Изучение пролонгированного влияния трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых

Беседина, Екатерина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Изучение пролонгированного влияния трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых
ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Изучение пролонгированного влияния трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых"

На правах рукописи 004609071 .

Ъ^Шп*

Беседина Екатерина Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ВЛИЯНИЯ ТРАНСГЕННОГО (В/) КАРТОФЕЛЯ НА НЕЦЕЛЕВЫХ НАСЕКОМЫХ

Специальность 06.01.07. - защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН ?Л1П

Краснодар-2010

004609071

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИБЗР РАСХН)

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук Киль Владимир Ильич

Официальные оппоненты, доктор биологических наук

Иванов Геннадий Иванович кандидат биологических наук Мухина Жанна Михайловна

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт риса»

Защита состоится 29 сентября 2010 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.038.06 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом - на сайте http://www.kubagro.ru.

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Горьковенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Защита растений от вредных организмов остается кардинальной проблемой современного сельскохозяйственного производства. При этом приоритетным способом решения проблемы должно быть развитие технологий и приемов, которые обеспечивают получение не только достаточной по объему, но и биологически полноценной и экологически безопасной продукции.

Создание методами генетической инженерии и биотехнологии генетически модифицированных сельскохозяйственных культур, устойчивых к вредителям и не нуждающихся для защиты урожая в обработке инсектоакарицидами, -выдающееся достижение 20 столетия. Площади посевов в мире под трансгенными или генетически модифицированными растениями возрастают с каждым годом, достигнув в 2008 г. 125 млн. га. Тем не менее, несмотря на увеличение посевов трансгенных растений недостаточно изученные экологические аспекты их биобезопасности сдерживают выращивание ГМР в России и ряде других стран. Отсутствие убедительных доказательств их экологической безопасности является источником научной неопределенности при оценке экологических рисков производства ГМ-культур.

Одним из основных экологических рисков считается возможность негативного влияния ГМР на нецелевые организмы биоценозов и возможно связанное с этим уменьшение биоразнообразия и нарушение трофических связей. Не является исключением в этом отношении и трансгенный картофель, устойчивый к колорадскому жуку, с геном СгуЗА. Несмотря на то, что действие гена СгуЗА высоко эффективно и селективно в отношении целевого вредителя, колорадского жука, сегодня никто не может с полной уверенностью утверждать, что другие нецелевые насекомые, питающиеся ¿^-картофелем, не подвергаются абсолютно никакому воздействию.

Особые опасения среди экологов вызывает не острая токсичность, но возможность негативного пролонгированного воздействия ¿fr-токсинов (в ряду нескольких генераций насекомых). Потенциальная опасность здесь заключается в том, что долговременное влияние /?/-токсинов может сказаться на внутрипопуляционной структуре и генотипическом разнообразии организмов, населяющих биоценоз ¿¡/-картофеля. Это, в свою очередь, может отразиться на адаптивности популяций и, в конечном итоге, на виде в целом.

Кроме того, влияние СгуЗА белка, токсичного для целевого вида (колорадского жука) может привести, наоборот, не к элиминации, а к увеличению жизнеспособности нецелевых видов насекомых и возможно к формированию резистентности этих вредителей к токсичным для них Bt-эндобелкам. Применительно к вредителям, данное явление крайне

нежелательно, так как неизбежно скажется на росте их численности и, соответственно, на урожае картофеля. На основании вышеизложенного, актуальность выбранного нами направления исследований очевидна.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась оценка пролонгированного действия трансгенного (В/) картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, на нецелевых насекомых.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Анализ ДНК-полиморфизма популяций колорадского жука и 7 нецелевых видов насекомых, в том числе и энтомофагов колорадского жука, по ЛАРО-,

и ББИ-маркерам.

2. Изучение изменчивости молекулярно-генетической структуры и внутрипопуляционного генетического разнообразия насекомых в зависимости от видовых особенностей и условий размножения.

3. Сравнительная оценка изменчивости молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки при питании трансгенным (В/) картофелем на протяжении нескольких поколений насекомых.

4. Оценка показателей роста и развития нецелевых видов насекомых-вредителей картофеля под влиянием ¿(/-токсинов в ряду нескольких генераций.

Научная новизна.

• Проведена оценка пролонгированного действия ГМ-картофеля на нецелевую биоту: изучены внутрипопуляционное генетическое разнообразие насекомых в условиях питания /й-картофелем и влияние СгуЗА белка на молекулярно-генетическую структуру популяций нецелевых видов в ряду поколений.

• Исследован ДНК-полиморфизм популяций картофельной минирующей моли, хлопковой совки и хищных клопов тасиИ\'еп1п$ и РегШш Ыоси1аШ$-энтомофагов колорадского жука.

• Выявлено позитивное влияние ¿/-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку (сорт Луговской плюс), на показатели роста и развития нецелевых насекомых-вредителей, в частности, на массу куколок хлопковой совки.

Практическая значимость результатов исследований.

Выявлены ЯДРО- и ^БЯ-праймеры, позволяющие изучать ДНК-полиморфизм различных видов насекомых.

- Предложен новый подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых, в основе которого лежит: культивирование поливольтинных видов нецелевых насекомых на искусственной питательной среде, содержащей В/-токсины, и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия и показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

- Разработана методика: «Методика оценки пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых», 2010 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

■ На этапе предрегистрационных испытаний трансгенных растений на экологическую безопасность, оценку пролонгированного действия ГМР на нецелевых насекомых следует проводить с использованием предлагаемого подхода, в основе которого лежит: культивирование поливольтинных видов нецелевых насекомых на искусственной питательной среде, содержащей Bt-токсины, и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия, показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

■ Трансгенный (Sí) картофель, устойчивый к колорадскому жуку (сорт Луговской плюс), не оказывает негативного пролонгированного действия на нецелевой вид

- картофельную минирующую моль.

■ Позитивное влияние fí/-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку (сорт Луговской плюс), на показатели роста и развития нецелевых насекомых-вредителей, в частности, на массу куколок хлопковой совки.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на научно-практических конференциях: международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург-Пушкин, 2008); международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (г. Краснодар, 2008); отчетной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой, Туапсинского района, 2008); международном симпозиуме «Защита растений - достижения и перспективы» (г. Кишинев, 2009), 3 Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (г. Краснодар, 2009).

Публикации материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 1 в издании, рекомендуемом ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методики проведения исследований, результатов исследований, выводов, практических рекомендаций и приложения. Включает 28 рисунков, 29 таблиц. Список литературных источников, используемых для написания или цитируемых в тексте работы, насчитывает 257 наименования, из которых 180 на иностранных языках.

Благодарность. Автор выражает особую благодарность научному руководителю диссертационной работы к.с-х.н. В.И. Килю, зам.директора ВНИИБЗР к.б.н. В.Я. Исмаилову, завлаб, массового разведения и применения энтомоакрифагов Ж.А. Ширинян и к.б.н. М.В. Пушня за ценные советы и помощь при выполнении исследований и оформлении диссертационной работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре приведены литературные данные о современном состоянии производства генетически модифицированных культур в мире. Анализируются сведения по биобезопасности ¿/-защищенного картофеля. Рассматривается риск, связанный с влиянием ¿/-растений на нецелевые организмы биоценоза. Проводится анализ различных типов ДНК-маркеров для тестирования изменчивости структуры популяций насекомых с помощью метода ПЦР.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научно-исследовательская работа выполнялась в период с 2007 г. по 2010 г. во Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений (г. Краснодар).

Объектом исследований явились выборки из популяций различных видов насекомых, представителей четырех отрядов: двукрылые, Díptera (муха, Ceroxys hortulana); полужесткокрылые, Hemiptera (клопы Nezara viridula, Perillus bioculatus, Podisiis maculiventris); жесткокрылые, Coleóptera (колорадский жук, Leptinotarsa decemlineata); чешуекрылые, Lepidoptera (яблонная плодожорка, Cydia pomonella: картофельная минирующая моль, Phthorimaea operculella; хлопковая совка, Helicoverpa armígera). В отличие от других видов, взятых из природных условий, выборки насекомых хлопковой совки, картофельной моли и хищного клопа-подизуса были взяты из лабораторных популяций. Для картофельной моли число генераций насекомых, выведенных в лаборатории, составило - 20, для подизуса - 30-40 поколений, для хлопковой совки - три генерации.

В экспериментах использовали растения исходного картофеля сорта Луговской и трансгенного (Bí) картофеля Луговской-плюс, устойчивого к колорадскому жуку. Опыты проводили в лабораторных условиях. Выборка особей, питающихся исходным и fií-картофелем, составляла: 20 образцов -контроль и 20 - опыт.

Для разведения картофельной минирующей моли использовали среду, разработанную Шаболтой и Перера [Шаболта О.М., Переро М,, 1996], основой

которой является порошок из высушенных листьев картофеля. Была взята универсальная питательная среда с растительной основой из семян маша, предложенная Успенской и Хлистовским (1967) для выращивания хлопковой совки. Рецептура этой среды до некоторой степени повторяет предложенную Шори X. [Shorey Н., 1963], в которой изменена растительная основа и соотношение компонентов.

Проводили выделение ДНК СТАВ-методом, RAPD- и ISSR-PCR анализ исследуемых видов насекомых [Киль В.И., 2009].

Микросателлитный (SSR-PCR) анализ ДНК популяции хлопковой совки проводили в 12,5 мкл реакционной смеси, содержащей 10 mM Tris-HCl, рН 9,0; 50 mM КС1; 3,0 mM MgCl2; 50 цМ каждого dNTP; 0,4цМ каждого из праймеров; 0,5 U TaqДНК полимеразы и 10-50 ng ДНК.

Режимы SSR-PCR

- 2 минуты предварительная денатурация при 94° С

30 секунд денатурация при 94° С

40 секунд отжиг праймера при 58°С

40 секунд элонгация при 72° С (35 циклов)

- 3 минуты конечный синтез при 72° С

Продукты амплификации (RAPD- и ISSR-PCR) разделяли в 1,7 %-ном агарозном геле, продукты SSR-PCR разделяли методом электрофореза в 8 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ), с дальнейшим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией полученных ампликонов в УФ-свете.

Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и индексу генетического разнообразия Шеннона (Н). Генегическое разнообразие по Шеннону оценивали с использованием формулы: Н= - I (р, х In р,), где pi _ частота /-го аллеля в выборке [Chalmers KJ. et. al., 1992]. Сравнение частот и средних по выборке проводили по стандартным критериям с использованием общепринятых методов и пакетов прикладных программ (Statistica 6.0 и SPSS 11.0).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Оптимизация параметров ПЦР

Оптимизация условий проведения ПЦР приводит к увеличению выхода продуктов реакции и к уменьшению количества неспецифических продуктов. Прежде всего, оптимизация условий реакции включает в себя выделение качественного препарата ДНК из биоматериала, пригодной для проведения ПЦР. Кроме того, должны быть оптимизированы условия проведения ПЦР (температура отжига, концентрация ионов магния и др.).

В результате ПЦР анализа более четко детектируемые фрагменты ДНК были выявлены нами у куколок картофельной минирующей моли, нежели у имаго этого вида насекомых. У хлопковой совки, наоборот, спектры фрагментов ДНК, выделенной из имаго, были более четкими по сравнению со спектрами ДНК, выделенной из куколок. Кроме того, при анализе ДНК куколок картофельной минирующей моли и имаго хлопковой совки спектры, полученные в ПЦР, были более информативны и воспроизводимы в сравнении с фрагментами ДНК куколок хлопковой совки и имаго картофельной моли. Поэтому в дальнейших исследованиях нами использовались куколки картофельной минирующей моли и имаго хлопковой совки.

