в момент

а о в г д време ни полулизиоа сгустка.

Таблица 4.

Радиоактивность электрофоретических зон гидролизатов фибриновцх сгустков, полученных с помощью различных ферментов ( в а по отношению к общей радиоактивности электрофорвтического трека )

ФЕРНШ to*h Ь * С м. в. НИЭКОЫОЛ.

40-50 «Да иит

ШЗМИН 63.7 1 4,8 16.0*8,1 6,6*0.8 4,7 1 О.Б 5,3 4 0.4 8,6 * 0.7

' МШ- 57,6*6.121.7*1,» 4.7 ^ 0.6 4,8*0,7 8,8*0.7 6,9 1 0.«

плпиан

' ШРО- 39.7*4.2 «9.0*3,3 10.8*1.2 5.3*0.4 7.8*(М 8.8*1,0 Ш11ЭЫНН

тпси 30.2*2.» 33.6*3,4 12,6*1.1 7,6*0.9 4,3*0.511.8*1.2

В трипсиновом и михроплазминовом гидролизатах сгустка мы обнаружили относительно низкое содержание фракций нативного фибрина и Х^ -фрагмента н относительно высокое содержание болев низкомолекулярных фрагментов фибрина. Вероятно, процесс растворения сгустка этими ферментами состоит в преимущественном удалении с поверхности фибриллы периферических молекул фибрина путем их протеолитческой деградации. Такой путь разрушения сгустка является, без сомнения, более трудоемким и длительным. Полученный нами результат о "круп-, ноблочном" характере гидролиза полимерного фибрина плазмином находит подтверждение и в работах других авторов (Gladner, Nossal, 1983, Weisel, 1987), которые обнаружили, что радиус частиц, высвобождающих с поверхности перевариемой плазмином фибриллы, в несколько раз превышает диаметр молекул мономьрного фибрина и составляет величину приблизительно равную 1*104 Причем, степень поперечной прошивки сгустка фактором Xllla не оказывала заметного влияния на скорость образования и размер частиц, сбрасываемых с поверхности фибриллы, если гидролиз сгустка осуществляли плазмином.

Однако, механизм процесса фибринолиза - с точки . ^эния разрушения структуры сгустка - не был достаточно подробно исследован при протеолитическом воздействии других ферментов (в том числе и' низкомолекулярных форм плазмина). Поэтому вопрос о каком-Tö особенном характере протеолитической деградации полимерного фибрина плазмином ранее не поднимался и не обсуждался.

Полученные результаты показывают, что участки связывания с фибрином, локализованные в кринглах 4 и 5 молекулы.плазмина, выполняют важную функцию при разрушении структуры фибринового сгустка плазмином. Они принимают участие в адсорбции плазмина на топографически разобщенных участках молекулы фибрина (Suenson et al., 1990))-, что и определяет характер процесса гидролиза - расщепление волокон фибрина на крупные растворимые надмолекулярные блоки и скорость разрушения фибриновой сети. Вероятно, участок крингла 5 может обеспечивать "крупноблочный" механизм гидролиза фибринового сгустка мишшлазмином, но не обеспечивает максимально высокую скорость фибринолиза. Дополнительное взаимодействие по участку крингла 4, возможно, придает необходимую аффинность плазмину и определяет высокую скорость гидролиза полимерного фибрина.

