Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли гена Hr в работе ВМР- и WNT-зависимых генных регуляторных сетей в цикле волосяного фолликула мыши

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли гена Hr в работе ВМР- и WNT-зависимых генных регуляторных сетей в цикле волосяного фолликула мыши"

На правах рукописи

| 003491949

I---------v------

ГОЛОВАТЕНКО-АБРАМОВ Павел Кириллович

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ГЕНА Нг В РАБОТЕ BMP- и WNT-ЗАВИСИМЫХ ГЕННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ СЕТЕЙ В ЦИКЛЕ ВОЛОСЯНОГО ФОЛЛИКУЛА МЫШИ

03.02.07 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

1 8 ФЕВ ?<1'0

003491949

Работа выполнена в лаборатории генетики развития

Учреждения Российской Академии Наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Евгений Семенович Платонов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мария Львовна Семенова

кандидат биологических наук Владимир Васильевич Соболев

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится « 4 » марта 2010 года в _ часов н

заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждени:

Российской Академии Наук Институте общей генетики им. Н. И. Вавилов

РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.

Факс: (499) 132-89-62

E-mail: iogen@vigg.ru

Адрес в Интернет: http://www.vigg.ru/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российско Академии Наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан « -S> »

гргЛр

Л4Л 2010 года

Ученый секре совета

диссертационного

кандидат биологических наук Т. А. Синелыцикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фенотип высших организмов формируется в результате сложных взаимодействий многих тысяч генов в онтогенезе. У позвоночных и, в частности, у млекопитающих ключевую роль играют взаимодействия эффектов неаллельных генов, работающих в разных клеточных системах. Сегодня наиболее популярной концепцией, позволяющей систематизировать взаимодействующие гены в онтогенезе, является концепция генных регуляторных сетей (или сигнальных путей) -абстрактных систем, состоящих из генов, кодирующих белки-лиганды (активаторы и ингибиторы), их рецепторы, посредники и факторы транскрипции, непосредственно связывающиеся с ДНК и регулирующие транскрипцию генов-эффекторов. Результатом слаженной работы генной регуляторной сети является протекание того или иного процесса в ходе онтогенеза. Изучение механизмов работы генных регуляторных сетей с одной стороны представляет большой интерес для понимания генетического контроля развития, а с другой открывает широкие возможности для направленного модулирования транскрипционной активности конкретных генов, что находит свое применение в лечении заболеваний различной этиологии, в том числе и онкологических.

Изучение генетических основ регуляции развития шерстного покрова у млекопитающих является актуальной задачей генетики развития. Оно имеет большое значение в контексте фундаментальной науки, а также в прикладном аспекте важно для современной дерматологии и косметической медицины. С точки зрения биологии развития как фундаментальной науки, кожа млекопитающих и волосяной фолликул (ВФ) представляются уникальными объектами исследований, так как кожа в целом является одним из интенсивно обновляемых органов, а морфогенез ВФ продолжается в ходе всего индивидуального развития организма. Поэтому генные регуляторные сети, контролирующие пути дифференцировки и миграции клеток, представлены в этих органах вне зависимости от стадии развития или возраста индивида. Среди генных регуляторных сетей, функционирующих в коже млекопитающих, особое место занимают сети, индуцируемые белковыми молекулами семейств WNT и BMP. Нарушения работы этих сетей приводят к различным аномалиям в развитии кожи и ВФ, от недоразвития определенных компонентов фолликулов до развития злокачественных новообразований.

Несмотря на то, что в общем виде молекулярные механизмы эмбрионального и постнатального морфогенеза ВФ у млекопитающих (на примере мыши) описаны, существуют десятки генов, мутантные аллели которых в гомозиготном состоянии приводят к нарушениям развития шерстного покрова, а роль в контексте молекулярного контроля физиологии ВФ не установлена. Одним из таких генов является ген Нг, мутантные аллели которого в гомозиготе приводят к дезинтеграции ВФ и полному выпадению шерсти после завершения роста волос первой генерации. Известные данные разных авторов подводят к мысли о том, что продукт нормального аллеля этого гена является важным модулятором активности генных регуляторных сетей, участвующих в физиологии ВФ у млекопитающих. Однако, хотя и существует ряд гипотетических молекулярных мишеней белка HR, конкретные сигнальные пути, затрагиваемые в случае мутации в гене Нг, точно не известны. Результаты научных работ на эту тему позволяют выстроить ряд гипотез о существовании связи между геном Нг и WNT- и BMP-зависимыми генными регуляторными сетями в ВФ. В частности, показана отрицательная корреляция между уровнями экспрессии белка HR и SOSTDC1 в ВФ мыши (Beaudoin et al., 2005), а также регуляторная функция белка SOSTDC1 в отношении работы WNT- (Itasaki et al., 2003) и BMP-зависимых генных сетей (Laurikkala et al., 2003).

Так как ген Нг кодирует белок, участвующий в регуляции транскрипции других генов, эффекты, наблюдаемые у мышей, гомозиготных по мутантному аллелю гена Нг, могут быть зарегистрированы методами оценки транскрипционной активности генов. Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция с детекцией продуктов амплификации в реальном времени (ПЦР-РВ). В сочетании с методом обратной транскрипции (ОТ), ПЦР-РВ позволяет достаточно точно измерить количество транскриптов интересующего гена в пробе (Wong, Medrano, 2005).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение молекулярно-генетических механизмов, при помощи которых ген Нг вовлекается в контроль морфогенетического цикла ВФ у мыши. Выполнение исследования предполагало решение следующих задач:

1) охарактеризовать на молекулярном уровне мутантный аллель гена Нг у животных, использованных в работе;

2) сопоставить динамику экспрессии BMP- и WNT-зависимых генов в коже мышей, гомозиготных по мутантному аллелю гена Нг, в период развития алопеции с динамикой экспрессии этих же генов в коже фенотипически нормальных сибсов-гетерозигот соответствующего возраста;

3) сопоставить компетенцию клеток ВФ рандомбредных мышей и клеток производных ВФ мышей, гомозиготных по мутантному аллелю гена Нг, в отношении травматического повреждения кожи на модели ожога Ша степени субдермальной глубины и вырезанной раны;

4) исследовать характер влияния экзогенного модулятора ВМР-зависимой генной сети NOGGIN на скорость роста волос у нормальных мышей линии СВА.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые на молекулярном уровне охарактеризован аллель Hrhr -мутантный аллель гена Нг, поддерживающийся в гомозиготной линии в отечественных питомниках лабораторных животных. Впервые показано, что у мышей, гомозиготных по мутантному аллелю в составе производных ВФ сохраняются клетки, способные к участию в репаративной регенерации эпидермиса в случае ожоговой и вырезанной раны. С помощью метода ОТ и ПЦР-РВ изучена и продемонстрирована корреляция между изменениями уровней экспрессии WNT- и BMP-зависимых генов в коже мышей. Показано, что угнетение работы BMP-зависимой генной сети в коже мышей путем непосредственного введения белка NOGGIN подавляет рост волос. Показано, что экспрессия гена Нг необходима для своевременного угнетения работы WNT-зависимой генной сети в коже мышей. Полученные данные указали на ключевую роль гена Нг во взаимодействии WNT- и BMP-зависимых генных регуляторных сетей в ВФ мыши и позволили определить место этого гена в генной сети, описывающей эти взаимодействия.

Изучение координированной экспрессии конкретных генов -участников BMP- и WNT-зависимых генных сетей в контексте морфогенеза ВФ вносит существенный вклад в понимание молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе нарушений роста волоса у млекопитающих. Новые данные о роли гена Нг в работе этих генных сетей позволяют

рассматривать его как потенциальную терапевтическую мишень в разработке лекарственных средств, направленных на лечение гиперпластических заболеваний кожи и заболеваний волос у человека.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на 3-й Московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (27 -31 июля 2007 г., Москва, Россия), Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения - 2008» (26 - 27 ноября 2008 г., Саратов, Россия), III съезде Российского общества патологоанатомов (26 - 30 мая 2009 г., Самара, Россия), Международной конференции «World Congress Gene 2009» (1-7 декабря 2009 г., Фошан, Китай), на межлабораторном семинаре «Генетика животных» ИОГен РАН 28 декабря 2009 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано и сдано в печать 6 научных работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, состоящий из 3 глав, экспериментальная часть, включающая главу «Материалы и методы», 4 главы, посвященные собственным исследованиям, обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, список литературы и приложения. Список литературы включает 184 источника, из которых 2 отечественных и 182 иностранных авторов. В работе содержится 11 таблиц (из которых 5 вынесены в приложения) и 27 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Животные. Объектом исследований в настоящей работе являлись мыши инбредной линии ВАЬВ/с генотипов Я/'7///'г и ///'/+, инбредной линии СВА, а также рандомбредные мыши. Животные были получены из коллекции вивария Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН. При проведении хирургических операций животных наркотизировали авертином (трибромэтанол в дозе 0,25 мг/г веса животного, внутрибрюшинно). Умерщвление взрослых животных проводили методом смещения шейных позвонков.

Определение мутантного аллеля гена Нг. Для проверки гипотезы о соответствии структуры изучаемого аллеля гена Нг аллелю ///" использовали методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования нуклеотидных последовательностей. ДНК выделяли из мелкоизмельченного материала ушных раковин мышей при помощи препарата «ДНК-Экспресс» (ООО НПФ «Литех») по протоколу, предоставленному производителем. Для проведения ПЦР были подобраны олигонуклеотидные праймеры Нг-Гб-Б, Ршу43-Я, НЬТЯ-Р, НЬТЯ-Я, гибридизующиеся с матрицей в 6 интроне гена Нг, как показано на рис. 1. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия реакций приведены в приложении к диссертационной работе. Продукты, полученные в результате ПЦР с парами праймеров Нг-16-Р/Ршу43-Я и НЬТЯ-Р/НЬТЯ-Я, были разделены электрофоретически в 2% агарозном геле, элюированы из геля и секвенированы (ООО НПФ «Литех») для окончательного подтверждения того, что их последовательность соответствует последовательности одного из известных вариантов аллеля Нг"г.

Экзон 6

/-1 НЫв-Р Н1ТШ*

■•''"' 4 ... ■ • ■ ■» Фрагмент, кодирующий белок оболочки вируса р15Е .....^43 " " Я^Р — Дпинный шнчевой по8Т°Р

Рис. 1. Ориентация олигонуклеотидных праймеров в 6-м интроне мутантного локуса Нг1"'.