Оптимизация условий ПЦР включала в себя также подбор наиболее информативных праймеров. Нами проведен скрининг 9 ЯАРО-праймеров на информативность и воспроизводимость. Наиболее информативными и воспроизводимыми при разных концентрациях ДНК оказались праймеры ОРА02, ОРВ 08, ОРА07, ОРА20 и ОРВОЬ Однако праймер ОРА02 характеризовался слабой интенсивностью всех фрагментов ДНК, а праймер ОРВО8 в последующих опытах показывал нестабильные результаты - до 30 % образцов с ним не амплифицировались. По этой причине были отобраны только три - праймеры ОРА07, ОРА20 и ОРВ01, которые и были использованы в дальнейшей работе для проведения ЯАРО-анализа популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки.

В основе метода ^Я-РСЯ лежит ПЦР с праймерами, состоящими из нуклеотидных повторов. В рамках данного исследования было испытано девять 155К-праймеров: ШС807, ивС810, ШС813, 11ВС818, ЦВС826, ШС864, ииЛ, ш2, иВС880. Из них пять имели динуклеотидный повтор: (АС)8Т; (вА^Т; (СТ)8Т; (СА)8С; (АС)8С; три праймера - тринуклеотидный: (АТС)б; (АСС)6; (САС)б и один - пентануклеотидный - (ССАСА)3. Все они были в разной степени информативны, кроме иВС813, не выявившего ампликоны в ПЦР при анализе ДНК хлопковой совки. Наиболее информативными из них оказались праймеры иВС810,11ВС864, те!.

Праймер ШС810, при этом, выявлял более четко детектируемые фрагменты ДНК и оказался универсальным для разных видов насекомых. Вот почему он был использован нами в дальнейшем (наряду с КАРЭ-праймерами) для оценки ДНК-полиморфизма популяций хлопковой совки и картофельной минирующей моли по 15811-маркерам.

В целом динуклеотидные праймеры выявляли большее количество маркеров, чем три- и пентануклеотидные. Это указывает, вероятно, на то, что повторы данного типа встречаются в геноме чешуекрылых более часто. В то же время это зависило также от типа праймера и вида насекомого. Так,

динуклеотидный праймер UBC818, имеющий повтор (СА), выявил только два ДНК-маркера у картофельной моли, при этом восемь фрагментов - у хлопковой совки.

Кроме того, важно отметить, что испытанные ISSR-праймеры выявляли также спектр ДНК-фрагментов при анализе жуков и клопов. Таким образом, можно заключить, что повторы, комплиментарные данным праймерам, присутствуют, по всей видимости, также в геномах многих других представителей членистоногих.

Таким образом, после проведения предварительного скрининга RAPD- и ISSR-праймеров для целей дальнейших исследований были отобраны четыре наиболее информативные: RAPD-праймеры - ОРА07, OPA2Ü, OPBOl и ISSR-праймер -UBC810.

3.2 Исследование ДНК-полиморфизма популяций насекомых

Для эффективного контроля и управления численностью популяций насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур необходимы знания о генетической изменчивости структуры популяций. Одним из современных методов анализа молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и различные ее модификации. Данный метод нашел сегодня широкое применение в изучении ДНК-полиморфизма различных видов насекомых и практике защиты растений от вредителей.

3.2.1 ДНК-полиморфизм популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки по RAPD-маркерам

В общей сложности по трем отобранным RAPD-праймерам, были проанализированы 34 особи хлопковой совки и 32 особи картофельной моли (рисунок 1).

П.н.

1700 805 339

1000 500

Рисунок 1 - RAPD-PCR картофельной минирующей моли и хлопковой совки. Дорожки 1-15- различные особи насекомых Phthorimaea operculella (праймер ОРВО1). Дорожки 16-32 - различные особи насекомых Helicoverpa armígera (праймер ОРА20), М - маркеры молекулярных масс (ДНК фага X, рестрицированная Pstl, MIOObp), пар нуклеотидов (п.н.)

Оценка ДНК-полиморфизма картофельной минирующей моли позволила заметить, что праймеры ОРА20 и OPBOl выявляли 24-25 ДНК-фрагментов каждый, которые все, за исключением трех (по праймеру OPBOl), были полиморфны (таблица 1). При этом размер фрагментов варьировал от 180 до 1800 пар нуклеотидов, а среднее количество фрагментов на особь составило 10,6-11,0. В тоже время, праймер ОРА07 выявлял почти в 2 раза больше ДНК-фрагментов, которые все были полиморфны. При этом диапазон варьирования и число фрагментов на особь были также в 1,5-2 раза выше, чем у двух других праймеров.

Таблица 1 - Полиморфизм ДНК Phthorimaea operculella по RAPD-маркерам

Праймер, объем выборки (п) Число детектируемых фрагментов Уровень полиморфизма (%) Размеры фрагментов (п.н.) Моно-морфные фрагменты (п.н.) Число фрагментов на особь Среднее число фрагментов на особь

ОРА20 п~32 25 100,0 1800-180 нет 4-14 11,0

OPBOl п=29 24 87,5 1400-180 800 650 510 4-20 10,6

ОРА07 п=30 47 100,0 2150-150 нет 8-28 15,5

Результаты оценки ДНК-полиморфизма хлопковой совки (таблица 2) показали, что число детектируемых фрагментов колебалось от 33 для праймера ОРА20 до 50 для - ОРВ01. Все ДНК-фрагменты были полиморфны. При этом размер ампликонов варьировал от 210 до 1500 пар нуклеотидов (п.н.), а количество фрагментов на особь колебалось от 4 до 14. Праймер ОРВ01 выявлял наибольшее количество ДНК-фрагментов, по сравнению с двумя другими праймерами.

Таблица 2 - Полиморфизм ДНК Helicoverpa armigera по RAPD-маркерам

Праймер, объем выборки (п) Число детектируемых фрагментов Уровень полиморфизма (%) Размеры фрагментов (гт.н.) Моно-морфные фрагменты (п.н.) Число фрагментов на особь Среднее число фрагментов на особь

ОРА20 п=30 33 100,0 1400-250 нет 5-14 8,6

OPBOl п=34 48 100,0 1450-210 нет 6-14 9,4

ОРА07 п=32 42 100,0 1400-220 нет 4-14 8,7

Таким образом, краснодарские популяции картофельной моли и хлопковой совки генотипированы по трем RAPD-маркерам. В общей сложности для картофельной моли получено 96 RAPD-маркеров с уровнем полиморфизма - 87,5-100,0 % и для хлопковой совки -125 RAPD-маркеров (все ДНК-фрагменты были полиморфны).

3.2.2 ISSR-анализ популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки

Одним из современных методов анализа генетического полиморфизма является ISSR-PCR (Inter simple sequence repeats, или межмикросателгштный анализ ДНК).

ПЦР-спектры фрагментов ДНК картофельной минирующей моли и хлопковой совки по ISSR-праймеру UBC810 приведены на рисунке 2.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 М 10 11 12 13 14 15 16 17

IS 19 20 21 22 23 24 2526 27 М 28 2930 31 32 33 34 3S 36

s---— -i

_1000 п.н. .500 п.н.

-1000 n. H. -500 n. h.

Рисунок 2 - ISSR-PCR с праймером UBC810. Дорожки: 1-17- различные особи насекомых Phthorimaea operculella. Дорожки: 18-36 - различные особи насекомых Helicoverpa armígera. М - маркер молекулярных масс МЮОЬр

В общей сложности по праймеру UBC810 получены 23 ISSR-маркера для картофельной моли и 29 ДНК-маркеров для хлопковой совки с высоким уровнем полиморфизма (таблица 3). При этом размер ампликонов варьировал от 350 до 2000 пар нуклеотидов (п.н.), а количество фрагментов на особь колебалось от 2 до 17.

Таблица 3 - Полиморфизм ДНК картофельной минирующей моли и хлопковой совки

Вид вредителя Число Уровень Размеры Моно- Число Среднее

детек- полимор- фраг- морфные фраг- число

тируемых физма ментов фраг- ментов фраг-

фраг- (%) (п.н.) менты на ментов

ментов (п.н.) особь на особь

Картофельная минирующая 23 95,5 3502000 950 3-17 8,6

моль

Хлопковая совка 29 100,0 4201800 нет 2- 15 9,0

Можно заметить, что в геноме исследуемых видов насекомых тандемно расположенные динуклеотидные повторы, комплиментарные ISSR-праймеру UBC810, присутствуют в значительном количестве и при этом обладают высоким уровнем полиморфизма. Так, единственный мономорфный фрагмент (950 п.н.) мы наблюдали только у картофельной моли. Это, в свою очередь, позволило нам использовать данный ISSR-праймер, наряду с RAPD-праймерами, для анализа внутрипопуляционных различий между насекомыми.

Таким образом, изучен ДНК-полиморфизм краснодарских популяций хлопковой совки Н. armígera и картофельной минирующей моли Р. operculella по RAPD- и ISSR-маркерам.

3.2.3 SSR-анализ популяции хлопковой совки

ПЦР анализ популяций хлопковой совки по микросателлитным (SSR) локусам стал возможен, благодаря созданию и идентификации специфических для этого вида SSR-маркеров [Tan S., 2001; Scott К. D., 2004]. С использованием данных маркеров SSR-анализ хлопковой совки, Helicoverpa armígera, проводили исследователи из Индии [Subramanian S., Mohankumar S., 2006]. В данной работе была исследована генетическая структура различных популяций Н. armígera. Авторы обнаружили строгую генетическую дифференциацию популяций насекомых собранных с различных видов растений.

В рамках нашей работы изучались ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяции хлопковой совки по двум микросателлитным локусам HaSSRl и HaSSR3. Можно заметить (рисунок 3), что основная часть ДНК-фрагментов для локуса HaSSRl, по сравнению с HaSSR3, смещена несколько в более высокомолекулярную часть спектра.

. HaSSRl ,,,,.............. -.. ........м П.н.

« - »I

щуг-'&у*

fíaSSRJ ,

Ш-'i

.. „^ г?

> Ы; ■■

Л-'Д/г о.. ' , ' ~ **

i¿ - -

3«

- 395

216

195

164

Рисунок 3 - SSR-фeнoтипы хлопковой совки. М-маркеры молекулярных масс, пар нуклеотидов (п.н.)

Размеры детектируемых ДНК-фрагментов варьировали от 230 до 480 пар нуклеотидов (п.н.) для HaSSRl и от 100 до 220 п.н. - для НаЗЗЯЗ. Оба локуса были высоко полиморфны (уровень полиморфизма 100 %). Число детектируемых аллелей (вне зависимости от интенсивности ДНК-фрагментов)

на локус составило 12 и 9 для НаЗБШ и НаББИЗ, соответственно. Доля гетерозигот для обоих локусов была равна 0,75 (таблица 4).

Таблица 4 - ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяции _Helicoverpa armigera по двум микросателлитным локусам

Локус Показатель

Р Sr А Аг N Ht h I

HaSSRI 100 230-480 12 2,9 0,05 0,75 0,19 ±0,16 0,32 ±0,20

HaSSR3 100 100-220 9 2,7 0,05 0,75 0,23 ±0,17 0,37 ±0,21

Sr - размеры ДНК-фрагментов, п.н. (пар нуклеотидов)

| А - число аллелей__

Аг - обогащенность аллелями (allelic richness) - средняя частота аллелей на

особь_____

N - доля нулевых гомозигот Ht - доля гетерозигот

h - генетическое разнообразие по Nei (± стандартное отклонение) I - индекс Шеннона (± стандартное отклонение) Р - уровень полиморфизма, %

Полученные нами данные по генетическому полиморфизму популяции хлопковой совки в целом были сходны с данными, полученными ранее на индийских популяциях [Subramanian S., Mohankumar S., 2006].

