Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение капсульных и бескапсульных форм Vibrio cholerae 0139 с использованием поли- и моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение капсульных и бескапсульных форм Vibrio cholerae 0139 с использованием поли- и моноклональных антител"

На правах рукописи

ТЕРЕШКИНА Наталия Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ КАПСУЛЬНЫХ И БЕСКАПСУЛЬНЫХ ФОРМ VIBRIO CHOLERAE 0139 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2004

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

Федорова Валентина Анатольевна

Официальные оппонешм:

доктор медицинских наук, профессор

Адамов Алексей Константинович

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Прохватилова Елена Валерьевна

Ведущая ор1ани*ация:

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный инсти гут

Защита состой 1ся «

2004

г. в SO

ао

заседании диссертационного совета Д 208. 078 01. по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Министерства здравоохранения Российской Федерации (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб» .

Автореферат разослан ¿3 Ш)Я1кЯ' 2004 I

Ученый секретарь диссертационного совет а доктор биологических наук, старший научный сотрудник L Слудский A.A.

473

ткуъо

з

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В настоящее время Vibrio cholerae 0139, ставший причиной крупных эпидемических вспышек в ряде стран Юго-Восточной Азии в начале 90-х годов XX века [Albert et al, 1993; Chongra-nguan et al, 1993, Levisalles, 1993; Ramamurthy et al, 1993; Albert, 1994, 1996], является, наряду с V cholerae Ol, признанным вторым этиологическим фактором холеры [Kaper et al, 1995; Faruque et al, 1998; Смирнова. Кокушкин, 2001; Смирнова, 2002] Хотя в данный момент на эндемичных территориях эпидемиологическая ситуация характеризуется преобладанием заболеваний холерой, связанной с V cholerae Ol, вспышки холеры, вызванной вибрионом Ol39 серогруппы, продолжают достаточно часто регистрироваться и по сей день [Raut et а/, 1999; Basu et al, 2000; Kamble et al, 2000]. При этом, активная миграция населения, обусловленная развитием международных торговых отношений и туризма, а также межнациональными конфликтами, значительно повышает риск повсеместного распространения данной инфекции и завоза ее в Россию, а ухудшение социально-экономических условий жизни в нашей стране служит дополнительным фактором, способствующим развитию эпидемических осложнений Учитывая также возрастание угрозы биотерроризма, проведение исследований, посвященных разработке эффективных тестов для детекции V cholerae 0139, представляется несомненно актуальным

Как известно, наряду со способностью сишезировать уникальный по структуре О-антиген [Johnson et al, 1994; Waldor et al, 1994; Bik et al, 1995; Comstock et al, 1995; Kaper et al, 1995; Nandy et al, 1995; Knirel et al, 1997; Смирнова, 2002], Г cholerae 0139 характеризуется наличием капсулы [Weintraub et al, 1994; Смирнова с соавт , 1995; Comstock et al. 1995, Kaper et al, 1995: Смирнова, 2002]. Ввиду потенциальной диагностической и протективной значимости, обе поверхностные структуры новою возбудителя стали предметом пристального внимания многих исследователей Несмотря на использование разнообразных подходов при изучении антигенной специфичности, иммуно- и биохимических свойств капсульного антигена (КАГ) и липополисахарида (ЛПС) V cholerae 0139, остаются открытыми ряд вопросов, связанных с выявлением различий в иммунореактивности отдельных компоненюв эшх субстанций, в частности, липида А ЛПС, и особенностей эпитопной композиции названных антигенов. Немаловажное значение имеет изучение антигенных свойств адгезинов вибрионов, играющих важную патогенетическую роль при холерной инфекции

Особенности антигенной структуры V cholerae 0139 обусловили неэффективность диагностикумов, предназначенных для выявления V cholerae Ol [Albert et а/. 1993, Levisalles, 1993], что предопределило необходимость разработки специфичных, высокочувствительных и экспрессных способов детекции данною возбудителя, среди которых ведущее место заслуженно

занимают иммуподиагностические методы На сегодняшний день для иммунодиагностики холеры, вызванной V cholerae 0139, предложено большое количество поли- и моноклональных препаратов [Мазрухо с соавт, 1994; Щуркина с соавт. 1995; Hasan et al, 1995; Qadri et al, 1995; Ишина, Мазрухо,

1997. Мазрухо. Ишина, 1997, 1998; Федорова с соавт, 1998; Chaicumpa et at,

1998, Ишина, 1999J, однако задача повышения их эффективности и совершенствования технологии получения специфических иммунореагентов представляется весьма важной Так. поликлональные диагностикумы основываются на использовании адсорбированных сывороток против V cholerae 0139 [Мазрухо с соавт , 1994; Shimada et al. 1994; Щуркина с соавт. 1995]. которым присуши такие недостатки, как ни!кая активность после проведения адсорбции гетерологичными микроорганизмами, значительное количество фоновых неспецифических реакций, нестандартность серий и тд. [Финдлей, Эванз, 1990; Г.горов с соавт, 1991; Кэтти. 1991] Одним из путей улучшения качества таких сывороток является отработка методик получения моноспецифических сывороток [Кэтти, 1991: Егоров с соавт, 1991; Janeway, Travers, 1997; Ройт с соавт, 2000], например, в результате использования для иммунизации биопродуцентов химически изолированных антигенов, взамен приготовленных кипячением термостабильных О-антигенов, иммунизация которыми приводит к получению антител с широкой кросс-реактивностью [Мазрухо с соавт , 1994; Shimada et al, 1994: Ломов с соавт., 1995; Щуркина с соавт, 1995; Чеховская с соавт., 2000]. Альтернативным способом повышения качества иммунодиагностических препаратов служит применение моноклональных антител (МКА). обладающих высокой активностью, строгой специфичностью, стандартностью [Кеннет с соавт . 1983; Финдлей, Эванз. 1990; Егоров с соавт.. 1991; Кэтти, 1991]. За рубежом применяется несколько моноклональных диагностических тест-систем для детекции V cholerae 0139 [Hasan et al, 1995; Qadri et a!., 1995; Chaicumpa et a!, 1998], однако в нашей стране аналогичные препараты пока находятся на стадии разработки [Маркина с соавт., 2001; Алексеева с соавт., 2002, 2003] Высокоактивные и специфичные антитела могут быть также использованы в качестве тонкого инструмента иммунохимической характеристики препаратов КАГ и ЛПС, термостабильных О-антигенов и изучения особенностей экспрессии соответствующих лигандов в цельной микробной клетке. Кроме того, как поли-, так и моноклональные иммунореагенты могут найти применение при экспериментальном и производственном выращивании ппаммов-продуцентов антигенов coo I ветствующей химической холерной вакцины для контроля экспрессии основных иммуногенов холерного вибриона 0139 (КАГ. ЛПС, холерного токсина (XT), нейраминидазы (НД), адгезинов) на этапах масштабированного культивирования. Оптимальным было бы внедрение с этой целью быстрых.

, - • Л f ,'ft < <.-•

». , v » t. - '* *

* î <•** .

t î» »

t. i-i

чувствительных, технически простых методов, таких как, например, дот-иммуноанализ (ДИА), с использованием гомологичных поли- и моноклональных антител, взамен недостаточно информативной и малочувствительной реакции двойной иммунодиффузии (РИД) [Ouchterlony, 1953].

Вышеизложенное определило цель и основные задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - иммунохимическая характеристика антигенной структуры капсульных и бескапсульных форм V cholerae 0139 серогруппы и разработка экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для детекции возбудителя и выявления отдельных диагностически значимых и протективных антигенов с использованием поли- и моноклональных антител.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Получить высокоактивные поликлональные серовароспецифические антисыворотки и стабильные при различных вариантах культивирования и хранения гибридные клеточные линии, синтезирующие МКА к отдельным эпитопам КАГ и ЛПС капсульных и бескапсульных вариантов V cholerae 0139.

2 Изучить иммунохимические свойства и молекулярную организацию КАГ, ЛПС и термостабильных О-антигенов V cholerae Ol39, используя поли- и моноклональные антитела, и выявить особенности экспрессии антигенных детерминантов у инкапсулированных и лишенных капсулы V. cholerae 0139, а также у холерных вибрионов других cepot рупп

3. Охарактеризовать иммунореактивность липида А V cholerae Ol 39 в зависимости от наличия или отсутствия капсулы у вибрионов гомологичной серогруппы, а также у некоторых других энтеропатогенных бактерий.

4. Изучить серологическое родство адгезина CFA/I Escherichia coli J53 с факторами адгезии холерного вибриона и ряда других возбудителей кишечных инфекций.

5. Разработать на основе полученных антител экспериментальные диагностические имчуноферментные поли- и моноклональные тест-системы для детекции V cholerae 0139.

6. Показать возможность использования и преимущества дот-иммуноанализа на основе гомологичных антител для контроля синтеза основных иммуногенов V cholerae 0139 (КАГ, ЛПС, холерного токсина, нейраминидазы, адгезина) на 3iane глубинного культивирования штаммов-продуцентов антигенов соответствующей холерной химической вакцины.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые создана клонотека гибридом, синтезирующих МКА к уникальным эпигопам КАГ и ЛПС V cholerae 0139, экспрессия которых различна в химически изолированных антигенах, нативных клетках вибрионов 01, 022 и 0139 cepoipynn, в том числе у бескапсульных и

инкапсулированных форм V cholerae 0139 Впервые с использованием панели поли- и моноклональных антител определена локализация и структура отдельных иммунореактивных компонентов КАГ и ЛПС V cholerae OI 39 серовара. Впервые выявлены и охарактеризованы конкретные эпитопы гликопептидной природы, являющиеся общими для холерных вибрионов OI, 022 и 0139 серо групп Новыми являются данные об иммунореактивности липидного компонента ЛПС, в том числе в зависимости от наличия или отсутствия бактериальной капсулы, и возможности использования липида А V cholerae 0139 и антител к нему в качестве дополнительного таксономическою критерия в дифференциации возбудителей холеры OI и не OI серогрупп. Впервые в препаратах термостабильных О-антигенов V cholerae 01 и 0139 обнаружены локализованные на антигенах полипептидной природы кросс-реактивные эпитопы, возможно обусловливающие перекрестную реактивность получаемых к ним антисывороток. Новыми являются данные об особенностях иммунореактивности препаратов ЛПС V cholerae 0139, выделенных различными методами. Экспериментально доказано наличие серологического родства адгезина CFA/I Е coh J53 и собственных адгезинов холерного вибриона и некоторых возбудителей кишечных инфекций Впервые с помощью МКА установлена способность ряда энтеропатогенных бактерий экспрессировать серологически идентичные эпитопы, предположительно ассоциированные со структурами адгезии и инвазии этих микроорганизмов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ состоит в создании на основе разноэпитопных МКА и поликлональных антител к ЛПС V cholerae 0139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции данного возбудителя холеры независимо от отсутствия или наличия у него капсулы. Разработана многокомпонентная система быстрого и эффективного контроля в ТИФА и ДИА продукции основных иммуногенов V cholerae 0139 на этапе экспериментального и производственного масштабированного культивирования штаммов-продуцентов антигенов новой химической холерной вакцины По материалам диссертации составлены «Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания капсульного антигена и липополисахарида Vibrio cholerae 0139 серовара на этапах экспериментального производства химической холерной вакцины» и «Методические рекомендации по определению адгезина CFA/I у рекомбинантных штаммов холерного вибриона в дот-иммуноанализе». одобренные ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протоколы № 5 от 20 июня 1997 i. и № 1 от 12 марта 1997 г., соответственно) и утвержденные директором института Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций по обшей иммунологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней на курсах специализации врачей и биологов по особо

опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммуноло1 ии и эпидемиологии при РосНИПЧИ «Микроб».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1 Иммунизация биомоделей изолированными биохимическими методами препаратами КАГ и Л ПС V cholerae 0139 позволяет получить поликлональные сыворотки, специфически реагирующие в ТИФА без предварительной адсорбции только со штаммами гомологичной серогруппы.

2. Анти-липид А-антитела у холерных вибрионов разных серогрупп, а также у капсульных и бескапсульных вариантов V cholerae 0139 могут быть использованы в качестве дополнительного критерия внутривидовой дифференциации холерных вибрионов.

3 Собственные адгезины возбудителя холеры обладают серологическим родством с адгезином CFA/I F. coh J53, а V cholerae, Е coli, Yersinia pseudotuberculosis. Yersinia enterocolitica, Shigella flexnert и Salmonella entenhdis экспрессируют идентичные эпигоны, возможно ассоциированные со структурами адгезии и инвазии этих бактерий.

4 Холерные вибрионы Ol. 022 и 0139 содержат ряд кросс-реактивных эпитопов гликопептидной природы с различной реакционноспособностью у представителей указанных серогрупп, а также у инкапсулированных и бескапсульных форм V cholerae 0139, присутствующих также в термостабильных О-антигенах возбудителей холеры обеих серогрупп.

5. Сконструированная на основе серовароспецифических поликлонапьных антител к ЛПС-ТХУ Г cholerae 0139 экспериментальная иммуноферментная тест-система («сэндвич»-вариант) позволяет идентифицировать в зависимости от использованного штамма от 9,4 104 до 1,5 106 м кл./мл соответствующего возбудителя. Разработанные экспериментальные иммуноферментные тест-системы. основанные на применении моноклональных антител («сэндвич», прямой и непрямой варианты), обладают чувствительностью от 7,5-104 до 2,3 106 м.кл./мл холерных вибрионов 0139 серогруппы в различных модификациях анализа.

6 Дот-иммуноанализ на основе полученных поли- и моноклональных антител представляет собой эффективный метод контроля синтеза основных иммуногенов и их отдельных иммунореактивных эпитопов в процессе масштабированного культивирования штаммов Г cholerae 0139 - продуцентов новой химической холерной вакцины.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции Академии Естествознания «Гомеостаз и инфекционный процесс», Саратов, 1996: VII съезде Общества эпидемиологов, микробиолотов и паразитологов. Москва, 1997: 4-ой Международной конференции молодых ученых и студентов. Бишкек. Кыргызстан, 1997; Втором

съезде биохимического общества РАН, Москва. 1997; Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997; Второй Всероссийской конференции «Гомеоста) и инфекционный процесс», Саратов, 1998; Проблемной комиссии по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2002; VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003; Итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2000, 2002, 2003, 2004. ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 работ. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 353 источника, из них зарубежных - 214 Объем диссертации составляет 206 страниц машинописного текста, включая 20 таблиц и 24 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. В работе использовали 73 штамма V cholerae Ol, 0139 и других серогрупп, 36 штаммов бактерий семейств Vibrionaceae и Enterobacteriaceae. 4 рекомбинантных штамма холерного вибриона, несущие плазмиду pCFA/I Е coli J53, и донорский штамм Е coli J53 были любезно предоставлены проф. Н.И Смирновой и к б н Т Л Захаровой. Вибрионы культивировали на агаре Хоттингера, pH 7,6. при 37°С в течение 16-18 ч, остальные бактерии - на агаре Хоттингера, pH 7,2, при 37°С в течение 48 ч Штаммы V cholerae 0139 М045 и Р16064 вырашинали также в реакторе V 500 л РЗРП-6/05 (Россия) в бульоне Хоттингера, pH 7.6, при аэрации с подкормкой глюкозой

При проведении исследований использовали следующие препарагы ЛПС' ЛПС-ТХУ. экстрагированный из нламма V cholerae 0139 Р16064 по методу А Boivin et al (1933). препараты ЛПС, полученные цз культуральной жидкости (КЖ) штамма-продуцента Г cholerae 0139 М045 с использованием технологии ультрафильтраиии. включая 4 серии дополнительно очищенных гель-фильтрацией образцов [Громова с соавт, 1999. 2002], выделенные фракционированием КЖ того же штамма или Г cholerae КМ-137 насыщенным раствором сульфата аммония [Джапаридзе с соавт, 1981], препараты ЛПС V cholerae Ol. изолированные методом А. Boivin et al (1933)

Для иммунизации животных, в качестве .шгандов при изучении специфичности поли- и МКА в твердофазном иммуноферментном анализ (ТИФА), ДИА, иммуноблоте и при проведении электрофореза в полиакрилами том геле с SDS использовали препарат адгезина CFA/I, выделенный и! штамма Е coli J53 по методу DG Fvans et al (1979). КЛГ, изолированный из ипамма С cholerae 0139 Р16064 по методу В И Вейнбла1а с

соавт. (1985); термостабильные О-антигены различных штаммов V cholerae, приготовленные в соответствии с рекомендациями Т Shimada et аI (1994); кипяченые холерные антигены V cholerae О Г О, Инаба и Огава; препараты О-специфических боковых цепей и корового полисахарида ЛПС V cholerae 0139 [Galanos et al, 1969, Захарова, Косенко, 1982]; препарат липида А V cholerae 0139 [Galanos et al, 1971], обработанный ультразвуком [Эльпинер, 1973], препарат НД Г cholerae «Neuraminidase from Vibrio cholerase» («Servan). В работе использовали диагностические О-агглютинирующие сыворотки против различных сероваров энтеропаюгенных вибрионов, адсорбированную О сыворотку против штамма М045 У cholerae 0139, коммерческие диагностические адсорбированные холерные сыворотки и иммуноглобулины диа1 ностические чумные (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов), диагностические сыворотки к возбудителям острых кишечных инфекций (ОКИ) (ЦНИИВС им И И. Мечникова и Ташкентский НИИВС), экспериментальные серии псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных сывороток и стандартную антихолерогенную сыворотку (ГИСК им Л.А Тарасевича). Ряд антигенных препаратов и сывороток были любезно предоставлены проф. М.Н. Джапаридзе, дм.н ИИ. Щуркиной, к.м н. О.В. Громовой, к.м н Т.В Аленкиной и к.б.н. O.A. Фомичевой.

Донорами иммунных спленоцитов и иммуноасцитической жидкости служили мыши инбредной линии BALB/c. Миеломные клетки линии S/?.2/0-Ag.8 были использованы для гибридизации с иммунными спленоцитами по методу G Galfré et al (1977), a Sp 2/0-Ag.l4 - для индукции у гипериммунных мышей асцшической жидкости Культивирование и хранение миеломных и гибридомных клеток осуществляли общепринятым методом [Адаме, 1983]. Селекцию гибридных клеток проводили на среде с добавлением гипоксантина и тимидина.