Экзон 7

Изучение экспрессии мРНК BMP- и WNT-зависимых генов в коже мышеи генотипов Я/7+ и Hi^'lHt*". Так как алопеция у мышей генотипа Я/7Я/Г развивается в период от 14 до 21 дня постнатальной жизни, именно в этот период ожидалось обнаружение различий в экспрессии генов, контролирующих цикл ВФ. Поэтому уровень мРНК генов - маркеров активности BMP- и WNT-зависимой генной регуляторной сети был определен методом ОТ и ПЦР-РВ в пробах дорзальной кожи мышей генотипа Я/7Я/Г и их гетерозиготных фенотипически нормальных сибсов генотипа Я/7+ на 10, 14, 15, 16, 17, 18 и 19 сутки постнатальной жизни. Мышей на указанных сроках жизни забивали и удаляли по три полнослойных фрагмента кожи размером 0,5 х 0,5 см с передней, средней и задней части спины, как показано на рис. 2. Из каждого фрагмента выделяли тотальную РНК при помощи набора реактивов «Trizol RNA Prep» (ООО «Изоген») по протоколу, предоставленному фирмой-изготовителем. После этого с полученной РНК проводили реакцию обратной транскрипции при помощи набора реактивов «RT Core» (ООО «Изоген»), Полученные образцы кДНК использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР и ПЦР-РВ. В исследуемых образцах анализировали наличие кДНК гена Нг, BMP-зависимых генов Втр2, Idl, Sostdcl, WNT-зависимого гена Mitf. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия реакций приведены в приложении к диссертационной работе. В каждой реакции участвовало 200 нг пробы кДНК (измерение концентрации проводили при помощи спектрофотометра «NanoDrop 2000» компании «Thermo Scientific»).

ПЦР-РВ проводили в присутствии интеркалирующего флюоресцентного красителя SYBR Green I и нейтрального (референсного) флюоресцентного красителя ROX. Для оценки исходного количества

передняя часть, M (médius) - средняя часть, Р (posterior) - задняя часть.

транскриптов целевых генов пользовались методом абсолютной квантификации. Для этого каждый из фрагментов, амплифицируемых в ходе реакции, был вначале наработан при помощи ПЦР и очищен, а затем использовался для приготовления концентрационных стандартов (образцов с известной концентрацией целевой матрицы). Ряд стандартов для каждой из пар праймеров содержал 100 нг, 66,7 нг и 50 нг целевого продукта ПЦР. Соотнесение исходного количества матрицы в стандартных пробах с номером порогового цикла, после которого начинается экспоненциальное накопление продукта ПЦР, позволило построить калибровочные кривые, которые при условии одинаковой эффективности отжига праймеров могут использоваться для определения исходного количества матрицы в исследуемых пробах при известном номере порогового цикла. Для оценки достоверности полученных результатов каждую из реакций проводили в четырех повторностях.

Для того, чтобы оценить координированность экспрессии гена Sostdcl и генов Втр2, Idl, Mitf у мышей генотипов Hrhr/+ и Н^г1Нгкг, вычисляли коэффициенты корреляции Пирсона между изменениями уровней мРНК этих генов в соседних временных точках.

Изучение регенерационной способности кожи мышей генотипа Hi^'IHi1". Способность клеток ВФ у нормальных мышей и их производных у мышей, мутантных по гену Нг, участвовать в регенерации эпидермиса оценивалась на модели ожога Illa степени и модели вырезанной раны субдермальной глубины. Использовались мыши, несущие в гомозиготном состоянии мутантныи аллель на генетическом бэкграунде линии BALB/c, весом 20 - 25 г, в возрасте 3-4 месяцев, а также рандомбредные мыши соответствующего веса и возраста. Животных наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией авертина. В первой группе на спину мыши путем аппликации печатки диаметром 12 мм, нагретой до температуры 95 -100 "С, в течение 8 секунд наносили ожог субдермальной глубины, соответствующий ожогу Ша степени 3% поверхности тела. Контракцию раны блокировали подшиванием к коже колец из поливинилхлорида диаметром 12 мм. Во второй группе, по аналогии с первой, на спину мыши скальпелем наносили вырезанную рану диаметром 10 х 10 мм.

В эксперименте было использовано 20 животных (10 #/7#/"' и 10 +/+) в модели ожоговой раны и 10 животных (5 I//r/Hrhr и 5 +/+) в модели вырезанной раны. Для гистологического исследования брали образцы ожоговой и вырезанной раны размером 15x15 мм через 6 часов, на 1, 3, 5 и 7

сутки после травмы. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, проводили обезвоживание в 96% и 100% этаноле, затем выдерживали в ксилоле для удаления спирта, помещали в чистый парафин и заливочный парафин, содержащий 5% пчелиного воска. Парафиновые срезы получали при помощи санного микротома и окрашивали гематоксилином и эозином.

Полученные гистологические препараты анализировали визуально. Основным параметром, на который обращалось внимание, была толщина эпителия, нарастающего на поверхности раны, и эпителия, выстилающего дермальные кисты у мышей генотипа Я/7Я/Г. Также описывали изменения в расположении дермальных кист в процессе заживления раны.

Исследование действия препарата NOGGIN на скорость роста волос у мышей СВА. Препарат белка NOGGIN («Sigma», номер по каталогу N6784-50UG) инъецировали подкожно в среднюю часть спины мышам инбредной линии СВА в возрасте 2-3 месяцев. Было проведено три серии эксперимента, в каждой из которых участвовало пять групп животных по 4 мыши в каждой группе. Непосредственно перед началом эксперимента всем мышам была проведена депиляция волос на спине для того, чтобы синхронизировать циклы ВФ. После этого животным в четырех группах вводили раствор препарата NOGGIN в буфере PBS в концентрации 7,0 мкг/мл, 6,0 мкг/мл, 5,0 мкг/мл, 4,0 мкг/мл с интервалом в 1 сутки в течение 20 дней. В контрольной группе мышам вводили буфер PBS, содержащий БСА в концентрации 10 мкг/мл. По завершении этого периода отросшую шерсть выщипывали, расправляли в капле глицерина и измеряли длины 20 случайно выбранных волос каждого типа (направляющие, остевые, пуховые) у каждой мыши. После этого из материала кожи спины мышей выделяли РНК, проводили реакцию обратной транскрипции и ПЦР-РВ для определения уровня транскрипционной активности гена Idl, использовавшегося в качестве маркера активности BMP-зависимой генной регуляторной сети.

Статистическая обработка данных. Для оценки различий между измеряемыми величинами вычисляли доверительные интервалы для средних значений генеральных совокупностей по ¿-критерию Стьюдента при P(t)=0,95. При статистическом анализе данных ПЦР-РВ о количестве копий того или иного гена объем выборки п был равен 4 (количество повторов реакции). При анализе длин волос мышей после подкожных инъекций белка NOGGIN выборочное среднее и доверительные интервалы также вычисляли с

использованием /-критерия Стьюдента для каждого типа волос каждого экспериментального животного («=20). Однако так как доверительные интервалы существенно пересекались, различия между выборочными средними были сочтены незначимыми, выборки данных (длины волос одного типа у каждой мыши в пределах одной группы) были объединены, и далее вычисления проводились для «=80.

Для оценки корреляции между дозой препарата NOGGIN и длиной шерсти, отросшей после цикла инъекций, вычисляли коэффициент корреляции Пирсона.

Результаты и обсуждение

Определение мутантного аллеля гена Нг. Фенотип мышей, использованных в данной работе, соответствовал фенотипическим описаниям мышей генотипа Я/7#/г. Тем не менее, принимая во внимание тот факт, что существует много разных мутантных аллелей гена Нг, а также и то, что ранее данные животные на молекулярном уровне не анализировались, нельзя было исключать вероятность того, что используемые мыши несут в гомозиготном состоянии какой-то другой аллель. При помощи метода ПЦР и секвенирования была определена последовательность нуклеотидов в 6-м интроне локуса Нг у гомозиготных мутантных мышей. Результаты анализа полученной последовательности и ее сопоставления с известными последовательностями мутантных аллелей этого локуса однозначно подтвердили, что исследуемые животные являются гомозиготами по аллелю Я/' . Природа этого мутантного аллеля заключается в наличии инсерции в 6-м интроне локуса Нг, представленной длинным концевым повтором вируса лейкемии мыши Pmv43. Этот длинный концевой повтор несет в себе канонический акцепторный сайт сплайсинга (Cachon-Gonzalez et al., 1999), и вследствие этого сплайсинг первичного транскрипта гена Нг у мышей генотипа Hrhr/Hrhr приводит к образованию «неправильной» мРНК и синтезу нефункционального (укороченного) полипептида.

Изучение процесса заживления кожных ран у мышей генотипов +/+ и Яг^/Яг'". Для того, чтобы проверить способность дермальных кист у мышей генотипа Hrhr/Hrhr принимать участие в репаративной регенерации эпидермиса, мы наносили ожог Ша степени на спину мышей нормального и мутантного генотипов (рис. 3). Через 6 часов после нанесения ожоговой

Рис. 3. а, б - гистологические препараты обожженной кожи мышей нормального генотипа через 6 часов и 1 сутки после нанесения травмы, соответственно; в - ж - гистологические препараты обожженной кожи мышей генотипа Нг1"'1Нг>"' через 6 часов, 1, 3, 5 и 7 суток после нанесения травмы, соответственно. Пояснения в тексте, вф - волосяной фолликул, дрм — дерма, пжк — подкожная жировая клетчатка, сж - сальная железа, э -эпидермис, дк - дермальная киста. Окраска - гематоксилин, эозин.

травмы рана мыши нормального генотипа (рис. 3, а) характеризуется отсутствием эпидермиса, выраженными деструктивными изменениями дермы, а также началом пролиферации эпителиальных клеток в сохранившихся частях ВФ, что выражалось в увеличении толщины наружного корневого влагалища ВФ. Через 1 сутки после нанесения ожога у мышей нормального генотипа также отмечается пролиферация эпителиальных клеток в составе ВФ и начало их миграции по поверхности раны (рис. 3, б). У мышей генотипа Н/г/Н/г через 6 часов после нанесения травмы наблюдается картина, сходная с описанной у мышей нормального генотипа (рис. 3, в). Через 1 сутки после нанесения ожога у мышей мутантного генотипа (рис. 3, г) поверхность раны частично покрыта уже нормальным двухслойным эпителием, под которым восстанавливается структура дермы (в той части раны, которая еще не покрыта эпителием, деструктивные изменения дермы и лейкоцитарная инфильтрация сохраняются). Дермальные кисты, находящиеся в глубине раны, имеют выстилку, состоящую из 2 - 3 слоев эпителиальных клеток, что свидетельствует о пролиферативной активности последних. На 3 сутки заживления ожоговая рана мутантных мышей практически полностью покрывается эпителием (рис. 3, д). На этой стадии мы обнаружили, что замкнутые образования, выстланные эпителиальными клетками, «раскрываются» на поверхности раны, в результате чего клетки их выстилки включаются в поверхностный эпителий, сформированный de novo. Некоторые из этих образований ассоциированы с сальными железами и внешне похожи на утрикулы, присутствующие в интактной коже мутантных мышей. Однако то, что в результате травмы был удален весь эпидермис и все структурные образования, находящиеся в нем, исключает возможность участия утрикул в первичной регенерации. Аналогичная картина отмечается и на 5 сутки заживления (рис. 3, е). Через 7 суток после нанесения ожога в коже мутантных мышей (рис. 3, ж) дермальных кист практически не наблюдалось, из чего мы делаем предположение, что именно эти образования принимают участие в регенерации эпидермиса.