Таким образом, краснодарская популяция хлопковой совки генотипирована по двум микросателлитным локусам, что может явиться основой для дальнейших генетико-популяционных исследований данного вида насекомых.

3.2.4 Сравнительный анализ ДНК-полиморфизма различных видов

насекомых

Сравнительный анализ ДНК-полиморфизма восьми различных видов насекомых, искусственно и естественно заселяющих ценоз картофеля, осуществлялся по отобранным нами RAPD-праймерам ОРА07, ОРА20, OPBOl и ISSR- праймеру UBC810.

Можно заметить, что наиболее низким уровнем полиморфизма и генетическим разнообразием отличалась популяция хищного клопа подизуса, Р. maculiventris (дорожки 51 -60 на электрофореграмме рисунка 4). Кроме того, это наглядно видно из данных таблицы 5.

Рисунок 4 - RAPD- и ISSR-фенотипы различных видов насекомых. Дорожки: 1-7 - Ceroxys hortulana; 8-14 - Nezara viridula; 15-20 - Leptinotarsa decemlineata; 2126 - Cydia pomonella, 27-33 - Phthorimaea operculella; 34-40 - Helicoverpa armígera (RAPD-праймер OPA07); 41-50 - Perillus bioculatus: 51 -60 - Podisus maculiventris (ISSR-праймер UBC810), М-маркеры молекулярных масс (ДНК фага рестрицированная Pstl), пар нуклеотидов (п.н.)

Таблица 5 - ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие различных видов

насекомых

Leptino Cydia pomonel ta Helicover Perillus Podisus

Праймер Ceroxys Nezara tarsa Phthorimaea pa biocula maculiven

hortulana viridula decemli operculella armígera tus tris

neata

Уровень полиморфизма, %

IUBC8Í0 100,0 89,5 86,2 95,0 78,8 100,0 100,0 75,0

¡~OPAW 90,3 89,7 82,8 94,4 69,0 88,2 100,0 70,0

(ОРА20 957> 93,8 85,0 82,3 58,8 89,5 100,0 40,0

Среднее 95,1± 2,8 91,0± 1,4 84,7± 1,0 90,6± 4,1 68,9± 5,8 92,6± 3,7 100,0± 0,0 61,7± 10,9

Индекс Шеннона (Н)

UBC8I0 6,9 4,0 5,5 6,1 3,0 5,1 5,7 1,5

OPA 07 8,2 7,0 6,5 4,6 2,8 4,2 8,9 1,6

OPA 20 6,0 4,5 5, i 4,3 2,8 4,7 8,9 1,2

Среднее 7,0±0,6 5,2±0,9 5,7±0,4 5,0±0,6 2,9±0,1 * 4,7±0,3 7,8±1,1 1,4±0,1*

*-ti|,aK-i>to5

Уровень ДНК-полиморфизма в популяции клопа-подизуса, в среднем по всем локусам, составил 61,7 %, что значительно ниже, чем у других исследуемых видов насекомых. Относительно низким уровнем ДНК-

полиморфизма отличались также особи картофельной минирующей моли (68,9 %). Эти же виды характеризовались и относительно низким генетическим разнообразием: Н=1,4±0,1 и 2,9±0,1 для подизуса и минирующей моли, соответственно, что достоверно ниже средних значений индекса Шеннона у других видов.

Несомненно, что столь низкие уровни ДНК-полиморфизма и внутрипопуляционного генетического разнообразия связаны не с видовыми особенностями насекомых, а с условиями их размножения. Понятно, что снижение ДНК-полиморфизма и гетерогенности было обусловлено высоким уровнем инбридинга, вызванного лабораторными условиями их разведения. При этом, чем больше поколений насекомых были выведены в лаборатории, тем более низким уровнем ДНК-полиморфизма и генетического разнообразия характеризовались эти выборки.

Таким образом, ЯАРО-праймеры ОРА07, С1РА20, ОРВ01 и праймер ивС810 оказались универсальными для различных видов насекомых. А проведенный молекулярно-генетический анализ популяций восьми различных видов насекомых с использованием данных праймеров показал, что более низкий ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций отдельных видов, по сравнению с другими, обусловлены, в первую очередь, условиями размножения насекомых (в лабораторных или природных условиях), нежели видовыми особенностями популяций насекомых.

3.3. Оценка пролонгированного воздействия /¿¿-картофеля на популяции нецелевых видов насекомых

Вопрос методического подхода к решению оценки длительного, в ряду поколений, влияния ^/-токсинов на нецелевую биоту остается открытым и требует своего решения.

В этой связи были проведены опыты по влиянию Вг-токсинов на некоторые нецелевые виды насекомых (картофельную минирующую моль и хлопковую совку), населяющие биоценоз трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, в ряду нескольких генераций.

3.3.1 Молекулярно-генетический анализ популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки в условиях питания ^/-картофелем на протяжении нескольких генераций насекомых

ПЦР-спектры фрагментов ДНК особей первых генераций картофельной минирующей моли и хлопковой совки, выращенных на искусственной питательной среде, содержащей листья традиционного и трансгенного картофеля, представлены на рисунке 5.

На среде с исходным Ня среде с Bt- На среде с исходным На среде с Bt-

Таблица 6 - Значения индекса хи-квадрат в популяциях РкИоптаеа орегсикИа и ИеИсоуегра a>■migera при питании исходным и трансгенным (5/) картофелем (первые генерации)

Рисунок 5 - RAPD-фенотипы хлопковой совки Helicoverpa armigera (дорожки 1-20) и картофельной минирующей моли Phlhorimaea opercitlella (дорожки 21-38) при питании исходным и ßr-картофелем (первые генерации). Праймеры - ОРА07, ОРА20. М-маркеры молекулярных масс (ДНК фага А, ресгрицированная Pst]), пар нуклеотвдов (п.н.)

Изменчивость молекулярно-генетической структуры и генетическое разнообразие популяций оценивали по частотам встречаемости ДНК-маркеров в ПЦР и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат (таблица 6) и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона (Н) (таблица 7).

Хлопковая совка ртофельная моль

Праймер Критерий хи-квадрат а2) Праймер Критерий хи-квадрат j (х2) 1

UBC810 4,01 UBC810 2,64

ОРА07 5,39 ОРА07 2,13

ОРА20 2,31 ОРА20 5,45

OPBOI 12,32 ОРВО! 1,58

Х2факт < Х205 - различия не достоверны

Как видно из данных таблицы 6 значения критерия хи-квадрат во всех случаях были меньше теоретически ожидаемого, что указывало на отсутствие различий в молекулярно-генетической структуре исследуемых выборок насекомых, питающихся Вс- и не ¿/-картофелем.

Оценка внутрипопуляционного разнообразия по Шеннону не выявила существенных различий между двумя выборками насекомых, питающихся исходным и трансгенным картофелем (таблица 7).

Таблица 7 - Значения индекса генетического разнообразия Шеннона (Н) в популяциях Phthorimaea operculella и Helicoverpa armígera при питании _исходным и трансгенным (Bi) картофелем (первые генерации)_

Хлопковая совка Картофельная моль

Праймер Исходный картофель Bt-картофель Праймер Исходный картофель Bt-картофель

UBC810 6,1 5,9 UBC810 5,2 5,5

ОРА07 6,0 5,3 ОРА07 8,4 9,4

ОРА20 4,2 4,3 ОРА20 8,5 9,2

OPBOl 5,7 5,4 OPBOl 6,3 6,3

среднее 5,5+0,44 5,2±0,34 среднее 7,1+0,81 7,6±0,99

Критерий Стьюдента 0,50 (^факт—tos. различия не достоверны) Критерий Стьюдента 0,39 ^фа^Зоз - различия не достоверны)

В дальнейших исследованиях осуществлялась оценка изменчивости молекулярно-генетической структуры популяций картофельной моли и хлопковой совки в условиях питания ¿/-картофелем, на протяжении последующих поколений.

В ходе ПЦР-анализа ДНК особей 20-й генерации картофельной минирующей моли были получены ЯАРО-фенотипы насекомых. Можно заметить отсутствие сколько-нибудь значимых видимых отличий в ДНК спектрах исследуемых двух групп насекомых картофельной моли (рисунок 6).

На среде с исходным На среде с Bt-

картофелем картофелем

Рисунок 6 - ИАРО-фенотипы 20-й генерации насекомых картофельной моли, содержащихся на различной диете. Дорожки: 1-10 - различные особи насекомых, культивированные на среде с исходным картофелем, 11 -20 -различные особи насекомых, культивированные на среде с ¿/-картофелем. М -маркеры молекулярных масс (ДНК фага \, рестрицированная Рэ!!)

В таблицах 8 и 9 приведены данные по оценке последующих генераций исследуемых видов насекомых.

Таблица 8 - Изменчивость молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия популяции Helicoverpa armígera при питании исходным и трансгенным (Bt) картофелем (третья генерация насекомых)

Праймер Индекс Шеннона (Н) Критерий хи-квадрат (х2)

Исходный картофель Bí-картофель

UBC810 1,9 1,9 2,01

ОРА07 2,3 2,2 1,67

ОРА20 2,5 2,4 1,48

Критерий Стьюдента 0фактЗо5 - различия не достоверны)

Таблица 9 - Изменчивость молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия популяции РЫИог'таеа орегсикИа при питании исходным и трансгенным (Д<) картофелем (двадцатая генерация насекомых)

Индекс Шеннона (Н) Критерий хи-

Праймер Исходный картофель Яг-картофель квадрат (х2)

UBC810 1,87 1,94 1,1

ОРА07 3,0 2,66 2,5

ОРА20 4,25 4,31 4,9

OPBOl 4,25 4,24 5,4

среднее 3,34+0,57 3,29±0,59 2 2 X факт<Х 05 ~

Критерий 0,067 различия не

Стьюдента (ЦактЗо5 - различия не достоверны) достоверны

Полученные значения критерия хи-квадрат по всем ДНК локусам, как в третьей генерации хлопковой совки (таблица 8), так и в двадцатом поколении картофельной моли (таблица 9), также были меньше теоретических, что указывало на отсутствие влияния картофеля на молекулярно-генетическую структуру этих нецелевых видов.

В свою очередь оценка внутрипопуляционного генетического разнообразия по Шеннону также не выявила существенных различий между исследуемыми выборками насекомых, питающихся традиционным и трансгенным (бг) картофелем, ни в третьем, ни в двадцатом поколениях насекомых (таблицы 8-9).

Важно отметить, что оценку изменчивости молекулярно-генетической структуры популяции проводили в общей сложности более чем по 100 ДНК-маркерам. Этого, с нашей точки зрения, достаточно для маркирования исследуемых видов насекомых и решения поставленных задач.

Таким образом, молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяций нецелевых видов насекомых под воздействием В1-картофеля в первых двадцати поколениях картофельной минирующей моли и трех генерациях хлопковой совки остаются неизменными.

3.3.2 Оценка влияния /?<-токсинов на некоторые показатели роста и развития нецелевых видов насекомых в ряду генераций

Влияние ¿¡/-картофеля на нецелевые виды насекомых оценивалось до настоящего времени с позиций биоразнообразия: не происходит ли элиминация нецелевой полезной биоты под действием СгуЗА белка и, таким образом, не происходит ли снижение видового разнообразия в ценозе трансгенного картофеля.