Однако, способность эффективно расщеплять полимерный фибрин определяется, возможно, и другими особенностями ферментов, которые в настоящее время не выяснены. На долю высокомолекулярной фракции в фибриновом гидролизате микроплазмина приходится 4ОХ радиоактивности, а в трипсиновом гидролизате - только 30», что из приведенных, выше соображений должно давать преимущество в скорости микро-шюзмину. Однако, фактически трипсин разрушает структуру фибрино-вого сгустка в два раза быстрее. Анализируя электрофореграммы восстановленных в присутствии 4% 2-меркаптоэтанола образцов гидро-лизатов фибрина (рис. 4), ми не обнаружили заметных различий в качественном составе белковых зон для плазмина, миниплазмина и микроплазмина . Наблюдаемые отклонения относятся к количественному содержанию 'той или иной белковой фракции в плазминовых гидролизатах. Трипсин гидролизует фибрин на несколько отличные фрагменты чем плэзмин и его протеолитические производные формы. В трипсиновом гидролизате присутствует белковая зона с м.в. около 29 кДа, которую мы не наблюдаем в плазминовых гидролизатах. Для последних, однако, характерно наличие белковой фракции с м.в. около 10-12 кДа, а в гидролизате трипсина она отсутствует.

Рис. 4. Электрофорез в 10% ПААГ с 0,1» ДС-натряя в присутствии 4% 2-меркаптоэтанола: 1 - исходный фибрин, 2 - фибрин, v-Jl-íl * * t j uJ инкубированный 190 минут в условиях эксперимента; гидролизаты полимерного фибрина в момент времени полулизиса сгустка' 3 - плазмином, 4 - миниплазмином, 5 - ми-^ : кроплазмином, б - трипсином.

'1 2 3 ,4 5 G

Чем определяются данные различия в ходе протеолитического расщепления фибрина плазмином и трипсином сказать сложно. С большой долей уверенности можно предположить, что они не определяются участками связывания, локализовашшмив крингловых структурах молекулы плазмина, поскольку микроплазмин, лишенный этих участков гидролизует в фибрине аналогичные пептидные связи. Вполне вероятно, что различия могут реализовываться на уровне активных центров этих фе-

рментов и/или из-за наличия в легкой цепи плазмина бензамидинспл-зыващего участка, функциональная роль которого в фибринолитичос-ком процессе пока не определена.

4. Исследование процесса разрушения фибриновых сгустков, сформированных при различных концентрациях мономерного фибрина.

Как установлено ранее (ВЮтЪ&к а1., 1989), одним из основных факторов, определяющих макроструктурную организацию фибриново-го сгустка, является концентрами фибршгагена и/или тромбина. Для изучения гидролитического действия плазмина в процессе разрушепия фибриновых сгустков различной матеро структурной организации мы исследовали протеолиз фибриновых сгустков, формгровашо которых проходило в интервале концентраций фнбрин-мономера 0,2-1,0 мг/мл, плазмином, его производными и трипсином. При этом соотношение фермент : субстрат оставалось величиной постоянной и составляло 0,035 к.е. : 1,0 мг.

Установлено, что сгустки, сформированные при концентрации Г0 1,0 мг/мл,разрушаются плазмином в 2,3 раза медленное, чем сгустки, формирование которых проходило при концентрации субстрата 0,2 мг/мл (таблица 5). Для трипсина, миниплазмкша и микроплазмина на-' блюдалась противоположная закономерность. Время полулизиса для этих ферментов сокращалось в 1,2, 1,3 и 1,9 раз' соответственно.

Таблица 5.

Время полулизиса фибриновых сгустков, формирование которых проходило при различных концентрациях мономерного фибрина, плазмином, миниплазмином, микроплазмином и трипсином.

концентрация мономерного фибрина Фермент 0,2 мг/мл 1,0 мг/мл

1^2» Ю5Н М1Ш

Плазмин 5,3 + 0,4 12,4 + 1,4

Миниплазмин . 48,4 + 4,1 40,0 + 4,1

Микроплазмин 212,2 + 16,2 164,1 + 14,8

Трипсин 146,8 +15,7 78,1 ± 9»6

Одним чз факторов, способным в определенной степени оказывать ингибирущев. влияше на фибрияолитическое действие шшзмина, являйся конечные продукты (и- ц Е-фрагмонты) деградации фибрин(оген)а (Розенфальд и сотр. 1583), концентрация которых, будет возрастать с увеличением концентрации субстрата. Мы изучили влияние продуктов деградации фибриногена и непрошитого фибрина (ЦЦФ) на процесс разрушения структуры фибринового сгустка плазмином и миниплазмином. Использованная концентрация ЦДФ более чем в четыре раза (на основании дишшх представленных в таблице Б) превышала га максимально возможную концентрации в момент времени полулизиса сгустка. Очевидно, что фактическая концентрация ЦЦФ, которая образуется в ходе лизиса сгустка,будет еще ниже.