Результаты гистологического исследования процесса заживления вырезанной раны оказались сходными с результатами исследования ожоговых ран.

Известно, что клетки выпячивания наружного корневого влагалища ВФ способны принимать участие не только в регенерации самого фолликула,

но и в восстановлении межфолликулярного эпидермиса в случае травмы (Taylor et al., 2000). Было показано, что производные этих клеток способны к миграции как в проксимальном направлении, поставляя материал для роста волоса, так и в направлении эпидермиса. В настоящем исследовании мы наблюдали сходный ответ на повреждение эпидермиса со стороны дермальных кист у мышей, мутантных по гену Hr. Наблюдаемая картина (включение эпителиальной выстилки этих аномальных образований в формирующийся эпидермис наряду с сокращением количества кист в ходе заживления раны) позволяет предположить, что кисты мутантных мышей и ВФ мышей нормального генотипа участвуют в регенерации сходным образом.

На основании сделанных наблюдений мы можем предположить, что кисты с признаками активной пролиферации эпителиальных клеток флотируют из глубины дермы к раневой поверхности.

Пролиферация клеток в области поражения у мышей генотипа Я/7ЯгЛг не менее выражена, чем у мышей генотипа +/+. Более того, на макроскопическом уровне у мышей генотипа Я/7ЯгЛг наблюдаются более короткие сроки эпителизации и заживления раны. Гистологический анализ показал, что у мышей генотипа Я/7Я/Г сохранившиеся кисты непосредственным образом принимают участие в регенерации кожи, перемещаясь к поверхности раны и закрывая раневую поверхность клетками своей выстилки. Следовательно, индуцированная кератинизация в целом у мышей генотипа Я/7///г выражена больше, чем у мышей дикого генотипа, но и о том, что патологические производные ВФ у мутантных мышей сохраняют в своем составе клетки, способные к пролиферативному ответу на травматические стимулы. Иными словами, дермальные кисты в коже мышей генотипа я/7ЯгЛг демонстрируют функциональную гомологию с нормальными ВФ, так как их клетки сохраняют компетенцию в отношении репаративной регенерации кожи.

Изучение экспрессии BMP- и WNT-зависимых генов в коже мышей генотипов Я/7+ и Для изучения влияния мутации в гене

Нг на работу BMP- и WNT-зависимой генной регуляторной сети был применен метод ПЦР-РВ. Этот метод позволил измерить абсолютные количества мРНК BMP-зависимых генов Втр2, Idl, Sostdcl и WNT-зависимого гена Mitf.

Экспрессия мРНК гена Втр2. Уровень мРНК гена Втр2 в коже колеблется в период 10-19 суток жизни как у мышей генотипа Я/7+, так и у мышей генотипа я/7я/г (данные измерений представлены в приложении к диссертационной работе). У гетерозигот максимальный уровень мРНК этого гена отмечается на 14, 18 и 19 день жизни в передней части спины, на 18 день жизни в средней части спины и на 15 день жизни в задней части спины (рис. 4, а). У мышей генотипа Я/7ЯА также отмечены колебания уровня мРНК этого гена в коже с максимумами на 14, 16 и 18 сутки в передней, средней и задней части спины. Однако абсолютные уровни мРНК этого гена у гомозигот существенно ниже, чем у гетерозигот, не демонстрирующих мутантного фенотипа, а временной профиль экспрессии мРНК гена Втр2 у мышей генотипа Я/7Я/Г более «сглажен» (рис. 4, б). В соответствии с этими данными, у мышей генотипа Я/7+ пик транскрипционной активности гена Втр2 смещается в пространстве в каудо-краниальном направлении в период от 15 до 19 суток жизни, чего не происходит у мышей генотипа Н/,Г1Н/'Г, у которых пики экспрессии Втр2 в образцах кожи передней, средней и задней части спины синхронны.

Рост экспрессии мРНК гена Втр2 у мышей генотипа Я/7+, не имеющих аномалий в развитии шерстного покрова, в разных частях кожи спины мышей после 14 суток постнатальной жизни соответствует данным Пликуса и соавторов (Plikus et al., 2008) о том, что экспрессия этого гена увеличивается к стадии катагена. Действительно, у мышей, не демонстрирующих каких-либо нарушений в шерстном покрове, к этому времени завершается анаген первой генерации ВФ, и в среднем к 17 суткам жизни начинается катаген (Schneider et al., 2009). Именно в этот день в средней части спины по полученным результатам уровень мРНК гена Втр2 начинает расти. Тот факт, что колебания уровня мРНК гена Втр2 асинхронны в разных частях спины мышей генотипа Я/7+, вместе с известными данными о морфологии и цикле ВФ в это время, не противоречит известным традиционным представлениям об асинхронности морфогенеза фолликулов и существовании «волн роста волос», формирующих передне-задний градиент во время первого цикла ВФ (Chase, Eaton, 1960). В связи с этим кривые, отражающие динамику экспрессии гена Втр2, а также других генов, экспрессия которых была измерена в этой части работы (Idl, Mitf, Sostdcl) анализировались независимо друг от друга.

Экспрессия мРНК гена Ы1. Уровень мРНК гена М1 также изменяется в период 10—19 суток жизни мышей обеих исследованных групп. У мышей генотипа я/7+ локальные максимумы экспрессии мРНК этого гена отмечаются на 15 и 18 сутки жизни в передней части спины, на 14 и 18 сутки в средней части спины и на 18 сутки в задней части спины (рис. 4, а). В образцах кожи мышей генотипа ЯА/ЯА пики уровня мРНК гена Ы1 были обнаружены на 14 и 17 сутки жизни в передней части спины, 14 и 19 сутки в средней части спины и 14 и 19 сутки жизни в задней части спины (рис. 4, б). Ген М1 является мишенью ВМР-зависимой генной регуляторной сети, и уровень экспрессии мРНК этого гена, действительно, в ряде изученных в данной работе временных точек возрастает или снижается в соответствии с уровнем экспрессии мРНК гена Втр2 у мышей обоих генотипов. Однако так как в контроле морфогенеза ВФ кроме этой генной сети задействованы и другие (в частности, ХУЫТ-зависимая генная регуляторная сеть, некоторые

средней части спины у мышей генотипов ///'7+ (а) и Я/7Яг'" (б).

эффекторы которой способны ингибировать ВМР-индуцированные внутриклеточные каскады), логично ожидать, что далеко не во всех случаях ВМР-зависимый сигнал достигнет своего эффектора Idl.

Экспрессия мРНК гена Mitf. Количество копий мРНК гена Mitf в коже мышей обеих исследованных групп также было неодинаковым как в кранио-каудальном направлении, так и во времени. У мышей генотипа Я/7+ локальные максимумы экспрессии мРНК Mitf наблюдались на 14, 17 и 19 сутки в передней части спины, на 10 и 18 сутки в средней части спины, на 15 и 19 сутки в задней части спины (рис. 4, а). У мышей генотипа Я/7Я/Г локальные пики уровня мРНК этого гена были отмечены на 14 и 16 сутки в коже передней части спины, 14 и 17 сутки в коже средней части спины, на 14 и 17 сутки в коже задней части спины (рис. 4, б).

У мышей генотипа Я/7+ пики уровня экспрессии мРНК гена Mitf приходятся на те временные точки, в которых ранее наблюдался спад экспрессии мРНК ВМР-зависимого гена Idl (17 и 19 сутки в передней части спины, 18 сутки в средней части спины и 15 сутки в задней части спины). Это подтверждает известные данные об антагонизме WNT- и ВМР-зависимых генных регуляторных сетей. Однако у мышей генотипа Я/7ЯгЛг такой закономерности нет, и этот факт подкрепляет гипотезу о том, что ген Нг вовлекается в молекулярный диалог между этими генными сетями.

Экспрессия мРНК гена Sostdcl. Пики уровней мРНК гена Sostdcl наблюдались у мышей генотипа Я/7+ на 15 и 18 сутки жизни в передней части спины, на 15 и 19 сутки в средней части спины, на 18 сутки в задней части спины (рис. 4, а). У мышей генотипа Я/'7Я/Г такие пики наблюдались на 14 и 17 сутки в передней части спины, на 14 и 19 сутки в средней части спины, на 14 сутки в задней части спины (рис. 4, б).

Экспрессия гена Sostdcl индуцируется ВМР-зависимой генной сетью, а его белковый продукт способен ингибировать работу этой сети (Laurikkala et al., 2003). Кроме того, SOSTDC1 может также модулировать работу WNT-зависимой генной регуляторной сети, угнетая или активируя ее работу в зависимости от своей концентрации (Itasaki et al., 2003). Это значит, что колебания уровня экспрессии мРНК гена Sostdcl должны находиться в определенном соответствии с колебаниями уровней мРНК как ВМР-зависимого гена Idl, так и WNT-зависимого гена Mitf (таб. 1). У мышей генотипа Я/7+ ожидаемая закономерность, действительно, наблюдалась: изменения уровня экспрессии мРНК гена Sostdcl положительно

Таб. 1. Коэффициенты корреляции Пирсона между изменениями количеств мРНК гена Sostdcl и генов Втр2, ldl, Mitf в пробах кожи передней («ant»), средней («med») и задней («post») частей спины мышей генотипов Я/7+ и

Генотип Группа проб Sostdcl/ldl Sostdcl/Mitf Sostdcl/Bmp2

+/яА ant 0,569 -0,656 -0,219

med 0,360 -0,843 -0,853

post 0,983 0,032 -0,115

ЯЛ/ЯЛ ant 0,920 0,610 0,563

med 0,895 0,453 0,621

post 0,853 0,036 0,240

коррелировали с изменениями количества мРНК гена ldl (коэффициенты корреляции 36 - 98%) и отрицательно коррелировали с изменениями уровня мРНК гена Mitf в передней и средней части спины (коэффициенты корреляции -66% и -84%). Это, в рамках рассматриваемой модели, непосредственным образом указывает на то, что в коже у мышей генотипа Я/7+ экспрессия гена Sostdcl индуцируется в результате работы ВМР-зависимой генной регуляторной сети, а его продукт угнетает работу WNT-зависимой генной сети. Обнаруженная отрицательная корреляция между изменениями уровней мРНК генов Sostdcl и Втр2 позволяет высказать предположение, что продукт гена Sostdcl угнетает экспрессию мРНК гена Втр2, то есть, контролирует работу BMP-зависимой генной сети и через эту регуляцию.

В пробах, полученных у мышей генотипа Я/7Я/Г, корреляция изменений уровней мРНК во всех парах генов Sostdcl - ldl, Sostdcl - Mitf и Sostdcl - Bmp2 положительная и варьирует в пределах 24 - 92% (исключение составляют изменения количеств мРНК генов Sostdcl и Mitf в задней части спины, между которыми существенной корреляции обнаружено не было). Это свидетельствует о том, что у мышей генотипа я/7я/г экспрессия гена Sostdcl индуцируется в результате работы BMP-зависимой генной сети, но продукт этого гена не угнетает ни экспрессию мРНК гена Втр2, ни экспрессию мРНК гена Mitf.