В то же время заслуживает внимания и другой аспект проблемы, а именно: не происходит ли обратный эффект, то есть, не оказывают ли положительное влияние ¿/-токсины на нецелевую биоту?... Этот вопрос до настоящего времени выпадал из поля зрения ученых. В этой части исследований нами проводился анализ нецелевых насекомых по некоторым показателям роста и развития, так как увеличение жизнеспособности вредителей под действием ¿/-токсинов, т.е. позитивное действие СгуЗА белка (возможно за счет плейотропных эффектов ¿/-гена) также крайне нежелательно с экологической точки зрения.

Оценка воздействия ¿/-картофеля на жизнеспособность и репродуктивные функции картофельной минирующей моли и хлопковой совки осуществлялась по таким показателям, как продолжительность развития насекомых, число окуклившихся гусениц, масса куколок, выход полноценных бабочек, количество отложенных яиц.

Данные по некоторым показателям роста и развития насекомых популяции хлопковой совки при разных условиях питания приведены в таблице 10.

Таблица 10 - Средние значения показателей роста и развития хлопковой совки в условиях питания ¿/-картофелем

Сорт картофеля Продолжительность развития от яйца до имаго, сут. Окуклилось гусениц, % Масса куколок, мг* (N=30)

Генерация насекомых

1 3 1 3 1 3

В/-картофель (Луговской плюс) )7,3±0,2 16,0±0,3 100,0±2,4 %,7±1,3 276±4,5 308±7,4

Исходный картофель (Луговской) 16,1 ±0,3 16,8±0,3 91,7±1,8 100,0±2,3 281 ±6,0 272±6,9

Критерий Стьюдента 1фа«г 5 йз- различия не достоверны ^факт — 1о5 - различия не достоверны 0,74 (,|>акт £ - различия не достоверны 3,55 1факг > 1оз - различия достоверны

Различия между двумя выборками были несущественными для первой генерации хлопковой совки: фактические значения критерия Стьюдента по всем

показателям были меньше табличного, тогда как для третьей генерации были отмечены статистически значимые отличия по массе куколок (таблица 10), что указывает на возможные плейотропные эффекты действия трансгенов в растении, сопровождающиеся некоторым позитивным эффектом влияния В1-гена на насекомых хлопковой совки и, в частности, на массу куколок. Подобное позитивное воздействие В1-токсина было обнаружено в исследованиях выживаемости и репродуктивных показателей картофельной моли под влиянием трансгенного картофеля сорта Супериор [Агасьева И.С. и др., 2001].

Первые 25 генераций насекомых картофельной моли, питающихся трансгенным (В() и традиционным (исходным) картофелем, также были проанализированы нами по некоторым показателям роста и развития (количество окуклившихся гусениц, вылетевших бабочек, отложенных яиц и др.). Анализировали 1,6, 12,18,19,20 и 25 генерации.

Можно заметить, что в целом различия между двумя исследуемыми группами насекомых картофельной минирующей моли на протяжении 25 поколений были несущественны (таблица 11).

Таблица 11 - Средние значения показателей роста и развития картофельной минирующей моли в условиях питания ^-картофелем

Сорт картофеля Продолжительность развития от яйца до имаго, сут (п=20) Окуклилось гусениц, % (п=20) Масса куколок, мг (п=27)

Генерация насекомых

1 25 I | 25 1 25

В1-картофель (Луговской плюс) 28,7±0,4 30,0±0,2 58,5±2,2 56±0,7 10,6±0,4 6,5±0,6

Исходный картофель (Луговской) 28,4±0,2 29,8±0,2 58,3±1,8 54,7±0,8 10,3±0,4 7,4±0,9

Критерий Стьюдента 0,7 0,96 0,09 1,31 0,49 0,75

1факт 5 - различия не достоверны

Таким образом, можно заключить, что /^-картофель не оказывает влияния на жизнеспособность и репродуктивные функции картофельной моли, тогда как статистически значимые отличия по некоторым показателям роста и развития в популяции хлопковой совки свидетельствуют о том, что влияние ¿^-токсинов на другие нецелевые объекты возможно благодаря плейотропным эффектам £/-гена растения картофеля (сорт Луговской плюс).

выводы

1. Краснодарские популяции хлопковой совки и картофельной минирующей моли генотипированы по RAPD-, ISSR- и SSR-маркерам. Выявлен высокий уровень ДНК-полиморфизма популяций вредителей (87,5-100 %).

2. RAPD-праймеры ОРА07, ОРА20, OPBOl и ISSR- праймер UBC810 оказались универсальными для восьми, исследуемых нами видов насекомых, принадлежащих к различным отрядам (Diptera, Hemiptera, Coleóptera, Lepidoptera), что позволяет использовать данные праймеры для анализа молекулярно-генетической структуры популяций насекомых.

3. Более низкий ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций обусловлены, в первую очередь, условиями размножения насекомых (в лабораторных или природных условиях), нежели их видовыми особенностями.

4. Молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяций нецелевых видов насекомых под воздействием ^/-картофеля (сорт Луговской плюс), как минимум, в первых двадцати поколениях картофельной минирующей моли и трех генерациях хлопковой совки остаются неизменными.

5. Оценка показателей роста и развития двадцати пяти поколений картофельной моли свидетельствует об отсутствии позитивного / негативного влияния йг-картофеля (сорт Луговской плюс) на жизнеспособность и репродуктивные функции этого вида насекомых.

6. Выявлено позитивное влияние Bt-токсинов на массу куколок нецелевого вида насекомых - хлопковую совку, обусловленное, по-видимому, проявлением плейотропных эффектов генаСгуЗА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1) Оценку пролонгированного влияния ГМР на нецелевых насекомых, на этапе предрегистрационных испытаний, целесообразно проводить с использованием предлагаемого нами подхода, в основе которого лежит: культивирование поливольтинных видов нецелевых насекомых на искусственной питательной среде, содержащей ^/-токсины, и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия и показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

2) Оценку влияния ¿/-картофеля на нецелевых насекомых следует проводить по разработанной нами методике: «Методика оценки пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых», 2010 г.

3) Для оценки пролонгированного действия трансгенного ¿/-картофеля на нецелевых насекомых рекомендуем использовать в качестве модельного объекта картофельную минирующую моль.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. КильВ.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., БесединаE.H., Пушня М.В., Ширинян Ж.А. Влияние трансгенного картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяций, рост и развитие нецелевых видов насекомых // Тезисы докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионарного конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «ЮГ РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (г. Анапа, 2007 г.). - Анапа. - 2007. - С. 190191.

2. Киль В.И., Беседина E.H. RAPD- и ISSR-анализ популяций картофельной моли и хлопковой совки при питании обычным и трансгенным (Bt) картофелем // Тезисы докладов международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур», (Санкт-Петербург-Пушкин, 12-16 мая 2008 г.). - Санкт-Петербург-Пушкин. - 2008. - С. 46-49.

3. Киль В.И., Беседина E.H. ДНК полиморфизм популяций хлопковой совки и картофельной минирующей моли по lSSR-маркерам // Материалы международной научно-практической конференции «Биологиеская защита растений - основа стабилизации агроэкосистем», вып. 5, (г. Краснодар, 23-25 сентября 2008 г.). - Краснодар. - 2008. - С. 415-420.

4. Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., Беседина E.H., Пушня М.В., Ширинян Ж.А., Исмаилов В.Я. Изменчивость молекулярно-генетической структуры нецелевых видов насекомых в условиях питания трансгенным картофелем, устойчивым к колорадскому жуку: анализ первых генераций // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем», вып. 5, (г. Краснодар, 23-25 сентября 2008 г.). - Краснодар. - 2008. - С. 421-425.

5. Киль В.И., Беседина E.H., Пушня М.В., Ширинян Ж.А. Биобезопасность трансгенного картофеля: оценка влияния ¿/-токсинов на нецелевые виды насекомых в ряду поколений // Тезисы докладов на отчетную конференцию

грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой Туапсинского района, 23-27 ноября 2008 г.). - Агой. - 2008. - С.55-56.

6. Беседина E.H., Киль В.И. Влияние трансгенного (Bt) картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяции картофельной минирующей моли // Тезисы докладов 9-й Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва, 8 апреля 2009 г.). - Москва. - 2009.

7. Беседина E.H. ДНК полиморфизм популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки по ISSR-маркерам // Тезисы докладов XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (г. Москва, 13-18 апреля 2009 г.). - Москва. - 2009.

8. Киль В.И., Беседина E.H., Пушня М.В., Исмаилов В.Я. Влияние трансгенного картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяции и жизнеспособность картофельной минирующей моли в ряду генераций // Наука Кубани. - 2009. № 3. - С. 69-73.

9. Киль В.И., Беседина E.H., Федичева О.О., Исмаилов В.Я. ПЦР анализ хищных клопов Perillus bioculatus F. (Hemiptera: Pentatomidae), различающихся окраской щитка, по RAPD- и ISSR-маркерам // Информационный бюллетень Восточно-Палеарктической региональной секции Международной организации по биологической борьбе с вредными животными и растениями № 39: материалы X сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Международной научно-практической конференции «Биологические основы регулирования вредных организмов в агроценозах» (г. Киев, 18-22 мая 2009 г.). - Киев. - 2009. - С. 128-130.

10. Киль В.И., Беседина E.H., Федичева О.О. ДНК полиморфизм различных популяций яблонной плодожорки Cydiapomonella L. (Lepidoptera: Torticidae) // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии», - вып. 5. (г. Ставрополь, 1 марта 2009 г.). / Ставропольский государственный аграрный университет. - Ставрополь: АГРУ С,- 2009. -С. 154-157.

11. Киль В.И., Беседина E.H., Федичева О.О., Исмаилов В.Я. Молекулярно-генетический анализ хищных клопов Perillus bioculatus F. (Hemiptera, Pentatomidae), различающихся по фенам окраски щитка // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии», - вып. 5. (г. Ставрополь, 1 марта 2009

г.). / Ставропольский государственный аграрный университет. - Ставрополь: АГРУ С, — 2009. - С. 158-162.

12. Беседина E.H. Влияние Ä-токсинов трансгенного картофеля на нецелевые виды насекомых в ряду поколений // Тезисы докладов VI Всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (г. Анапа, 1-5 октября 2009 г.). - Анапа. - 2009. - С. 48-49.

13. КильВ.И., Беседина E.H., ФедичеваО.О. Молекулярно-генетический анализ популяций яблонной плодожорки Cydia pomoneüa L. по RAPD- и ISSR-маркерам // Материалы докладов международного симпозиума «Защита растений - достижения и перспективы» (г. Кишинев, 19-22 октября 2009 г.). -Кишинев. - 2009. - С. 92-94.

14. Исмаилов В.Я., Киль В.И., Агасьева И.С., Федоренко Е.В., Федичева О.О., Степанов Д.В., Беседина E.H. Биологические особенности и морфогенетическая структура популяции хищного клопа Perillus bioculatus F. (Hemiptera, Pentatomidae) Н Тезисы докладов научно-практической конференции грангодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой Туапсинского района, 26-30 октября 2009 г.). -Агой. - 2009. - С. 34-35.

15. Киль В.И., Беседина E.H., Федичева О.О. ПЦР анализ популяций яблонной плодожорки Cydia pomonella L. // Тезисы докладов научно-практической конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой Туапсинского района, 26-30 октября 2009 г.). -Агой.-2009.-С. 37-38.

16. Беседина E.H. Оценка влияния трансгенного (Bt) картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяций нецелевых видов насекомых // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (г. Краснодар, 18-20 ноября 2009 г.). - Краснодар. - 2009. - С. 142-143.

17. Киль В.И., Беседина E.H., Пушня М.В., Исмаилов В.Я. Изучение пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых // Труды Кубанского государственного аграрного университета. -2010. № 1(22). - С. 96-100.