Скрининг МКА. определение специфичности и активности поликлональных антител и МКА проводили в различных вариантах ТИФА и ДИА. РИД выполняли по методу О. Ouchterlony (1953). Для изучения молекулярной организации и природы комплементарных МКА лигандов применяли метод M Brockhaus et а! (1981) с использованием взвесей нативных и протсолитически обработанных бактерий [Hitchcock. Brown, 1983) Изучение иммунохимических свойств поли- и моноклональных антител осуществляли методом иммуноблотгиша по H Towbin et al (1984). Электрофоретическое разделение антигенов и цельноклеточных лизатов (ЦКЛ) бактерий проводили в 12,5 % полиакриамидном 1еле с SDS по U.K Laemmli (1970) с окраской гелей Coomassie Brilliant Blue R-250 или по методу С М. Tsai and С К Frasch (1982) Иммуноглоб\лины (IgCi) из сыворотки крови, КЖ и асцитической жидкости выделяли осаждением сульфатом аммония [Фримель. 1987]. Конъкм ирование

IgG с пероксидазой хрена (ПХ) («Serva») проводили по методу Р К Nakane and A. Kawaoi (1974) Статистическую обработку полученных результатов осуществляли по И П Ашмарину, А.А Воробьеву (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку одним из путей получения специфических сывороток является использование химически изолированных антигенов [Ишина с соавт. 1994; Sengupta el al, 1996. Федорова с соавт , 1996, 1997. 2004; Martinez-Govea el al, 2001; Абрамова с соавт, 2002; Громова с соавт 2002], первоначально мышам линии BALB/c вводили препарат ЛПС-ТХУ V cholerae 0139. Для отработки схемы иммунизации, позволяющей добиться максимального титра антител, варьировали дозу антигена, кратность его введения, интервал между прививками и количество циклов иммунизации. Оптимальным оказалось 4-кратное внутрибрюшинное введение ЛПС-ТХУ в дозе 25-50 мкг с 2-недельным интервалом, которое уже после первого цикла иммунизации приводило к индукции сывороточных антител к гомологичному антигену в наибольшем тигре - 1 "86016+30223. Эту же схему использовали для изучения иммунореактивности препаратов ЛПС, выделенных другими методами. Все они оказались способными вызывать выработку специфических антител в значительных титрах При этом, мышиные антисыворотки к ЛПС-ТХУ и препаратам ЛПС, очищенным гель-фильтрацией, специфически реагировали в ДИА только с вибрионами гомологичного серовара без дополнительной адсорбции, выявляя 7,5 1 08-3 1 09 м.кл /мл штамма М045.

Применение КАГ для иммунизации мышей было не менее эффективным. Антикапсульные сыворотки, полученные после 2 циклов иммунизации, состоящих из 5 внутрибрюшинных инъекций 25-50 мкг КАГ с интервшюм 2 недели, реагировали в непрямом ТИФА с исходным антигеном в титре 1'86016±30223 и взаимодействовали только с цельными м.кл Г cholerae 0139 в концентрации не менее МО4 м.кл./мл

Иммунореактивными оказались как углеводный, так и белковый компоненты препаратов ЛПС и КАГ. При иммунизации ЛПС-ТХУ выработка антител происходила преимущественно к белковой части препарата, тк в «сэндвич»-ТИФА значения оптической плотности образцов ЛПС-ТХУ и м кл. V cholerae 0139, лишенных белка, были в 1,3-4 раза меньше, чем образцов, содержащих белок. Специфический титр ангикапсульных антител при взаимодействии с нативным и депротеинизированным КАГ оставатся на сходном уровне.

На блоттограмме антител к ЛПС-ТХУ с нашвным гомологичным антигеном визуализировались зоны специфического взаимодействия с быстро- и медленномигрирующим углеводными компонентами и двумя белковыми полосами с молекулярной массой (м.м.) 53.7±2 и 36,3+2 кДа. В иммуноблоте

нативных ЦКЛ 22 штаммов V сИокгае 0139. выделенных в разное время от больных холерой, с антисывороткой к ЛПС-ТХУ во всех образцах обнаруживались отчетливые зоны специфического взаимодействия с указанными белками и быстромигрирующими углеводными компонентами без существенных различий между отдельными цламмами. На блоттограмме депротеинизированных ЦКЛ обнаруживались некоторые штаммовые отличия в экспрессии иммунореактивных углеводных компонентов. Зоны специфического взаимодействия антител к ЛПС-ТХУ с термостабильными О-антигенами соответствующих штаммов оказались существенно меньше по размеру и интенсивности окрашивания по сравнению с таковыми во фракционированном препарате ЛПС-ТХУ, что, вероятно, связано с частичной деградацией специфическою полисахарида в процессе кипячения [Федорова с соавт., 1996]. Антитела к ЛПС-ТХУ не реагировали с кипяченым О-антигеном V сИокгае 022. Ведущую роль в определении специфичности препарата ЛПС-ТХУ играли О-специфические боковые цепи, поскольку в «сэндвич»-'ГИФА с использованием изолированных из данного препарата кора и О-цепей специфическая реакция антител к ЛПС-ТХУ отмечалась только с последними.

Учитывая мнение о том, что КАГ Г сИо!егае 0139 возможно представляет собой конденсированные О-полисахаридные цепи ЛПС [\Valdor е! а1, 1994], изучали способность антикапсульных антител реагировать с препаратом ЛПС-ТХУ В непрямом ТИФА с данным ангшеном регистрироватся несколько меньший титр (1 20480-1'40960), чем с КАГ, что указывает на различия в иммунореактивности углеводных компонентов капсулы и ЛПС, несмотря на их очевидное серологическое сходство. Для выявления конкретных кросс-реактивных компонентов ЛПС и КАГ осуществляли постановку иммуноблота препарата ЛПС-ТХУ с ашикапсульной сывороткой. На блоттограмме визуализироватись две диффузные углеводные зоны в верхней и нижней частях блоттограммы В то же время препараты ЛПС и КАГ Г сИокгае 0139, очевидно, были иммунохимически неидентичными и содержати индивидуальные антигенные детерминанты белковой природы, специфичные для каждого из указанных анттенов. поскольку на блоттограмме антикапсульных антител с ЛПС-ТХУ отсутствовало взаимодействие с белковыми компонентами препарата. В иммуноблоте с антикапсульной сывороткой у штаммов, формирующих капсулу, и бескапсульных форм были выявлены различия, связанные как с белковыми, так и с углеводными компонентами

Следующим этапом исследований стало изучение серологической иммунореактивности и иммунохимических свойств липида А V сИокгае 0139, обработанного ультразвуком в режиме, оптимальном для работы с биомолек\лами класса чипидов В полик юнальных мышиных сыворотках к ЛПС-ТХУ и КАГ реакционноспособные антитела к липиду А не

обнаруживались, о чем свидетельствовала отрицательная реакция с препаратом липида А в непрямом и «сэндвич»-вариантах ДИА. В то же время было обнаружено присутствие анти-липид А-антител во всех тестированных поликлональных сыворотках к холерным вибрионам не 01 серо группы из коллекции Я Закагаки так как они специфически взаимодействовали в непрямом ДИА с липилом А V сИокгае 0139 При этом отмечалась различная интенсивность окрашивания пятен специфической реакции, что было обусловлено, вероятно, неодинаковым количеством анти-липид А-антител в сыворотках, ввиду разной степени демаскировки детерминантов липида А варьирующими по длине О-боковыми цепями вибрионов не 01 серогруппы [Ыапс)у е1 а!. 1995] Слабоположительная реакция в ДИА липида А с РО-сывороткой, вероятно, демонстрировала близость антигенной ор1анизаиии ЛПС Я-форм Г сИокгае О! и неагглюшнирующихся вибрионов Отсутствие реакции данного препарата с холерными О. Инаба и Огава сыворотками подтверждало предположение об экранировании детерминанте липида А полисахаридными компонентами ЛПС - полностью у I'сИокгае О! и частично у V сИокгае не 01. В непрямом ДИА отмечалась положительная реакция с сыворотками протеус (ОВ и ОС) и кишечноиерсиниозной антисывороткой, тогда как с эшерихиозными (ОКА, ОКС, ОКД. ОКЕ), сапьмонеллезными (О и холера суис), брюшно-тифозной. шигеллезными (Зонне и Флекснера). псевдотуберкулезной сыворотками и чумными адсорбированными иммуноглобулинами специфического взаимодействия не регистрировалось.

Изучение антигенных свойств препарата липида А показало, что он способен индуцировать у мышей ВАЬВ/с при 5-кратном внутрибрюшинном введении 10-15 мкг с 2-недельным интервалом специфические антитела в титре 1-3200-1 "6400 Полученные антитела взаимодействовали с препаратами ЛПС-ТХУ и КАГ V сИокгае 0139, указывая на присутствие в них соотиетствуюших детерминантов Анти-липид А-антитсла взаимодействовали в ДИА с вибрионами бескапсулыюй формы в титре, превышающем в 5 раз таковой в реакции с инкапсулированной формой, что, вероятно, связано с экранированием ашигенных структур липида А полисахаридными компонентами капсулы. При изучении специфичности анти-липид А-антител с использованием цельных м.кл. V сИокгае 01, 0139 и не О! в непрямом ДИА было установлено, что специфическое взаимодействие отмечалось, кроме штаммов гомоло! ичного серовара, лишь с некоторыми вибрионами не 01 серогруппы.

С целью анализа эпитопного строения ЛПС и КАГ V сИокгае 0139. а также выявления ассоциированных с ними детерминантов в цельных клетках V сИокгае, была генерирована панель гибридом - продуцентов разноэпитопных МКА Для гибридизации с миеломными клетками использовали епденоцты

мышей BALB/c, гипсриммунизированных КАГ (2 фузии) и цельными м кл

V cholerae 0139 (2 фузии). В результате слияния были получены гибридные клоны, синтезирующие МКА, реакционноспособные в ТИФА с цельными м кл

V cholerae 0139 и ЛПС-ГХУ, из которых после клонирования по результатам скрининга было отобрано 22 клона с максимальной продукцией МКА Все клоны приживались в организме сингенных биомоделей, однако объем асцитической жидкости, полученной от одной мыши, и количество содержащихся в ней клеюк существенно варьировали Наибольшие значения одновременно обоих показателей обнаруживались у клонов 5D3, 13D8, 14D8. 5G6 и 1В7. МКА большинства из 22 изучаемых клонов (36,4 %) реа1ировали в непрямом ТИФА с инкапсулированной формой V cholerae 0139 в более высоком титре, чем с бескансульной (ipyniia I) МКА II 1руппы (31,8 %) активнее взаимодействовали с бескапсульной формой В III группу (31,8 %) объединили МКА, которые связывались с обеими формами в одинаковом гитре Для дальнейшей иммунохимической характеристики было отобрано 4 клона i ибридом. отличавшихся наилучшими ростовыми свойствами в организме биопродуцентов, из которых 2 относились к I tруине (5D3 и 1В7) и по одному ко II (14D8) и III (5G6) группам. Указанные линии гибридных клеток после криоконсервирования сохраняли опухолеродность и антителообразующую способность, которые стабилизировались к III и к V пассажу т vivo. соо i ветственно.

Было установлено, чю МКА 4 полученных клонов узнавали термостабильные эпитопы гликопептидной природы, по-разному экспонированные на поверхности клеток инкапсулированных и бескапсульных вариантов вибрионов Г cholerae 0139. Как видно из табл 1, МКА 5D3 менее активно связывалось со всеми протеолитически обработанными лигандами (м кл V cholerae Ol 39 и изолированными из них антигенами) по сравнению с нативными субстанциями, и следовательно, узнавало эпитоп гликопептидной природы. Интенсивность связывания трех остальных МКА с препаратом КАГ до и после протеолиза оставалась на сходном уровне, а реакция с нативными цельными м.кл Г cholerae Ol 39 была более интенсивной, чем с протеолитически обработанными, что предполагало различную структурную организацию эпитопов в молекулах очищенных антигенных препаратов и нативной клетке [Мештер, 1980; Блинов, 1989] Взаимодействие всех МКА с кипяченым О-антигеном cholerae 0139 свидетельствовало о термостабильном характере комплементарных лш андов.

При проведении иммуноблоттинга каждого из полученных МКА с использованием нативных и протеолитически обработанных антигенов капсульных и бескапсульных вариантов V cholerae 0139, удалось выявить конкретные иммунореактивмые компоненты препаратов ЛПС и КАГ Г cholerae 0139 1ак. в организации ашшеннот дегерминаша, комплементарного МКА

Таблица 1

Особенности взаимодействия МКА в непрямом ДИА с антигенами и цельными клетками V сИокгае 0139 в зависимости от способа их обработки

Лиганды (антигены и Способ Реакция с МКА клонов

вибрионы) обработки 503 1В7 1408 5С6

КАГ Н ++ 1 + + +

П + + + +

ЛПС-ТХУ Н ++ 1 + | - -

п + + - -

ЛПС-КМ137 н ++ + - -

II + + - -

Цельные м кл V сИокгае 0139 Н ++ 1++ ++ ++

п + + + +

О-антиген V сИокгае 0139 Кипячение + + + +

Н - нативный образец, П - образец, обработанный проназой К

503, вероятно, принимали участие компоненты липида А-кора О-боковых цепей ЛПС и белки, предположительно локализованные на наружной клеточной стенке Г с!ю!егае 0139 МКА 1В7 оказалось направлено к эпитопу, сформированному преимущественно моносахаридами О-специфического полисахарида и внешнего кора Детерминанты, комплементарные МКА 1408 и 506. были образованы полисахаридными компонентами КАГ. Изучение биосинтеза соответствующих эпитопов м кл. вибрионов 0139 серогруппы продемонстрировало различия в структурной организации антигенных детерминантов, узнаваемых МКА, в ^

молекулах очищенных антигенов и нативных м кл В иммуноблоте нативных ЦКЛ штамма V сИокгае 0139 Р16064 с МКА 5ЭЗ, 1408 и 5в6 отмечалось взаимодействие с углеводными компонентами разной конфигурации и /

локализации, соответствующими расположению' структур специфического ®

полисахарида и внешнего кора ЛПС [Мас1п1уге е/ а!, 1986: Книрель. Кочетков. 1993]. а также широким спектром белков с м м 28-79±2 кДа На блоттограмме ЦКЛ V сИо!егае 0139 и МКА 1В7 выявлялись только белковые полосы Углеводный компонент, узнаваемый МКА 1В7 в химически выделенных антигенах, в нативном лизате, по-видимому, экранировался белками, т к в депротеинизированном образце отчетливо проявлялась низкомолекулярная углеводная зона Аналогичные результаты были получены в иммуноблоте протеолитически обработанных ЦКЛ того же штамма и МКА 5ОЗ. 1408 и 506. Во всех случаях сохранялась реакция с утлеводными компонентами, однако мегсгрофоретическая подвижность и конфигурация последних заметно изменялась Следовательно, в организации комплементарных МКА эпигонов в

цельной м кл V сИокгае 0139 важную роль играет бел ково-полисах аридная ассоциация Методом иммуноблота удалось выявить также различия в антигенной структуре капсульных и бескапсульных вибрионов 0139 серогруппы. МКА I группы (503 и 1В7) отличались от МКА других групп способностью реагировать с низкомолекулярной углеводной зоной депротсинизированного ЦКЛ. МКА II группы (1408) выявляло в протеолигически обработанном лизате среднемолекулярный углеводный фрагмент В аналогичном образце МКА III группы (506) визуализировало как низко-, гак и среднемолекулярный компоненты Кроме того, в отличие от МКА других групп, МКА I группы связывались с меньшим количеством белков нативного лизата штамма V сИокгае 0139.

Все МКА обладали различной иммунореактивностью в ТИФА (табл. 2).

Иммунохимическая характеристика кросс-реактивных компонентов, экспонирующих комплементарные МКА эпитопы. у наиболее близких в антигенном отношении бактерий - холерных вибрионов 01 и 022 серогрупп. показала что исследуемые антигенные детерминанты у них имеют различную организацию. В нативном ЦКЛ штамма V сИокгае 01 МКА 503 визуализироваю 3 белка, взаимодействие с которыми от мечалось и у V сИокгае 0139, а также углеводный фрагмент, не отличавшийся по локализации от такового у V сИокгае 0139. но больший по размеру, что указывало на сходную организацию характеризуемого эпитопа у возбудителей холеры обеих серогрупп В депротеинизированном ЦКЛ сохранялось взаимодействие только с низкомолекулярным углеводным компонентом, конфигурация которого существенно отличаюсь от таковой у V сИокгае 0139 На блоттограммах МКА 1В7 и нативных ЦКЛ V сИокгае 01, как и 0139, отмечалось взаимодействие исключительно с белковыми полосами. Общих белков, содержащих узнаваемый данным МКА эпиюи, у представителей разных серогрупп не обнаруживаюсь. В депротеинизированном образце зоны специфического взаимодействия отсутствовали, что демонстрировало ведущую роль белкового компонента в организации эпитопа, узнаваемого МКА 1В7, в клетках V сИокгае 01. У Г сИокгае 022 антигенный детерминант, комплементарный МКА 503, оказался экспонированным на низкомолекулярном углеводном компоненте, соогветствующем консервативной у большинства патогенных бактерий зоне кора-липида А [Мас1туге е/ а/, 1986; Книрель, Кочетков. 1993] Эпитоп. узнаваемый МКА 1В7, был ассоциирован у V сИокгае 022 исключительно с белками Отсутствие реакции МКА I группы с холерным вибрионом 022 серогруппы в ТИФА, очевидно, объясняется недоступностью соответствующих дегерминантов для взаимодействия с антителами вследствие маскировки О-полисахаридными цепями и/или слабой их экспрессией на поверхности цельной м кл Иммуноблотгинг нативного лизата м.кл V сИокгае 01 с МКА 1408 оказагся весьма схожим с таковым V сИокгае 0139. хотя отмечались

Таблица 2

Специфичность МКА к ЛПС и КАГ V cholerae 0139 в непрямом ТИФА

Штамм бактерий KO.I-BO Реакция с МКА клонов

штаммов 5D3 1В7 14D8 5G6

V cholerae 0139 22 + + + + i 1

Г cholerae Ol 8 + + + +

V cholerae R0 1 - - + + !

V cholerae 022 1 - - + +

V alginolyticus 1 - - - +

V parahaemolyticus 1 - - + +

Е coll - + + + 1

S flexneri 1 - + +

S sonnet 1 - + +

S typhi 1 - - + -

S paratyphi 1 - - +

S enteritidis 1 - - +

P vulgaris 1 - - - -

Y pseudotuberculosis 1 - + - -

Y enterocohtica 1 - + - -

некоторые различия по белковому спектру У использованного в работе штамма V cholerae 022 данное МКА выявляло как общие с холерными вибрионами 01 и 0139 серофупп, так и индивидуальные полипешиды, а 1акже углеводный фрагмент Блоттограммы МКА 5G6 с нативными лизатами m.k.i V cholerae OI и 022 незначительно отличались друг от друга по числу белковых полос. Углеводные же компоненты были почти иденшчными как между собой, так и с углеводным профилем депротеинизированного лизата штамма V cholerae 0139 Образцы i' cholerae 01, 0139 и 022 после протеолиза также демонстрировали сходный иммуноблоттинг. Это указывало на практически одинаковую организацию эпитопа. комплементарного МКА 5G6, у V cholerae указанных ceporpyrm. подтверждая тесные антигенные взаимосвязи между ними [Shimada, Sakazaki, 1977; Shimada et al. 1994; Алексеева с соавт., 2002].