Изучение влияния экзогенного препарата NOGGIN на скорость роста волос у мыши. Для того, чтобы выяснить, оказывает ли ингибирование BMP-зависимой генной регуляторной сети влияние на рост

волос у взрослых мышей in vivo, мы оценили скорость роста волос на фоне подкожных инъекций препарата белка NOGGIN в различных концентрациях.

В процессе эксперимента эффект от подкожных инъекций был заметен уже на уровне визуального анализа. В контрольной группе и в группе мышей, которым вводили препарат в дозе 4 мкг/мл, короткие волосы появлялись уже на 8 день после депиляции, при дозе NOGGIN 5 мкг/мл - на 10 день после депиляции, а при большей дозе препарата - на 11 день.

Чтобы установить, действительно ли NOGGIN, введенный подкожно, снижает уровень активности BMP-зависимой генной регуляторной сети в

Таб. 2. Средняя длина волос у мышей через 19 дней после начала серии подкожных инъекций препарата NOGGIN. Доверительные интервалы вычислены при P(t)=0,95.

Доза препарата (мкг/мл) Направляющие (мм) Остевые (мм) Пуховые (мм)

0 4,7738±0,395 3,2736±0,171 2,7922±0,316

4 3,7613±0,298 2,5875±0,109 -

5 3,0623±0,256 2,0799±0,095 -

6 2,2170±0,204 1,5082±0,084 -

7 1,5573±0,164 1,0779±0,075 -

2500000

а

| 2000000

ас х

s 1500000 >s

S с

2 1000000 §

| 500000 1

о

012345678 Доза препарата NOGGIN, мг/мкл

if-

Т

lie-

fit

м t"

3=..

-1

Рис. 5. Зависимость количества копий мРНК гена Idl в пробах кожи спины мышей от дозы препарата NOGGIN, инъецированного подкожно.

коже мышей, по окончании эксперимента мы проанализировали методом ОТ/ПЦР-РВ уровень транскрипционной активности BMP-зависимого гена Idl во фрагментах кожи исследуемых мышей. В результате этого анализа было установлено, что нормированное количество копий мРНК гена Idl достоверно и закономерно снижается с увеличением дозы белка NOGGIN, введенного подкожно (рис. 5, коэффициент корреляции -0,977).

Чтобы оценить физиологический эффект, который производит NOGGIN, введенный подкожно, по окончании эксперимента (через 20 дней после начала серии инъекций) был выполнен анализ длин направляющих, остевых и пуховых волос исследуемых мышей. В результате этого анализа была выявлена строгая отрицательная корреляция между дозой препарата и скоростью роста волос. Так, коэффициенты корреляции между дозой NOGGIN и длиной направляющих волос, а также между дозой NOGGIN и длиной остевых волос составили -0,999 (таб. 2). При этом у мышей, которым была проведена серия инъекций белка NOGGIN, среди 80 случайно выбранных волос, отросших за период эксперимента, ни один не был классифицирован как пуховой.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что инъецируемый подкожно NOGGIN, действительно, ингибирует работу ВМР-зависимой генной регуляторной сети, и это ингибирование, в свою очередь, подавляет инициацию нового анагена (и, следовательно, начало роста новых волос) в ВФ всех типов. Тот факт, что через 20 дней после начала инъекций NOGGIN на исследуемом участке кожи мышей не были обнаружены de novo сформированные пуховые волосы, говорит, по меньшей мере, о различной чувствительности ВФ разных типов к уровню активности ВМР-зависимой генной регуляторной сети. По результатам эксперимента, очевидно, что ВФ, которые формируют пуховые волосы, более чувствительны к снижению активности ВМР-зависимой генной регуляторной сети, в сравнении с фолликулами, которые формируют направляющие или остевые волосы. Таким образом, хотя ВФ, формирующие остевые волосы, и ВФ, формирующие пуховые волосы у мыши условно относят к одному типу (нешиловидные ВФ, формирующиеся в период от 16,5 дня эмбрионального развития до 0,5 дня постнатальной жизни; Botchkarev et al., 2002), существуют принципиальные различия в молекулярном контроле инициации их роста и, возможно, их морфогенетического цикла.

выводы

1. Впервые показано, что у мышей, гомозиготных по мутантному аллелю яЛ, в составе производных волосяных фолликулов сохраняются клетки, способные к участию в репаративной регенерации эпидермиса и восстановлению собственной популяции.

2. Белок NOGGIN, являющийся модулятором BMP-зависимой генной регуляторной сети, при подкожной инъекции мышам генотипа +/+ угнетает работу этой сети, что в свою очередь приводит к дозозависимому угнетению роста волос.

3. В коже мышей генотипов Я/7+ и экспрессия мРНК генов Idl и Sostdcl усиливается при увеличении уровня мРНК гена Втр2, что подтверждает гипотезу о зависимости экспрессии этих генов в коже от активности BMP-зависимой генной сети.

4. В коже мышей генотипа Я/7+ увеличение экспрессии мРНК ВМР-зависимого гена Sostdcl сопровождается угнетением работы WNT-зависимой генной регуляторной сети, что выражается в снижении экспрессии мРНК WNT-зависимого гена Mitf. В коже мышей генотипа ЯЛ/ЯЛ увеличение экспрессии мРНК гена Sostdcl не сопровождается угнетением работы WNT-зависимой генной регуляторной сети.

5. Координация работы BMP- и WNT-зависимой генной сети, необходимая для нормального протекания морфогенетического цикла волосяных фолликулов у мышей, осуществляется путем ингибирования WNT-зависимой генной сети продуктом гена Sostdcl только в присутствии продукта гена Нг.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Головатенко-Абрамов П. К.. Платонов Е, С. Генные регуляторные сети, контролирующие морфогенез волосяного фолликула у мыши // Усп. совр. биол. 2009. Т. 129. С. 144- 157.

2. Колокольчикова Е. Г., Жиркова Е. А., Головатенко-Абрамов П. К., Платонов Е. С., Хватов В. Б., Бочарова В. С. Морфофункциональная оценка влияния биологической повязки на основе коллагена 1 типа на регенерацию кожи после ожоговой травмы у мышей двух генетических линий // Клет. технол. в биологии и медицине. 2010. №1. С. 12 - 16.

3. Golovatenko-Abramov Р. К. ATGC, software for nucleotide sequence analysis / Proceedings of the 3-rd Moscow Conference on Computational Molecular Biology. July 27 - 31, 2007, Moscow, Russia.

4. Головатенко-Абрамов П. К. Изучение влияния мутантного гена hr на экспрессию BMP-зависимых генов в цикле волосяного фолликула у мыши / Вавиловские чтения - 2008: Материалы Межд. науч.-практ. конф. (Саратов, 26 - 27 ноября, 2009) - Саратов: ИЦ «Наука», 2008.

5. Колокольчикова Е. Г., Жиркова Е. А., Головатенко-Абрамов П. К.. Хватов В. Б. Изучение репаративной регенерации кожи у безволосых мышей линии «hairless» / Актуальные вопросы патологической анатомии: Материалы III съезда Российского общества патологоанатомов. Самара, 26 -30 мая, 2009.

6. Nesterova А. P., Golovatenko-Abramov Р. К.. Platonov Е. S. Hair growth disorders caused by mutant genes hr, we, wal and Fgfig0~y in mice are associated with disruption of BMP and WNT pathways in skin / Proceedings of World Congress Gene 2009, December 1 - 7, 2009, Foshan, China.

Подписано в печать 26 января 2010 г. Объем 1,0 п.л. Тираж 70 экз. Заказ № 63

Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Головатенко-Абрамов, Павел Кириллович

Введение

Цели и задачи работы

Часть I. Обзор литературы

Глава 1. Постнатальный морфогенез волосяных фолликулов у мыши

Глава 2. Ключевые генные регуляторные сети, контролирующие морфогенез волосяных фолликулов

2.1. Генная регуляторная сеть SHH

2.2. Генная регуляторная сеть WNT

2.3. Генная регуляторная сеть BMP

2.4. Взаимодействие WNT- и TGF-p-зависимых механизмов в индукции морфогенеза волосяных фолликулов у мыши

2.5. Роль специфических антагонистов WNT- и ВМР-зависимых генных сетей в обеспечении взаимодействия этих генных сетей

Глава 3. Ген Нг и его мутантные аллели как инструмент для изучения генетического контроля развития волоса

3.1. Мыши, мутантные по гену Нг, как модель наследственной алопеции

3.2. Молекулярные принципы действия гена Нг и плейотропные эффекты его мутантных аллелей

Часть II. Экспериментальная часть

Глава 4. Материалы и методы

4.1. Животные

4.2. Выделение ДНК и определение мутантного аллеля гена Нг

4.3. Изучение экспрессии мРНК BMP- и WNT-зависимых генов в коже мышей генотипов Hrh'/+ и Hrhr/Hr'"

4.4. Изучение регенерационной способности кожи мышей генотипа HrhrIHrh

4.5. Исследование действия препарата NOGGIN на скорость роста волос у мышей СВА

4.6. Статистическая обработка данных

Глава 5. Определение мутантного аллеля гена Нг

Глава 6. Изучение влияния мутации в гене Нг на пространственно-временной паттерн транскрипционной активности BMP- и WNT-зависимых генов в коже мыши

6.1. Экспрессия мРНК гена Втр

6.2. Экспрессия мРНК гена Idl

6.3. Экспрессия мРНК гена Mitf

6.4. Экспрессия мРНК гена Sostdcl

Глава 7. Изучение влияния мутации в гене Нг на регенерационнуго способность кожи мыши

Глава 8. Изучение влияния экзогенного препарата NOGGIN на скорость роста волос у мыши

Обсуждение

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли гена Hr в работе ВМР- и WNT-зависимых генных регуляторных сетей в цикле волосяного фолликула мыши"

Фенотип высших организмов формируется в результате сложных взаимодействий многих тысяч генов в онтогенезе. У позвоночных и, в частности, млекопитающих ключевую роль в органогенезах играют взаимодействия эффектов неаллельных генов, работающих в разных клеточных системах. Такие взаимодействия определяют время активации, проявления эффектов и степень экспрессии взаимодействующих генов. Сегодня наиболее популярной концепцией, позволяющей систематизировать взаимодействующие гены в онтогенезе, является концепция генных регуляторных сетей. Генные регуляторные сети (или сигнальные пути) в общем случае являют собой абстрактные системы, описывающие взаимодействие генов, кодирующих лиганды (активаторы и ингибиторы), их рецепторы, посредники и факторы транскрипции, непосредственно связывающиеся с ДНК и активирующие транскрипцию генов — эффекторов. Дифференциальная экспрессия генов в ходе всего онтогенеза является результатом функционирования и взаимодействия таких сетей. Изучение механизмов работы генных регуляторных сетей с одной стороны представляет большой интерес для понимания генетического контроля развития, а с другой определяет широкие возможности для направленного модулирования транскрипционной активности конкретных генов, что находит свое применение в лечении заболеваний разной этиологии.

Изучение генетического контроля процессов развития волосяного покрова у млекопитающих является актуальной задачей генетики развития, имеющей прикладное значение для косметической медицины и дерматологии. С точки зрения биологии развития как фундаментальной науки, кожа млекопитающих и волосяной фолликул представляются уникальными объектами исследований, так как кожа в целом является интенсивно обновляемым органом, а морфогенез волосяного фолликула 5 протекает в ходе всего индивидуального развития организма. Поэтому генные регуляторные сети, контролирующие пути дифференцировки и миграции клеток, представлены в этих органах вне зависимости от стадии развития или возраста. Среди генных регуляторных сетей, функционирующих в коже млекопитающих, особое место занимают сети, индуцируемые белковыми молекулами семейств WNT и BMP. Нарушения работы этих сетей приводят к различным аномалиям в развитии кожи и волосяных фолликулов, от недоразвития определенных компонентов фолликулов до развития злокачественных новообразований.

Эффект мутантного гена hr у мышей был впервые описан в первой половине XX века (Brooke, 1926), но нормальный аллель Нг был охарактеризован лишь в 1994 году (Cachon-Gonzalez et al., 1994). Наиболее явное фенотипическое проявление мутации в этом гене заключается в полной потере шерстного покрова в период с 14 до 21 дня постнатальной жизни мыши, после чего алопеция сохраняется пожизненно. В настоящее время ген Нг представляет особый интерес в аспекте регуляции индуктивных взаимодействий между эктодермальными и мезодермальными компонентами волосяного фолликула, обусловливающих инициацию его морфогенеза в эмбриональный период, а также циклический морфогенез в течение всей жизни индивида. К настоящему моменту детали патогенеза характерного фенотипа у мутантных животных описаны на морфологическом уровне достаточно подробно (Panteleyev et al., 1998), но молекулярные механизмы, лежащие в основе эффектов мутантных аллелей гена Нг, по-прежнему остаются неизученными. Также не вполне ясными остаются ключевые моменты физиологии клеток, задействованных в аномальном морфогенезе волосяного фолликула у мутантных животных, после стабилизации фенотипа. Насколько способны клетки, оставшиеся после дезинтеграции волосяного фолликула, к физиологическим реакциям, которые в норме свойственны клеткам такого типа? Одной из таких реакций является б вовлечение стволовых клеток волосяного фолликула в репаративную регенерацию эпидермиса (Oshima et al., 2001; Blanpain et al., 2004; Morris et al., 2004). Поэтому одним из методов, позволяющим ответить на поставленный вопрос, является создание кожной травмы и морфологический анализ регенерации эпидермиса.

Известные данные разных авторов подводят к мысли о том, что продукт нормального аллеля гена Нг является важным модулятором активности генных регуляторных сетей, участвующих в физиологии волосяного фолликула у млекопитающих. Однако, хотя и существует ряд гипотетических молекулярных мишеней белка HR, конкретные сигнальные пути, затрагиваемые в случае мутации в этом гене, точно не известны. Показано также, что мутантные аллели этого гена обладают целым спектром плейотропных эффектов в различных органах и тканях (Nonchev et al., 2006). При этом примечателен тот факт, что развитие органов, в которых у мышей, мутантных по гену Нг, отмечаются анатомические аномалии, также связано с работой эволюционно консервативных WNT- и BMP-зависимых генных сетей, координирующих пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток в ходе морфогенеза (Lowry, Richter, 2007).

Все вместе, эти факты порождают новые вопросы о вовлечении гена

Нг в работу WNT- и BMP-зависимых генных сетей: о его конкретных молекулярных мишенях и о том, одинаковы ли эти мишени в клетках разных типов. Изучение изменений в работе WNT- и ВМР-зависимых генных сетей у мышей, мутантных по гену Нг, таким образом, является первым шагом на пути к получению ответов на эти вопросы. Оценка активности этих генных сетей может быть проведена на разных уровнях их работы; в частности, об их активности можно судить по экспрессии мРНК генов, индуцирующих сигнальный каскад WNT или BMP, и генов, транскрипция которых активируется в результате работы этих генных регуляторных сетей. При этом наиболее полные и полезные сведения 7 можно получить, пользуясь методами количественной оценки уровней мРНК интересующих генов. Одним из методов, применяемых в таких случаях, является метод полимеразной цепной реакции с флюоресцентной оценкой количества продуктов реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) в сочетании с реакцией обратной транскрипции (Bustin, 2000). Этот метод позволяет относительно точно определить исходное количество транскрипта интересующего гена в изучаемой пробе.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью настоящей работы является изучение молекулярно-генетических механизмов, при помощи которых ген Нг вовлекается в контроль морфогенетического цикла волосяных фолликулов у мыши. Центральной теоретической предпосылкой для выполнения данной работы были известные факты о том, что в развитии и цикле волосяного фолликула мыши ключевую роль играют WNT- и BMP-зависимая генная сеть (Schneider et al., 2009), и о том, что в контроле транскрипции гена Sostdcl, белковый продукт которого способен модулировать активность обеих этих сетей (Itasaki et al., 2003; Laurikkala et al., 2003), может участвовать ген Hr (Thompson, Bottcher, 1997; Beaudoin et al., 2005).

Исходя из цели работы и особенностей объекта исследования, были поставлены следующие задачи.

1. Охарактеризовать на молекулярном уровне мутантный аллель гена Нг у животных, используемых в дальнейшей работе.

2. Сопоставить компетенцию клеток волосяных фолликулов рандомбредных мышей и клеток производных волосяных фолликулов мышей, гомозиготных по мутантному аллелю гена Нг, в отношении травматического повреждения кожи на модели ожога Ша степени субдермальной глубины и вырезанной раны.

3. Исследовать характер влияния экзогенного модулятора ВМР-зависимой генной сети NOGGIN на скорость роста волос у мышей дикого типа (линии СБА).

4. Сопоставить динамику экспрессии BMP- и WNT-зависимых генов в коже мышей, гомозиготных по мутантному аллелю гена Нг, в период развития алопеции с динамикой экспрессии этих же генов в коже феногипически нормальных сибсов-гетерозигот соответствующего возраста.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Головатенко-Абрамов, Павел Кириллович

выводы

1. Впервые показано, что у мышей, гомозиготных по мутантному аллелю Hrh, в составе производных волосяных фолликулов сохраняются клетки, способные к участию в репаративной регенерации эпидермиса и восстановлению собственной популяции.

2. Белок NOGGIN, являющийся модулятором ВМР-зависимой генной регуляторной сети, при подкожной инъекции мышам генотипа +/+ угнетает работу этой сети, что в свою очередь приводит к дозозависимому угнетению роста волос.

3. В коже мышей генотипов Hrh7+ и Hrh'/Hrhr экспрессия мРНК генов Idl и Sostdcl усиливается при увеличении уровня мРНК гена Втр2, что подтверждает гипотезу о зависимости экспрессии этих генов в коже от активности ВМР-зависимой генной сети.

4. В коже мышей генотипа Ягл7+ увеличение экспрессии мРНК BMP-зависимого гена Sostdcl сопровождается угнетением работы WNT-зависимой генной регуляторной сети, что выражается в снижении экспрессии мРНК WNT-зависимого гена Mitf. В коже мышей генотипа HrhrHIrhr увеличение экспрессии мРНК гена Sostdcl не сопровождается угнетением работы WNT-зависимой генной регуляторной сети.

5. Координация работы BMP- и WNT-зависимой генной сети, необходимая для нормального протекания морфогенетического цикла волосяных фолликулов у мышей, осуществляется путем ингибирования WNT-зависимой генной сети продуктом гена Sostdcl только в присутствии продукта гена Нг.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Имеющиеся данные о взаимоотношениях генных сетей BMP и WNT с одной стороны и о гипотетической связи генов Нг и Sostdcl с другой позволили нам создать гипотетическую модель, включающую в себя ген Нг, BMP-зависимые гены Втр2, Idl, Sostdcl и WNT-зависимый ген Mitf и проверить ее адекватность путем анализа уровней транскрипционной активности этих генов методом ОТ/ПЦР-РВ. Результаты анализа этой модели не только подтвердили известные факты о том, что экспрессия гена Sostdcl активируется в результате работы BMP-зависимой генной сети (наблюдалась положительная корреляция между изменениями уровней экспрессии мРНК гена Sostdcl и BMP-зависимого гена Idl), но и позволили выдвинуть ряд новых предположений о взаимодействии генных сетей BMP и WNT в коже мышей.

Во-первых, у мышей генотипа Hrhrf+, используемых в качестве модели животных дикого генотипа, изменения экспрессии мРНК гена Sostdcl отрицательно коррелировали с изменениями экпрессии мРНК WNT-зависимого гена Mitf. У мышей генотипа HrhrIHrh такой корреляции обнаружено не было. Это позволяет нам выдвинуть предположение о том, что в норме в коже мышей продукт гена Sostdcl ингибирует работу WNT-зависимой генной сети, и этот эффект возможен только в присутствии продукта гена Нг. Это предположение подкрепляется результатами эксперимента о заживлении ран у мышей генотипа Нг1'IHr" и данными разных авторов о преобладании процессов пролиферации в коже мышей, мутантных по гену Нг, а полученный результат подтверждает наше предыдущее предположение о гиперактивации WNT-зависимой генной регуляторной сети в коже мышей генотипа Hrh7Hr'".

Во-вторых, у мышей генотипа Hrhr/+ изменения экспрессии мРНК гена Sostdcl отрицательно коррелировали с изменениями экспрессии мРНК гена Втр2, но не BMP-зависимого гена Idl. У мышей генотипа

101

HrhrIHrhr корреляция между изменениями уровней мРНК генов Sostdcl и Втр2 была положительной. Это позволяет нам выдвинуть предположение о том, что в норме продукт гена Sostdcl угнетает транскрипционную активность гена Втр2, но в целом работа BMP-зависимой генной сети оказывается незатронутой (возможно, вследствие активности других ее индукторов, которые в данной работе не изучались).