Подписано в печать 19.07.2010 г. Формат 60x84 1/16

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ.л.-1,0 Заказ Х»533

Тираж- 100 экз._

Отпечатано в типографии КубГАУ 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Беседина, Екатерина Николаевна

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Современное состояние производства генно-инженерно-модифицированных растений в мире.

1.2 Трансгенный ^/'-картофель, устойчивый к колорадскому жуку.

1.3 Проблемы биобезопасности энтомоцидных трансгенных растений.

1.4 Влияние Б£-токсинов на нецелевую биоту.

1.5 Молекулярно-генетические маркеры.

1.6 Принцип ПЦР-метода.

1.7 ДНК-маркеры для тестирования изменчивости структуры популяций насекомых.

2 МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Оборудование и реактивы.

2.2 Объект и методы исследования.

2.3 Статистическая обработка данных.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Оптимизация параметров ПЦР.

3.2 Исследование ДНК-полнморфизма популяций насекомых.

3.2.1 ДНК-полиморфизм популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки по RAPD-маркерам.

3.2.2 ISSR-анализ популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки.

3.2.3 SSR-анализ популяции хлопковой совки.

3.2.4 Сравнительный анализ ДНК-полиморфизма различных видов насекомых.

3.3 Оценка пролонгированного воздействия 2?г-картофеля на популяции нецелевых видов насекомых.

3.3.1 Молекулярно-генетический анализ популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки в условиях питания /^-картофелем на протяжении нескольких генераций насекомых.

3.3.2 Оценка влияния 5?-токсинов на некоторые показатели роста и развития нецелевых видов насекомых в ряду генераций.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение пролонгированного влияния трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых"

Защита растений от вредных организмов остается кардинальной проблемой современного сельскохозяйственного производства. При этом приоритетным способом решения проблемы должно быть развитие технологий и приемов, которые обеспечивают получение не только достаточной по объему, но и биологически полноценной и экологически безопасной продукции.

Создание методами генетической инженерии и биотехнологии генетически модифицированных сельскохозяйственных культур, устойчивых к вредителям и не нуждающихся для защиты урожая в обработке инсектоакарицидами, — выдающееся достижение 20 столетия. Площади посевов в мире под трансгенными или генетически модифицированными растениями возрастают с каждым годом, достигнув в 2008 г. 125 млн. га [171]. Тем не менее, несмотря на увеличение посевов трансгенных растений недостаточно изученные экологические аспекты их биобезопасности сдерживают выращивание ГМР в России и ряде других стран. Отсутствие убедительных доказательств их экологической безопасности является источником научной неопределенности при оценке экологических рисков производства ГМ-культур.

Одним из основных экологических рисков считается возможность негативного влияния ГМР на нецелевые организмы биоценозов и возможно связанные с этим уменьшение биоразнообразия и нарушение трофических связей. Не является исключением в этом отношении и трансгенный картофель, устойчивый к колорадскому жуку, с геном СгуЗА. Несмотря на то, что действие гена СгуЗА высокоэффективно и селективно в отношении целевого вредителя, колорадского жука, сегодня никто не может с полной уверенностью утверждать, что другие нецелевые насекомые, питающиеся Bt-картофелем, не подвергаются абсолютно никакому воздействию.

Особые опасения среди экологов вызывает не острая токсичность, но возможность негативного пролонгированного воздействия /^-токсинов (в ряду нескольких генераций насекомых) [65]. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что долговременное влияние 2?г-токсинов может сказаться на внутрипопуляционной структуре и генотипическом разнообразии организмов, населяющих биоценоз ^-картофеля. Это, в свою очередь, может отразиться на адаптивности популяций и, в конечном итоге, на виде в целом.

Кроме того, влияние СгуЗА белка, токсичного для целевого вида (колорадского жука), может привести, наоборот, не к элиминации, а к увеличению жизнеспособности нецелевых видов насекомых и возможно к формированию резистентности этих вредителей к токсичным для них Bt-эндобелкам. Применительно к вредителям данное явление крайне нежелательно, так как неизбежно скажется на росте их численности и, соответственно, на урожае картофеля. На основании вышеизложенного актуальность выбранного нами направления исследований очевидна.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась оценка пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, на нецелевых насекомых.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Анализ ДНК-полиморфизма популяций колорадского жука и 7 нецелевых видов насекомых, в том числе и энтомофагов колорадского жука, по RAPD-, ISSR- и SSR-маркерам.

3. Сравнительная оценка изменчивости молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия популяций картофельной минирующей моли и хлопковой совки при питании трансгенным (Bt) картофелем на протяжении нескольких поколений насекомых.

4. Оценка показателей роста и развития нецелевых видов насекомых-вредителей картофеля под влиянием ^-токсинов в ряду нескольких генераций.

Научная новизна.

• Проведена оценка пролонгированного действия ГМ картофеля на нецелевую биоту: изучены внутрипопуляционное генетическое разнообразие насекомых в условиях питания ^/-картофелем и влияние СгуЗА белка на молекулярно-генетическую структуру популяций нецелевых видов в ряду поколений.

• Исследован ДНК-полиморфизм популяций картофельной минирующей моли, хлопковой совки и хищных клопов Podisas maculiventris и Perillus bioculatus - энтомофагов колорадского жука.

• Выявлено позитивное влияние ^/-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку (сорт Луговской плюс), на показатели роста и развития нецелевых насекомых-вредителей, в частности, на массу куколок хлопковой совки.

Практическая значимость результатов исследований.

- Выявлены RAPD- и ISSR-праймеры, позволяющие изучать ДНК-полиморфизм различных видов насекомых.

- Предложен новый подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых, в основе которого лежит: культивирование поливольтинных видов нецелевых насекомых на искусственной питательной среде, содержащей ^/-токсины, и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия и показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

Основные положения, выносимые на защиту: На этапе предрегистрационных испытаний трансгенных растений на экологическую безопасность, оценку пролонгированного действия ГМР на нецелевых насекомых следует проводить с использованием предлагаемого подхода, в основе которого лежит: культивирование поливольтинных видов нецелевых насекомых на искусственной питательной среде, содержащей Bt-токсины, и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия, показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

Трансгенный {Bt) картофель, устойчивый к колорадскому жуку (сорт Луговской плюс), не оказывает негативного пролонгированного действия на нецелевой вид — картофельную минирующую моль.

Позитивное влияние ift-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку (сорт Луговской плюс), на показатели роста и развития нецелевых насекомых-вредителей, в частности, на массу куколок хлопковой совки.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на научно-практических конференциях: международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург-Пушкин, 2008); международной конференции «Биологическая защита растений — основа стабилизации агроэкосистем» (г. Краснодар, 2008); отчетной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой, Туапсинского района, 2008); международном симпозиуме «Защита растений - достижения и перспективы» (г. Кишинев, 2009), 3 Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (г. Краснодар, 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методики проведения исследований, результатов исследований, выводов, практических рекомендаций и приложения. Включает 26 рисунков, 29 таблиц. Список литературных источников, используемых для написания или цитируемых в тексте работы, насчитывает 257 наименования, из которых 180 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Плодоводство, виноградарство", Беседина, Екатерина Николаевна

выводы

2. RAPD-праймеры ОРА07, ОРА20, OPBOl и ISSR-праймер UBC810 оказались универсальными для восьми, исследуемых нами видов насекомых, принадлежащих к различным отрядам (Diptera, Hemiptera, Coleoptera, Lepidoptera), что позволяет использовать данные праймеры для анализа молекулярно-генетической структуры популяций насекомых.

4. Молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяций нецелевых видов насекомых под воздействием ^/-картофеля (сорт Луговской плюс), как минимум, в первых, двадцати поколениях картофельной минирующей моли и трех генерациях хлопковой совки остаются неизменными.

5. Оценка показателей роста и развития двадцати пяти поколений картофельной моли свидетельствует об отсутствии позитивного / негативного влияния 2?Г-картофеля (сорт Луговской плюс) на жизнеспособность и репродуктивные функции этого вида насекомых.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1) Оценку пролонгированного влияния ГМР на нецелевых насекомых, на этапе предрегистрационных испытаний, целесообразно проводить с использованием предлагаемого нами подхода, в основе которого лежит: культивирование поливольтинных видов нецелевых насекомых на искусственной питательной среде, содержащей 2?£-токсины, и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия и показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Беседина, Екатерина Николаевна, Краснодар

1. Анон. ^/-кукуруза и нецелевые организмы // Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку. М.: Центр «Биоинженерия» РАН. 2000. Приложение 2. - С. 9-10; 19-22.

2. Брянцев Б. А. Сельскохозяйственная энтомология. — Л.: Колос, 1966. -344 с.

3. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений // Физиология растений. 1999. - Т. 46. № 6. — С. 930-944.

4. Ван Лянь-Чжен, Ван Лан, Ли Квянг. Трансгенные растения в Китае // Материалы международной научно-практической конференции «Трансгенные растения — новое направление в биологической защите растений», Краснодар, 2002. - С. 114-117.

5. Бельков В.В., Соколов М.С., Медвинский А.Б. Проблема государственного регулирования производства трансгенных растений // Вестник защиты растений. — 2003 б. № 3. — С. 3-16.

6. Викторов А.Г. Трансгенные растения и почвенная биота // Природа. -2006. № 11.-С. 47-51.

7. Викторов А.Г. Яг-растения и биологическая активность почв // Агрохимия. 2007. № 2. - С. 83-88.

8. Гапоненко А.К., Игнатов А.Н. Генетическая инженерия растений -направление развития // Трансгенные растения новое направление в биологической защите растений: Мат-лы международ, науч.-практ. конф., ВНИИБЗР, - Краснодар: РАСХН, 2003. - С. 81-100.

9. Гаппаров М.М., Сорокина Е.Ю., Тышко Н.В. Генетически модифицированные продукты мифы и реальность. - Киев: КВ1Ц. 2007. -40 с.

10. Глазко В.И., Доманский Н.Н., Созинов А.А. Современные направления использования ДНК-технологий // Цитология и генетика. 1998. - Т. 32. №5.-С. 80-93.

11. Глазко В.И., Дунин И.М., Глазко Г.В., Калашникова JI.A. Введение в ДНК-технологии. -М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2001. 436 с.

12. Глазко В.И. Генетически модифицированные организмы: от бактерий до человека. Киев: КВ1Ц, 2002.-210 с.

13. Глазко В. И., Глазко Т. Т. ДНК-технологии в генетике и селекции: Курс лекций. Краснодар, 2006. - 399 с.

14. Глазко В.И. Кризис аграрной цивилизации и генетически модифицированные организмы. — Киев. PA NOVA. 2007. 206 с.

15. ГМО скрытая угроза России (Материалы к докладу Президента Российской Федерации). - М.: Общенациональная ассоциация генетической безопасности. 2004. — 142 с.

16. Жиганова Л.П. Проблемы использования генетически модифицированных растений // США Канада: экономика, политика, культура.-2001. №8.-С. 105-127.

17. Жученко А.А. Роль генетической инженерии в адаптивной системе селекции растений (мифы и реалии) // Сельскохозяйственная биология. 2003. № 1.-С. 3-33.

18. Жученко А.А. Роль, место и последствия трансгеноза в современной селекции растений // Трансгенные растения новое направление в биологической защите растений: Мат-лы международ, науч.-практ. конф., ВНИИБЗР, - Краснодар: РАСХН, 2003. - С. 20-35.

19. Захаров В.М. К принятию Россией решения об использовании ГМО // ГМО скрытая угроза России (Мат-лы к Докладу Президенту Российской Федерации). — М.: Общенациональная ассоциация генетической безопасности, 2004. - С. 4-5.