При данной постановке эксперимента наш не было обнаружено достоверного влияния ПДФ на процесс разрушения структуры фибринового сгустка миниплазмином. Время полулизиса сгустка плазмином возрастало с 5,3 + 0,4 минут до 6,6 + 0,7 минуты. Это значение почти в два раза ниже величины 12,4 мин, которую мы наблюдали при

уьоличотш концентрации мономерного фибрина до 1 мг/мл. Полученный результат свидетельствует о том, что ПДФ, образующиеся в ходе про-теолитической деградации сгустка плазмином, не определяют скорость разрушения структуры фибринового сгустка.

Наличие дополнительных факторов, влияющих на гидролиз полимерного фибрина; предполагает и характер зависимости скорости разрушения фибринового сгустка плазмином от Концентрации мономерного фибрина (рис. б). На оси ординат представлена величина (1Л1/2) пропорциональная скорости разрушения фибринового сгустка, а по оси абсцисс - концентрация фибрина, при которой происходят формирование сгустка. Скорость гидролиза сгустка миниплазмином замедлялась пропорционально увеличению концентрации мономерного фибрина. Линейный характер уменьшения скорости разрушения структуры полимерного фибрина миниплазмином связан в основном с фактическим изменением числа пептидных связей, которые необходимо расщепить Ферменту для двухкратного уменьшения величины мутности, регистрируемой при длине волны 350 нм. Как и в случае пропорционального увеличения концентраций фермента й субстрата (таблица б), минипла-змин сказался нечувствительным к изменению магсроструктурной орга-

низации фиОршювого сгустка. 0.2 т-

Рис.5. Зависимость скорости гидолиза фибрино-вого сгустка плазмином (о) и минишшзмшюм (♦) от концентрации мономз-рного фибрина. Активность ферментов составляла 0,007 к.е./мл.

О 1 ' 2 3 А

[fol, )1М

Зависимость скорости разрушения полимерного фибрина плазмином от концентрации мономерного фибрина носила экспоненциальный характер. В интервале концентраций субстрата 0,2-0,6 мг/мл наблюдаотся наиболее значительное падение скорости гидролиза, которое заметно нивелируется при дальнейшем увеличении концентрации фибрин-мономера. Кроме фактического увеличения числа обязательно расщепляемых пептидных связей, наиболее вероятным фактором, имеющим место при данном процессе и способным оказывать существенное влияние на ход протеолитического разрушения полимерного фибрина плазмином, является изменение макроструктурной организации фибринового сгустка.

На основании полученных нами результатов и данных других авторов (de Fonw et al., 1988, IJair et al., 1989) можно заключить, что одним из основных факторов, способным оказывать заметное влияние на процесс разрушения полимерного фибрина плазмином, является изменение макроструктурной организации сгустка.

Механизм, регулирующий направление (ускорение или замедление) процесса гидролиза для различных протеаз, обусловленного изменением макроструктурной организации сгустка, вероятно, связан со .спецификой фибринолитического действия ферментов. Плазмин расщепляет полимерный фибрин в связанном со сгустком состоянии. Поэтому один

I

раз сортированная но л о кула плазмина. может подвергнуть расщеплению большое количество молекул субстрата при гидролизе более толотих и длинных фибриношх волокон. Трипсин и микроплазмин осуществляют гидролиз хаотично, контактируя с субстратом за счет своего активного центра. Фибринолитическое действие мшшплазмина, вероятно, носит промежуточный характер между деАотьломнлазмша и микроплаз-мина.