Таким образом, результаты, полученные в данной работе, позволяют построить схему, описывающую взаимодействия между генными сетями BMP и WNT в ВФ мыши, и определить на такой схеме место гена Нг (рисунок 27). В рамках рассматриваемой модели взаимодействий можно утверждать, что координация работы BMP- и WNT-зависимой генной регуляторной сети, необходимая для нормального протекания морфогенетического цикла волосяных фолликулов у мышей, осуществляется путем ингибирования WNT-зависимой генной сети продуктом гена Sostdcl только в присутствии продукта гена Нг. У мышей генотипа Hrhr!H/r такая координация нарушена. Врзникающий при этом

Пролиферация и миграция клеток Рост фолликула

Дифференцировка

Рост волоса

Рисунок 27. Роль гена Нг в координации взаимодействия между BMP- и WNT-зависимой генной регуляторной сетью. Результаты, полученные в данной работе, свидетельствуют о том, что увеличение в коже экспрессии мРНК гена Sostdcl сопровождается снижением уровней мРНК генов Втр2 и Mitf только у мышей генотипа Нг/+. Следовательно, для осуществления такой регуляции необходим достаточно высокий уровень экспрессии гена Нг. дисбаланс сил WNT-зависимых сигналов к пролиферации и миграции клеток-предшественников наружного корневого влагалища и ВМР-зависимых сигналов к их дифференцировке приводит к переполнению матрикса луковицы волосяного фолликула дифференцированными или вставшими на путь дифференцировки эпидермальными клетками, что неизбежно ведет к развитию патологического фенотипа. Нужно дополнительно отметить, что ранее гену Нг спекулятивно предписывали противоположную функцию: предполагалось, что белок HR ингибирует активность белка SOSTDCl, который, в свою очередь, ингибирует активность WNT-зависимой генной сети; таким образом, HR предположительно активировал WNT-зависимую генную сеть (Beaudoin et al., 2005). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что ген Нг не активирует работу WNT-зависимой генной регуляторной сети в ВФ мышей, а ингибирует ее, и эта функция на транскрипционном уровне опосредуется геном Sostdcl.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Головатенко-Абрамов, Павел Кириллович, Москва

1. Всеволодов Э. Б. Волосяные фолликулы / Алма-Ата: Наука, 1979. 192 с.

2. Конюхов Б. В. Биологическое моделирование наследственных болезней человека / М.: Медицина, 1969. 259 с.

3. Ahmad W., Panteleyev A. A., Christiano А. М. The molecular basis of congenital atrichia in humans and mice: mutations in the hairless gene // J. Invest. Dermatol. 1999. V. 4. P. 240 243.

4. Baker J. C., Beddington R. S., Harland R. M. Wnt signaling in Xenopus embryos inhibits bmp4 expression and activates neural development // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 3149-3159.

5. Balemans W., Van Hul W. Extracellular regulation of BMP signaling in vertebrates: a cocktail of modulators // Dev. Biol. 2002. V. 250. P. 231 -250.

6. Beaudoin G. M. J. Ill, Sisk J. M., Coulombe P. A., Thompson С. C. Hairless triggers reactivation of hair growth by promoting Wnt signaling // PNAS. 2005. V. 102. P. 14653 14658.

7. Bernerd F., Schweizer J., Demarchez M. Dermal cysts of the rhino mouse develop into unopened sebaceous glands // Arch. Dermatol. Res. 1996. V. 288. P. 586-595.

8. Billingham R. E., Silvers W. K. Transplantation and cutaneous genetics // J. Invest. Dermatol. 1973. V. 60. P. 509 515.

9. Bitgood M. J., McMahon A. P. Hedgehog and Bmp genes are coexpressed at many diverse sites of cell cell interaction in the mouse embryo // Dev. Biol. 1995. V. 172. P. 126 - 138.

10. Blanpain С., Lowry W. E., Geoghegan A., Polak L., Fuchs E. Self-renewal, multipoteney, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche // Cell. 2004. V. 118. P. 635 648.

11. Blessing M., Nanney L. В., King L. E., Jones С. M., Hogan B. L. transgenic mice as a model to study the role of TGF-beta-related molecules in hair follicles // Genes Dev. 1993. V. 7. P. 204 215.

12. Blume-Peytavi U., Tosti A., Whiting D. A., Trueb R. M. Hair Growth and Disorders / Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2008.

13. Botchkarev V. A., Botchkareva N. V., Nakamura M., Huber O., Funa K., Lauster R., Paus R., Gilchrcst B. A. Noggin is required for induction of the hair follicle growth phase in postnatal skin // FASEB J. 2001. V. 15. P. 2205-2214.

14. Botchkarev V. A., Botchkareva N. V., Sharov A. A., Funa K., Huber O., Glichrest B. A. Modulation of BMP signaling by noggin is required for induction of the secondary (nontylotrich) hair follicles // J. Invest. Dermatol. 2002. V. 118. P. 3 10.

15. Brooke H. C. Hairless mice // J. Hered. 1926. V. 17. P. 173 174.

16. Brott В. K., Sokol S. Y. Regulation of Wnt/LRP signaling by distinct domains of Dickkopf proteins // mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 6100 -6110.

17. Bustin S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reversetranscription polymerase chain reaction assays // J. Mol. Endocrinol. 2000.1061. V. 25. P. 169- 193.

18. Cachon-Gonzalez M. В., Fenner S., Coffin J. M., Moran C., Best S., Stoye J. P. Structure and Expression of the Hairless Gene of Mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 7717 7721.

19. Cachon-Gonzalez M. В., San-Jose I., Cano A., Vega J. A., Garcia N., Freeman Т., Schimmang Т., Stoye J. P. The heirless gene of the mouse: relationship of phenotypic effects with expression profile and genotype // Dev. Dyn. 1999. V. 216. P. 113 126.

20. Chase H. В., Eaton G. J. The growth of hair follicles in waves // Ann. N. Y. Acad. Sci. USA. 1960. V. 83. P. 365 -368.

21. Chen J. D., Evans R. M. A transcriptional co-repressor that interacts with nuclear hormone receptors // Nature. 1995. V. 377. P. 454 457.

22. Chuong С. M., Chen H. M., Jiang Т. X., Chia J. Adhesion molecules in skin development: morphogenesis of feather and hair // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1991. V. 642. P. 263-280.

23. Chuong С. M., Widelitz R. В., Ting-Berreth S., Jiang Т. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance // J. invest. Dermatol. 1996. V. 107. P. 639 646.

24. Chuong C.-M. E. Molecular Basis of Epithelial Appendage Morphogenesis / Austin, TX: R. G. Landes Co. 1998.

25. Cotsarelis G., Millar S. Towards a molecular understanding of hair loss and its treatment // Trends Mol. Med. 2001. V. 7. P. 293 301.

26. Cotsarelis G., Sun Т. Т., Lavker R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis // Cell. 1990. V. 61. P. 1329 1337.

27. Crew F. A. E., Mirskaia L. The character "hairless" in the mouse // J. Genet. 1931. V. 25. P. 17-24.

28. Dahmane N., Lee J., Robins P., Heller P., Ruiz i Altaba A. Activation of the transcription factor Glil and the Sonic hedgehog signaling pathway in skin tumors // Nature. 1997. V. 389. P. 876 881.

29. Dale L., Wardle F. C. A gradient of BMP activity specifies dorsal-ventral fates in early Xenopus embryos // Semin. Cell Dev. Biol. 1999. V. 10. P. 319-326.

30. DasGupta R., Fuchs E. Multiple roles for activated LEF/TCF transcription complex during hair follicle development and differentiation // Development. 1999. V. 126. P. 4557-4568.

31. Dassule H., McMahon A. P. Analysis of epithelial-mesenchymal interactions in the initial morphogenesis of the mammalian tooth // Dev. Biol. 1998. V. 202. P. 215 227.

32. Di Simone N., Hall H. A., Welt C., Schneyer A. L. Activin regulates betaA-subunit and activin receptor messenger ribonucleic acid and cellular proliferation in activin-responsive testicular tumor cells // Endocrinology. 1999. V. 139. P. 1147- 1155.

33. Domingos P. M., Itasaki N., Jones С. M., Mercurio S., Sargent M. G.,

34. Smith J. C., Krumlauf R. The Wnt/beta-catenin pathway posteriorizesneural tissue in Xenopus by an indirect mechanism requiring FGF108signalling // Dev. Biol. 2001. V. 239. P. 148 160.

35. Evans R. M. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily // Science. 1988. V. 240. P. 889 895.

36. Ferguson C. A., Tucker A. S., Christicn L., Lau A. L., Matzuk M. M., Sharpe P. T. Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 2636 2649.

37. Finch P. W., Rubin J. S., Miki Т., Ron D., Aaronson S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine cffcctor of epithelial cell growth // Science. 1989. V. 245. P. 752 755.

38. Foitzik K., Paus R., Doetschman Т., Dotto G. P. The TGF-beta2 isoform is both a required and sufficient inducer of murine hair follicle morphogenesis // Dev. Biol. 1999. V. 212. P. 278 289.

39. Freeman Т. C., Dixon A. K., Campbell E. A., Tait Т. M., Richardson P. J., Rice К. M., Maslen G. L., Metcalfe A. D., Streuli С. H., Bentley D. R. Expression mapping of mouse genes // MGI Direct Data Submission. 1998. (MGI: 1199209).

40. Fuchs E. Scratching the surface of skin development // Nature. 2007. V. 445. P. 834-842.

41. Fuchs E., Merrill B. J., Jamora C., DasGupta R. At the roots of a never-ending cycle // Dev. Cell. 2001. V. 1. P. 13 25.

42. Gallagher С. H., Canfield P. J., Greenoak G. E., Reeve V. E. Characterization and histogenesis of tumors in the hairless mouse produced by low-dosage incremental ultraviolet radiation // J. Invest. Dermatol. 1984. V. 83. P. 169- 174.

43. Garcia-Castro M. I., Marcelle C., Bronner-Fraser M. Ectodermal Wnt function as a neural crest inducer // Science. 2002. V. 297. P. 848 — 851.

44. Gat U., DasGupta R., Degenstein L., Fuchs E. De Novo hair follicle morphogenesis and hair tumors in mice expressing a truncated beta-catenin in skin // Cell. 1998. V. 95. P. 605 614.

45. Gates A. H., Arundell F. D., Karasek M. A. Hereditary defect of the pilosebaceous unit in a new double mutant mouse // J. Invest. Dermatol. 1969. V. 52. P. 115-118.

46. Ghazizadeh S., Taichman L. B. Multiple classes of stem cells in cutaneous epithelium: a lineage analysis of adult mouse skin // EMBO J. 2001. V. 20. P. 1215- 1222.

47. Godwin A. R., Capecchi M. R. Hoxl3c mutant mice lack external hair // Genes Dev. 1998. V 12. P. 11-20.

48. Grotewold L., Plum M., Dildrop R., Peters Т., Ruther U. Bambi is coexpressed with Bmp-4 during mouse embryogenesis // Mech. Dev. 2001. V. 100. P. 327-330.

49. Hammerschmidt M., Brook A., McMahon A. P. The world according to hedgehog // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 14 21.

50. Hardy M. H. The secret life of the hair follicle // Trends Getet. 1992. V. 8. P. 55-61.

51. He X., Saint J. J., Wang Y., Nathans J., Dawid I., Varmus H. A member of the Frizzled protein family mediating axis induction by Wnt-5A // Science. 1997. V. 275. P. 1652- 1654.

52. Headon D. J., Overbeek P. A. Involvement of a novel Tnf receptor homologue in hair follicle induction // Nature Genet. 1999. P. 370 374.

53. Heisenberg C. P., Tada M., Rauch G. J., Saude L., Concha M. L., Geisler1 10

54. R., Stemple D. L., Smith J. C., Wilson S. W. Silberblick/Wntl 1 mediates convergent extension movements during zebrafish gastrulation // Nature. 2000. V. 405. P. 76-81.

55. Herskowitz I. A regulatory hierarchy for cell specialization in yeast // Nature. 1989. V. 342. P. 749 757.

56. Hidalgo A. Interactions between segment polarity genes and the generation of the segmental pattern in Drosophila // Mech. Dev. 1991. V. 35. P. 77 -87.

57. Hogan B. L. M. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development// Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1580 1594.

58. Hogan B. L. M. Morphogenesis // Cell. 1999. V. 96. P. 225 233.

59. Holland D. В., Roberts S. G., Cunliffe W. J. Localization of keratin 17 mRNA in acne // J. Invest. Dermatol. 1997. V. 108. P. 384.

60. Huber O., Korn R., McLaughlin J., Ohsugi M., Herrmann B. G., Kemler R. Nuclear localization of beta-catenin by interaction with transcription factor LEF-1 // Mech. Dev. 1996. V. 59. P. 3 10.

61. Huelsken J., Birchmeier W., Behrens J. E-cadherin and APC compete for the interaction with beta-catenin and cytoskeleton // J. Cell Biol. 1994. V. 127. P. 2061 -2069.

62. Huelsken J., Vogel R., Brinkmann V., Erdmann В., Birchmeier C., Birchmeier W. Requirement for beta-catenin in anterior-posterior axis formation in mice // J. Cell Biol. 2000. V. 148. P. 567 578.

63. Itasaki N., Jones С. M., Mercurio S., Rowe A., Domingos P. M., Smith J. C., Krumlauf R. Wise, a context-dependent activator and inhibitor of Wnt signalling // Development. 2003. V. 130. P. 4295 4305.

64. Jepsen K., Rosenfeld M. G. Biological roles and mechanistic actions of compressor complexes // J. Cell Sci. 2002. V. 115. P. 689 698.

65. Kameda Т., Koike C., Saitoh K., Kuroiwa A., Iba H. Developmental patterning in chondrocytic cultures by morphogenic gradients: BMP induces expression of indian hedgehog and noggin // Genes Cells. 1999. V. 4. P. 175- 184.

66. Knutson J. C., Poland A. Response of murine epidermis to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin: interaction of the ah and hr loci // Cell. 1982. V. 30. P. 225-234.

67. Kratochwil K., Dull M., Farinas I., Galceran J., Grosschedl R. Lefl expression is activated by BMP-4 and regulates inductive tissue interactions in tooth and hair development // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1382- 1394.

68. Kulessa H., Turk G., Hogan B. L. M. Inhibition of Bmp signaling affects growth and differentiation in the anagen hair follicle // EMBO J. 2000. V. 19. P. 6664-6674.

69. LaBonne C., Bonner-Fraser M. Neural crest induction in Xenopus: evidence for a two-signal model // Development. 1998. V. 125. P. 2403 -2414.

70. Lamb Т. M., Knecht А. К., Smith W. С., Stachel S. E., Economides A. N„ Stahl N., Yancopolous G. D., Harland R. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin// Science. 1993. V. 262. P. 713 718.

71. Lane T. F., Leder P. Wnt-lOb directs hypermorphic development and transformation in mammary glands of male and female mice // Oncogene. 1997. V. 15. P. 2133-2144.

72. Laurikkala J., Kassai Y., Pakkasjarvi L., Thesleff I., Itoh N. Identification of a secreted BMP antagonist, ectodin, integrating BMP, FGF, and SHH signals from the tooth enamel knot // Dev. Biol. 2003. V. 264. P. 91 105.

73. Legue E., Nicolas J. F. Hair follicle renewal: organization of stem cells in the matrix and the role of stereotype lineages and behaviors // Development. 2005. V. 132. P. 4143 4154.

74. Lowry W. E., Blanpain C., Nowak J. A., Guasch G., Lewis L., Fuchs E. Defining the impact of beta-catenin/Tcf transactivation on epithelial stem cells // Genes Dev. 2005. V. 19. P. 1596 1611.

75. Lowry W. E., Richter L. Signaling in adult stem cells // Front. Biosci. 2007. V. 12. P. 3911 -3927.

76. Lyon M. F., Rastan S., Brown S. D. M. Genetic variants and strains of the laboratory mouse / Oxford University Press. 1996.

77. Lyons К. M., Pelton R. W., Hogan B. L. Organogenesis and pattern formation in mouse: RNA distribution patterns suggest a role for bone morphogenetic protein-2A (BMP-2A) //Development. 1990. V. 833 844.

78. Ma С. В., Kawamura S., Deng X. H., Ying L., Schneidkraut J., Hays P., Rodeo S. A. Bone morphogenetic proteins-signaling plays a role in tendonto-bone healing: a study of rhBMP-2 and noggin // Am. J. Sports Med.1132007. V. 35. P. 597 604.

79. Mangelsdorf D. J., Thummel C., Beato M., Herrlich P., Schultz G., Umesono K., Blumberg В., Kastner P., Mark M., Chambon P., Evans R. M. The nuclear receptor superfamily: the second decade // Cell. 1995. V. 83. P. 835 839.

80. Mann S. J. Hair loss and cyst formation in hairless and rhino mutant mice // Anat. Rec. 1971. V. 170. P. 485-500.

81. Matsuzaki T. Technologies for hair reconstruction and their applicability for pharmaceutical research // Yakugaku Zasshi. 2008. V. 128. P. 11 20.

82. McGrew L., Lai C.-J., Moon R. Specification of the anterioposterior neural axis through synergistic interaction of the Wnt signalling cascade with noggin and follistatin // Dev. Biol. 1995. V. 172. P. 337 342.

83. McKenna N. J., O'Malley B. W. Combinatorial control of gene expression by nuclear receptors and coregulators // Cell. 2002. V. 108. P. 465 474.

84. McMahon J. A., Takada S., Zimmerman L. В., Fan С. M., Harland R. M., McMahon A. P. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 1438 1452.

85. Merino R., Ganan Y., Macias D., Economides A. N., Sampath К. Т., Hurle J. M. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling // Dev. Biol. 1998. V. 200. P. 35-45.

86. Merrill B. J., Gat U., DasGupta R., Fuchs E. Tcf3 and Lefl regulate lineage differentiation of multipotent stem cells in skin // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 1688- 1705.

87. Mill P., Mo R., Fu H., Grachtchouk M., Kim P. C., Dlugosz A. A., Hui C.114

88. С. Sonic hedgehog-dependent activation of Gli2 is essential for embryonic hair follicle development // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 282 294.

89. Millar S. E. The role of patterning genes in epidermal differentiation. In: Cowin P., Klymkowsky M. (eds.). Cytoskeletal-Membrane Interactions and Signal Transduction / Landes Bioscience Austin, TX. 1997. P. 87 102.

90. Millar S. E., Willert K., Salinas P. C., Roelink H., Nusse R., Sussman D. J., Barsh G. S. WNT signaling in the control of hair growth and structure // Dev. Biol. 1999. V. 207. P. 133 149.

91. Miller-Bertoglio V. E., Fisher S., Sanchez A., Mullins M. C., Halpem M. E. Differential regulation of chordin expression domains in mutant zebrafish // Dev. Biol. 1997. V. 192. P. 537 550.

92. Miyazaki Y., Oshima K., Fogo A., Hogan B. L., Ichikawa I. Bone morphogenetic protein 4 regulates the budding site and elongation of the mouse ureter // J. Clin. Invest. 2000. V. 105. P. 863 873.

93. Montagna W., Chase H. В., Melaragno H. P. The skin of hairless mice. The formation of cysts and the distribution of lipids // J. Invest. Dermatol. 1952. V. 19. P. 83 94.

94. Moon R. Т., Campbell R. M., Christian J. L., McGrew L. L., Shih J., Fraser S. Xwnt-5A: a metrnal Wnt that affects morphogenetic movements after overexpression in embryos of Xenopus laevis // Development. 1993. V. 119. P. 97-111.

95. Moraitis A. N., Giguere V., Thompson С. C. Novel mechanism of nuclear receptor corepressor interaction dictated by activation function 2 helix determinants // Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 6831 6841.

96. Morris R. J., Liu Y., Males L., Yang Z., Trempus C., Li S., Lin J. S., Sawicki J. A., Cotsarelis G. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells //Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P. 411 417.

97. Morris R. J., Tryson K. A., Wu K. Q. Evidence that the epidermal targets of carcinogen action are found in the interfollicular epidermis ofinfundibulum as well as in the hair follicles // Cancer Res. 2000. V. 60. P.115226.229.

98. Nehls M., Pfeifer D., Schorpp M., Hedrich H., Boehm T. New member of the windeg-helix protein family disrupted in mouse and rat nude mutations //Nature. 1994. V. 372. P. 103 107.

99. Neubuser A., Peters H., Balling R., Martin G. R. Antagonistic interactions between FGF and BMP signaling pathways: a mechanism for positioning the sites of tooth formation // Cell. 1997. V. 90. P. 247 255.

100. Niemann C., Watt F. M. Designer skin: lineage commitment in postnatal epidermis // Trends Cell Biol. 2002. V. 12. P. 185 192.

101. Nonchev S., Brancaz M. V., Folco E., Romero Y., Iratni R. The mouse hairless gene: its function in hair root and at the heart of a subtle pleiotropy // Med. Sci. (Paris). 2006. V. 22. P. 525 530.

102. Noramly S., Freeman A., Morgan B. A. Beta-catenin signaling can initiate feather bud development//Development. 1999. V. 126. P. 3509-3521.

103. Noramly S., Morgan B. A. BMPs mediate lateral inhibition at successive stages in feather tract development // Development. 1998. V. 125. P. 3775 -3787.

104. Nusse R., van Ooyen A., Cox D., Fung Y. K., Varmus H. Mode of proviral activation of a putative mammary oncogene (int-1) on mouse chromosome 15 //Nature. 1984. V. 307. P. 131 136.

105. Oshima H., Rochat A., Kedzia C., Kobayashi K., Barrandon Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells // Cell. 2001. V. 104. P. 233-245.

106. Panteleyev A. A., Paus R., Wanner R., Nurnberg W., Eichmuller S., Thiel R., Zhang J., Henz В. M., Rosenbach T. Keratin 17 gene expression during the murine hair cycle // J. Invest. Dermatol. 1997. V. 108. P. 324 329.

107. Panteleyev A. A., van der Veen C., Rosenbach Т., Muller-Rover S., Sokolov V. E., Paus R. Towards defining the pathogenesis of the hairless phenotype // J. Invest. Dermatol. 1998. V. 110. P. 902 907.

108. Park H. L., Bai C., Piatt K. A., Matise M. P., Beeghly A., Hui С. C., Nakashima M., Joyner A. L. Mouse Glil mutants are viable but have defects in SHH signaling in combination with a Gli2 mutation // Development. 2000. V. 127. P. 1593 1605.

109. Paus R., Cotsarelis G. The biology of hair follicles // N. Engl. J. Med. 1999. V. 341. P. 491-497.

110. Paus R., Foitzik K., Welker P., Bulfone-Paus S„ Eichmuller S. Transforming growth factor-beta receptor type I and type II expression during murine hair follicle development and cycling // J. Invest. Dermatol. 1997. V. 109. P. 518- 526.