20. Иванюк В.Г. Банадысев С.А., Журомский Г.К. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. — Мн.: Белпринт, 2005. — 696 с.

21. Каледарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение // Физиол. и биохим. культ, растений. — 2002. № 4.-С. 279-296.

22. Картахенский протокол по биобезопасности Конвенции о биологическом разнообразии. Текст и приложения. Монреаль (The Secretariat of the Convention of Biological Diversity). 2000. 40 c.

23. Кащъяп В. Пестициды и трансгенные растения как международная экологическая проблема. — М., 1998. — 168 с.

24. Киль В.И. Оценка риска вертикального переноса генов ^/-картофеля и других трансгенных культур // Агрохимия. 2003. № 4. - С. 81-89.

25. Киль В.И., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В. Резистентность вредителей к трансгенному картофелю и другим ^/-защищенным культурам // Агрохимия. 2004. № 7. - С. 77-91.

26. Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. Молекулярно-генетическая структура популяции картофельной минирующей моли Phthorimaea operculella Zell. (Lepidoptera: Gelechiidae) // Наука Кубани. 2007. № 4. -С. 25-29.

27. Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В., Исмаилов В.Я. О полиморфизме RAPD-маркеров у различных таксонов полужесткокрылых (Hemiptera) // Сельскохозяйственная биология. 2008. № 1. - С. 70-76.

28. Киль В. И., Ширинян Ж. А. RAPD-анализ популяции хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. (Lepidoptera: Noctuidae) // Наука Кубани. -2008. C.176-179.

29. Кононенко B.C. Совки. / Определитель насекомых Дальнего Востока. Веерокрылые и бабочки // Ред. Jlep П.А. — Владивосток: Дальнаука, 2003. -Т. 5.-Вып. 4.-688 с.

30. Конарев В.Г. Морфогенез и молекулярно-биологический анализ растений. Санкт-Петербург: ВИР, 1998. - 370 с.

31. Мазин В.В. Самозащита растений или смена парадигм // С.-х. биология.- 2001. №3.-С. 37-42.

32. Медицинские биотехнологии (специальный выпуск) // Информационный дайджест. Центр «Биоинженерия» РАН. - 2000. № 4. - 32 с.

33. Международные руководящие принципы техники безопасности ЮНЕП в области биотехнологии // ЮНЕП. 1995. 39 с.

34. Мигулин А.А. Осмоловский Г.Е. Сельскохозяйственная энтомология. -М.: Колос, 1976.-448 с.

35. Монастырский О.А. Готова ли Россия к распространению трансгенных культур? // Трансгенные растения новое направление в биологической защите растений: Мат-лы международ, науч.-практ. конф., ВНИИБЗР,- Краснодар: РАСХН, 2003. С. 105-110.

36. Новожилов О.В. ГМО для всех. Киев. 2004. - 51 с.

37. Общий обзор по промышленному применению трансгенных культур //

38. С.-х. биотехнология. 2000. - Т. 1. - С. 253-260.

39. Панчин А. Война против ГМО будет проиграна // «Новая газета. Свободное пространство». 2008. № 1. - С. 3-4.

40. Положение о регистрационных испытаниях и регистрации пестицидов в Российской Федерации. -М.: Госхимкомиссия. 1995.

41. Поспелов С. М., Арсеньева М. В., Груздев Г. С., Защита растений. JI., 1973.

42. Поспелов С.М. Совки вредители сельскохозяйственных культур. - М.: Агропромиздат, 1989. - 112 с.

43. Романов Г.А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности // Физиология растений. 2000. - Т. 47. № 3. -С. 343-352.

44. Сатарова Т.Н. Перенос чужеродных генов и наследование при генетической трансформации кукурузы // Цитология и генетика. — 2001. -Т. 32. №2.-С. 60-66.

45. Семенюк Е.Г. Проблема оценки риска трансгенных растений // Агрохимия. 2001 а. № 10. - С. 85-96.

46. Семенюк Е.Г. Агроэкологические аспекты использования генетически модифицированных сельскохозяйственных культур // Агрохимия. 2001 б. № 11.-С. 80-93.

47. Соколов М.С., Марченко А.И. Потенциальный риск возделывания трансгенных растений и потребления;их урожая?// Сельскохозяйственная биология. 2002. № 5. - С. 3-22.

48. Соколов М.С., Марченко А.И., Бельков В.В., Медвинский А.Б., Спиридонов Ю.Я. Система эколого-токсикологической оценки генетически модифицированных энтомоцидных растений (концептуальное обоснование) // Агрохимия. — 2005. № 9. — С. 76-90.

49. Сухарева И.Л. Совки. // Насекомые и клещи вредители сельского хозяйства. Чешуекрылые. Ред. Кузнецов В.И. - СПб.: Наука, 1999. Т. 3, 4. 2.-С. 332-378:

50. Гкаченко Е. ГМ картофель вырастет в России через два года. Но найдет ли он спрос? // Агробизнес. - 2002. № 1.

51. Уайтхед Т., Мак-Интош Т., Финдлей У. Картофель здоровый и больной. М.: Издательство иностранной литературы, 1955. — 608 с.

52. Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности // Тезисы Международного симпозиума; ■ М., Отд. Бйол. Наук РАН. 2004. -72 с.

53. Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности // Тезисы 2-го Всероссийского симпозиума. М., Отд. Биол. Наук РАН. 2007.-93 с.

54. Харченко П.Н. ДНК-технологии в биологической защите растений // Трансгенные растения новое направление в биологической защите растений: Мат-лы международ, науч.-практ. конф., ВНИИБЗР, -Краснодар: РАСХН, 2003. - С. 100-105.

55. Харченко П.Н., Глазко В.И. ДНК-технологии в развитии агробиологии. — М.: Воскресенье, 2006. 480 с.

56. Шаболта О.М., Переро М. Питательные среды для выращивания картофельной моли в биолабораториях // Садоводство и виноградарство. -1996. №2.-С. 50.

57. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. — Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1994. Ч. 1. 304 с.

58. AGBIOS. Biotech Crop Database. 2006. www.agbios.com.

59. Anon. Safety assessment of YeldGard Insect-Protected Corn Event MON 810 // In: MON 81 OP. YeldGard Corn Borer. Key Facts. Monsanto Europe-Africa. 2006.-P. 26-52.

60. APHIS-USDA. Petition 93-258-01 for Determination of Nonregulated Status for Glyphosate-Tolerant Soybean Line 40-3-2 // United States Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Hyattsville MD. 1994.

61. Astrid Т., Groot A.T., Dicke M. Insect-resistant transgenic plants in a multi-trophic context // Plant J. 2002. - V. 31. № 4. - P. 387-406.

62. Barton K.A., Binns A.N., Matzke A.J., Chilton M.-D. Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA, and transmission of T-DNA to R1 progeny. 1983. Cell 32. P. 1033-1043.

63. Bates S.L., Zhao J.Z., Roush R.T., Shelton A.M. Insect resistance management in GM crops: past, present and future // Nat. Biotechnol. 2005. -V. 23. № l.-P. 57-62.

64. Baur M.E., Boethel D.J. Effect of Bt cotton expressing CrylA(c) on the survival and fecundity of two hy-menopteran parasitoids (Braconidae, Encyrtidae) in the laboratory // Biol. Control. 2003. - V. 26. - P. 325-332.

65. Bernal J.S., Griset J.G., Gillogly P.O. Impacts of developing on Bt maize-intoxicated hosts on fitness parameters of a stem borer parasitoid // J. Entomol. Sci. 2002. - V. 37. - P. 27-40.

66. Betz F.S., Hammond B.G., Fuchs R.L. Safety and advantages of Bacillus thuringiensis-protected plants to control insect pests // Regul. Toxicol. Pharmacol. -2000. -V. 32. № 2. P. 156-73.

67. Birch A.N.E., Wheatley R.E. GM pest-resistant crops: assessing environmental impacts on non-target organisms // Issues in Environmental Science and Technology. 2005. - V. 21. - P. 31-57.

68. Bird L.J., Akhurst R.J. Relative fitness of CrylA-resistant and -susceptible Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) on conventional and transgenic cotton // J. Econ. Entomol. 2004. - V. 97. № 5. - P. 1699-1709.

69. Borch K., Rasmussen B. An analytical approach to the implementation of genetically modified crops // Trends Biotechnol. 2000. - V. 18. № 12. P. 484-486.

70. Borisjuk N.V., Borisjuk L.G., Logendra S., Petersen F., Gleba Y., Raskin I. Production of recombinant proteins in plant root exudates // Nat. Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 466-469.

71. Bourguet D., Genissel A., Raymond M. Insecticide resistance and dominance levels //J. Econ. Entomol. 2000. - V. 93. № 6. - P. 1588-1595.

72. Brouat С., Sennedot F., Audiot P., et al. Fine-scale genetic structure of two carabid species with contrasted levels of habitat specialization // Molecular Ecology.-2003.-V. 12.-P. 1731-1745

73. Brusetti L., Fracia P., Bertolini C, Pagliuca A.S.B. et al. Bacterial communities associated with the rhizosphere of transgenic Bt 176 maize (Zea mays) and its non-transgenic counterpart // Plant Soil. — 2004. V. 218. -P. 137-144.

74. Bulla L.A., Bechtel J., Kramer К J. Ultrastructure, Physiology and Biochemistry of Bacillus thuringiensis //Crit. Rev. Microbiol. 1980. - V. 8. -P. 147-204.

75. Burke J.M., Gardner K.A., Reisenberg L.H. The potential for gene flow between cultivated and wild sunflower (Helianthus annuus) in the United States//Am. J. Bot. 2002. - V. 89. №9.-P. 1550-1552.

76. Caetano-Anolles G. MAAP: a versatile and universal tool for genome analysis // Plant Molecular biology. 1994. - V. 25. - P. 1011-1026.

77. Caetano-Anolles G. Scanning of nucleic acids by in vitro amplification: New developments and applications // Nature Biotechnology. 1996. - V. 14. -P. 1668-1674.

78. Cao J., Zhao J.Z., Tang D., Shelton M., Earle D. Broccoli plants with pyramided crylAc and crylC Bt genes control diamondback moths resistant to102

79. CrylA and CrylC proteins // Theor. Appl. Genet. 2002. - V. 105. № 2-3. -P. 258-264.

80. Carpenter J.E. Case studies in benefits and risks of agricultural biotechnology: Roundup Ready soybean and Bt field corn // National Center for Food and Agricultural Policy, Washington DC. 2001.

81. Carriere Y., Tabashnik B.E. Reversing insect adaptation to transgenic . insecticidal plants // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2001. - V. 268.1475.-P. 1475-1480.

82. Carriere Y., Ellers-Kirk C., Sisterson M., Antilla L., Whitlow M., Dennehy T.J., Tabashnik B.E. Long-term regional suppression of pink bollworm by Bacillus thuringiensis cotton // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. №4.-P. 1519-1523.

83. Chalmers К J., Waugh J.I., Sprent A. J., Simons A. J., Powell W. Detection of genetic variation between and within populations of Gliricidia sepium and G. maculata using RAPD markers // Heredity. 1992. - V. 69. - P. 465-472.

84. Chaufaux J., Seguin M., Swanson J.J., Bourguet D., Siegfried B.D. Chronic exposure of the European corn borer (Lepidoptera: Crambidae) to CrylAb Bacillus thuringiensis toxin // J: Econ. Entomol. — 2001. — V. 94. № 6. -P. 1564-1570.

85. Chen M., Presting G., Barbazuk W. B. et al. An integrated physical and genetic map of the rice genome // The Plant Cell. 2002. V. 14. - P. 537-545.