Совокупность щюдставлешшх результатов позволяет заключить, что разрушение фибринового сгустка плазмином представляет собой направленный процесс, суть которого заключается в расщеплении фибринового сгустка на крупные надмолекулярные частицы фибрилл. Определяющая роль в этом процессе принадлежит участкам кринглов 4 и 5 молекул« плазмшю.

виводо

1. Установлено, что время полулизиса фибринового сгустка плазмином и Вал^-плаомшюм практически 'одинаковое и приблизительно п 9, 2В и 40 раз меньше, чем - мшшнлазмшюм, трипсином и микро-шп^мпном, соответсвешю. Наличие участков кринглов 4 и 5 тяжелой цоии шшштся необходимым и достаточным условием, опроделящим эффективность нротеолптического разрушения структуры фибринового сгустка плавмшюм.

2. Обнаружено, что высокая эффективность действия плазмина и Валд^-шшзмина, по сравнению с мишшлазмином и микроплазмином, проявляется только по отношению к природному субстрату - полимерному фибрину.

3. При сравнении фибриногенолитических активностей плазмина, мшшплазмина и микроплазмшю установлено, что участок связывания крингла 5 определяет скорость гидролиза фибриногена плазмином.

4. Эффективность фибргаюлитнческого действия плазмина обеспечивается преимущественным разрушением сгустка с образовшмем надмолекулярных частиц фибринового волокна.

Б. Скорость протеолитической деградации полимерного фибрина в высокой степени зависит от макроструктурной оргашиации сгустка.

6. Продукты деградации фибрин(оген)а не оказывают существенного ингибирующего эффекта на процесс разрушения структуры фибринового сгустка плазмином.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Андрианов С.И., Макогоненко Е.М., Лежен Т.И., Кудинов С.А. Функция кринглов 1-4 и 5 плазмина в разрушении структуры фибрино-вого сгустка// vil Всесоюзный симпозиум по химии белков и пепти-дов:тезисы докладов / Таллин, октябрь, 1987./ -С.21.

2. Андрианов С.И., Макогоненко Е.М., Лежен Т.И., Кудинов O.A. Роль крингловых структур молекулы плазминогена в осуществлении фи-бринолитической функции// Доклады Alt УССР. -1988. -я 12. -с.44-47.

3. Заявка Я 4837619/14 от 30. 06. 1990 г. "Способ определения параметров свертывания и фибринолиза крови" /Лежен Т.И., Макогоненко Е.М., Колесник Л.А., Крамарев O.A., Мартынкж Т.В., Андрианов С.И./ ; Решение о выдаче патента от 13. 05. 1991 г.

4. Андрианов С.И., Макогоненко Е.М., Кудинов С.А. Роль кринглов К4 и Кб тяжелой цепи плазмина в разрушении структуры фибрином вого сгустка// Укр.биохим.журн. -1992. -64, N 2. -С.31-38.

5. Андрианов С.И., Макогоненко Е.М., Кудинов С.А. Особенности гидролиза полимерного фибрина плазмином, миниплаэмином, микроплаз-мином и трипсином // Укр. биохим. журн. -1992. -64, N 3. -С.14-20.

6. Андр1анов C.I ., Куд1нов С.О. осооливост! г1лрод1зу пол1 мерного ф1 брину плазм1ном I Вал^^-плязм! ном/ VI Укр. ÖloxlM. зМзд:' Тез. доп. - Ки1в, 1992. - Ч. I. - С. 108.

Подп. к печ. rs'-tt >Я, Формат te- tv^ Бумага Tu-^i'Z

Печ. офс. Усл. неч. л. е Уч.-иэд. л. Тираж /¿е

Зак. 3-3tog . Бесплатно.

Киевская книжная типография паучноЛ книги. Киев, Репина, 4.