Все 4 кросс-реактивных эпитопа были обнаружены в препаратах термостабильных О-антигенов V cholerae 01 и 0139, что, возможно, объясняет перекрестную реактивность и необходимость адсорбции сывороток после иммунизации биопродуцентов приготовленными кипячением О-антигенами холерных вибрионов [Saka/aki et al, 1970, Адамов, Наумшина. 1981; Щуркина.

1981; Shimada el al, 1994]. По данным иммуноблоттинга в организации этих эпитопов участвовали термостабильные антигены полипептидной природы.

Анализ блоттограмм МКА IB7, реагировавшего в 1ИФА с м.кл иерсиний и Е coll, и ЦКЛ штаммов У enterocolitica, У pseudotuberculosis, Е coh, S enteritidis и S flexneri показал, что большая часть реакционноспособных белков обладали мм, которая соотвезствовала, по данным литературы [Sansonetti, 1992, Kaniga el al, 1995; Perry, Fetherston, 1997; Сомов с соавт., 2001. Ценева с соавт . 2002], известным белкам, вовлеченным в реализацию функции адгезии и инвазии указанных микроорг анизмов

Для изучения сероло! ических связей адгезина CFA/1 кишечной палочки с собственными адтезинами холерных вибрионов и некоторых энтеропатогенных бактерий, были получены мышиные поликлональные сыворотки к адгезину CFA/I Их применение оказалось эффекгивным для оценки экспрессии соответствующего антигена рекомбинантными штаммами V cholerae - в непрямом ДИА анти-СРА/1-антитела реагировали с Е coh J53 и штаммами V cholerae, несущими гены cfal, но не взаимодействовали с исходными штаммами, лишенными cfal. В то же время, отмечался значительный процент положительных реакций с другими штаммами V cholerae 01 (80 %). V cholerae не 01 (78 %). Е colt (50 %), .S' sonnei (75 %), У pseudotuberculosis (67 %) и У enterocolitica (100 %).

В иммуноблоте препарата адгезина CFA/I с гомолог ичными антителами наряду с двумя белками с мм. 26.3±2 и 45.7+2 кДа, которые также обнаруживались в )лектрофорети чески разделенном CFA/I, визуализировались диффузные зоны в верхней, средней и нижней частях блоггограммы. характерные для углеводных компонентов грамнегативных бактерий [Maclntyre et al, 1986; Книрель, Кочетков, 1993]. Для блокировки иммунореактивных эпитопов ЛПС в конкурентном ДИА использовали холерную О сыворотку Экспрессия адгезина отмечалась не только у всех штаммов со встроенной плазмидой pCFA/I. но и у исходного штамма V cholerae 569В. а также других представителей V cholerae 01 и 0139 серогрупп, что свидетельствовало о наличии у них антигенных структур, серологически сходных с CFA/I. В иммуноблоте обращало на себя внимание заметное различие спектра иммунореактивных структур у V cholerae Ol и 0139 серогрупп, а также \ разных штаммов этих серогрупп, и штаммовьге различия в размере, интенсивности и локализации углеводных компонентов В ЦКЛ У pseudotuberculous было обнаружено четьгре белковых полосы, а также углеводные фрагменты в средней и нижней частях блотгограммы. После блокировки холерной О сывороткой перед обработкой специфическими антителами спектр иммунореактивных компонентов заметно изменялся, что подтверждало наличие в пу те анти-CFA/l-антител, антител к консервативным

структурам ЛПС, общим для всех грамнегативных бактерий [Яровая, Алешкин, 1991; Книрель, Кочетков, 1993]

Полученные нами поликлоначьные антитела и МКА были использованы в качестве иммунореагентов при конструировании экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для детекции капсульных и бескапсульных форм V cholerae 0139. Для разработки пол и клепального диагностикума использовали антитела к ЛПС, определяющему сероваропринадлежность вибрионов [Shimada. Sakazaki, 1977; Kaper et al, 1995] и синтезируемому независимо от наличия или от сутствия капсульного вещества Оптимальным вариантом тест-системы оказался «сэндвич»-ТИФА, с применением в качестве первых антител («подложки») и вторых антител (меченного ПХ конъкмага) IgG изогенных гипериммунных животных - мыши или кролика Метод демонстрировал строгую специфичность по отношению к Г cholerae 0139. Его чувствительность составляла 9,4 I04-I,5 I06 м.кл./мл при тестировании 22 штаммов V cholerae 0139, выделенных из различных источников.

При создании моноклонапьных тест-систем на основе каждого из четырех МКА было разработано три модификации иммуноферментных тестов -

1) «сэндвич»-ТИФА, с использованием в качестве первых антител IgG, выделенных из холерной О сыворотки или из поликлональных мышиных антисывороток к ЛПС-ТХУ, и меченных ПХ МКА - в качестве вторых антител,

2) непрямой, с применением МКА и коммерческою иммунопероксидазного конъюгата против мышиных IgG. и 3) прямой на основе МКА, меченных 1IX. Наименее чувствительным при этом оказался непрямой вариант ТИФА, позволявший выявлять не менее 2,3 106 м.кл./мл V cholerae 0139 при использовании всех МКА. Наибольшей же чувствительностью характеризовался «сэндвич»-ТИФА на основе МКА 5D3, который обнаруживал ог 7,5 104 до 1,2 105 м.кл./мл в зависимости от использованной «подложки» - антител к ЛПС-ТХУ в первом случае и IgG из О сыворогки во втором.

Поскольку ЛПС и КАГ являются не только диагностически значимыми, но и протективными антигенами [Sengupta et al. 1996; Федорова с соавт, 1997; Kossaczka et al, 2000). представляло интерес применение разработанных тест-систем для контроля синтеза основных иммуногенов при глубинном культивировании производственных штаммов Г cholerae 0139 - продуцентов компонентов соответствующей химической вакцины, разрабатываемой в РосНИПЧИ «Микроб» Применение «сэндвич»-ГИФА на основе поликлонатьных антител к ЛГ1С-1ХУ позволяло определять изучаемый антиген в предварительно обеззараженных почасовых пробах бульонной культуры (ПБК) штаммов (' cholerae 0139 PI6064 и М045 даже при огноситсльно невысокой концентрации бактерий (10 млрд/мл), когда регламентированный способ

определения данного антигена (РИД с О сывороткой) был неэффективным, а также выявлять динамику увеличения концентрации ЛПС в ходе выращивания Однако более рациональным представлялось применение ДИА, преимущества которого связаны с возможностью при фиксации образцов на НЦМ 96° этанолом осуществлять одновременное обеззараживание ПБК и выполнять анализ непосредственно после забора ПБК из реактора, т.е осуществлять мониторинг масштабированного культивирования. Нами были предложены варианты ДИА, основанные на использовании поликлональных антител различной специфичности, в частности для выявления ЛПС. КАГ, холерного токсина (ХТ), НД, адгезина, присутствие которых определяет эффективность химической холерной вакцины [Джапаридзе с соавт, 1996; .ктвоп е1 а/, 1996]. Динамика изменения их концентрации отражена на рис. 1.

Рисунок 1 Динамика изменения в процессе глубинного культивирования штамма М045 V cholerae 0139 концентрации мои некоторых иммуногенов I - XT, II - ЛПС (непрямой ДИА с адсорбированной О сывороткой), III - ЛПС (непрямой ДИА с поликлональными антителами к ЛПС-ТХУ), IV - адгезина, V - КЛГ. VI -нейраминидазы, VII - микробном концентрации

Не менее успешным явилось использование МКА в ДИА для изучения закономерностей экспрессии комплементарных им эпитопов основных иммуногенов V cholerae 0139 Максимальное содержание антигенного детерминанта ЛПС Г cholerae 0139, распознаваемого МКА 5D3,

регистрировалось в логарифмическую фазу роста культуры с последующим снижением к концу стационарной фазы Концентрация эпитопа КАГ, узнаваемого МКА 506, нарастала, достигая максимума к концу выращивания. Для антигенного детерминанта структур адгезии V сИо!егае 0139, выявляемого МКА 1В7, было характерно умеренное увеличение содержания в ПБК к началу стационарной фазы роста. Эпитоп КАГ, комплементарный МКА 141)8, максимально экспрессировался в середине 1о§-фазы Характерные изменения концентрации соответствующих эпитопов позволяли судить об особенностях накопления иммунореактивных субстанций в ходе реакторного выращивания производственных штаммов.

Таким образом, в результате проведенных исследований по изучению антигенной структуры V сИокгае 0139 с использованием поли- и моноклональных антител был выявлен ряд иммунохимических особенностей, частично изучена молекулярная организация и эпитопная композиция его основных диагностически значимых антигенов - ЛИС и КАГ, а также решен некоторые вопросы, связанные с разработкой серовароспецифических диагностических тест-систем и методов контроля продукции иммуногенов штаммами-продуцентами компонентов химической вакцины против V сИокгае 0139.

ВЫВОДЫ

1 Оптимизированы схемы иммунизации инбредных мышей линии ВАЬВ/с экстрагированными из V сИокгае 0139 различными методами препара[ачи ЛПС и выделенным из культуральной жидкости препаратом КАГ, обеспечивающие получение поликлональных алтисывороток с высоким титром ангтел, специфически взаимодействующих только с холерными вибрионами 0139 серогруппы и юмологичными антигенами без дополнительной адсорбции.

2 Генерирована панель стабильных при различных вариантах хранения гибридом, продуцирующих МКА к различным эпитопам ЛПС и КАГ V сИокгае 0139, изучены иммунохимические свойства МКА, природа и особенности молекулярной организации комплементарных им лигандов.

3. С использованием полученных поли- и моноклональных антител охарак1еризованы иммунореактивные углеводные и белковые составляющие препаратов ЛПС и КАГ Г сИокгае 0139, установлена иммунохимическая неидешичность указанных антигенов, а также выявлены различия в экспрессии реакционноспособных компонентов в химически изолированных антигенных субстанциях и нативных цельных клетках вибрионов данного серовара

4. Определено дифференциально-диагностическое значение анти-липид А-ангшел у холерных вибрионов различных серофуип, а также у капсульных и бескапсульных форм Г сИокгае 0139.

5 С помощью панели моноклональныч антител в иммуноферментном аначизе и иммуноблоттинге выявлено по крайней мере четыре общих эпитопа iликопептидной природы у V cholerae Ol, 022 и ОП9 Данные эпитопы неодинаково экспрессируются у холерных вибрионов указанных серогрупп, а также у инкапсулированных и бескапсульных вариантов V cholerae 0139 Те же кросс-реактивные эпитопы. локализованные на антигенах полипептидной природы, обнаружены в термостабильных О-антигенах V cholerae Ol и 0139

6 Установлено серологическое родство собственных адгезинов холерного вибриона и адгезина CFA/1 Е coli J53, а также показано наличие у ряда близкородственных и отдаленных в таксономическом отношении бактерий серологически сходных структур с потенциально адгезивными свойствами.

7 Продемонстрирована эффективность применения полученных поли- и моноклонапьных антител в ГИФА и ДИА и их преимущество перед регламентированным методом контроля для качественного определения и изучения динамики продукции основных иммуногенов Г cholerae 0139 при глубинном культивировании штаммов-продуцентов антигенов для соответствующей химической холерной вакцины

8 На основе серовароспецифических поликлонатьных антител к ЛПС-ТХУ Г cholerae 0139 сконструирована и успешно апробирована экспериментальная иммуноферментная тест-система («сэндвич»-вариант) для детекции в зависимости от использованного штамма от 9,4 104 до 1.5 10б м.кл./мл соответствующего возбудителя Разработано также несколько модификаций иммуноферментных тест-систем («сэндвич», прямой и непрямой варианты), основанных на применении МКА, с чувствительностью различных вариантов анатизаот7,5 104до2,3 Юбмкл/мл V cholerae 0139

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

(.Федорова В.А., Джапаридзе МН, Громова О.В., Девдариани З.Л, Мелещенко М.В., Тсрсшкина Н.Е, Сырова H.A., Киреев М.Н. Применение дот-иммуноанализа для определения содержания нейраминидазы при аппаратном кулыивировании Vibrio cholerae 0139 серовара// Тез. докл. Междунар. конфер. Акад Естествозн. «Гомеостаз и инфекц. процесс» - Саратов, 1996.-С 265.

2 Терешкина Н.Е., Федорова В.А, Громова О.В, Девдариани З.Л. Кинетика образования антител к капсульному антигену Vibrio cholerae 0139 серовара / Рос. науч -иссл. противочумн. ин-т «Микроб» - Саратов, 1996. - 8 с. -Библиогр.: 14 назв.-Рус. - Деп В ВИНИ IИ 04.11.96. № 3209-В96.

3 Федорова В А, Терешкина Н.Е, Громова О В.. Девдариани 3 Л Иммунореактивность канс>льно!о антигена Vibrio cholerae 0139 серовара // Maiep VII съезда Всероссийск общества эпидемиол , микробиол. и паразитол. (28-31 янв. 1997 г.). - Москва 1997.-Т. 1.-С. 312-313

4 Федорова В Л., Громова О.В., Девдариани 3 Л, Аленкина Т.В. Терешкина НЕ Специфическая активность антител к капсульному антигену Vibrio cholerae 0139 серовара // Там же. - С. 313-314.

5 Федорова В.А., Терешкина Н.Е., Джапаридзе М Н , Громова О.В . Сырова НА, Мелещенко МВ, Девдариани 3 Л., Киреев МН Определение продукции нейраминидазы при производстве химической холерной вакцины методом дот-иммуноанализа (ДИА) // 4-я Международн конфер молодых ученых и студентов (23-25 апр. 1997 г.). - Бишкек, Кыргызстан, 1997. - С. 23.

6 Федорова В А.. Громова О В , Девдариани З.Л., Герешкина Н Е , Киреев МН Антигенные свойства липида A Vibrio cholerae 0139 серовара // Второй съезд биохимич. общества РАН (19-23 мая 1997 г.). - Москва, 1997 - С. 365-366.

7 Федорова В.А., Терешкина H.F., Громова О В , Девдариани З.Л , Джапарицзе М Н , Киреев М Н.. Солодовников Н С., Аленкина Т.В Эпитопный анализ липида A Vibrio cholerae 0139 серовара / Рос науч -иссл противочумн. ин-1 «Микроб» - Саратов, 1997 - 7 с. - Библиогр ■ 9 назв - Рус - Деп В ВИНИТИ 23.05 97, № 1700-В97

8 Федорова В.А., Терешкина Н Е., Громова О В , Девдариани 3 Л , Белякова Н И., Доброва Г В . Елисеев Ю Ю., Джапаридзе М.Н., Киреев М Н Применение дот-иммуноанализа для контроля синтеза основных иммуногенов Vibrio cholerae 0139 серовара при его глубинном культивировании / Рос науч -иссл противочумн. ин-т «Микроб» - Саратов, 1997 - 10 с. - Библиогр: 16 назв. - Рус - Деп. В ВИНИТИ 24 11 97, № 3446-В97.

9 Сырова Н А , Федорова В.А., Девдариани 3 Л , Терешкина Н.Е., Захарова Т Л . Джапаридзе М.Н. Определение продукции адгезинов у штаммов Vibrio cholerae с встроенным геном адгезии Е coh J53 (CFA1) в дот-иммуноанализе // Матер научно-практич конфер, посвящ. 100-летию образования противочумн службы России (16-18 сент 1997 г) - Саратов, 1997. - Т 2 -С 32

10 Федорова В А.. Громова О В., Девдариани З.Л., Терешкина НЕ., Солодовников Н С , Джапаридзе М Н Детекция штаммов Vibrio cholerae 0139 в иммуноферментном и дот-иммуноанализе // Там же - С 228-229.

11 Федорова В А., Терешкина Н Е.. Громова О.В , Девдариани 3 Л Анти-липид A-антитела как дополнительный критерий дифференциации Vibrio cholerae 01 и не OI серогрупп // Там же - С. 231

12 Терешкина Н.Е , Федорова В.А , Громова О.В . Девдариани З.Л.. Сырова НА, Белякова Н.И . Доброва Г В.. Джапаридзе МН, Елисеев Ю.Ю Дот-имм\ноанализ - эффективный метод контроля продукции антигенов при культивировании Vibrio cholerae 0139 серовара // Там же - С 275

13. Федорова В.А. Сырова Н.А, Громова О В, Терешкина НЕ. Девдариани 3 Л , Джапаридзе М II. Доброва Г В , Белякова НИ, Елисеев Ю.Ю Разработка нового метода контроля синтеза основных иммуногенов на этапах

12. Терешкина Н.Е., Федорова В А., Громова О.В., Девдариани ЗЛ, Сырова H А., Белякова Н.И., Доброва Г В , Джапаридзе М.Н , Елисеев Ю Ю Дот-иммуноанализ - эффективный метод контроля продукции антигенов при культивировании Vibrio cholerae 0139 серовара // Там же. - С. 275.

13. Федорова В.А., Сырова Н.А., Громова О.В., Терешкина Н.Е, Девдариани 3 Л , Джапаридзе М.Н , Доброва Г В., Белякова Н.И., Елисеев Ю Ю. Разработка нового метода контроля синтеза основных иммуногенов на этапах производства оральной химической холерной вакцины // Матер Второй Всеросс конфер. «Гомеостаз и инфекционный процесс». - Саратов, 1998. - С. 69.

14. Девдариани З.Л., Федорова В.А., Ермаков Н.М., Терешкина Н.Е., Сырова НА., Грашкин В А Перспективы использования линейных мышей для производства диагностических иммуноглобулиновых препаратов // Матер, юбилейн. научн. конфер., посвящ 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Диагн, лечение и профилакт. опасн. инфекц. забол. Биотехнология. Ветеринария». - Киров, 1998. - С. 81-82.

15. Федорова В.А., Терешкина НЕ, Громова О.В., Сырова Н.А., Девдариани 3 Л , Ермаков Н.М, Белякова Н.И., Доброва Г В., Елисеев Ю.Ю., Джапаридзе М.Н. Новые методы контроля синтеза иммуногенов при производстве химической вакцины против холеры, вызванной Vibrio cholerae 0139 II Биотехнология. - 1999. - № 2. - С. 82-88.

16. Feodorova V.A., Gromova O.V., Devdariani Z.L., Dzhaparidze MN, Teryoshkina N.Y. Immuunochemical characterisation of Vibrio cholerae 0139 О antigens and production of a diagnostic antiserum without absorption // Journal of Médical Microbiology.-2001 - Vol 50. -№ 6. - P. 499-508.

17 Терешкина НЕ, Громова О.В., Федорова В А, Девдариани ЗЛ, Киреев M H Иммунореактивность липополисахаридов Vibrio cholerae 0139, выделенных различными методами // «Холера и патогенные для человека вибрионы». Информ. пробл. комиссии (46.04) МНС по сан.-эгшд охране территории РФ. Ростов-на-Дону. 2002. - № 15 С. 91-92

18. Сырова H А , Терешкина H Е , Федорова В.А., Громова О В , Белякова Н.И., Доброва Г.В., Дятлов И.А , Киреев М.Н., Ляпин М.Н., Девдариани З.Л. Изучение динамики синтеза основных иммуногенов при масштабированном культивировании производственных штаммов Vibrio cholerae 01 и 0139 серофупп с использованием моноклональных антител // Холера- Матер VIII Росс научн.-практич конфер по проблеме «Холера» (4-5 июня 2003 г.) -Ростов-на-Дону, 2003. - С. 230-233

»2 67 1 3

РНБ Русский фонд

2006-4 473

ТЕРЕШКИНА Наталия Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ КАПСУЛЬНЫХ И БЕСКАПСУЛЬНЫХ ФОРМ VIBRIO CHOLERAE OI 39 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 14 09 2004г Формаг 60x84 1/16 Объем 1,5 печ л Тираж 100 экз Заказ №205

Типография Издательства Саратовского университета 410012 г Саратов, ул Астраханская, 83

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Терешкина, Наталия Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ И

ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИММУНОДИАГНОСТИКИ

ХОЛЕРЫ, ВЫЗЫВАЕМОЙ У.СНОЬЕЯАЕ 0139 СЕРОГРУППЫ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы.

3.2. Антигены и сыворотки.

3.3. Клеточные линии и культуральные среды.

3.4. Реактивы и растворы.

3.5. Оборудование и приборы.

3.6. Методы иммуноанализа.

3.6.1. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА).

3.6.2. «Сэндвич»-ТИФА.

3.6.3. Дот-иммуноанализ.

3.6.4. Иммуноблоттинг.

3.6.5. Реакция двойной иммунодиффузии.

3.7. Электрофорез.

3.8. Лабораторные животные.

3.9. Методы статистического анализа.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНОМУ АНТИГЕНУ И ЛПС

V. СНОЬЕЯАЕ 0139.

4.1. Выбор антигенов и оптимизация условий иммунизации животных.

4.1.1. Получение антисывороток к ЛПС У.сИо!егае 0139.

4.1.2. Получение антисывороток к КАГ и цельным клеткам У.скокгае 0139.

4.2. Иммунохимическая характеристика поликлональных антител к ЛПС-ТХУ, КАГ и цельным клеткам V.cholerae 0139.

4.3. Получение и диагностическая значимость антител к липиду А V.cholerae 0139.

ГЛАВА 5. СОЗДАНИЕ'ПАНЕЛИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОСОБЕННОСТЕЙ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ КАПСУЛЬНЫХ И БЕСКАПСУЛЬНЫХ ФОРМ V.CHOLERAE 0139.

5.1. Эффективность процедуры слияния и особенности скрининга позитивных клонов.

5.2. Стабилизация гибридных линии и отбор МКА к отдельным эпитопам V.cholerae 0139.

5.2.1. Изучение опухолеродности клеточных линий.

5.2.2. Особенности взаимодействия МКА с капсульными и бескапсульными вариантами вибрионов Ol39 серогруппы.

5.2.3. Влияние разных способов хранения на основные свойства гибридом

5.3. Применение МКА для изучения антигенной структуры вибрионов Ol39 серогруппы.

5.3.1. Общая характеристика лигандов, комплементарных МКА.

5.3.2. Молекулярная организация эпитопов, узнаваемых МКА, в препаратах антигенов, изолированных из капсульных и бескапсульных форм V.cholerae 0139.

5.3.3. Изучение особенностей биосинтеза эпитопов, узнаваемых МКА, вибрионами 0139 серогруппы.

5.3.4. Идентификация и характеристика эпитопов со сходной специфичностью у близкородственных в антигенном отношении бактерий.

5.4. Изучение серологического родства структур адгезии некоторых возбудителей кишечных инфекций и холерного вибриона.

ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ V.CHOLERAE 0139.

6.1. Поликлональные иммуноферментные тест-системы.

6.2. Моноклональные иммуноферментные тест-системы.

ГЛАВА 7. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ АНТИГЕНОВ ПРИ

МАСШТАБИРОВАННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ У.СНОЬЕЯАЕ 0139 В ПРОЦЕССЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ

СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ ХИМИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение капсульных и бескапсульных форм Vibrio cholerae 0139 с использованием поли- и моноклональных антител"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время Vibrio cholerae 0139, ставший причиной крупных эпидемий в ряде стран Юго-Восточной Азии в начале 90-х годов XX века [140-142, 144, 179-182, 256, 294, 321], является, наряду с V.cholerae 01, признанным вторым этиологическим фактором холеры [109, 110, 238]. Хотя в данный момент на эндемичных территориях эпидемиологическая ситуация характеризуется преобладанием заболеваний холерой, связанной с V.cholerae 01, вспышки холеры, вызванной вибрионом 0139 серогруппы, продолжают достаточно часто регистрироваться и по сей день [159, 235, 296]. При этом, активная миграция населения, обусловленная развитием международных торговых отношений и туризма, а также межнациональными конфликтами, значительно повышает риск повсеместного распространения данной инфекции и завоза ее в Россию, а ухудшение социально-экономических условий жизни в нашей стране служит дополнительным фактором, способствующим развитию эпидемических осложнений. Учитывая также возрастание угрозы биотерроризма, проведение исследований, посвященных разработке эффективных тестов для детекции V.cholerae 0139, представляется несомненно актуальным.

Как известно, наряду со способностью синтезировать уникальный по структуре О-антиген [109, 163, 184, 232, 238, 243, 273, 333], V.cholerae 0139 характеризуется наличием капсулы [109, 112, 184,238, 339]. Ввиду потенциальной диагностической и протективной значимости, обе поверхностные структуры нового возбудителя стали предметом пристального внимания многих исследователей. Несмотря на использование разнообразных подходов при изучении антигенной специфичности, иммуно- и биохимических свойств капсульного антигена (КАГ) и лнпополисахарида (ЛПС) V.cholerae 0139, остаются открытыми ряд вопросов, связанных с выявлением различий в иммунореактивностн отдельных компонентов этих субстанций, в частности липнда А ЛПС, и особенностей эпитопной композиции названных антигенов. Немаловажное значение имеет изучение антигенных свойств адгезинов вибрионов, играющих важную патогенетическую роль при холерной инфекции.

Особенности антигенной структуры V.cholerae 0139 - обусловили неэффективность диагностикумов, предназначенных для выявления V.cholerae 01 [144, 180, 256], что предопределило необходимость разработки специфичных, высокочувствительных н экспрессных способов детекции данного возбудителя, среди которых ведущее место заслуженно занимают иммуноднагностнческие методы. На сегодняшний день для иммунодиагностики холеры, вызванной V.cholerae 0139, предложено большое количество поли- и моноклональных препаратов [59, 60, 72, 80-82, 117, 123, 137, 175, 218, 291, 292], однако задача повышения их эффективности и совершенствования технологии получения специфических иммунореагентов представляется весьма важной. Так, поликлональные диагностнкумы основываются на использовании адсорбированных сывороток против V.cholerae 0139 [82, 137, 311], которым присущи такие недостатки, как низкая активность после проведения адсорбции гетерологичными микроорганизмами, значительное количество фоновых неспецифических реакции, нестандартность серий и т.д. [13, 16, 47]. Одним из путей улучшения качества таких сывороток является отработка методик получения моноспецнфических сывороток [13, 47, 102, 228], например, в результате использования для иммунизации биопродуцентов химически изолированных антигенов, взамен приготовленных кипячением термостабильных О-антигенов, иммунизация - которыми приводит к получению антител с широкой кросс-реактивностью [77, 82, 117, 133, 137, 311]. Альтернативным способом повышения качества иммуноднагностических препаратов служит применение моноклональных антител (МКА), обладающих высокой активностью, строгой специфичностью, стандартностью [13, 16, 47, 56, 58, 87]. За рубежом применяется несколько моноклональных диагностических тест-систем для детекции V.cholerae 0139 [175, 218, 291, 292], однако в нашей стране аналогичные препараты пока находятся на стадии разработки [9, 10, 83]. Высокоактивные и специфичные антитела могут быть также использованы в качестве тонкого инструмента иммунохнмической характеристики препаратов КАГ и ЛПС, термостабильных О-антигенов и изучения особенностей экспрессии соответствующих лигандов в цельной микробной клетке. Кроме того, как поли-, так и моноклональные иммунореагенты могут найти применение при экспериментальном и производственном выращивании штаммовпродуцентов антигенов соответствующей химической холерной вакцины для контроля экспрессии основных иммуногенов холерного вибриона 0139 (КАГ, ЛПС, холерного токсина (ХТ), нейраминидазы (НД), адгезинов) на этапах масштабированного культивирования. Оптимальным было бы внедрение с этой целью быстрых, чувствительных, технически простых методов, таких как, например, дот-иммуноанализ (ДИА), с использованием гомологичных поли- и моноклональных антител, взамен недостаточно информативной и малочувствительной реакции двойной иммунодиффузии (РИД) (282).

Вышеизложенное определило цель и основные задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - иммунохимическая характеристика антигенной структуры капсульных и бескапсульных форм У.сИокгае 0139 серогруппы и разработка экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем " для детекции возбудителя и выявления отдельных диагностически значимых и протективных антигенов с использованием поли- и моноклональных антител.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Получить высокоактивные поликлональные серовароспецифические антисыворотки и стабильные при различных вариантах культивирования и хранения гибридные клеточные линии, синтезирующие МКА к отдельным эпитопам КАГ и ЛПС капсульных и бескапсульных вариантов У.сИокгае 0139.

2. Изучить иммунохимические свойства и молекулярную организацию КАГ, ЛПС и термостабильных О-антигенов У.сИокгае 0139, используя поли- и моноклональные антитела, и выявить особенности экспрессии антигенных детерминантов у инкапсулированных и лишенных капсулы У.сИокгае 0139, а также у холерных вибрионов других серогрупп.

3. Охарактеризовать иммунореактивность липида А У.сИокгае 0139 в зависимости от наличия или отсутствия капсулы у вибрионов гомологичной серогруппы, а также у некоторых других энтеропатогенных бактерий.

4. Изучить серологическое родство адгезина CFA/I Escherichia coli J53 с факторами адгезии холерного вибриона и ряда других возбудителен кишечных инфекций.

5. Разработать на основе полученных атител экспериментальные диагностические иммуноферментные поли- и моноклональные тест-системы для детекции V.cholerae 0139.

6. Показать возможность использования и преимущества дот-иммуноанализа на основе гомологичных антител для контроля синтеза основных иммуногенов V.cholerae 0139 (КАГ, ЛПС, холерного токсина, нейраминндазы, адгезина) на этапе глубинного культивирования штаммов-продуцентов антигенов соответствующей холерной химической вакцины.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые создана клонотека гибридом, синтезирующих МКА к уникальным эпитопам КАГ и ЛПС V.cholerae 0139, экспрессия которых различна в химически изолированных антигенах, нативных клетках вибрионов 01, 022 и 0139 серогрупп, в том числе у бескапсульных и инкапсулированных форм V.cholerae 0139. Впервые с использованием панели поли- и моноклональных антител определена локализация и структура отдельных иммунореактивных компонентов КАГ и ЛПС V.cholerae 0139 серогруппы. Впервые выявлены и охарактеризованы конкретные эпитопы гликопептидной природы, являющиеся общими для холерных вибрионов 01, 022 и 0139 серогрупп. Новыми являются данные об иммунореактивности липндного компонента микробного ЛПС, в том числе в зависимости от наличия или отсутствия бактериальной капсулы, и возможности использования липида A V.cholerae 0139 и антител к нему в качестве дополнительного таксономического критерия в дифференциации возбудителей холеры 01 и не 01 серогрупп. Впервые в препаратах термостабильных О-антигенов V.cholerae Ol и 0139 обнаружены локализованные на антигенах полипептидной природы кросс-реактивные эпитопы, возможно обусловливающие перекрестную реактивность получаемых к ним антнсывороток. Новыми являются данные об особенностях иммунореактивности препаратов ЛПС V.cholerae 0139, выделенных различными методами. Экспериментально доказано наличие серологического родства адгезина CFA/I E.coli J53 и собственных адгезинов холерного вибриона и некоторых возбудителей кишечных инфекции. Впервые с помощью МКА установлена способность ряда энтеропатогенных бактерий экспрессировать серологически идентичные эпитопы, предположительно ассоциированные со структурами адгезии и инвазии этих микроорганизмов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ состоит в создании на основе разноэпитопных МКА и поликлонапьных антител к ЛПС V.cholerae OI39 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции данного возбудителя холеры независимо от отсутствия или наличия у него капсулы.

Разработана многокомпонентная система быстрого и эффективного контроля в ТИФА и ДИА продукции основных иммуногенов V.cholerae OI39 на этапе экспериментального и производственного масштабированного культивирования штаммов-продуцентов антигенов новой химической холерной вакцины.

По материалам диссертационного исследования составлены «Методические рекомендации по определению в дот-иммуноанализе содержания капсулыюго антигена и липополисахарида Vibrio cholerae OI39 серовара на этапах экспериментального производства химической холерной вакцины» и «Методические рекомендации по определению адгезина CFA/I у рекомбинантных штаммов холерного вибриона в дот-иммуноанализе», одобренные ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протоколы № 5 от 20 июня 1997 г. и № 1 от 12 марта 1997 г., соответственно) и утвержденные директором института.

Материалы диссертации используются при чтении лекций по общей иммунологии и лабораторной диагностике инфекционных болезней на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям - и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ «Микроб».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Иммунизация биомоделей изолированными биохимическими методами препаратами КАГ и ЛПС V.cholerae 0139 позволяет получить поликлональные сыворотки, специфически реагирующие в ТИФА без предварительной адсорбции только со штаммами гомологичной серогруппы.

2. Анти-липид А-антитела у холерных вибрионов разных серогрупп, а также у капсульных и бескапсульных вариантов V.cholerae 0139 могут быть использованы в качестве, дополнительного критерия внутривидовой дифференциации холерных вибрионов.

3. Собственные адгезины возбудителя холеры обладают серологическим родством с адгезином CFA/I E.coli J53, a V.cholerae, E.coli, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri и Salmonella enteritidis экспрессируют идентичные эпитопы, возможно ассоциированные со структурами адгезии и инвазии этих бактерий.

4. Холерные вибрионы 01, 022 и 0139 содержат ряд кросс-реактивных эпитопов гликопептидной природы с различной реакционноспособностыо у представителей указанных серогрупп, а также у инкапсулированных и бескапсульных форм V.cholerae 0139, присутствующих также в термостабильных О-антигенах возбудителей холеры обеих серогрупп.

5. Сконструированная на основе серовароспецифнческих полнклональных антител к ЛПС-ТХУ V.cholerae 0139 экспериментальная иммуиоферментная тестсистема («сэндвич»-вариант) позволяет идентифицировать в зависимости от 1 использованного штамма от 9,4*10 до 1,5-10 м.кл./мл соответствующего возбудителя. Разработанные экспериментальные иммуноферментные тест-системы, основанные на применении моноклональных антител («сэндвич», прямой и непрямой варианты), обладают чувствительностью от 7,5-104 до 2,3-10б м.кл./мл холерных вибрионов 0139 серогруппы в различных модификациях анализа.

6. Дот-иммуноанализ на основе полученных поли- и моноклональных антител представляет собой эффективный метод контроля синтеза основных иммуногенов и их отдельных иммунореактивных эпитопов в процессе масштабированного культивирования штаммов V.cholerae 0139 - продуцентов новой химической холерной вакцины.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции Академии Естествознания «Гомеостаз и инфекционный процесс», Саратов, 1996; VII съезде Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997; 4-ой Международной конференции молодых ученых и студентов, Бишкек, Кыргызстан, 1997; Втором съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997; Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997; Второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс», Саратов, 1998; Проблемной комиссии по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ «Холера и патогенные для человека вибрионы», Ростов-на-Дону, 2002; VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», Ростов-на-Дону, 2003; Итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2000,2002,2003,2004.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 353 источника, из них зарубежных - 214. Объем диссертации составляет 206 страниц машинописного текста, включая 20 таблиц и 24 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Терешкина, Наталия Евгеньевна

выводы

1. Оптимизированы схемы иммунизации инбредных мышей линии ВАЬВ/с экстрагированными из У.сЬокгае 0139 различными методами препаратами ЛПС и выделенным из культуральной жидкости препаратом КАГ, обеспечивающие получение поликлональных антисывороток с высоким титром антител, специфически взаимодействующих только с холерными вибрионами 0139 серогруппы и гомологичными антигенами без дополнительной адсорбции.

2. Генерирована панель стабильных при различных вариантах храпения гибридом, продуцирующих МКА к различным эпитопам ЛПС и КАГ У.сЬокгае 0139, изучены иммунохимические свойства МКА, природа и особенности молекулярной организации комплементарных им лигандов.

3. С использованием полученных поли- и моноклональных антител охарактеризованы иммунореактивные углеводные и белковые составляющие препаратов ЛПС и КАГ У.сЬокгае 0139, установлена иммунохимическая неидентичность указанных антигенов, а также выявлены различия в экспрессии реакцнонноспособных компонентов в химически изолированных антигенных субстанциях и нативных цельных клетках вибрионов данного серовара.

4. Определено дифференциально-диагностическое значение анти-липид А-антител у холерных вибрионов различных серогрупп, а также у капсульных и бескапсульных форм У.сЬокгае 0139.

5. С помощью панели моноклональных антител в иммуноферментном анализе и иммуноблотгинге выявлено по крайней мере четыре общих эпитопа гликопептидной природы у У.сЬокгае 01, 022 и 0139. Данные эпитопы неодинаково экспрессируются у холерных вибрионов указанных серогрупп, а также у инкапсулированных и бескапсульных вариантов У.сЬокгае 0139. Те же кросс-реактивные эпитопы, локализованные на антигенах полипептидной природы, обнаружены в термостабильных О-антигенах У.сЬокгае 01 и 0139.

6. Установлено серологическое родство собственных адгезинов холерного вибриона и адгезина СРАЛ Е.соИ 153, а также показано наличие у ряда близкородственных и отдаленных в таксономическом отношении бактерий серологически сходных структур с потенциально адгезивными свойствами.

7. Продемонстрирована эффективность применения полученных поли- и моноклональных антител в ТИФА и ДИА и их преимущество перед регламентированным методом контроля для качественного определения и изучения динамики продукции основных иммуногенов V.cholerae 0139 при глубинном культивировании штаммов — продуцентов антигенов для соответствующей химической холерной вакцины.

8. На основе серовароспецифических поликлональных антител к ЛПС-ТХУ V.cholerae 0139 сконструирована и успешно апробирована экспериментальная иммуноферментная тест-система («сэндвич»-вариант) для детекции в зависимости от использованного штамма от 9,4-104 до 1,5'106 м.кл./мл соответствующего возбудителя. Разработано также несколько модификаций иммуноферментных тест-систем («сэндвич», прямой и непрямой варианты), основанных на применении МКА, с чувствительностью различных вариантов анализа от 7,5-104 до 2,3-106 м.кл./мл V.cholerae 0139.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вид У.с1ю1егае включает в себя обширную группу энтеропатогенных вибрионов, отличающихся друг от друга структурой О-боковых полисахаридных цепей ЛПС, определяющих серологическую специфичность холерных вибрионов [5, 6, 67, 136, 197, 238, 312]. При этом, к возбудителям холеры долгое время относили только вибрионы 01 серогруппы, которые служили причиной крупных эпидемий на эндемичных территориях и семи пандемий [5, 69, 110, 197], в то время как представители других серогрупп вызывали спорадические гастроэнтериты и экстраинтестинальные инфекции [25, 136, 238]. Однако в начале 90-х годов прошлого столетия в странах Юго-Восточной Азии были зарегистрированы эпидемические вспышки клинически неотличимого от холеры заболевания с высокой летальностью, вызванного не принадлежащим ни к одному из известных к тому времени сероваров холерным вибрионом, который был отнесен к новой 0139 серогруппе [109, 238, 140-142, 144, 180-182, 196, 197, 256, 268, 321]. Так, впервые способным вызвать эпидемическую холеру оказался холерный вибрион не 01, что предопределило пристальное внимание исследователей к данному возбудителю.

Одной из особенностей У.сИокгае 0139, отличающей его от У.сИокгае 01, наряду с продукцией уникального по структуре соматического антигена (ЛПС) [109, 163, 184, 232, 238, 243, 273, 333], являлась его способность к капсулообразованию [109, 112, 184, 238, 339], свойственная многим холерным вибрионам не 01 серогруппы [109, 231, 238]. Хотя ведущая роль ЛПС в определении серологической специфичности холерного вибриона нового серовара была неоспоримой [109, 141, 175, 238], поверхностная локализация капсульной субстанции, очевидно, обусловливала не только ряд биологически важных свойств инкапсулированных вариантов У.с1ю1егае 0139, таких как значительная устойчивость к лнтическому действию сыворотки [109, 112, 132, 232], выраженная адгезивность к клеткам слизистой тонкого кишечника человека [349] и новорожденных мышей [333] и более высокая по сравнению с бескапсульными формами вирулентность [112, 333], но и потенциальную диагностическую значимость антигенов капсулы. Полученные данные об отличиях ЛПС и КАГ У.сЬокгае 0139 по химическому составу [127, 242, 243, 339] и генетическому контролю [109, 132, 163, 164] предопределили многочисленные попытки использования каждого из указанных антигенов, извлеченных различными методами, для получения антител и сывороток, пригодных как для конструирования диагностических тестов, так и для иммунохимической характеристики ЛПС и КАГ [1, 9, 33, 82, 117, 123-125, 127, 133, 175,210, 234,247, 309,311,312,333].

Однако, как показал анализ доступной литературы, несмотря на разнообразие подходов, использованных для решения этих задач, ряд вопросов - как прикладных, связанных, в частности, с некоторыми бнотехнологнческими аспектами получения специфических сывороток, так и фундаментальных, связанных с выявлением особенностей молекулярной организации изучаемых антигенов, оставался открытым, что и послужило основанием для проведения настоящего исследования.

В соответствии с целью диссертационной работы первоначально были получены полнклональные антисыворотки к ЛПС и КАГ V.cholerae 0139.

Традиционный способ получения серовароспецифических холерных сывороток, предусматривающий иммунизацию животных приготовленными кипячением термостабильными О-антигенами, предполагает присутствие в них кросс-реагирующих агглютининов, которые удаляются адсорбцией гетерологичными микроорганизмами [25, 56, 69, 117, 133, 136, 173, 311]. Это не только усложняет технологию приготовления диагностических сывороток, но и приводит к их истощению, т.е. значительному снижению титра специфических антител [13, 47]. Поэтому мы применили для иммунизации биомоделей химически выделенные антигены, перспективность использования которых для получения антисывороток, отличающихся высокой активностью и специфичностью без адсорбции, была продемонстрирована ранее [123,124, 127].

Практическое применение принципов классической иммунологии, заключающееся в варьировании дозы антигена, кратности прививок и интервала между ними для достижения максимальной стимуляции антителопродуцирующих клонов B-клеток требуемой специфичности, позволило отработать схемы иммунизации биопродуцентов препаратами ЛПС и КАГ V.cholerae 0139, обеспечивающие индукцию у животных достаточно высоких титров специфических антител, способных без дополнительной адсорбции взаимодействать в ТИФА и ДИА только со штаммами гомологичного серовара. При этом, для получения анти-JIПС-антител, реакционноспособных как с капсульной, так и с бескапсульной формой холерных вибрионов 0139, оказались пригодными препараты ЛПС, приготовленные сотрудниками РосНИПЧИ «Микроб» из штаммов V.cholerae 0139 фракционированием культуральной жидкости сульфатом аммония [41], новым способом — ультрафильтрацней, дополненной гель-фильтрацией [32, 33], и эндотоксиновый комплекс (ЛПС-ТХУ), экстрагированный классическим методом A. Boivin et al. [168]. Последний обеспечивал наибольший титр специфических антител, в связи с чем его применение для решения задач настоящего исследования было, на наш взгляд, более целесообразным. Кроме того, были наглядно подтверждены установленные ранее [36, 37, 87, 105, 121] преимущества использования в качестве биомоделей при получении препаративных количеств антител к гликопептидным антигенам мышей инбредной линии BALB/c. В сравнении с кроликами у мышей указанной линии регистрировался значительно более высокий титр специфических антител к препаратам ЛПС при менее продолжительном периоде иммунизации. Возможность индукции у них при внутрибрюшинном заражении сингенной мнеломой иммуноасцитнческих жидкостей, в которых накапливается до 25 мг/мл специфических иммуноглобулинов [98], в сочетании с меньшими затратами на содержание животных этого вида делают мышей BALB/c наиболее перспективными продуцентами соответствующих нммунореагентов.

Результатом применения для иммунизации мышей указанной линии препарата КАГ V.cholerae 0139, выделенным щадящим методом выделения капсульных субстанций [22], стало получение высокоактивных антикапсульных сывороток, которые также, как и анти-ЛПС-антитела, реагировали в ТИФА исключительно со штаммами холерного вибриона 0139.

Как известно, антитела являются уникальными молекулярными детекторами, позволяющими осуществлять тонкий анализ сложноорганизованных антигенных субстанций, к которым относятся бактериальные антигены [13, 16, 18, 48, 56, 94, 96, 98, 102, 228]. Строгая специфичность полученных в ходе проведенных экспериментов поликлональных антител к препаратам ЛПС-ТХУ и КАГ V.cholerae

0139 предопределила их успешное использование в экспериментах по выявлению иммунохимических особенностей соответствующих антигенов.

Препараты ЛПС-ТХУ и КАГ холерного вибриона 0139 серогруппы, подобно другим патогенным бактериям, представляют собой гетерогенные субстанции, содержащие углеводный и белковый компоненты [124, 127]. Благодаря применению в ТИФА нативных и депротеинизнрованных образцов указанных антигенов и цельных м.кл. в соответствии с подходом, предложенным М. Brockhaus et al. [172], нам удалось установить реакционноспособность обеих составляющих препаратов. При этом, в препарате ЛПС-ТХУ наибольшей иммунореактивностью обладал белковый компонент, а в КАГ —углеводный.

Полученные результаты были подтверждены методом иммуноблота. На иммуноблоттограммах антител к ЛПС-ТХУ и гомологичного антигена, нативного и обработанного проназой, а также нативных цельноклеточных лизатов различных штаммов V.cholerae 0139 визуализировались две белковые полосы с м.м. 53,7+2 и 36,3+2 кДа, а также быстромигрнрующнй углеводный компонент. Последний отличался по размеру и интенсивности окрашивания у использованных в эксперименте штаммов после протеолиза соответствующих лизатов как в иммуноблоте, так и при окраске гелей серебром [330], обнаруживая штаммовые различия в экспрессии специфических антигенов углеводной природы, что согласуется с данными литературы [273].

Иммуноблоттинг антител к ЛПС-ТХУ и термостабильных О-антигенов холерных вибрионов 0139 серогруппы свидетельствовал о деградации специфического полисахарида в процессе кипячения, что является, на наш взгляд, весьма важным наблюдением, так как объясняет перекрестную реактивность получаемых к соответствующим антигенам сывороток, возможно вследствие обнажения консервативных структур ЛПС, экспонирующих кросс-реактивные детерминанты [50,65,66, 139,224,228].

Не менее интересные данные были получены в иммуноблоттинге антикапсульных сывороток с препаратами ЛПС, КАГ и цельноклеточными лизатамн м.кл. инкапсулированной и бескапсульной форм V.cholerae 0139, который позволил установить иммунохимическую неидентичность белкового компонента указанных антигенных субстанций, а также выявить существенные различия в иммунореактивиости белковых и углеводных компонентов вибрионов одного и того же штамма в зависимости от наличия и отсутствия капсулы.

Одним из наиболее значимых результатов проведенного исследования представляется определение дифференциально-диагностического значения липнда A V.cholerae 0139, что стало возможным, очевидно, благодаря использованию в экспериментах ультразвукового дезинтегранта этого компонента ЛПС. В ДИА были установлены существенные различия в доступности для взаимодействия с анти-липнд А-антнтелами антигенных детерминантов липида А у некоторых возбудителей кишечных инфекций, нерсиний и холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп, а также у отдельных представителей V.cholerae не 01. Особое значение имеет выявление разной степени экспонирования детерминантов липида А у инкапсулированных и бескапсульных вариантов V.cholerae 0139, обусловленное экранированием их капсульной субстанцией.

Несмотря на достаточно высокую информативность иммунохимических методов, основанных на применении поликлональных антител, более детальное изучение антигенной структуры бактерий становится возможным только при использовании такого тонкого инструмента как МКА. В отличие от полнклоналыюй сыворотки, содержащей гетерогенные по специфичности антитела [13, 16,47, 56], МКА способны узнавать только один антигенный детерминант, что обусловливает их эффективность для изучения эпитопной композиции различных полидетерминантных антигенов [11, 16,58,65-67, 105, 121, 125, 128, 139,201].

В результате проведенных нами экспериментов по гибридизации спленоцитов мышей BALB/c, иммунных к КАГ и цельным м.кл., и клеток сннгенной миеломной линии были получены 22 клона гибридом, синтезирующих МКА к поверхностным структурам V.cholerae 0139 и отличавшихся по способности взаимодействовать в ТИФА с инкапсулированными и бескапсульными вариантами вибрионов указанной серогруппы. Из них были отобраны четыре клона, обладавшие наилучшими показателями опухолеродностн in vivo и различавшиеся своей активностью по отношению к имеющим и лишенным капсулы вибрионам и эпитопной специфичностью. Так, МКА 5D3 и 1В7 реагировали в ТИФА с инкапсулированной формой V.cholerae 0139 в более высоком титре, чем с бескапсульной, МКА 14D8, напротив, активнее взаимодействовало с бескапсульной формой, тогда как МКА

5G6 было в равной степени реакционноспособным с обеими формами. Все четыре линии сохраняли удовлетворительные ростовые свойства после криоконсервирования и пассирования через организм сингенной биомодели и оставались стабильными продуцентами МКА в течение 5 пассажей in vivo без реверсии к миеломе.

Следующим этапом исследований стало использование полученных МКА для изучения антигенной структуры холерных вибрионов с применением современных приемов иммунохимического анализа и молекулярной иммунологии. В результате установлено, что все МКА были направлены к различным эпитопам ЛПС и капсулыюй субстанции. В организации антигенного детерминанта, комплементарного МКА 5D3, вероятно, принимали участие компоненты липида А-кора, О-боковых цепей ЛПС и белки, предположительно локализованные на наружной клеточной стенке V.cholerae 0139. МКА 1В7 оказалось направлено к эпитопу, сформированному преимущественно моносахаридами О-специфического полисахарида и внешнего кора. Детерминанты, комплементарные МКА 14D8 и 5G6, были образованы полисахаридными компонентами КАГ. Изучение биосинтеза соответствующих эпитопов м.кл. вибрионов 0139 серогруппы с применением иммуноблоттинга МКА и различным образом обработанных целыюклеточных лизатов V.cholerae 0139 продемонстрировало различия в структурной организации антигенных детерминантов, узнаваемых МКА, в молекулах очищенных антигенов и нативных микробных клетках, в том числе в зависимости от наличия или отсутствия у последних капсулы. Также установлена тесная связь полисахаридов ЛПС и КАГ с белками, которые предположительно являлись интегральными, что обусловливало участие и углеводного и белкового компонентов в формировании всех характеризуемых гликопептидных эпитопов.

Несомненный интерес представляло изучение специфичности характеризуемых МКА. Оказалось, что все МКА обладали различной иммунореактивностыо в ТИФА и взаимодействовали, кроме V.cholerae 0139, с другими бактериями. Так, МКА 5D3 реагировало с V.cholerae 0139 и V.cholerae 01, т.е. узнавало эпитоп, общий для обоих возбудителей холеры. МКА 1В7 было направлено к антигенному детерминанту, экспрессируемому, кроме V.cholerae 0139 и 01, кишечной палочкой и иерсиниями. Наибольшей кросс-реактивностью в ТИФА обладало МКА 14D8, которое связывалось с эпитопом, экспонированным на поверхности большинства использованных в анализе вибрионов, кишечной палочки, шигелл и сальмонелл. Антигенный детерминант, комплементарный МКА 5G6, обнаруживался у всех представителей рода Vibrio, а также E.coli и бактерий рода Shigella. Два последних МКА перекрестно реагировали с холерным вибрионом 022 серовара. Иммунохимическая характеристика кросс-реактивных компонентов, экспонирующих комплементарные МКА эпитопы, у наиболее близких в антигенном отношении бактерии - холерных вибрионов 01 и 022 серогруппы, показала, что исследуемые антигенные детерминанты у этих микроорганизмов имеют различную организацию. Применение иммуноблота позволило подтвердить значительное антигенное родство V.cholerae 01, 022 и 0139, выявив у них по крайней мере четыре общих эпитопа, в том числе не реакционноспособные в ТИФА, локализованные как на сходных, так и на различных иммунореактивных структурах указанных возбудителей.

Одним из наиболее важных наблюдений оказалось, с нашей точки зрения, обнаружение всех четырех кросс-реактивных эпнтопов в препаратах термостабильных О-антигенов V.cholerae 01 и 0139, что, возможно, объясняет перекрестную реактивность и необходимость адсорбции сывороток, получаемых при иммунизации биопродуцентов приготовленными кипячением О-антигенами холерных вибрионов [5, 133, 136, 303, 311]. Данные иммуноблота свидетельствовали об участии в организации указанных эпитопов V.cholerae 01 и 0139 термостабильных антигенов полипептидной природы, возможно, представлявшие собой белки теплового шока, которые, будучи структурно однотипными у различных патогенных микроорганизмов, вызывают образование при иммунном ответе антител с широкой кросс-реактивностью [102].

Безусловный интерес представляла более детальная иммунохимическая характеристика МКА 1В7, реагировавшего в ТИФА с иерсиниями, на серологическое родство которых с холерными вибрионами и E.coli есть указания в литературе [15, 114, 346]. Анализ блоттограмм МКА 1В7 и цельноклеточных лизатов м.кл. Y.eníerocolitica, Y.pseudotuberculosis, E.coli, S.enteritidis и S.flexneri показал, что большая часть реакционноспособных белков обладали м.м., которая соответствовала, по данным литературы, известным белкам, вовлеченным в реализацию функции адгезии и инвазии указанных микроорганизмов. Обнаружение с помощью МКА иммунореактивного эпитопа структур адгезии и инвазии, широко экспрессируемого целым рядом возбудителен ОКИ, являлось важным доказательством серологического родства соответствующих факторов патогенности большого числа бактерий и указывало на принципиальную возможность использования адгезинов/инвазинов, обладающих протективными свойствами, для создания поливалентных вакцинных препаратов, одновременно защищающих от нескольких кишечных инфекций [85].

Проведенные нами исследования, базирующиеся на применении традиционных и оригинальных методов иммуноанализа, позволили впервые установить серологическое родство адгезина CFA/I кишечной палочки и собственных адгезинов холерных вибрионов и некоторых энтеропатогенных бактерий, что служит теоретическим обоснованием правомерности использования, в частности, плазмиды, кодирующей синтез адгезина CFA/I энтеротоксигенной E.coli [49, 194], при конструировании штаммов холерного вибриона, являющихся либо продуцентами белков-адгезинов для оральной химической холерной вакцины [55], либо кандидатами в вакцинные при создании живой холерной вакцины [74]. Полученные иммунизацией мышей BALB/c поликлональные сыворотки к адгезину CFA/I оказались эффективными как для оценки экспрессии соответствующего антигена рекомбинантными штаммами V.cholerae, несущими гены cfal, так и для иммунохимической характеристики препарата адгезина и изучения особенностей экспрессии серологически родственных структур адгезии у различных возбудителей кишечных инфекций.

Уникальные свойства полученных нами поликлональных антител и МКА предопределили попытку их использования в качестве иммунореагентов при конструировании экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для детекции капсульных и бескапсульных форм V.cholerae 0139.

Для разработки поликлоналыюго диагностического препарата использовали антитела к ЛПС - основному антигену, определяющему сероваропринадлежность вибрионов [6, 109, 238, 303, 312] и синтезируемому независимо от наличия или отсутствия капсулыюго вещества. Оптимальным вариантом тест-системы оказался «сэндвич»-ТИФА с применением в качестве первых антител («подложки») и вторых антител (меченного ПХ конъюгата) иммуноглобулинов изогенных животных - мыши или кролика. Метод демонстрировал строгую специфичность по отношению к вибрионам 0139 серогруппы. Его чувствительность составляла 9,4-104-1,5-106 м.кл./мл при тестировании 22 штаммов природных V.cholerae 0139, выделенных из различных источников.

На следующем этапе для создания экспериментальных тест-систем были использованы МКА, направленные, как показано в данной работе, к различным эпитопам диагностически значимых антигенов V.cholerae 0139. На основе каждого из четырех МКА было разработано три модификации иммуноферментных тестов

1) «сэндвич»-ТИФА, с использованием в качестве первых антител иммуноглобулинов, выделенных из холерной О сыворотки или из поликлональных мышиных антисывороток к ЛПС-ТХУ, и МКА - в качестве вторых антител, 2) непрямой, с применением МКА и коммерческого иммунопероксидазного конъюгата против мышиных IgG, и 3) прямой на основе МКА, меченных пероксндазой по методу Р.К. Nakane and A. Kawaoi [270]. Наименее чувствительным при этом оказался непрямой вариант ТИФА, позволявший выявлять не менее 2,3-Ю6 м.кл. V.cholerae 0139 при использовании всех МКА.

Наибольшей же чувствительностью характеризовался «сэндвич»-ТИФА на основе

1 €

МКА 5D3, который обнаруживал от 7,5*10 до 1,2-10 м.кл./мл в зависимости от использованной «подложки».

Следует отметить, что сконструированные поли- и моноклональные диагностнкумы могут применяться для решения самых различных задач. Так, тест-системы с использованием поликлональных иммуноглобулинов к ЛПС-ТХУ ввиду их строгой специфичности по отношению к вибрионам 0139 серогруппы можно рекомендовать для индикации и идентификации соответствующего возбудителя. Применение препаратов на основе МКА 5D3, которое взаимодействовало в ТИФА только с V.cholerae Ol и 0139, представляется перспективным для диагностики холеры, независимо от принадлежности возбудителя к определенной серогруппе. МКА 1В7, направленное к эпитопам структур адгезии различных энтеропатогенных микроорганизмов, является пригодным для идентификации V.cholerae 01 и 0139 после определения принадлежности выделенной культуры к семейству Vibrionaceae. Данное МКА может также служить ценным инструментом выявления и иммунохимической характеристики гомологичных детерминантов, локализующихся на макромолекулах с функцией адгезии и инвазии у разных бактерий. МКА 14D8 и 5G6, способные реагировать в ТИФА с рядом возбудителей ОКИ, будут полезны в качестве дополнительного теста для серологического подтверждения видовой принадлежности выделенного микроорганизма. Комплексное применение всех четырех МКА на этапе чистых культур окажется эффективным при определении наличия капсулы у V.cholerae 0139 с учетом их различной активности по отношению к инкапсулированной и бескапсулыюй формам возбудителя.

Поскольку ЛПС и КАГ являются не только диагностически значимыми, но и протективнымн антигенами [109, 127, 199, 246, 309], представляло несомненный интерес применение разработанных нами поли- и моноклональных тест-систем для контроля синтеза основных иммуногенов в процессе глубинного культивирования производственных штаммов V.cholerae 0139 - продуцентов компонентов соответствующей химической холерной вакцины, разрабатываемой в РосНИПЧИ «Микроб». Применение «сэндвич»-ТИФА на основе поликлональных антител к ЛПС-ТХУ позволяло определять изучаемый антиген в почасовых ПБК штаммов V.cholerae 0139 PI6064 и М045 даже при относительно невысокой концентрации бактерий (10 млрд/мл), когда регламентированный способ определения данного антигена - РИД был неэффективным, а также выявлять динамику увеличения концентрации ЛПС, являющегося основным иммуногеном V.cholerae [199, 234, 238], в ходе выращивания.

Несмотря на успешное применение ТИФА для контроля синтеза ЛПС при масштабированном культивировании вибрионов 0139 серогруппы более рациональным, с нашей точки зрения, было использование для этого другого варианта иммуноанализа - ДИА, который не только отличается экспрессностыо и экономичностью [90], но и позволяет при фиксации образцов на НЦМ 96° этанолом осуществлять одновременное обеззараживание ПБК. Это дает возможность проводить анализ непосредственно после забора почасовых ПБК из реактора, т.е. осуществлять мониторинг выращивания, тогда как для постановки ТИФА их следует предварительно обеззараживать в соответствии с требованиями биологической безопасности, что позволяет получить лишь ретроспективные данные об изменении концентрации иммуногенов в ходе глубинного культивирования. Поскольку эффективность химической холерной вакцины определяется присутствием в ней наряду с ЛПС, обеспечивающим формирование антибактериального иммунитета [109, 199, 234, 238], таких протектнвных антигенов, как КАГ, экзотоксин, ферменты, факторы колонизации [41, 234], нами были предложены варианты ДИА, основанные на использовании поликлональных антител различной специфичности, перспективные для контроля синтеза соответствующих ряда иммуногенов V.cholerae 0139. ДИА оказался пригодным для изучения особенностей продукции не только ЛПС, но и КАГ, ХТ, НД, адгезина. Эффективность данной модификации нммуноферментного анализа была показана как при реакторном выращивании, так и при экспериментальной отработке условий культивирования штамма М045 на средах с различным содержанием пептона.

Не менее успешным явилось использование в ДИА полученных нами четырех разноэпитопных МКА для изучения закономерностей экспрессии комплементарных им эпитопов основных иммуногенов V.cholerae 0139. Характерные изменения синтеза соответствующих антигенных детерминантов позволяли судить об особенностях накопления иммунореактнвных субстанций на разных этапах реакторного выращивания производственных штаммов, что также может способствовать оптимизации процедуры наблюдения за процессом масштабированного культивирования V.cholerae 0139.

Обобщая весь представленный в настоящей диссертационной работе материал, следует отметить, что применение современных методов иммунохимии и молекулярной иммунологии в сочетании с приемами классической иммунологии при изучении антигенной структуры холерного вибриона 0139 серогруппы позволило выявить ряд интересных нммунохимическнх особенностей, изучить молекулярную организацию и частично охарактеризовать эпитопную композицию его основных диагностически значимых антигенов - ЛПС и КАГ, а также решить некоторые вопросы, связанные с разработкой серовароспецифическнх диагностических тест-систем и методов контроля продукции иммуногенов штаммами - продуцентами компонентов химической холерной вакцины против V.cholerae 0139.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Терешкина, Наталия Евгеньевна, Саратов

1. Абрамова Е.Г., Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Громова О.В. Получение диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов к Vibrio cholerae 0139 // Сб. науч. трудов, посвящ. 50-летию Дагестанской противочумной станции. -Махачкала. - 2002. - С. 96-99.

2. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов: Изд-во СГУ, 1981.

3. Адамов А.К., Воронежская Л.Г., Гальцева Г.В., Мединский Г.М., Смоликова Л.М., Сомова А.Г., Усов Г.А., Щуркина И.И. Методические указания по серологическому типированию вибрионов, не агглютинирующихся О-холерной сывороткой. Саратов, 1980.

4. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов: Изд-во СГУ, 1981.

5. Адамов А.К., Щуркина И.И., Александрова Н.М. Серотипирование НАГ-внбрионов группы Саказаки, выделенных в разных странах // Проблемы ООИ. -Саратов, 1974. Вып. 3(37). - С. 76-78.

6. Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Маркина О.В., Чемисова О.С., Сальникова О.И., Ишина Е.В. Получение диагностических флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов к Vcholerae 0139 серовара // Клин. лаб. диагностика. 2002. -№ 12.-С. 50-51.

7. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Мазрухо Б.Л., Маркина О.В., Чемисова О.С., Лобанов В.В. Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholerae Ol39 // Биотехнология. 2002. - № 2. - С. 79-84.

8. Алексеева Л.П., Черепахина И.Я., Сальникова О.И., Бурлакова О.С. Изучение антигенных взаимосвязей типичных и R-форм холерных вибрионов на основе моноклональных антител // ЖМЭИ. 1998. - № 4. - С. 9-12.

9. Андрусенко И.Т., Лобанов В.В., Ермолов В.И., Ведьмина Е.А., Пастернак H.A., Скирда Г.И. Изучение ультраструктуры энтеропатогенных и непатогенных НАГ вибрионов // Острые кишечные инфекции. Респ. сборник. — Ленинград, 1980. -Вып. 4.-С. 118-122.

10. Антитела. Методы: В 2-х кн. / Под ред. Д. Кэтти. Т. 1-2. М.: Мир, 1991.

11. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях.-Л.: Медгиз, 1962.

12. Белая Ю.А., Ценева Г.Я., Сергеева Н.С., Петрухин В.Г. Иммуноэлектрофоретический анализ антигенного состава иерсиний // ЖМЭИ. -1989,-№8.-С. 21-24.

13. Биологические мембраны. Методы. / Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза. М.: Мир, 1990.

14. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко А.М., Шмидт Е.В. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. М.: Наука, 1983.

15. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М.: МИА, 2002.

16. Борисов Л.Б., Фрейдлин И.С. Краткий справочник микробиологической терминологии. Л.: Медицина, 1975.

17. Васюренко З.П., Падченко А.Г., Рубан Н.М., Алексеенко В.В., Доброштан Е.В., Гурлева Г.Г., Опанасенко И.С. Состав клеточных жирных кислот бактерий семейства Vibrionaceae //ЖМЭИ. 1995.-№ 1.-С. 10-15.

18. Вейнблат В.И., Гусева Н.П., Ананьев В.В., Самыгин В.М. Липид препаратов капсульного антигена чумного микроба // Микробиол., лабораторная диагностика и специф. профилактика карантинных инфекций. Саратов, 1989. - С. 90-92.

19. Видяева H.A., Кутырев В.В., Проценко O.A., Олейников П.Н., Анисимов П.И. Экспрессия антигенов чумного микроба, кодируемых плазмидой Ca -зависимости // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1990. - № 6. - С. 17-20.

20. Волгарева Г.М., Свиридов В.В. Некоторые вопросы поддержания гибридом in vivo //ЖМЭИ. 1987. - № 1. - С. 90-93.

21. Воронежская Л.Г. Холерные вибрионы не Ol группы (биологическая характеристика): Автореф. дне. докт. мед. наук. Саратов, 1994.

22. Высоцкий В.В. Ультраструктура бруцелл. Сообщение V. Процесс диссоциации // ЖМЭИ. 1968. - № 8. - С. 42-47.

23. Гашимова П.Ш., Уварова Р.Н., Степанова Л.К., Иванов К.К. Выделение, очистка и биохимическое изучение поверхностных антигенов из Salmonella Stanley II ЖМЭИ. 1970. - № 2. - С. 37-42.

24. Гинсбург H.H., Федотова Ю.М. Сравнительное изучение вакцинного и вирулентного сибиреязвенных штаммов в культуре тканей эмбриона человека // ЖМЭИ.-1963.- № 11.-С. 3-7.

25. Голубинский Е.П., Загоскина Т.Ю., Марков ЕЛО., Чарная Т.Г., Алексеева Л.А., Коха A.M. Некоторые свойства липополисахарида возбудителя бруцеллеза // Сб. тез. докл. науч. конф. «Соврем, аспекты профил. зоонозн. инфекций». -Ставрополь, 1991.-С. 9-10.

26. Гремякова Т.А. Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумныхнммунопрофилактических препаратов: Автореф. дне. . докт. мед. наук. — Москва, 2004.

27. Громова О.В. Изучение О-антнгена холерного вибриона и биохимические аспекты снижения токсичности: Автореф. дис. канд. мед. наук. — Саратов, 1995.

28. Далин М.В., Фиш Н.Г. Итоги науки и техники. Микробиология. Т. 16. Адгезины микроорганизмов. М., 1985.

29. Девдариани 3.JI. Научно-методические основы конструирования чумных моноклональных иммуноглобулиновых реагентов с использованием гнбрндомной технологии: Автореф. дне. докт. мед. наук. Саратов, 1993.

30. Девдариани 3.JL, Федорова В.А. Прижизненное неоднократное получение асцитической жидкости у зараженных гибридомами мышей // Лаб. дело. — 1991. -№6.-С. 79.

31. Дерябин П.Г., Логинова Н.В., Лебедева Г.А., Новохатский A.C., Малахова И.В. Моноклональные антитела к вирусу японского энцефалита в асцитных препаратах гибридом //Антибиотики и мед. биотехнол. 1986. - № 1. - С. 24-28.

32. Джапаридзе М.Н., Мартене JI.A., Дертева И.И., Зарецкая Г.В., Караева JI.T., Никитина Г.П. Изучение нейраминидазы в вакцине холероген-анатоксин // Генетика и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1980. - С. 48-52.

33. Джапаридзе М.Н., Наумов A.B., Никитина Г.П., Мелещенко М.В., Доброва Г.В., Заворотных В.И., Грачева В.П., Захарова T.JI. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры // ЖМЭИ.- 1991.-№ 4.-С. 31-33.

34. Домарадский И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы. М.: Медицина, 1998.

35. Дубровская И.И. Исследование белковых компонентов антигенных комплексов бруцелл // Биохимия. 1957. - Т. 22, вып. 5. - С. 924-928.

36. Дубровская И.И. Изменение химического состава бруцелл и их антигенных комплексов под влиянием фага. В кн. Изменчивость микроорганизмов и бактериофагия. М.: «Медгиз», 1960. С. 307-314.

37. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. -М.: Высш. шк., 1991.

38. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Наука, 1977.

39. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. -М.: Медицина, 1985.

40. Елинов Н.П. Химическая микробиология. М.: Высшая школа, 1989.

41. Захарова И.Я. Эндотоксины О-антигены кишечной палочки. - Киев, 1980.

42. Захарова И.Я., Косенко JT.B. Методы изучения микробных полисахаридов. -Киев, 1982.

43. Захарова T.JI. Создание и свойства штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией протективных антигенов: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1997.

44. Захарова T.JI., Джапаридзе М.Н., Смирнова Н.И. Создание штаммов холерного вибриона сероваров Инаба и Огава с повышенной адгезивной активностью // Матер. Российск. науч. конф. «Иммуиол. и специфич. профил. особоопасн. инф.»-Саратов, 1993.-С. 179-180.

45. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. М.: Медицина, 1987.

46. Иммунологические методы исследований / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1988.

47. Иммуноферментный анализ / Под ред. Нго Т., Ленхоффа Г. М.: Мир, 1988.

48. Ишина Е.В., Мазрухо Б.Л. КоА диагностикум для серологической идентификации холерных вибрионов 0139 серогруппы // Материалы науч,-практич. конф., поев. 100-летию образов, противочумн. службы России. Т. 2. -Саратов.-1997.-С. 56.

49. Карагулова С.Т. Ускоренный метод выявления сальмонелл по их специфическим термостабильным О-антигенам у людей и из объектов внешней среды: Автореф. дис. канд. мед. наук. Москва, 1994.

50. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. -М.: Медицина, 1976.

51. Книрель Ю.А., Кочарова H.A. Структура и свойства общего полисахаридного антигена бактерий Pseudomonas aeruginosa II Биохимия. 1995. -Т. 60, вып. 12.-С. 1964-1976.

52. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. 1. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (Обзор)//Биохимия. 1993. - Т. 58, вып. 2. - С. 166-181.

53. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (Обзор) // Там же. С. 182-201.

54. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов (Обзор) // Там же. 1994. - Т. 59, вып. 12. - С. 1784-1851.

55. Коников А.П., Жидкова В.А. Фракционирование антигенов палочки Бреслау с помощью фенола//ЖМЭИ. 1942. -№ 1/2. - С. 108-115.

56. Коробкова Е.И. Микробиология и эпидемиология холеры. М.: Медгиз, 1959.

57. Король В.В., Рожков Е.В., Гофман E.JI., Ларионова Л.В. Антигены адгезии холерных вибрионов и перспективы их применения для профилактики холеры // Холера. Ростов-на-Дону, 1992. - С. 89-92.

58. Красильников А.П. Микробиологический словарь-справочник. Минск: «Беларусь», 1986.

59. Лабораторная диагностика холеры: Методические указания МУ 4.2.1097-02. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002.

60. Левина E.H., Кац Л.Н. Антигенная структура вакцинного штамма Bacillus anthracis II ЖМЭИ. 1964. - № 10. - С. 85-89.

61. Лобанов В.В., Андрусенко И.Т., Милютин В.Н. Электронная микроскопия холерных вибрионов из содержимого кишечника зараженных кроликов-сосунков // ЖМЭИ. 1975. - № 7. - С. 90-92.

62. Ломов Ю.М., Мазрухо Б.Л., Мишанькнн Б.Н., Авроров В.П., Власов В.П., Кудрякова Т.А., Кондратенко Т.А., Швагер М.И. Случай завоза на территорию России холеры, вызванной новым сероваром // ЖМЭИ. 1995 (Приложение). - С. 97-101.

63. Мазрухо А.Б. Изучение продукции и свойств энтеротоксина холерных вибрионов 0-139 серовара: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1997.

64. Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Серодиагностика холеры, обусловленной вибрионами «Бенгал»: препараты для идентификации // Матер. Второй Всероссийск. конф. «Гомеостаз и инфекционный процесс», 20-21 мая 1998 г. -Саратов, 1998.-С. 45.

65. Мазрухо Б.Л., Ишина Е.В. Холерный эритроцитарный диапюстикум на основе лизата холерных вибрионов 0139 серогруппы // Материалы науч.-практич. конф., поев. 100-летию образов, противочумн. службы России. Т. 2. Саратов. -1997.-С. 193.

66. Маянский А.Н. Микробиология для врачей (очерки патогенетической микробиологии). Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 1999.

67. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 1999.

68. Мецлер Д. Биохимия. Т. 1. — М.: Мир, 1980.

69. Моноклональные антитела / Под ред. Кеннета Р.Г., Мак-Керна Т.Дж., Бетхол К.Б.-М.: Медицина, 1983.

70. Моул С.Е., Лейн Д.П. Получение моноклональных антител к гибридным белкам, продуцируемым в клетках E.coli II В кн.: Д. Гловер. Новое в клонировании ДНК. Методы. -М.: Мир, 1989.

71. Новые методы иммуноанализа. Под ред. Коллинза У.П. М.: Мир, 1991.

72. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. — М.: Медицина, 1975.

73. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.

74. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1982.

75. Петрова JI.C., Гончарова Н.С., Карасева З.Н., Адамов А.К. Влияние крахмала на антигенную структуру, вирулентность и выживаемость в желудочном соке холерных, Эль Тор и парахолерных вибрионов // Пробл. ООИ. Вып. 1(17). - 1971. -С. 136-143.

76. Плейфэр Д. Наглядная иммунология. М.: ГЭОТАР «Медицина», 1998.

77. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР «Медицина», 1999.

78. Пол У. Иммунология: В 3-х т. Т. 1-3. -М.: Мир, 1987-1989.

79. Практикум по биохимии / Под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А. Изд-во Московского ун-та, 1989.

80. Практическая химия белка / Под ред. А. Дарбре. М.: Мир, 1989.

81. Рингерц Н., СэвиджР. Гибридные клетки. -М.: Мир, 1979.

82. Роит А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000.

83. Самелня Ж.Г. Изучение антигенной структуры различных серовариантов возбудителя псевдотуберкулеза с использованием поли- и моноклональных антител: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 2002.

84. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985.

85. Смирнова Н.И. Адгезины Vibrio cholerae: фенотипический анализ и генетический контроль синтеза // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1995. -№ 3. - С. 18-26.

86. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139-серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 2002. - № 3. - С. 23-33.

87. Смирнова Н.И., Кокушкин А.Н. Эпидемически значимые штаммы холерного вибриона: генетические особенности и возникновение // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 2001. - № 3. - С. 25-30.

88. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Чеховская Г.В., Ерошенко Г.А., Лазовский Ю.В., Захарова Т.Л. Штаммы Vibrio cholerae серогрупп Ol и 0139 продуценты основных протектнвных антигенов //ЖМЭИ. - 2000. - № 3. - С. 47-51.

89. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И., Ливанова Л.Ф., Ерошенко Г.А., Остроумова Н.М. Фенотипический анализ двух морфологически разных типов колоний Vibrio cholerae 0139 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1995.-№3.-С. 30-34.

90. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. -М.: Медицина, 2001.

91. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа, 1996.

92. Степаншина В.Н., Коробова О.В., Степаншин Ю.Г., Светоч Э.А., Гусев В.В. Иммунохимические свойства белка капсулы Pasteurella multocida и его роль в процессе диссоциации микроба // Биотехнология. 1996. - № 11. - С. 16-21.

93. Сыворотка диагностическая холерная Ol39 адсорбированная жидкая для реакции агглютинации на стекле // Здоровье населения и среда обитания. 1994. -№4.-С. 22.

94. Таран И.Ф., Лямкин Г.И. Бруцеллез (микробиология, иммунология, эпидемиология, профилактика). Ставрополь, 1996.

95. Уткин Д.В., Девдариани З.Л., Федорова В.А., Дроздов И.Г. Получение и характеристика моноклональных антител к различным серовариантам Yersinia enterocolitica II Биотехнол. 2004. - № 1. - С. 91 -96.

96. Федорова В.А. Получение и научно-прикладное значение моноклональных антител к липополисахарнду Yersinia pestis: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Саратов, 1994.

97. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л. Иммуноферментная тест-система для детекции Vibrio cholerae 0139 серовара // ЖМЭИ. 1998. - № 5. - С. 77-80.

98. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л., Джапаридзе М.Н. Иммунохимическая характеристика липополисахарида Vibrio cholerae 0139сероварианта и диагностическая значимость полученных к нему антител // Биотехнология. 1996. - № 11. - С. 33-37.

99. Федорова В.А., Девдариани 3.JI. Видо-, биоваро- и серовароспецифические полипептиды Vibrio cholerae II Материалы науч.-практнч. конф., поев. 100-летию образов, противочумн. службы России. Т. 2. Саратов. - 1997. - С. 229-230.

100. Федорова В.А., Девдариани 3.JI., Громова О.В., Ливанова Л.Ф. Некоторые иммунохимнческие и иммунобиологические свойства капсульного антигена Vibrio cholerae 0139 серовара // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1997. - № 3. -С. 18-19.

101. Федорова В.А., Пуденкова О.С., Громова О.В., Девдариани З.Л. Эпитопный анализ липополисахарида Vibrio cholerae 0139 // Сб. научн. трудов, посвящ. 50-летию Дагестанской противочумн. станции. Махачкала, 2002. - С. 99-101.

102. Хусаинова С.А. К вопросу о контроле активности сальмонеллезных О-монодиагностнкумов//Тр. ГКИМБП. Т. 1.- 1971.-С. 14-15.

103. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клин, микробиол. и антнмикробн. терапия. -2002. Т. 4. - № 3. - С. 248-266.

104. Чеховская Г.В. Генетический анализ хромосомной области Vibrio cholerae 0139, содержащей гены О-антигена: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1997.

105. Чеховская Г.В., Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И. Бескапсульные мутанты Vibrio cholerae 0139 серогруппы: получение, идентификация и использование для приготовления диагностической 0139 антисыворотки // ЖМЭИ. 2000. -№ 1. — С. 34-37.

106. Шиманюк Н.Я., Дуванова О.В., Сучков И.Ю., Мишанькин Б.Н. Нейраминидаза Vibrio cholerae 0139 «Бенгал»: обнаружение, очистка и некоторые свойства // Биотехнология. 1999. — № 3. - С. 56-62.

107. Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю., Мишанькин Б.Н. Нейраминидазная активность у штаммов холерных вибрионов серовара 0139 «Бенгал» // Акт. пробл. профил. особо опасн. и прир.-очагов. инфекц. болезней. Иркутск, 1994. - С. 175.

108. Щуркина И.И. Усовершенствование серологической идентификации энтеропатогенных вибрионов: Автореф. дис. докт. мед. наук. Саратов, 1981.

109. Щуркина И.И., Адамов А.К., Лукьянова О.И., Казакова Е.С. Антигенная структура холерного вибриона не 01 группы М045 0139 серовара // Деп. в ВИНИТИ 19.07.95 г. № 2220. В95., 1995.

110. ЭльпинерИ.Е. Биофизика ультразвука.-М.: Наука, 1973.

111. Яровая Л.М., Алешкин В.А. Новые данные о химической структуре липополисахаридов и практические перспективы // ЖМЭИ. 1991. - № 3. - С. 7378.

112. Albert M.J. Epidemiology and molecular biology of Vibrio cholerae 0139 Bengal I I Indian J. Med. Res. 1996. - Vol. 104. - P. 14027.

113. Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 Bengal // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. -P. 2345-2349.

114. Albert M.J., Ansaruzammen M., Bahdhan P.K., Rarique A.S.G. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - Vol. 42. - P. 38-40.

115. Albert M.J., Islam D., Nahar S., Qadri F., Falklind S., Weintraub A. Rapid detection of Vibrio cholerae 0139 Bengal in stool specimens by PCR // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 1633-1635.

116. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S., Faruque A.S.G., Ansaruzzaman M., Faruque S.M., Sack R.B. A large outbreak of clinical cholera due to Vibrio choleras non Ol in Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 704.

117. Aim R.A., Braun G., Morona R., Manning P.A. Detection of OmpA-like protein in Vibrio cholerae IIFEMS Microbiol. Lett. 1986. - Vol. 37. - P. 99-104.

118. Amaro C., Biosca E.G., Fouz B., Toranzo A.E., Garay E. Role of iron, capsule, and toxins in the pathogenicity of Vibrio vulnificus biotype 2 for mice // Infect. Immun. -1994.-Vol. 62.-P. 759-763.

119. Ames G. F.-L., Spudich E.N., Nikaido H. Protein composition of the outer membrane of Salmonella typhimuriunr. effect of lipopolysaccharide mutations // J. Bacteriol. 1974. - Vol. 117. - P. 406-416.

120. Apicella M.A. Immunological and biochemical studies of meningococcal C polysaccharides isolated by diethylaminoethyl chromatography // J. Immunol. 1976. -Vol. 14.-P. 106-113.

121. Ashbaugh C.D., Albert! S., Wessels M.R. Molecular analysis of the capsule gene region of group A Streptococcus: the hasAB genes are sufficient for capsule expression // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 90. - P. 4955-4959.

122. Atassi M.Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites // Eur J Biochem. 1984. - Vol. 145. - P. 1-20.

123. Aucken H.M., Pitt T.L. Lipopolysaccharide profile typing as a technique for comparative typing of gram-negative bacteria // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31. -P. 1286-1289.

124. Aucken H.M., Wilkinson S.G., Pitt T.L. Identification of capsular antigens in Serratia marcescens //J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P. 59-63.

125. Avakyan A.A., Katz L.N., Levina K.N., Pavlova I.B. Structure and composition of the Bacillus anthracis capsule // J. Bacteriol. 1965.-Vol. 90.-P. 1082-1095.

126. Babb J.L., Cummins C.S. Encapsulation of Bacteroides species // Infect. Immun.- 1978.-Vol. 19.-P. 1088-1091.

127. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E., Meyer E., Meyer K.F. Studies on immunisation against plague. I. The isolation and characterisation of the soluble antigen of the Pasteurella pestisll J. Immunol. 1952. - Vol. 68. - P. 131-145.

128. Banemann A., Deppisch H., Gross R. The lipopolysaccharide of Bordctella bronchiseptica acts as a protective shield against antimicrobial peptides // Infect. Immun.- 1998. Vol. 66. - P. 5607-5612.

129. Bartelt M.A., Duncan J.L. Adherence of group A streptococci to human epithelial cells // Infect. Immun. 1978. - Vol. 20. - P. 200-208.

130. Beher M.G., Schnaitman C.A., Pugsley A.P. Major heat-modifiable outer membrane protein in gram-negative bacteria: comparison with the OmpA protein of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1980. - Vol. 143. - P. 906-913.

131. Bhat N.M., Bieber M.M., Chapman C.J., Stevenson F.K., Teng N.N.H. Human antilipid A monoclonal antibodies bind to human B cells and the i antigen on cord red blood cells // J. Immunol. 1993. - Vol. 151. - P. 5011 -5021.

132. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouw R.D., Mool F.R. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis // The EMBO Journal. 1995. - Vol. 14. - P. 209-216.

133. Bik E.M., Bunschoten A.E., Willems R.J.L., Chang A.C.Y., Mooi F.R. Genetic organization and functional analysis of the otn DNA essential for cell-wall polysaccharide synthesis in Vibrio cholerae 0139 // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20. -P. 799-811.

134. Bik E.M., Gouvv R.D., Mooi F.R. DNA fingerprinting of Vibrio cholerae strains with a novel insertion sequence element: a tool to identify epidemic strains // J. Clin. Microbiol. 1996.-Vol. 34.-P. 1453-1461.

135. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Extraction d'un complexe toxique et antigénique a partir du bacille d'aertrycke // Comp. Rend. Soc. Biol. 1933. - Vol. 114. -P. 307-310.

136. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Technique pour la préparation des polysaccharides microbiens spécifiques // Comp. Rend. Soc. Biol. 1933. - Vol. 113.-P. 490-492.

137. Boyce J.D., Adler B. The capsule is a virulence determinant in the pathogenesis of Pasteurella multocida M1404 (B:2) // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 34633468.

138. Brade L., Brandenburg K., Kuhn H.-M., Kusumoto S., Mâcher I., Rietschel E.T., Brade H. The immunogenicity and antigenicity of lipid A are influenced by its physicochemical state and environment // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55. - P. 26362644.

139. Brade L., Rietschel E.T., Kusumoto S., Shiba T., Brade H. Immunogenicity and antigenicity of synthetic Escherichia coli lipid A // Infect. Immun. 1986. - Vol. 51. - P. 110-114.

140. Brockhaus M., Magnani J.L., Blaszczyk M., Steplevvski Z., Korpowski H., Karlsson K.-A., Larson G., Ginsburg V. // J. Biol. Chem. 1981. - Vol. 256. - P. 132313225.

141. Burrows W., Pollitzer R. Laboratory diagnosis of cholera // Bull. Wld. Hlth. Org. 1958.-Vol. 18.-P. 275-290.

142. Chae C.H., Gentry M.J., Confer A.W., Anderson G.A. Resistance to host immune defense mechanisms afforded by capsular material of Pasteurella haemolytica, serotype 1 //Vet. Microbiol. 1990.-Vol. 25.-P. 241-251.

143. Chang H.S., Sack D.A. Detection of anti-lipopolysaccharide antibodies to Vibrio cholerae 01 and 0139 using a novel microtiter limulus amebocyte lysate (LAL) assay // Clin. Chem. Acta. -2001. Vol. 312. - P. 49-54.

144. Chitnis D.S., Sharma K.D., Kamat R.S. Role of somatic antigen of Vibrio cholerae in adhesion to intestinal mucosa // J. Med. Microbiol. 1982. - Vol. 5. - P.53-61.

145. Cholera in 1993 Part 1 //Wkly Epidem. Rec. - 1994. - Vol. 9. - P. 205-212.

146. Cholera in 1993 Part II //Wkly Epidem. Rec. - 1994. - Vol. 9. - P. 213-216.

147. Cholera Working Group, International Centre for Diarrhoeal Diseases Research, Bangladesh // Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 387-390.

148. Comstock L.E., Pantosti A., Kasper D.L. Genetic diversity of the capsular polysaccharide C biosynthesis region of Bacteroides fragilis I I Infect. Immun. 2000. -Vol. 68.-P.6182-6188.

149. Cornelis G.R., Boland A., Boyd A.P., Geuijen C„ Iriarte M., Neyt C., Sory M.-P., Stainier I. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol, and Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1315-1352.

150. Cox A.D., Brisson J.-R., Varma V., Perry M.B. Structural analysis of the lipopolysaccharide from Vibrio cholerae 0139 // Carbohydr. Res. 1996. - Vol. 290. -P. 43-58.

151. Dassy B., Stringfellow W.T., Leib M., Fournier J.M. Production of type 5 capsular polysaccharide by Staphylococcus aureus grown in semisynthetic medium // J. Gen. Microbiol.-1991.-Vol. 137.-P. 1155-1162.

152. Davies D.A.L. A specific polysaccharide of Pasteurella pestis I I Biochem. J. -1955.-Vol. 63.-P. 105-116.

153. Dubos R.J., Schaedler R.W. Reversible changes in the susceptibility of mice to bacterial infections. 1. Changes brought about by infection of pertussis vaccine or of bacterial endotoxin // J. Exp. Med. 1956. - Vol. 104. - P.53-65.

154. Dumontier S., Berche P. Vibrio cholerae 022 might be a putative source of exogenous DNA resulting in the emergence of the new strain of Vibrio cholerae 0139 // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 164. - P. 91-98.

155. Evans D.G., Evans D.J., Clegg S., Rayley J.A. Purification and characterization of the CFA/1 antigen of enterotoxigenic Escherichia coli II Infect.Immun. 1979. - V. 25.-№2.-P. 738-748.

156. Falklind S., Stark M., Albert M.J., Uhlen M., Lundeberg J., Weintraub A. Cloning and sequence of a region of Vibrio cholerae 0139 Bengal and its use in PCR-based detection // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 2904-2908.

157. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae II Microbiol, and Molecul. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1301-1314.

158. Fattom A.I., Sarwar J., Ortiz A., Nazo R. A Staphylococcus aureus capsular polysaccharide (CP) vaccine and CP-specific antibodies protect mice against bacterial challenge // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 1659-1665.

159. Favre D., Cryz S.J., Viret J.-F. Construction and characterization of a potential live oral carrier-based vaccine against Vibrio choleare 0139 // Infect. Immun. 1996. -Vol. 64.-P. 3565-3570.

160. Favre-Bonte S., Joly B., Forestier C. Consequences of reduction of Klebsiella pneumoniae capsule expression on interactions of this bacterium with epithelial cells // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 554-561.

161. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Development, characterisation and diagnostic application of monoclonal antibodies against Yersinia pestis fibrinolysin and coagulase // J. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 49. - P. 261-269.

162. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. New genes involved in Yersinia pestis fraction I biosynthesis // J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50. - P. 969-978.

163. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. The interaction of Yersinia pestis with erythrocytes//J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51.-P. 150-158.

164. Finlay B.B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited // Microbiol, andMol. Biol. Rev. 1997.-Vol. 61.-P. 136-169.

165. Galanos C., Freudenberg M.A., Jay F., Nercar D., Veleva K., Brade H., Strittmatter W. Immunogenic properties of lipid A // A. Rev. Infect. Dis. 1984. - Vol. 6.-P. 546-552.

166. Galanos C., Luderitz O., Rietschel E.T., Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. 1969. - Vol. 9. - P. 245-249.

167. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. Preparation and properties of antisera against the lipid-A component of bacterial lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. -1971.-Vol. 24.-P. 116-122.

168. Galfre G., Howe S.C., Milstein C., Butcher G.W., Howard J.C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines // Nature. 1977. - Vol. 266.-P. 550.

169. Gaston M.A., Pitt T.L. O-antigen specificities of the serotype strains of Serratia marcesccns II J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27. - P. 2697-2701.

170. Geme St. J.W. Ill, Falkow S. Loss of capsule expression by Haemophilus influenzae type b results in enhanced adherence to and invasion of human cells // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 1325-1333.

171. GlosniCka R., Gruszkiewicz E. Chemical composition and biological activity of the Yersiniapestis envelope substance // Infect. Immun. 1980. - Vol. 30. - P. 506-512.

172. Goldman R.C., White D., Leive L. Identification of outer membrane proteins, including known lymphocyte mitogens, as the endotoxin protein of Escherichia coli Olll//J. Immunol.-1981.-Vol. 127.-P. 1290-1294.

173. Gunawardena A., Fiore C.R., Johnson J.A., Bush C.A. Conformation of a rigid tetrasaccharide epitope in the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae 0139 // Biochemistry. 1999.-Vol. 170.-P. 12062-12071.

174. Harvill E.N., Preston A., Cotter P.A., Allen A.G., Maskell D.J., Miller J.F. Multiple roles for Bordetella lipopolysaccharide molecules during respiratory tract infection // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 6720-6728.

175. Haseley S.R., Hoist O., Brade H. Structural and serological characterisation of the O-antigenic polysaccharide of the lipopolysaccharide from Acinetobacter strain 90 belonging to DNA group 10 // Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 245. - P. 470-476.

176. Helmerhorst E.J., Maaskant J.J., Appelmelk B.J. Anti-lipid A monoclonal antibody Centoxin (HA-1A) binds to a wide variety of hydrophobic ligands // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 870-873.

177. Hendy A., Toivanen P., Skurnik M. Lipopolysaccharide O side chain of Yersinia enterocolitica 0:3 is an essential virulence factor in an orally infected murine model // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 870-875.

178. Hill A.W., Shears A.L., Hibbitt K.J. Increased antibacterial activity against Escherichia coli in bovine serum after the induction of endotoxin tolerance // Infect. Immun. 1976. - Vol. 14. - P. 257-265.

179. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacterid. -1983. Vol. 154. - P. 269-277.

180. Hoist O., Aucken H.M., Seltmann G. Structural and serological characterization of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide from proposed new serotype of Serratia marcescens I I J. Endotox. Res. 1997. - Vol. 4. - P. 215-220.

181. Ivanoff B. Cholera // Working papers of Global programme for Vaccine and Immunization. WHO, Geneva, 1997.

182. Janeway C.A., Travers P. Immunobiology. The immune system in health and disease. Current Biol. Ltd., London, UK, 1997.

183. Jesudason M.V., Cherian A.M., John T.J. Bloodstream invasion by Vibrio cholerae 0139 //Lancet. 1993. - Vol. 342. -P. 431.

184. Johns M.A., Bruins S.C., McCabe W.R. Immunization with R mutants of Salmonella minnesota. II. Serological response to lipid A and the lipopolysaccharide of the Re mutants // Infect. Immun. 1977. - Vol. 17. - P. 9-15.

185. Johnson J.A., Panigrahi P., Morris J.G. Non-01 Vibrio cholerae NRT36S produces a polysaccharide capsule that determines colony morphology, serum resistance and virulence in mice //J. Infect. Immunol. 1992. - Vol. 60. - P. 864-869.

186. Johnson K.J., Perry M.B. Improved techniques for the preparation of bacterial lipopolysaccharide // Can. J. Microbiol. 1976. - Vol. 22. - P. 29-34.

187. Jonson G., Osek J., Svennerholm A.-M., Holmgren J. Immune mechanisms and protective antigens of Vibrio cholerae 0139 as a basis for vaccine development // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 3778-3785.

188. Kamble T.K., More S.R., Chavan S.S., Kulkarni N.D., Lodha N.S., Kamble A.S. Clinical profile of non-01 strain 0139 of Vibrio cholerae in the region of Ambajogai, Maharashtra // J. Assoc. Physicians India. 2000. - Vol. 48. - P. 505-506.

189. Kaniga K., Tucker S., Trollinger D., Galán J.E. Homologs of the Shigella IpaB and IpaC invasins are required for Salmonella typhimurium entry into cultured epithelial cells//J. Bacteriol.- 1995.-Vol. 177.-P. 3965-3971.

190. Kantor E., Luxenberg J.S., Lucas A.H., Granoff D.M. Phase 1 study of the immunogenicity and safety of conjugated Haemophilus influenzae type b vaccines in the eldery//Vaccine.- 1997.-Vol. 15.-P. 129-132.

191. Kaper JB., Morris J.G., Levine M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. -Vol. 8.-P. 48-86.

192. Kasper D.L. The polysaccharide capsule of Bacteroides fragilis subspecies fragilis: immunochemical and morphologic definition //J. Infect. Dis. 1976. - Vol. 133. - P. 79-87.

193. Keppie J., Harris-Smith P.W., Smith H. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. IX. Its aggressins and their mode of action // Brit. J. Exptl. Pathol. -1963.-Vol. 44.-P. 446-453.

194. Knirel Y.A., Paredes L., Jansson P.E., Weintraub A., Widmalm G., Albert M.J. Structure of the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae Ol39 synonym Bengal containing D-galactose 4,6-cyclophosphate // Eur. J. Biochem. 1995. - Vol. 232. - P. 391-396.

195. Knirel Y.A., Widmalm G., Senchenkova S.N., Jansson P.-E., Weintraub A. Structural study on the short-chain lipopolysaccharide of Vibrio cholerae Ol39 Bengal // Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 247. - P. 402-410.

196. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - Vol. 256. - P. 495-497.

197. Koplow J., Goldfine H. Alterations in the outer membrane of the cell envelope of heptose-deficient mutants of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1974. - Vol. 117. - P. 527543.

198. Kossaczka Z., Szu S.C. Evaluation of synthetic schemes to prepare immunogenic conjugates of Vibrio cholerae 0139 capsular polysaccharide with chicken serum albumin // Glycoconj. J. 2000. - Vol. 17. - P. 425-433.

199. Kreger A., DeChatelet L., Shirley P. Interaction of Vibrio vulnificus with human polymorphonuclear leucocytes: association of virulence with resistance to phagocytosis // J. Infect. Dis. 1981. - Vol. 144. - P. 244-248.

200. Kroll J.S., Hopkins I., Moxon E.R. Capsule loss in H.influenzae type b occurs by recombination-mediated disruption of a gene essential for polysaccharide export // Cell. -1988.-Vol. 53.-P. 347-356.

201. Kwan L.Y., Isaacson R.E. Identification and characterization of a phase-variable nonfimbrial Salmonella typhimurium gene that alters O-antigen production // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 5725-5730.

202. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the assembly of the Head of Bacteriophage T 4 //Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

203. Landy M., Pillemer L. Elevation of the properdin levels in mice following administration of bacterial lipopolysaccharides // J. Exp. Med. 1956. - Vol. 103. - P. 823-833.

204. Lang H.A., Palva E.T. The ompS gene of Vibrio cholerae encodes a growth-phase dependent maltoporin //Mol. Microbiol. Vol. 10. - P. 891-901.

205. Lee J.C., Park J.S., Shepherd S.E., Carey V., Fattom A. Protective efficacy of antibodies to the Staphylococcus aureus type 5 capsular polysaccharide in a modified model of endocarditis in rats //Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 4146-4151.

206. Lee D.R., Schnaitman C.A., Pugsley A.P. Chemical heterogeneity of major outer membrane pore proteins of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1979. - Vol. 138. - P. 861870.

207. Levisalles P. Nouvelle pandemic? Cholera: indictant agent 0139 // J. Int. Med. -1993. Vol. 289. - P. 51-55.

208. Leying H., Suerbaum S., Kroll H.-P., Stahl D., Opferkuch W. The capsular polysaccharide is a major determinant of serum resistance in K-l-positive blood culture isolates of Escherichia coli II Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 222-227.

209. Liu P.V., Matsumoto H., Kusama H., Bergan T. Survey of heat-stable, major somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa II Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. - Vol. 33. -P. 256-264.

210. Luderitz O., Jann K., Wheat R. Somatic and capsular antigens of gram-negative bacteria // Compr. Biochem. 1968. - Vol. 26A. - P. 105-228.

211. MacLachlan P.R., Keenleyside W.J., Dodgson C., Whitfield C. Formation of the K30 (group I) capsule in Escherichia coli 09:K30 does not require attachment to lipopolysaccharide lipid A-core //J. Bacteriol. 1993. -Vol. 175.-P. 7515-7522.

212. Martinez-Govea A., Ambrosio J., Guttierrez-Cogco L., Flisser A. Identification and strain differentiation of Vibrio cholerae by using polyclonal antibodies against outer membrane proteins. //Clin. Diagn. Lab. Immunol. -2001. Vol. 8. - P. 768-771.

213. Meno Y., Waldor M.K., Mekalanos J.J., Amako K. Morphological and physical characterization of the capsular layer of Vibrio cholerae 0139 //Arch. Microbiol. 1998. -Vol. 170.-P. 339-344.

214. Morgan W.T.J., Partridge S.M. An examination of the O-antigenic complex of Bact. typhosum II Brit. J. Exp. Pathol. 1942. - Vol. 23. - P. 151-165.

215. Morgan W.T.J., Partridge S.M. Studies in immunochemistry. 4. The fractionation and nature of antigenic material isolated from Bad. dysenteriae (Shiga) // Biochem. J. -1940.-Vol. 34.-P. 169-181.

216. Nair G.B., Ramamurthy T., Bhattacharya SX, Mukhopadhyaya A., Garg S., Bhattacharya MX, Takeda T., Shimada T., Takeda Y., Deb B.C. Spread of Vibrio cholerae 0139 Bengal in India//J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 169. - P. 1029-1034.

217. Nakamura K., Pirtle R.M., Inouye M. Homology of the gene coding for outer membrane lipoprotein within various gram-negative bacteria // J. Bacterid. 1979. -Vol. 137.-P. 595-604.

218. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxydase-labelled antibody: a new method of conjugation//J. Histochem. Cytochem.- 1974.- Vol. 22.-P. 1084-1091.

219. Nakasone N., Iwanaga M. Characterization of outer membrane protein OmpU of Vibrio cholerae Ol // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 4726-4728.

220. Nandi B., Nandy RX, Mukhopadhyaya S„ Nair G.B., Shimada T., Ghose A.C. Rapid method for species-specific identification of Vibrio cholerae using primers to the gene of outer membrane protein OmpW // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 4145-4151.

221. Nandy RX, Sengupta T.K., Mukhopadhyaya S., Ghose A.C. A comparative study of the properties of Vibrio cholerae 0139, Ol and other non-Ol strains // J. Med. Microbiol. 1995. - Vol. 42. - P. 251-257.

222. Neogy K.N., Sanyal S.N. Slime production in Vibrio cholerae strains // Bull. Calcutta School of Tropical Medicine. 1967. - Vol. XV. - P. 106-107.

223. Nilsson I.-M., Lee J.C., Bremell T., Ryden C., Tarkowski A. The role of staphylococcal polysaccharide microcapsule expression in septicemia and septic arthritis // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 4216-4221.

224. Nowotny A., Thomas S., Duron O.S. Relation of structure to function in bacterial antigens. I. Isolation methods //J. Bacteriol. 1963. - Vol. 85. - P. 418-426.

225. Okuda S., Sato M., Uchiyamo H., Takahashi H. Degradation of lipopolysaceharide of Escherichia coli by a hot phenol extraction // J. Gen. Appl. Microbiol. 1975.-Vol. 21.-P. 169-184.

226. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gels. IV. Types of reactions in coordinated systems of diffusion // Acta Pathol, et Microbiol. Scand. 1953. - Vol. 32. -P. 231-240.

227. Pantophlet R., Brade L., Dijkshoom L., Brade H. Specificity of rabbit antisera against lipopolysaccharide of Acinetobacter II J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 1245-1250.

228. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague // Clin. Microbiol. Revv. - 1997. - Vol. 10. - P. 35-66.

229. Pier G.B., Matthews W.J., Jr., Eardley D.D. Immunochemical characterization of the mucoid exopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa II J. Infect. Dis. 1983. -Vol. 147. -P.494-503.

230. Poxton I.R. Antibodies to lipopolysaccharide // J. Immunol. Methods. 1995. -Vol. 186.-P.1-15.

231. Prior J.L., Hitchen P.J., Williamson E.D., Reason A.J., Morris H.R., Dell A., Wren B.W., Titball R.W. Characterization of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis II Microb. Pathogen. 2001. - Vol. 30. - P. 49-57.

232. Qadri F., Azim T., Chovvdhury A., Hossain J., Sack R.B., Albert M.J. Production, characterization and application of monoclonal antibodies to Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal//Clin, and Diagn. Immunol. 1994.-Vol. 1.-P. 51-54.

233. Ramphal R., Pier G. Role of Pseudomonas aeruginosa mucoid exopolysaccharide in adherence to tracheal cells // Infect. Immun. 1985. - Vol. 47. - P. 1-4.

234. Raut S., Jalgaonkar S.V., Tankhivvale N.S., Agarwal V.A. Re-emergence of Vibrio cholerae 0139 serogroup during 1998 in Nagpur (Maharashtra), India // Indian J. Med. Res. 1999. - Vol. 109. - P. 1-2.

235. Reeves P.R., Hobbs M., Valvano M.A., Skurnik M., Whitfield C., Coplin D., Kido N., Klena J., Maskell D., Raetz C.R.H., Rick P.D. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature // Trends Microbiol. 1996. - Vol. 4. - P. 495-503.

236. Ried G., Hindennach I., Henning U. Role of lipopolysaccharide in assembly of Escherichia coli outer membrane proteins OmpA, OmpC and OmpF // J. Bacteriol. -1990. Vol. 172. - P. 6048-6053.

237. Roberts R.S. Preparation of endotoxin // Nature. 1966. - Vol. 209. - P.80.

238. Roberts R.S. The endotoxin of Bact. coli II J. Comp. Pathol. Therap. 1949. -Vol. 59.-P. 284-289.

239. Rui Y., Cai C., Xiao B. Simultaneous detection and differentiation of Ol classical, El Tor, 0139 and non-Ol non-0139 strains of Vibrio cholerae by using multiplex PCR // Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. Vol. 34. - P. 278-280.

240. Runnels P.L., Moon H.W. Capsule reduces adherence of Escherichia coli to isolated intestinal epithelial cells of pigs // Infect. Immun. 1984. - Vol. 45. - P. 737740.

241. Sakazaki R., Tamura K., Gomes C.Z. Serological studies on the cholerae group of Vibrios I I Jap. J. Med. Sei. Biol. 1970. - Vol. 23. - P. 13-20.

242. Sansonetti P.J. Molecular and cellular biology of Shigella flexneri invasiveness: from cell assay systems to shigellosis // Curr. Trop. Microbiol. Immunol. 1992. - Vol. 180.-P. 1-19.

243. Schreiber J.R., Basker C.J., Siber G.R. Effect of complement depletion on anticapsular-antibody-mediated immunity to experimental infection with Haemophilus influenzae type b // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55. - P. 2830-2833.

244. Selinger D.S., Reed W.P. Pneumococcal adherence to human epithelial cells // Infect. Immun. 1978. - Vol. 23. - P. 545-548.

245. Seitmann G., Beer W., Witte W., Акатов A.K., Прохоров В.Я. Изучение химических и иммуногенных свойств капсульного антигена Staphylococcus aureus. Сообщение I. Очистка и химическая характеристика капсульного антигена // ЖМЭИ. 1977. - № 6. - С. 55-58.

246. Sen K., Nikaido H. Lipopolysaccharide structure required for in vitro trimcrization of Escherichia coli OmpF porin // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P. 926928.

247. Sengupta D.K., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Antibody against the capsule of Vibrio cholerae Ol39 protects against experimental challenge // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 343-345.

248. Sengupta D.K., Sengupta T.K., Ghose A.C. Major outer membrane proteins of Vibrio cholerae and their role in induction of protective immunity through inhibition of intestinal colonization // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 4848-4855.

249. Shimada T., Sakazaki R. Additional serovars and inter-0 antigenic relationships of V.cholerae II Jap. J. Med. Sei. Biol. 1977. - Vol. 30. - P. 275-277.

250. Shimoji Y., Yokomizo Y., Sekizaki T., Mori Y., Kubo M. Presence of a capsule in Erysipelothrix rhusiopathiae and its relation for virulence in mice // Infect. Immun. -1994. Vol. 62. - P. 2806-2810.

251. Simonson J.G., Siebeling R.J. Immunogenicity of Vibrio vulnificus capsular polysaccharides and polysaccharide-protein conjugates // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61.-P. 2053-2058.

252. Sperandio V., Giron J.A., Silveira W.D., Kaper J.B. The OmpU outer membrane protein, a potential adherence factor of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1995. - Vol. 63.-P. 4433-4438.

253. Stephens D.S., Spellman P.A., Swartley J.S. Effect of the (alpha 2->8)-linked polysialic acid capsule on adherence of Neisseria meningitidis to human mucosal cells I I J. Infect. Dis. 1993. - Vol. 167. - P. 475-479.

254. Stringfellow W.T., Dassy B., Leib M., Fournier J.M. Staphylococcus aureus growth and type 5 capsular polysaccharide production in synthetic media // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 57. - P. 618-621.

255. Stroeher U.H., Jedani K.E., Dredge B.K., Morona R., Brown M.H., Karageorgos L.E., Albert M.J., Manning P.A. Genetic rearrangements in the rfb regions of Vibrio cholerae Ol and 0139 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 1037410378.

256. Stroeher U.H., Parasivam G., Dredge B.K., Manning P.A. Novel Vibrio cholerae 0139 genes involved in lipopolysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179.-P. 2740-2747.

257. Surveillance of cholera due to Vibrio cholerae 0139 // Wkly Epidem. Rec. -1994.-Vol. 9.-P. 2.

258. Talbot U.M., Paton A.W., Paton J.C. Uptake of Streptococcus pneumoniae by respiratory epithelial cells // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 3772-3777.

259. Tashima K.T., Carroll P.A., Rogers M.B., Calderwood S.B. Relative importance of three iron regulated outer membrane proteins for in vivo growth of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1996.-Vol. 64.-P. 1756-1761.

260. Thakker M., Park J.-S., Carey V., Lee J.C. Staphylococcus aureus serotype 5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 5183-5189.

261. Thome C.B., Gomez C.G., Blind G.R., Housewright R.D. Synthesis of glutamic acid and glutamyl polypeptide by Bacillus anthracis. III. Factors affecting peptide production in synthetic liquid media // J. Bacteriol. 1953. - Vol. 65. - P. 472-478.

262. Towbin H., Schoenenberger C., Ball R., Braun D.G., Rosenfelder G. Glycosphingolipid-bloting: an immunological detection procedure after separation by thin layer chromatography ( JIM 03169 ) II J. Immunol. Meth. 1984. - Vol. 72. - P. 471-479.

263. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.

264. Tsai C.M., Frasch C.F. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels//Anal. Biochem.- 1982.-Vol. 119.-P. 115-119.

265. Tsang J.C., Wang C.S., Alaupovic P. Degradative effect of phenol on endotoxin and lipopolysaccharide preparations from Serracia marcescens II J. Bacterid. 1982. -Vol. 117.-P. 786-795.

266. Vermeulen C., Cross A., Byrne W.R., Zollinger W. Quantitative relationship between capsular content and killing of K1 -encapsulated Escherichia coli II Infect. Immun. 1988. - Vol. 56. - P. 2723-2730.

267. Waldor M.K., Colvvell R., Mekalanos J.J. The Vibrio cholerae 0139 serogroup antigen includes an O-antigen capsule and lipopolysaccharide virulence determinants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 11388-11392.

268. Waldor M., Mekalanos J. Molecular probes for the detection of Vibrio cholerae 0139 // Sci. Conf. Chem. and Biol. Def. Res., Aberdeen, 15-18 Nov. 1994: Abstr. Dig. -1994.-P. 89.

269. Wasserman S.G., Losonsky G.A., Noriega F., Tacket C.O., Castaneda E., Levine M.M. Kinetics of the vibriocidal antibody response to live oral cholera vaccines // Vaccine.-1994.-1994.-Vol. 11.-P. 1000-1003.

270. Webster M.E., Sagin J.F., Landy M, Johnson A.G. Studies on the O antigen of Salmonella typhosa. I. Purification of the antigen // J. Immunol. 1955. - Vol. 74. - P. 455-465.

271. Weintraub A., Widmalm G., Jansson P., Jansson M, Hultenby K., Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 Bengal possesses a capsular polysaccharide which may confer increased virulence // Microbial. Pathogen. 1994. - Vol. 16. - P. 235-241.

272. Wessels M.R., Moses A.E., Goldberg J.B., DiCesare T.J. Hyaluronic acid capsule is a virulence factor for mucoid group A streptococci // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1991.-Vol. 88.-P. 8317-8321.

273. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Meth. Carbohyd. Chem. 1965. - Vol. 5.-P. 83-91.

274. Westphal O., Luderitz O., Bister F. Uber die extraktion von bakterien mit phenol/wasser // Z. Naturforsch. 1952. - B. 7. - S. 148-155.

275. Whitfield C. Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens // Trends Microbiol. 1995.-Vol. 3.-N. 5.-P. 178-185.

276. Whitfield C., Amor P.A., Koplin R. Modulation of the surface architecture of gram-negative bacteria by the action of surface polymer:lipid A-core ligase and by determinants of polimer chain length // 1997. Mol. Microbiol. - Vol. 23. - P. 629-638.

277. Whitnack E., Bisno A.L., Beachey E.H. Hyaluronate capsule prevents attachment of group A streptococci to mouse peritoneal macrophages // Infect. Immun. 1981. -Vol. 31.-P. 985-991.

278. Winkle S., Refai M., Rohde R. On the antigenic relationship of "Vibrio cholerae''' to "Enterobacteriaceae" //Ann. Inst. Pasteur. 1972. - Vol. 123. - P. 775-781.

279. Wright A., McConnel M., Kanegasaki S. Receptors and recognition. Ser. B. Vol. 7. Virus receptors. L.: Chapman and Hall, 1980.

280. Yamamoto T., Albert M.J., Sack R.B. Adherence to small intestines of capsulated Vibrio cholerae 0139 // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. 119. - P. 229235.

281. Yamasaki S., Shimizu T., Hoshino K., Ho S.T., Shimada T., Nair G.B., Takeda Y. The genes responsible for O-antigen synthesis of Vibrio cholerae 0139 are closely related to those of Vibrio cholerae 022 II Gene. 1999. - Vol. 237. - P. 321-332.

282. Yoshida S.-I., Ogawa M., Mizuguchi Y. Relation of capsular materials and colony opacity to virulence of Vibrio vulnificus II Infect. Immun. 1985. - Vol. 47. - P. 446-451.

283. Young V.B., Miller V.L., Falkow S., Schoolnik G.K. Sequence, localization and function of the invasin protein of Yersinia enterocolitica II Mol. Microbiol. 1990. -Vol. 4.-P. 1119-1128.

284. Zuppardo A.B., Siebeling R.J. An epimerase gene essential for capsule synthesis in Vibrio vulnificus I I Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 2601-2606.