86. Chilcutt C.F., Tabashnik B.E. Contamination of refuges by Bacillus thuringiensis toxin genes from transgenic maize // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. № 20. - P. 7526-7529.

87. Chin E.C.L., Senior M.L., Shu H. et al. Maize simple repetitive DNA sequences: abundance and allele variation // Genome. 1996. - V. 39. -P. 866-873.

88. Crickmore N.D., Ziegler D.R., Feitelson J. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins // Microbiol, and Molec. Biol. Rev. 1998. -V. 62. - P. 807-813.

89. Conner A.J., Glare T.R., Nap J.P. The release of genetically modified crops into the environment. Part 11. Overview of ecological risk assessment // Plant Journal. 2003. - V. 33. - P. 19-46.

90. Cowgill S.E., Atkinson H.J. A sequential approach to risk assessment of transgenic plants expressing protease inhibitors: effects on nontargetherbivorous insect I I Transgenic Research. — 2003. V. 12. - P. 439-449.

91. Dale P.J., Clarke В., Fontes E.M.G. Potential for the environmental impact of transgenic crops // Nature Biotechnology. 2002. - V. 20. - P. 567-574.

92. De La Rua P., Galian J., Serrano J., Moritz R. F. A. Molecular characterization and population structure of the honeybees from the Balearic islands (Spain) // Apidologie. 2001. - V. 32. - P. 417-427.

93. Dunfield K.L., Germida J.J. Impact of genetically modified crops on soil-and plant-associated microbial communities // J. Environ. Qual. 2004. -V. 33. №3.-P. 806-815.

94. Dutton A., Klein H., Romeis J., Bigler F. Uptake of I?/-toxin by herbivores feeding on transgenic maize and consequences for the predator Chrysoperla carnea II Ecol. Entomol. 2002. - V. 27. - P. 441-447.

95. Dutton A., Klein H., Romeis J., Bigler F. Prey-mediated effects of Bacillus thuringiensis spray on the predator Chrysoperla carnea in maize // Biol. Control. 2003. - V. 26. - P. 209-215.

96. Dutton A., Romeis J., Bigler F. Assessing the risks of insect resistant transgenic plants on entomphagous arthropods: Bt-maize expressing CrylAbas a case study // Biocontrol. 2003. - V. 48. - P. 611-636.

97. EFSA. Guidance document of the scientific panel on genetically modified organisms for the risk assessment of genetically modified plants and derived food and feed // European Food Safety Authority. Brussels. 2004.

98. Ellstrand N.C. Dangerous liaisons? When cultivated plants mate with their wild elatives // The John Hopkins University Press. — Baltimore and London. 2003.

99. EPA. Guidelines for ecological risk assessment. Federal Register // U.S. Environmental Protection Agency. Washington DC. 1998.

100. EPA. Biopesticides registration action document — Bacillus thuringiensis plant-incorporated protectants. // U.S. Environmental Protection Agency., Washington DC. 2001.

101. Fakrudin В., Prakash H., Krishnareddy K.B, Vijaykumar Badari,

102. Prasad P.R., Patil B.V., Kuruvinashetti M.S. Genetic variation of cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hiibner) of South Indian cotton ecosystem using RAPD markers // Current Science. 2004. - V. 87. - P. 1654-1659.

103. FAO. The state of food and agriculture agricultural biotechnology, meeting the needs of the poor? // Food and Agriculture Organization of the United Nations. - Rome. 2004.

104. Ferre J., Van Rie J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis II Annu. Rev. Entomol. 2002. - V. 47. - P. 501-533.

105. Franck P., Reyes M., Olivares J., Sauphanor B. Genetic architecture of in codling moth populations: comparison between microsatellite and insecticide resistance markers // Molecular Ecology. 2007. - V.l 6. - P. 3554-3564.

106. Fuentes-Contreras E., Espinoza J.L., Lavandero В., Ramirez C.C. Population Genetic Structure of codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) from Apple Orchards in Central Chile // Journal of Economic Entomology. — 2008. -V. 101. № l.-P. 190-198.

107. Gahan L.J., Gould F., Heckel D.G. Identification of a gene associated with Bt resistance in Heliothis virescens II Sci. 2001. - V. 293. № 5531. - P. 857860.

108. Giovannetti M. The ecological risks of transgenic plants // Riv. Biol. 2003. -V. 96. №2.-P. 207-223.

109. Glare T.R., O'Callaghan M. Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology and Safeety. John Wiley and Sons Ltd, Chichester UK. GM Science Review Panel (2003). GM science review: first report // Department of Trade and Industry. 2000.

110. Glaser J.A., Matten S.R. Sustainability of insect resistance managementstrategies for transgenic Bt corn // Biotechnol. Adv. 2003. - V. 22. № 1-2. -P. 45-49.

111. Gonzalez-Cabrera J., Herrero S., Ferre J. High genetic variability for resistance to Bacillus thuringiensis toxins in a single population of diamondback moth // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. № 11. -P. 5043-5048.

112. Gould F., Martinez-Ramirez A., Anderson A., Ferre J., Silva F.J., Moar W.J. Broad-spectrum resistance to Bacillus thuringiensis toxins in Heliothis virescens II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1992. - V. 89. № 17. - P. 79867990.

113. Griffitts J.S., Whitacre J.L., Stevens D.E., Aroian R.V. Bt toxin resistance from loss of a putative carbohydrate-modifying enzyme // Sci. 2001. -V. 293. № 5531. - P. 860-864.

114. Groot A.T., Dicke M. Insect-resistant transgenic plants in a multi-trophic context // Plant Journal. 2002. - V. 31. - P. 387-406.

115. Gupta M., Chyi Y.S., Romero-Severson J., Owen J.L. // Theoret. Appl. Genet. 1994. - V. 89. - P. 998.

116. Hails R.S. Genetically modified plants the debate continues // TREE. - 2000. - V. 15.-P. 14-18.

117. Heritage J. Transgenes for tea? // Trends Biotechnol. 2005. - V. 23. № 1. -P. 17-21.

118. Herrera-Estrella L.A., Depicker M., Van Montagu J.S. Expression of chimeric Genes transferred into plant cells using a Ti-plasmidderived vector // Nature 303. 1983. -P. 209-213.

119. Hilbeck A., Baumgartner M., Fried P.M., Bigler F. Effects of transgenic Bacillus thuringiensis corn-fed prey on mortality and development time of immature Chrysoperla carnea (Neuroptera: Chrysopidae) // Environ. Entomol. 1998. - V. 27. - P. 480-487.

120. Hilbeck A., Meier M.S., Raps A. Rewiew on non-target organisms and implants // Ecological technology Assessment and Environmental Consulting. 2000.-77 pp.

121. Hilbeck A. Implications of transgenic, insecticidal plants for insect and plant biodiversity // Perspectives in Plant Ecology Evolution and Systematics. -2001. — V. 4.-P. 43-61.

122. Hill R.A., Sendashonga C. General principles for risk assessment of living modified organisms: Lessons from chemical risk assessment // Environmental Biosafety Research. 2003. - V. 2. - P. 81-88.

123. Hofite H., Whiteley H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis //Microbiol. Rev. 1989. - V. 53. - P. 242-255.

124. Hokanson S.C., Grumet R., Hancock J.F. Effect of border rows and trap/donor ratios on pollen-mediated gene movement // Ecol. Appl. 1997. №7.-P. 1075-1081.

125. Huang F., Buschman L.L., Higgins R.A., McGaughey W.H. Inheritance of resistance to Bacillus thuringiensis toxin (Dipel ES) in the european corn borer // Science. 1999. - V. 284. № 5416. - P. 965-967.

126. Icoz I., Stotzky G. Fate and effects of insect-resistant Bt crops in soil ecosestems // Soil biology and biocemistry. 2008. - V. 40. - P. 559-586.

127. Jaffe G. Regulating transgenic crops: a comparative analysis of different regulatory processes // Transgenic Research. 2004. - V. 13. - P. 5-19.

128. James C. Global status of commercialized biotech/GM crops: 2004 // ISAAA Brief No. 34. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications. Ithaca. NY. 2005.

129. James C. Global review of commercialized transgenic crops: 2008 // ISAAA Briefs. No. 39. International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications. Ithaca. NY. 2009.

130. Jank В., Gaugitsch H. Decision making under the Cartagena Protocol on Biosafety 11 Trends in Biotechnology. 2001. - V. 18. № 5. - P. 194-197.

131. Ji' Y.J., Zhang D.X., Hewitt G.M., Kang L., Li D.M. Polimorphic microsatellite loci for the cotton bollworm Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and some remarks on their isolation // Molecular Ecology Notes. 2003. -V. 3. № 1. -P: 102-104.

132. Ji Ya-Jie, Zhang De-Xing. Characteristics of microsatellite DNA in lepidopteran genomes and implications for their isolation // Acta Zoologica Sinica. 2004. - V. 50 (4). - P. 608-614.

133. Ji Y.J., Wu Y.C., Zhang D.X. Novel polimorphic microsatellity markers developed in the cotton bollworm Helicoverpa armigera' (Lepidoptera: Noctuidae) // Insect Science. 2005. - V. 12. - P. 331-334.

134. Karlin S., Burge C. Dinucleotide relative abundance extremes: a genomic signature // Trends in genetics. 1995. - V. 25. № 7. - P. 283-290.

135. Koivisto R.A., Tormakangas K.M., Kauppinen V.S. Hazard identification and risk assessment procedure for genetically modified plants in the field -GMHAZID // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2002. - V. 9. № 2. - P. 110-116.

136. Kowalchuk G.A., Bruinsma M., van Veen J.A. Assessing responses of soil microorganisms to GM plants // Trends in Ecology and Evolution. — 2003. -V. 18.-P. 403-410.

137. Knowles B.H., Ellar D.J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanisms of action of Bacillus thuringiensis (delta) — endotoxins withdifferent insect specifity // Biochem. Biophys. Acta. 1987. - V. 924. -P. 509-518.

138. Kuiper H.A., Kleter G.A., Noteborn H.P., Kok EJ. Assessment of the food safety issues related to genetically modified foods // Plant J. 2001. - V. 27. № 6. - P. 503-528.

139. Lery X., LaRue В., Cossette J., Charpentier G. Characterization and authentication of insect cell lines using RAPD markers // Insect Biochem. Mol. Biol.-2003.-V. 33 (10).-P. 1035-41.

140. Lift M., Luty J.A. // Am. J. Hum. Genet. 1989. - V. 44. № 3. - P. 397.

141. Liu Y.B., Tabashnik B.E., Meyer S.K., Carriere Y., Bartlett A.C. Genetics of pink bollworm resistance to Bacillus thuringiensis toxin CrylAc // J. Econ. Entomol. 2001. -V. 94. №1. - P. 248-252.

142. Lumbierres В., Albajes R., Pons X. Transgenic Bt-maize and Rhopalosiphum padi (Homoptera: Aphididae) performance // Ecological Entomology. 2004. - V. 29. - P. 309-317.

143. Mann C.C. Has GM corn "invaded" Mexico? // Science. 2002. - V. 295. -P. 1618-1619.

144. MaiToquin L.D., Elyassnia D., Griffitts J.S., Feitelson J.S., Aroian R.V. Bacillus thuringiensis (Bt) toxin susceptibility and isolation of resistance mutants in the nematode Caenorhabditis elegans II Genetics. 2000. - V. 155. №4.-P. 1693-1699.

145. Marvier M. Improving risk assessment for non target safety of transgenic crops // Ecol. Appl. 2002. - V. 12. - P. 1119-1124.