111. Pera E. M., De Robertis E. M. A direct screen for secreted proteins in Xenopus embryos identifies distinct activities for the Wnt antagonists Crescent and Frzb-1 // Mech. Dev. 2000. V. 96. P. 183 195.

112. Pereira R. C., Rydziel S., Canalis E. Bone morphogenetic protein-4 regulates its own expression in cultured osteoblasts // J. Cell. Physiol. 2000. V. 182. P. 239-246.

113. Perrimon N., McMahon A. P. Negative feedback mechanisms and their roles during pattern formation // Cell. 2000. V. 97. P. 13 16.

114. Philpott M. P., Paus R. Principles of hair follicle morphogenesis. In: Chuong С. M. (ed.). Molecular Basis of Epithelial Appendage Morphogenesis / Landes Bioscience Publishers. 1998. P. 75 — 103.

115. Pinkus H., Iwasaki Т., Mishima Y. Outer root sheath keratinization in anagen and catagen of the mammalian hair follicle. A seventh distinct type of keratinization in the hair follicle: trichilemmal keratinization // J. Anat. 1981. V. 133. P. 19-35.

116. Pispa J., Jung H. S., Jernvall J., Kettunen P., Mustonen Т., Tabata M. J., Kere J., Thesleff I. Cusp patterning defect in Tabby mouse teeth and its partial rescue by FGF // Dev. Biol. 1999. V. 216. P. 521 534.

117. Plikus M. V., Mayer J. A., de la Cruz D., Baker R. E., Maini P. K., Maxson R., Chuong C.-M. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration // Nature. 2008. V. 451. P. 340 345.

118. Poland A., Knutson J. C., Glover E. Histologic changes produced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in the skin of mice carrying mutations that affect the integument // J. Invest. Dermatol. 1984. V. 83. P. 454 459.

119. Potter G. В., Beaudoin G. M. Ill, DeRenzo C. L., Zarach J. M., Chen S. H., Thompson С. C. The hairless gene mutated in congenital hair loss disorders encodes a novel nuclear receptor corepressor // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 2687-2701.

120. Privalsky M. L. The role of corepressors in transcriptional regulation by nuclear hormone receptors // Annu. Rev. Physiol. 2004. V. 66. P. 315 -360.

121. Rasmussen J. Т., Deardorff M. A., Tan C., Rao M. S., Klein P. S., Vetter M. L. Regulation of eye development by frizzled signaling in Xenopus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 3861 3866.

122. Rebrikov D. V., Trofimov D. Yu. Real-time PCR: a review of approaches to data analysis // Applied Biochem. Microbiol. 2006. V. 42. P. 455 463.

123. Rendl M., Lewis L., Fuchs E. A. Molecular dissection of mesenchymal-epithelial interactions in the hair follicle // PLoS Biology. 2005. V. 3. P. 1910-1924.

124. Rijsewijk F., Schuermann M., Wagenaar E., Parren P., Weigel D., Nusse R. The Drosophila homolog of the mouse mammary oncogene int-1 i identical to the segment polarity gene wingless // Cell. 1987. V. 50. P. 649 -657.

125. Saint-Jeannet J. P., He X., Varmus H. E., Dawid I. B. Regulation of dorsal fate in the neuraxis by Wnt-1 and Wnt-3a // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 13713 13718.

126. Saito H., Yasumoto K., Takeda K., Takahashi K., Yamamoto H., Shibahara S. Microphtalmia-associated transcription factor in the Wnt signaling pathway // Pigment Cell Res. 2003. V. 16. P. 261 265.

127. Sasai Y., De Robertis E. M. Ectodermal patterning in vertebrate embryos // Dev. Biol. 1997. V. 182. P. 5 20.

128. Sato N., Leopold P. L., Crystal R. G. Induction of the hair growth phase in postnatal mice by localized transient expression of Sonic hedgehog // J. Clin. Invest. 1999. V. 104. P. 855 864.

129. Schmitt A., Rochat A., Zeltner R., Borenstein L., Barrandon Y., Wettstein F. O., Iftner T. The primary target cells of the high-risk cottontail rabbit papillomavirus colocalize with hair follicle stem cells // J. Virol. 1996. V. 70. P. 1912-1922.

130. Schulte-Merker S., Lee K. J., McMahon A. P., Hammerschmidt M. The zebrafish organizer requires chordino //Nature. 1997. V. 387. P. 862- 863.

131. Sengel P. Morphogenesis of Skin / Cambridge University Press. 1976.

132. Sheldahl L., Park M., Malbon C., Moon R. Protein kinase С is differentially stimulated by Wnt and Frizzled homologs in a G-protein-dependent manner // Curr. Biol. 1999. V. 9. P. 695 698.

133. Springer I. N., Warnke P. H„ Terheyden H., Acil Y., Bulhoff A., Kuchenbecker S., Bolte H., Russo P. A., Vairaktaris E. G., Wiltfang J. Craniectomy and noggin application in an infant model // J. Craniomaxillofac. Surg. 2007. V. 35. P. 177-184.

134. Steinberg M. S., McNuyy P. M. Cadherins and their connections: adhesion junctions have broader functions // Curr. Opin. Cell Biol. 1999. V. 11. P. 554 560.

135. Stenn K. S., Paus R. Controls of hair follicle cycling // Physiol. Rev. 2001. V. 81. P. 449-494.

136. St-Jacques В., Dassule H. R., Karavanova I., Botchkarev V. A., Li J., Danielian P. S., McMahon J. A., Lewis P. M., Paus R., McMahon A. P. Sonic hedgehog signaling is essential for hair development // Curr. Biol. 1998. V. 8. P. 1058- 1068.

137. Stottman R. W., Anderson R. M., Klingensmith J. The BMP antagonists Chordin and Noggin have essential but rebundant roles in mouse mandibular outgrowth // Dev. Biol. 2001. V. 240. P. 457 473.

138. Stoye J. P., Fenner S., Greenoak G. E., Moran C., Coffin J. M. Role of endogenous retroviruses as mutagens: the hairless mutation of mice // Cell. 1988. V. 54. P. 383 -391.

139. Sundberg J. P. The hairless and rhino mutations, chromosome 14 / Sundberg J. P. (ed.). Handbook of Mouse Mutations with Skin and Hair Abnormalities. CRC Press, Boca Raton, 1994. P. 291 312.

140. Taipale J., Cooper M. K., Maiti Т., Beachy P. A. Patched acts catalytically to suppress the activity of smoothened // Nature. 2002. V. 418. P. 892 -897.

141. Takahashi H., Ikeda T. Transcripts for two members of transforming growth factor-beta superfamily BMP-3 and BMP-7 are expressed in developing rat embryos // Dev. Dyn. 1996. V. 207. P. 439 449.

142. Tamai K., Setnenov M., Kato Y., Spokony R., Liu C., Katsuyama Y., Hess F., Saint-Jeannet J.-P., He X. LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction // Nature. 2000. V. 407. P. 530 535.

143. Taylor G., Lehrer M. S., Jensen P. J., Sun Т. Т., Lavker R. M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis // Cell. 2000. V. 102. P. 451 461.

144. Thomas B. L., Tucker A. S., Qui M., Ferguson C. A., Hardcastle Z., Rubcnstein J. L., Sharpe P. T. Role of Dlx-1 and Dlx-2 genes in patterning of the murine dentition // Development. 1997. V. 124. P. 4811 4818.

145. Thompson С. C., Bottcher M. C. The Product of a Thyroid hormone responsive gene interacts with thyroid hormone receptors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 8527-8532.

146. Trempus C. S., Morris R. J., Bortner C. D., Cotsarelis G., Faircloth R. S., Reece J. M., Tennant R. W. Enrichment for living murine keratinocytesfrom the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34 // J. Invest.121

147. Dermatol. 2003. V. 120. P. 501-511.

148. Vielkind U., Hardy M. H. Changing patterns of cell adhesion molecules during mouse pelage hair follicle development. 2. Follicle morphogenesis in the hair mutants, Tabby and downy // Acta Anat. 1996. V. 157. P. 183 -194.

149. Viti J., Gulacsi A., Lillien L. Wnt regulation of progenitor maturation in the cortex depends on Shh or fibroblast growth factor 2 // J. Neurosci. 2003. V. 23. P. 5919-5927.

150. Von Bubnoff A., Cho K. W. Intracellular BMP signaling regulation in vertebrates: pathway or network // Dev. Biol. 2001. V. 239. P. 1 14.

151. Wang J., Shackleford G. M. Murine WntlOa and WntlOb: cloning and expression in developing limbs, face and skin of embryos and in adults // Oncogene. 1996. V. 13. P. 1537- 1544.

152. Widelitz R. В., Jiang Т. X., Noveen A., Chen C. W., Chuong С. M. FGF induces new feather buds from developing avian skin // J. Invest. Dermatol. 1996. V. 107. P. 797-803.

153. Wilson N., Hynd P. I., Powell В. C. The role of BMP-2 and BMP-4 in follicle initiation and the murine hair cycle // Exp. Dermatol. 1999. V. 8. P. 367-368.

154. Winkler D. G., Sutherland M. S., Ojala E., Turcott E., Geoghegan J. C.,

155. Shpektor D., Skonier J. E., Yu C., Latham J. A. Sclerostin inhibition of

156. Wnt-3a-induced C3H10T1/2 cell differentiation is indirect and mediated by122bone morphogenetic proteins // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 2498 -2502.

157. Wong M. L., Medrano J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation // Biotechniques. 2005. V. 39. P. 75 85.

158. Wu W., Glinka A., Delius H., Niehrs C. Mutual antagonism between dickkopfl and dickkopf2 regulates Wnt/beta-catenin signalling // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 1611 1614.

159. Yamaguchi T. P., Bradley A., McMahon A. P., Jones S. A Wnt5a pathway underlies outgrowth of multiple structures in the vertebrate embryo // Development. 1999. V. 126. P. 1211 1223.

160. Ying Q., Nichols J., Chambers I., Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self renewal in collaboration with STAT3 // Cell. 2003. V. 115. P. 281 292.

161. Zarach J. M., Beaudoin G. M. J. Ill, Coulombe P. A., Thompson С. C. The co-repressor hairless has a role in epithelial cell differentiation in the skin // Development. 2004. V. 131. P. 4189-4200.

162. Zhang J.-T., Fang S.-G., Wang C.-Y. A novel nonsense mutation and polymorphisms in the mouse hairless gene // J. Invest. Dermatol. 2005. V. 124. P. 1200- 1205.

163. Zhao G. Q., Hogan B. L. Evidence that mouse Bmp8a (Op2) and Bmp8b are duplicated genes that play a role in spermatogenesis and placental development // Mech. Dev. 1996. V. 57. P. 159 168.

164. Zhou P., Byrne C., Jacobs J., Fuchs E. Lymphoid enhancer factor 1 directs hair follicle patterning and epithelial cell fate // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 700-713.

165. Zuniga A., Haramis A. P., McMahon A. P., Zeller R. Signal relay by BMP antagonism controls the SHH/FGF4 feedback loop in vertebrate limb buds // Nature. 1999. V. 401. P. 598 602.