146. Mezghani M., Marrakchi M., Makni H. Genetic diversity of Mayetiola destructor and Mayetiola hordei (Diptera: Cecidomyiidae) by inter-simple sequence repeats (ISSRs) // African Journal of Biotechnology. 2005. - V. 4. №7.-P. 601-606.

147. Mohan M., Nair S., Bhagwat A., Krishna T.G., Yano M., Bhatia C.R., Sasaki T. // Molecular Breeding. 1997. - V. 3. - P. 87.

148. Motavalli P.P., Kremer R.J., Fanga M., Meansa N.E. Impact of genetically modified crops and their management on soil microbially mediated plant nutrient transformations // J. Environ. Qual. 2004. - V. 33. - P. 816-824.

149. NRC. Risk assessment in the Federal Government: Managing the process. National Recearch Council // National Academy Press. Washington DC. 1983.

150. O'Callaghan M., Glare T.R., Burgess E.P.J., Malone L.A. Effects of plants genetically modified for insect resistance on non-target organisms // Annual Review of Entomology. 2005. - V. 50. - P. 271-292.

151. Olsen K.M., Daly J.C. Plant-toxin interactions in transgenic Bt-cotton and their effect on mortality of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) I I J. Econ. Entomol. 2000. - V. 93. № 4. - P. 1293-1299.

152. Ooms G., Karp A., Burrel M.M., Twell D., Roberts J. Genetic modification of potato development using RL T-DNA // Theor. Appl. Genetic. 1985. -V. 70.-P. 444-446.

153. Pearce F. The great Mexican maize scandal // New Scientists. 2002. -V. 174. №2347.-P. 14-16.

154. Perlak F.J., Stone T.B., Muskopf Y.M. Genetically improved potato: protection from damage by Colorado potato beetles // Plant Molecular Biology. 1993. - № 22. - P. 313-321.

155. Pilcher C.D., Rice M.E., Obrycki J.J., Lewis L.C. Field and laboratory evaluations of transgenic Bacillus thuringiensis corn on secondary lepidopteran pests (Lepidoptera: Noctuidae) // Journal of Economic Entomology. 1997. -V. 90.-P. 669-678.

156. Pilcher C.D., Rice M.E. Effect of planting dates and Bacillus thuringiensis corn on the population dynamics of European corn borer (Lepidoptera: Crambidae) // J. Econ. Entomol. 2001. - V. 94. № 3. - P. 730-742.

157. Pittendrigh B.R., Gaffhey PJ., Huesing J.E., Onstad D.W., Roush R.T., Murdock L.L. Active refuges can inhibit the evolution of resistance in insects towards transgenic insect-resistant plants // J. Theor. Biol. — 2004. — V. 231. №4.-P. 461-474.

158. Pons X., Lumbierres В., Lopez C., Albajes R. Abundance of non-target pests in transgenic Bt-maize: A farm scale study // European Journal of Entomology. -2005. V. 102.-P. 73-79.

159. Poppy G.M., Sutherland J.P. Can biological control benefit from genetically-modified crops? Tritrophic interactions on insect-resistant transgenic plants // Physiological Entomology. 2004. - V. 29. - P. 257-268.

160. Pradeep A.R., Chatterjee S.N., Nair C.V. Genetic differentiation induced by selection in an inbred population of the silkworm Bombyx mori, revealed by RAPD and ISSR marker systems // J. Appl. Genet. 2005. - V. 46. № 3. -P. 291-298.

161. Puterka G.J., Bocchetti C., Dang P., Bell R.L., Scorza R. Pear transformed with a lytic peptide gene for disease control affects nontarget organism, pear psylla (Homoptera: Psyllidae) // J. Econ. Entomol. 2002. - V. 95. - P. 797802.

162. Quist D., Chapela I.H. Transgenic DNA introgressed into traditional maize landraces in Oaxaca, Mexico // Nature. 2001. - V. 414. № 6863. - P. 541543.

163. Robert D. J., Butcher, Denis J. Wright, James M. Cook. Development and assessment of microsatellites and AFLPs for Plutella xylostella II Molecular Ecology.-2002.-V. 6.-P. 101-104.

164. Romeis J., Meissle M., Bigler F. Transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis toxins and biological control // Nature Biotechnology. 2006. -V. 24.-P. 63-71.

165. Rose R.I. Tier-based testing for effects of proteinaceous insecticidal plant-incorporated protectants of non-target arthropods in the context of regulatory risk assessments // IOBC wprs bulletin. 2006. - V. 29. - P. 143-149.

166. Ruibal-Mendieta N.L., Lints FA. Novel and transgenic food crops: overview of scientific versus public perception // Transgenic Res. 1998. — V. 7. № 5. -P. 379-386.

167. Rychlik W., Spenser W.J., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro II Nucleic Acids Research, Molecular Biology. 1990. -V. 18. № 21. - P. 6409-6412.

168. Saeedi Z., Esmaili M., Abd-Mishani C., Abdollahi G., Talebi K. Detection of DNA polymorphisms between populations of Eurygaster integriceps Put. in Iran using RAPD-PCR I I Iranian Journal of Agricultural- Sciences 30 (2). -1999.-P. 331-340.

169. Saxena D., Stotzky G. Bt corn has a higher lignin content than non-ifr corn // Am. J. Botany.-2001.-V. 88. №9.-P. 1704-1706.

170. Schmitz G., Bartsch D., Pretscher P. Select MP of relevant non-target herbivores for monitoring the environmental effects of Bt maize pollen // Environ; Biosafety. 2003. - V. 2. - P. 117-132.

171. Scott K. D.,, Lange C. L., Scott L. J., Graham G. C. Isolation and characterization of microsatellite loci from Helicoverpa armigera. Hubner (Lepidoptera: Noctuidae) // Molecular Ecology Notes. 2004. - V. 4. -P. 204-205.

172. Shelton A.M., Zhao J.Z., Roush R.T. Economic, ecological, food safety, and social consequences of the deployment of Bt transgenic plants // Annu. Rev. Entomol. 2002. - V. 47. - P. 845-881.

173. Shorey H.H. A simpl artificial rearing medium fort the cabbage looper // J. Ecom Entomol. -1963. -V. 56. №4. P. 436-537.

174. Steinhauser K.G. Environmental risks of chemical and genetically modified organisms: a comparison. Part 1: Classification and characterization of risks posed by chemical and GMOs. // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2001. — V. 8. №2.-P. 120-126.

175. Steinhauser K.G. Environmental risks of chemical and genetically modified organisms: a comparison. Part 2: Susteinability and precaution in riskassessment and risk management // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2001'. -V. 8. №3.-P. 222-226.

176. Stewart C.N.Jr., Richards H.A., Halfhill M.D. Transgenic plants and biosafety: science, misconceptions and public perceptions // Biotechniques. 2000. - V. 29. № 4. - P. 832-6, 838-43.

177. Storer N.P., Van Duyn J.W., Kennedy G.G. Life history traits of Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) on non-Bt and ^/-transgenic corn hybrids in eastern North Carolina // J. Econ. Entomol. 2001. - V. 94. № 5. -P. 1268-1279.

178. Subramanian S., Mohankumar S. Genetic variability of the bollworm, Helicoverpa armigera, occurring on different host plants // Journal of Insect Science. — 2006. V. 6. - P. 26. /available online: insectscience.org/6.26.

179. Sudeep A.B., Khushiramani R., Athawale S.S., Mishra A.C., Mourya D.T. Characterization of a newly established potato tuber moth (Phthorimaea operculella Zeller) cell line. // Indian J. Med. Biol. 2005. № 121(3). - P. 159-63.

180. Tabashnik B.E., Patin A.L., Dennehy T.J., Liu Y.B., Carriere Y., Sims M.A., Antilla L. Frequency of resistance to Bacillus thuringiensis in field populations of pink bollworm // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2000. - V. 97. № 24. -P. 12980-12984.

181. Tabashnik B.E, Gould F., Carriere Y. Delaying evolution of insect resistance' to transgenic crops by decreasing dominance and heritability // Ji Evol: Biol.- 2004. V. 17. №4. - P. 904-912.

182. Tan S., Chen X., Zhang A., Li D. Isolation and characterization of DNA microsatellites from cotton bollworm (Helicoverpa armigera. Hiibner) // Molecular Ecology Notes. 2001. - V. 1. - P. 243-244.

183. Tang J.D., Collins H.L., Metz T.D., Earle E.D., Zhao J.Z., Roush R.T., Shelton A.M. Greenhouse tests on resistance management of Bt transgenic plants using refuge strategies // J. Econ. Entomol. — 2001. V. 94. № 1.- P. 240-247.

184. Tautz D. // Nucll Acids Res. 1989. - V. 17. №T 6. - P.' 64-631

185. Turrini A., Sbrana C, Nuti, M.P., Pietrangeli Bt, Giovannetti M. Development- of a* model system to assess the impact of genetically» modified', corn and' aubergine plants on arbuscular mycorrhizal fungi' // Plant Soil.- 2004. V. 266.-P. 69-75.

186. US Environmental Protection^ Agency (EPA). Pesticides: Regulating Biopesticides, Plant Incorporated Protectants, Current and' Previously Registered Section 3-PIP Registrations, /http://www.epa.gov/pesticides/2007. biopesticides/piplist.htms.

187. Van Leeuwen C.J., Hermens J.L.M. Risk Assessment of Chemicals // Anf Introduction. Kluwer Academic Publishers, London, UK. 1995. P. 224-31.

188. Velkov V.V., Medvinsky A.B., Sokolov M.S., Marchenko A.I. Will transgenic plants adversely affect the environment? // J. Biosci. 2005.117-V. 30. №4.-P. 515-548.

189. Vijayan К., Anuradha H.J., Nair C.V., et al. Genetic diversity and differentiation among population of the Indian eri silkworm, Samia Cynthia ricini, revealed by ISSR markers // Journal of Insect Science. — 2006. V. 6. №30.-P. 1-11.

190. Walklate P.J., Hunt J.C., Higson H.L., Sweet J.B. A model of pollen-mediated gene flow for oilseed rape // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2004. -V. 271. № 1538. - P. 441-449.

191. Walsh J.M. McClelland. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. № 24. - P. 7213-7218.

192. Wang Z., Weber J. L., Zhong G., Tanksley S. D. Survey of plant short tandem DNA repeats // Theor. and Appl. Genetics. 1994. - V. 88. - P. 1-6.

193. Weber J.L., May P.E. Human DNA polymorphism and methods of analysis // Am. J. Hum. Genet. 1989. - V. 44. № 3. - P. 388.

194. Williams J.G.K., Kubelic A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. - V. 7. № 18. № 22. - P. 6531-6535.

195. Wold S., Burkness E.C., Hutchinson W.D., Venette R.C. In-field monitoring of beneficial insect populations in transgenic corn expressing a Bacillus thuringiensis toxin // J. Entomol. Sci. 2001. - V. 36. - P. 177-186.

196. Wolfenbarger L.L., Phifer P. The ecological risks and benefits of genetically engineered plants // Science. 2000. - V. 290. № 5499. - P. 2088-2093.

197. Wu F. Explaining public resistance to genetically modified corn: an analysis of the distribution of benefits and risks // Risk Anal. 2004. - V. 24. № 3.-P. 715-726.

198. Zhao J.Z., Li Y.X., Collins H.L., Shelton A.M. Examination of the F2 screen for rare resistance alleles to Bacillus thuringiensis toxins in the diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae) // J. Econ. Entomol. 2002. - V. 95. № 1. -P. 14-21.

199. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. - V. 20. № 2. - P. 176-183.

Информация о работе

Беседина, Екатерина Николаевна
кандидата биологических наук
Краснодар, 2010
ВАК 06.01.07

Диссертация

Изучение пролонгированного влияния трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы