Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение интерактома протеинкиназы MAK-V с целью характеризации ее функциональных свойств

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение интерактома протеинкиназы MAK-V с целью характеризации ее функциональных свойств"

На правах рукописи

Калиниченко Светлана Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ИНТЕРАКТОМА ПРОТЕИНКИНАЗЫ МАК-У С ЦЕЛЬЮ ХАРАКТЕРИЗАЦИИ ЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Москва 2012

005054784

005054784

Работа выполнена в лаборатории молекулярной онкогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Научный руководитель: Коробко Игорь Викторович,

доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Надеждина Елена Сергеевна,

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института белка Российской академии наук

Кантидзе Омар Леванович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Защита диссертации состоится 28 ноября 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан « » октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук

Л С- ГРабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Протеинкиназа МАК-У является одним из наименее изученных представителей семейства АМРК-подобных серин-треониновых протеинкнназ. Однако, принимая во внимание общепризнанную роль протеинкиназ как регуляторов различных внутриклеточных процессов, не подлежит сомнению ее важность как в нормальном функционировании клетки и организма, так и при патологических состояниях. Это определяет актуальность дальнейших исследований свойств и функций протеинкиназы МАК-У. Выявление молекулярных процессов, протекающих с участием протеинкиназы МАК-У, и механизмов регуляции ее активности представляет большой научный интерес как с точки зрения фундаментальной науки, так и в перспективе - для разработки способов терапии ряда заболеваний человека.

В частности, ген так-у человека расположен в локусе 21 хромосомы, ассоциированном с диабетом I типа, и по результатам транскрипционного анализа в системе, моделирующей это заболевание, протеинкиназа МАК-У потенциально может влиять на функцию р-клеток. Выяснение роли протеинкиназы МАК-У в индуцированном цитокинами разрушении р-клеток может иметь существенное значение для профилактики и сопутствующей терапии инсулин-зависимого диабета.

Помимо этого, выраженная экспрессия гена так-у во всех отделах головного мозга развивающегося эмбриона и взрослого организма, а также локализация гена так-у человека в локусе 21 хромосомы, ассоциированном с шизофренией, аутизмом и фенотипическими проявлениями синдрома Дауна, свидетельствуют о возможной роли протеинкиназы МАК-У в развитии и функционировании нервной системы. На основании имеющихся данных можно предполагать, что протеинкиназа МАК-У может участвовать в синаптической передаче сигналов посредством регуляции эндоцитоза. Однако функции протеинкиназы МАК-У в головном мозге на сегодняшний день остаются неизвестными. Выявление молекулярных процессов, протекающих в нейронах с участием протеинкиназы МАК-У, представляет большой научный интерес как для понимания ее роли в нормальном функционировании центральной нервной системы, так и для исследования ее возможных связей с патологическими состояниями, с которыми может быть ассоциирована протеинкиназа МАК-У, и, в случае их выявления, для поиска способов коррекции этих состояний.

Наконец, протеинкиназа МАК-У контролирует эмбриогенез путем регуляции сигнального пути. Нарушение регуляции этого сигнального каскада наблюдается при многих злокачественных новообразованиях и может происходить с участием протеинкиназы

1

MAK-V, уровень содержания которой в опухолевых клетках часто изменен. Особенно выражена ассоциация протеинкиназы MAK-V с возникновением и развитием опухолей молочной железы, что позволяет рассматривать ее как мишень для противоопухолевой терапии. Однако роль протеинкиназы MAK-V в канцерогенезе онкоген-специфична и, видимо, зависит от клеточного контекста. Выявление сигнальных путей с участием протеинкиназы MAK-V и понимание механизмов ее регуляции является необходимым условием для разработки методов специфичного воздействия на опухоль с использованием MAK-V в качестве мишени при терапии онкологических заболеваний.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в изучении функциональных связей протеинкиназы MAK-V в клетке. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить участие протеинкиназы MAK-V в некоторых сигнальных путях в клетках PC12TetOn с индуцибельной экспрессией MAK-V мыши.

2. Исследовать внутриклеточное распределение белка MAK-V.

3. Идентифицировать партнеры по взаимодействию протеинкиназы MAK-V.

4. Оценить функциональные следствия выявленных взаимодействий.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе было показано, что анти-апоптотическая активность протеинкиназы MAK-V мыши в клетках РС12ТеЮп при их контакте с коллагеном IV не связана с регуляцией фосфорилирования кофилина 1 и с регуляцией уровня активации сигнальных путей протеинкиназ Akt и ERK.1/2. Полученные данные исключают участие этих молекулярных процессов в опосредованном MAK-V повышении выживаемости клеток.

Впервые было показано, что протеинкиназа MAK-V взаимодействует с синаптоподином. Учитывая роль синаптоподина в дендритных шипиках, это открывает дальнейшие перспективы для изучения роли протеинкиназы MAK-V в головном мозге в свете ее возможного участия в функционировании синапсов, процессах памяти и обучения, а также в интеллектуальном развитии человека.

В работе было впервые выявлено взаимодействие протеинкиназы MAK-V и убиквитин-лигазы Nedd4 и продемонстрирована его функциональность. Установленное влияние Nedd4 на MAK-V вместе с ранее выявленной регуляторной ролью MAK-V в Wnt сигнальном пути впервые свидетельствует о роли в этом сигнальном пути убиквитин-лигазы Nedd4. Более того, поскольку убиквитин-лигаза Nedd4 вовлечена в регуляцию Notch и IGF-1R сигнальных путей, обнаруженная взаимосвязь служит основой для интеграции не

только этих сигнальных путей, но и, в дополнение к ним, Wnt сигнального пути через взаимодействие между Nedd4 и MAK-V.

Полученные в работе данные указывают и на возможные механизмы регуляции активности протеинкиназы MAK-V. Это зависимая от убиквитин-ассоциированного домена локализация на мембране, контроль уровня белка в клетке путем протеасомной деградации, ингибирование активности MAK-V убиквитин-лигазой Nedd4 и возможная ассоциация с шипиковым аппаратом дендритных шипиков посредством связывания с синаптоподином.

Таким образом, результаты работы существенно расширяют наши представления о регуляции и функциональных связях протеинкиназы MAK-V и открывают перспективы для дальнейшего изучения роли протеинкиназы MAK-V в клетке и организме. Это, в свою очередь, является необходимой предпосылкой для установления роли протеинкиназы MAK-V в патологических процессах в организме, что абсолютно необходимо для валидации MAK-V как молекулярной мишени для терапии и, в конечном итоге, для разработки новых стратегий лечения заболеваний человека, в которых протеинкиназа MAK-V может играть существенную роль, в частности, в онкологических заболеваниях.

Личный вклад автора

Основные результаты работы получены автором лично или при его непосредственном участии. Масс-спектрометрический анализ белков проведен Р.Х. Зиганшиным (ИБХ РАН, г.Москва). Биохимическое фракционирование клеток PC12TetOn с индуцированной экспрессией протеинкиназы MAK-V мыши и анализ ее мембранной локализации в дрожжах выполнены совместно с И.В. Коробко. Иммунофлуоресцентный анализ колокализации синаптоподина и протеинкиназы MAK-V в клетках линии NCI-H1299 проведен И.В. Коробко. Фракция периферических мембран клеток головного мозга мыши была получена П.Н. Вихревой (ИБГ РАН, г.Москва). Получение клонов клеток РС12ТеЮп, продуцирующих микроРНК к гену Nedd4 крысы и контрольную микроРНК, проводилось при участии И.В. Коробко. Эксперименты по трансляции мРНК генов mak-v и Nedd4 в эмбрионах X.laevis выполнены Кейджи Ито (Mount Sinai School of Medicine, г.Нью-Йорк, США) с использованием предоставленных автором плазмидных конструкций и планом эксперимента. Имена соавторов приведены в соответствующих публикациях.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 11-15 февраля 2008), International

Conference on Biomolecular Science in honor of the 75 th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (Russia, Moscow-Pushchino, September 28 - October 2, 2009), International symposium "Control of gene expression and cancer" (Russia, Moscow, June 21-25, 2010), а также на межлабораторном семинаре по апробации кандидатской диссертации в ИБГ РАН 17 октября 2012 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах и 3 тезиса докладов и сообщений на международных конференциях.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 122 страницах, содержит 31 рисунок и включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Цели и задачи, Материалы и методы, Результаты и их обсуждение, Заключение, Выводы и Список литературы (250 цитируемых источников).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

І.Изучение влияния иротеинкиназы MAK-V на статус фосфорилирования кофилииа 1 и активацию сигнальных путей протеинкиназ ERK1/2 и Akt в клетках PC12TetOn с индуцибельной экспрессией протеинкиназы MAK-V мыши

Полученные ранее в нашей лаборатории линии клеток РС12ТеЮп с индуцируемой доксициклином экспрессией протеинкиназы MAK-V мыши или ее каталитически неактивного мутанта MAK-V(K91R) с С-концевым FLAG-эпитопом без индукции экспрессии трансгена подвергались апоптозу при росте на коллагене IV, но не на ламинине. Индукция MAK-V, в отличие от индукции каталитически неактивного мутанта

Субстрат: DOX

кофилин-1 а-тубулин

фосфо-кофилин-1 (Ser3) а-тубулин

S /

+ - + - + -

Рис.1. Статус фосфорилирования кофилина 1 в клетках РС12ТеЮп с индуцибельной экспрессией МАК-У при росте на различных субстратах при индукции экспрессии МАК-У (1)ОХ +) или без индукции (1ЮХ -).

MAK-V(K91R), подавляла апоптоз клеток PC12TetOn при росте на коллагене IV. В данной работе была поставлена задача исследовать роль протеинкиназы MAK-V в некоторых молекулярных процессах, которые могут обуславливать выживание клеток PC12TetOn при росте на коллагене IV.

Недавно было показано, что протеинкиназа MAK-V подавляет метастатический потенциал клеток базальноподобного рака молочной железы, поддерживая ингибирующее фосфорилирование кофилина 1, регулятора перестройки актинового цитоскелета. Поскольку контакт клеток PC12TetOn с коллагеном IV вызывает перестройку актинового цитоскелета, была исследована возможная роль MAK-V в регуляции этого процесса в клетках PC12TetOn через регуляцию фосфорилирования кофилина 1. В результате проведенных исследований было установлено, что продукция протеинкиназы MAK-V не влияет на статус фосфорилирования кофилина 1 в клетках PC12TetOn (Рис. 1).

Этот результат согласуется с ранее опубликованными данными, что функциональная активность MAK-V определяется специфическим клеточным контекстом и указывает на то, что протеинкиназа MAK-V влияет на индуцируемые контактом с коллагеном IV внутриклеточные процессы в клетках РС12ТеЮп через другие сигнальные каскады, не приводящие к изменению статуса фосфорилирования кофилина 1.

Контакт интегринов с внеклеточным матриксом индуцирует многочисленные внутриклеточные сигнальные каскады, в том числе и сигнальные пути протеинкиназ ERK1/2 и Akt, влияющие на рост и выживаемость клеток. Однако было обнаружено, что протеинкиназа MAK-V не влияет на уровень активации сигнальных путей протеинкиназ ERK1/2 и Akt в клетках PC12TetOn, растущих на коллагене IV (Рис. 2).

Таким образом, анализ молекулярных событий, которые могли бы опосредовать анти-апоптотическую активность протеинкиназы MAK-V в клетках РС12ТеЮп при их контакте с коллагеном IV, выявил отсутствие влияния MAK-V на статус фосфорилирования кофилина 1 и на уровень активации сигнальных путей протеинкиназ ERK1/2 и Akt. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что апоптоз клеток РС12ТеЮп, индуцированный их взаимодействием с коллагеном IV, подавляется протеинкиназой MAK-V путем воздействия на другие молекулярные пути.

Рис.2. Активация сигнальных DOX + + - путей протеинкиназ ERK1/2 и Akt

в клетках РС12ТеЮп с ERK1/2 индуцибельной экспрессией MAK-V при росте на коллагене а-туоулин jy_ Показаны результаты Вестерн-

cboc(t)o-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) а-тубулин

фосфо-Akt (Ser473) 1 — «Ц Akt блот-анализа с антителами против

v , ' ^^ _ протеинкиназы ERK1/2, Akt и их

«-тубулин ■» <тттт\ а-тубулин фосфорилированнЬ1Х форм.

2. Мембранная локализация протеинкиназы MAK-V

Локализация белков в специфическом внутриклеточном компартменте часто бывает важной составляющей в регуляции их функций. Локализация АМРК-подобной протеинкиназы MARK2 на мембране необходима для ее функционирования как регулятора клеточной полярности и подвержена контролю в клетке. Активация протеинкиназ SIK сопровождается изменением их внутриклеточной локализации: транслокацией SIK1 из ядра в цитоплазму и релокализацией SIK2 в цитоплазме. Активация протеинкиназы BRSK1 сопровождается ядерной транслокацией. Протеинкиназа MELK релокализуется в цитоплазме во время клеточного цикла. Все эти процессы обеспечивают корректную локализацию протеинкиназ относительно их субстратов, что является существенным для функций этих протеинкиназ.

2.1. Ассоциация экзогенно продуцируемого и эндогенного белка MAK-V с клеточными мембранами

Для анализа внутриклеточного распределения экзогенно продуцируемого белка MAK-V было проведено биохимическое фракционирование клеток РС12ТеЮп с индуцированной экспрессией MAK-V-FLAG. Аликвоты цитозольной и мембранной фракций были проанализированы Вестерн-блоттингом с помощью анти-РЬАО-антител. В результате было выявлено, что существенная часть белка MAK-V локализована на мембране (Рис. 3).

Для подтверждения корректного распределения цитозольных и мембранных белков в

л*

анти-FLAG

анти-а-тубупин

анти-дт130

анти-mTOR

aHTH-Nedd4

Рис.3. Экзогенно продуцируемая в клетках РС12ТеЮп протеинкиназа МАК-У ассоциирована с мембранной фракцией. Вестерн-блот анализ цитозольной и мембранной фракций постьядерного супернатанта клеток РС12ТеЮп, продуцирующих белок МАК-У-РЬАО, с анти-РЬАО-антителами. Мембрана также была окрашена с антителами против трансмембранного белка gml30, цитозольного белка а-тубулина и частично ассоциированных с мембранами клетки белков №ск14 и тТСЖ.

полученных фракциях, фракции были проанализированы на присутствие белков а-тубулина, тТСЖ, №(1ё4 и gml30. Результаты анализа показали, что а-тубулин, переходящий в цитозоль в результате деполимеризации микротрубочек, обнаруживается только в цитозольной фракции. Трансмембранный белок аппарата Гольджи, gml30, присутствовал только в мембранной фракции. Белки тТСЖ и №ёс14, часть клеточного пула которых ассоциирована с мембранами за счет межмолекулярных взаимодействий, были обнаружены как в цитозольной, так и в мембранной фракциях (Рис. 3). Таким образом, использованный способ фракционирования клеток не влияет на распределение белков с известной мембранной или цитозольной локализациями, что позволяет сделать вывод об ассоциации экзогенно продуцируемой протеинкиназы МАК-У с мембранами.

Для исключения аномальности присутствия на мембранах экзогенно продуцируемого белка МАК-У-РЬАО вследствие его увеличенной продукции в клетках РС12ТеЮп была исследована ассоциация с клеточными мембранами эндогенного белка МАК-У. Для этого были получены антитела к полноразмерному белку МАК-У, которые детектировали белок с ожидаемой для МАК-У массой (~ 80 кДа) в лизатах клеток линии СЭМЬ-О, продуцирующих эндогенную протеинкиназу МАК-У. При этом белок отсутствовал в лизатах клеток линии СвМЬ-100, негативных по экспрессии гена так-\. Тот же белок обнаруживался и в лизатах клеток УМЯ-Ыу, в которых также присутствует транскрипт так-\, хотя и на значительно более низком уровне, чем в клетках линии С5МЬ-0. В то же время в /ио£-у-негативных клетках УМЯ-О белок отсутствовал (Рис. 4). Это позволяет сделать вывод, что полученные антитела способны специфически узнавать эндогенный белок МАК-У.

Рис. 4. Протеинкиназа МАК-У ассоциирована с мембранами в клетках линии СвМЬ-О.

Вестерн-блот анализ с антителами против белка МАК-У суммарных лизатов клеток линий СЭМЫ) и УМЯ-Ьіу, в которых обнаруживается транскрипт так-у, С8МЬ-100 и УМЯ-О, в которых транскрипт так-м отсутствует, а также постъядерного супернатанта клеток линии С5МЬ-0 и приготовленных из него мембранной и цитозольной фракций.

Далее были проведены фракционирование клеток линии С8МЬ-0 и детекция белка МАК-У в различных фракциях с использованием полученных антител. Как и в случае экзогенно продуцируемого в клетках РС12ТеЮп белка, эндогенный белок МАК-У обнаруживался преимущественно в мембранной фракции (Рис. 4). Этот результат подтверждает предположение о мембранной ассоциации протеинкиназы МАК-У, сделанное на основании анализа распределения экзогенно продуцируемого белка.

2.2. Мембранная локализация протеинкиназы МАК-У в дрожжах

Для дальнейшего подтверждения ассоциации протеинкиназы МАК-У с мембранами была использована дрожжевая система, основанная на комплементации температурно-чувствительной мутации гена сс1с25, которая блокирует рост дрожжей при 37°С, но не препятствует их росту при 25°С. Белок ЬЭОЭ способен комплементировать мутацию в белке СБС25 в случае своей мембранной локализации, которая обуславливается мембранной ассоциацией исследуемого белка, продуцируемого как химера с ЬЗОБ.

При продукции химеры ЬБОБ-МАК-У в дрожжах наблюдалась комплементация

25° 37°

Рис. 5. Анализ мембранной локализации протеинкиназы МАК-У и ее делеционных мутантов в дрожжах. Слева схематически изображены белки, продуцируемые в дрожжах штамма сс!с25Н. Положения делеций в белке МАК-У показаны в аминокислотных остатках. Справа приведены результаты анализа комплементации температурно-чувствительной мутации при продукции в дрожжах соответствующих белков.

мутации (Рис. 5). При этом продукция одного белка ЬБОЭ или одного белка МАК-У не оказывала такого эффекта. Это позволяет сделать вывод, что протеинкиназа МАК-У сама не способна комплементировать мутацию, а наблюдаемая комплементация мутации при продукции химеры ЬБОБ-МАК-У обусловлена именно способностью МАК-У локализоваться на мембранах.

Для определения роли структурных доменов белка МАК-У в его способности локализоваться на мембранах был проведен анализ способности химер ЬБОБ с различными делеционными мутантами МАК-У комплементировать температурно-чувствительную мутацию. Делеция уникального С-концевого домена, как и делеция 26 1ч[-концевых аминокислотных остатков вне каталитического домена МАК-У не влияла на способность химеры с белком ЬБОБ комплементировать мутацию (Рис. 5). Делеция каталитического и убиквитин-ассоциированного (ЦВА) доменов приводила к неспособности дрожжей расти при непермессивной температуре. Удаление только домена ЦВА не приводило к полному ингибированию роста, однако вызывало его значительную супрессию в непермессивных условиях по сравнению с полноразмерным белком МАК-У в составе химеры с ЬБОБ (Рис. 5). Этот результат указывает на необходимость присутствия домена ЦВА для обеспечения эффективной мембранной локализации протеинкиназы МАК-У.

Анализ первичной структуры выявил в каталитическом домене МАК-У богатую положительно заряженными аминокислотными остатками последовательность "КУГОККЯАКК, являющуюся частным случаем консенсусной последовательности связывания фосфатидилинозитол-(4,5)-бифосфата (Р1(4,5)Р2). Принимая во внимание консервативность этой Ьув/А^-богатой последовательности в протеинкиназах МАК-У человека, мыши, лягушки и рыбы, можно предположить, что именно она может опосредовать взаимодействие МАК-У с Р1(4,5)Р2, определяя ассоциацию протеинкиназы с мембраной.

Анализ мембранной локализации протеинкиназы МАК-У в дрожжах показал, что для эффективной ассоциации МАК-У с мембранами необходимо присутствие ЦВА-домена. ЦВА-домены АМРК-подобных протеинкиназ играют важную конформационную роль и необходимы для их активации. Можно предположить, что удаление иВА-домена в белке МАК-У может приводить к изменению конформации и/или доступности области в каталитическом домене, содержащей мотив "КУГОККЯАКК, тем самым влияя на способность МАК-У взаимодействовать с Р1(4,5)Р2 и локализоваться на мембране.

Таким образом, было обнаружено, что часть клеточного пула протеинкиназы МАК-У ассоциирована с мембранами. Выявлена необходимость участия убиквитин-ассоциированного домена ЦВА для мембранной ассоциации МАК-У, что является ранее

9

неизвестной функцией этого домена АМРК-подобных протеинкиназ. Анализ первичной последовательности белка МАК-У выявил в каталитическом домене потенциальный сайт связывания фосфатидилинозитол-(4,5)-бифосфата. Эта последовательность

предположительно может опосредовать взаимодействие протеинкиназы МАК-У с мембраной. Обнаруженная в работе ассоциация протеинкиназы МАК-У с мембранами указывает на один из возможных способов регуляции ее активности посредством пространственного контроля и может иметь существенное значение для дальнейшего изучения функций МАК-У в клетке и организме.

3. Взаимодействие протеинкиназы MAK-V с синаптоподином

3.1. Идентификация синаптоподина как белка-партнера по взаимодействию с протеинкиназой MAK-V

Для ассоциации белка МАК-У с определенными молекулярными процессами был предпринят поиск его партнеров по взаимодействию. Аффинная очистка белков из фракции периферических мембран головного мозга мыши на матриксе с иммобилизованной химерой глутатион-5-трансферазы (GST) с рекомбинантным С-концевым доменом МАК-У мыши (GST-C-MAK-V) выявила белок с подвижностью 99 кДа, который был идентифицирован с помощью времяпролетной масс-спектрометрии как синаптоподин (SYNPO).

Вестерн-блот анализ белков, очищенных на матриксе GST-C-MAK-V и на контрольном матриксе, с антителами против синаптоподина показал, что антитела детектируют белок с подвижностью 99 кДа, что соответствует экспериментально

Рис. 6. Взаимодействие синаптоподина с протеинкиназой MAK-V.(A) Вестерн-блот анализ белков периферических мембран головного мозга мыши, очищенных на аффинном матриксе GST-C-MAK-V или на контрольном матриксе GST, с использованием антител против синаптоподина. (Б) Вестерн-блот анализ белков фракции периферических мембран головного мозга мыши, очищенных на иммобилизованной на анти-FLAG аффинном геле полноразмерной протеинкиназе MAK-V-FLAG (IP:cmmu-FLAG+) или на контрольном матриксе (IP ■.анти-FLAG-'), с использованием антител против синаптоподина. Ниже приведены результаты Вестерн-блоттинга той же мембраны с анти-РЬАО-антителами для детекции иммобилизованной на матриксе протеинкиназы MAK-V.

/ О* О*

анти-SYNPO

IP:

анти-FLAG_+_

анти-SYNPO

анти-FLAG

наблюдаемой подвижности синаптоподина, продуцируемого в головном мозге. При этом окраска синаптоподина наблюдалась только в элюате с матрикса с иммобилизованным С-концевым доменом МАК-У (Рис. 6А). Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что синаптоподин специфически взаимодействует с С-концевым доменом белка МАК-У. Для исключения артефактности выявленного взаимодействия по причине использования фрагмента протеинкиназы МАК-У, а не полноразмерного белка, было проанализировано взаимодействие синаптоподина с полноразмерным белком МАК-У. Полноразмерный белок МАК-У-РЬАв был очищен на анти-РЬАО аффинном геле из клеток линии РС12ТеЮп с индуцируемой экспрессией МАК-У-РЬАС. Аффинный гель с иммобилизованной за РЬАО-эпитоп протеинкиназой МАК-У был использован для преципитации синаптоподина из фракции периферических мембран головного мозга мыши. В качестве контроля специфичности взаимодействия использовался анти-РЬАв аффинный гель, инкубированный с лизатом клеток, в которых не была индуцирована экспрессия МАК-У-РЬАО. В результате было установлено, что синаптоподин связывается с анти-РЬАО аффинным гелем только в том случае, если на нем иммобилизована протеинкиназа МАК-У (Рис. 6Б). Таким образом, синаптоподин взаимодействует не только с С-концевым фрагментом, но и с полноразмерной протеинкиназой МАК-У.

Рис.7. Колокализация протеинкиназы МАК-У и синаптоподина в клетках.

Иммунофлуоресцентный анализ клеток линии 1МС1-Н1299, транзиторно продуцирующих ОРР-синаптоподин, детектированный по зеленой флуоресценции вРР (А), и протеинкиназу МАК-У с С-концевым РЬАО-эпитопом, детектированную с помощью первичных анти-РЬАО антител и вторичных антител, меченых красителем А1ехаР1иог546 (Б). На увеличенных вставках видно, что МАК-У-позитивные везикулы преимущественно располагаются вдоль синаптоподин-позитивных фибрилл.

3.2. Анализ колокализации МАК-У и синаптоподина в клетках

Для дальнейшего подтверждения взаимодействия МАК-У и синаптоподина был проведен анализ их колокализации в клетках. Клетки линии 1ЧС1-Н1299 были транзиторно трансфицированы плазмидами для продукции белка МАК-У с С-концевым РЬАО-эпитопом, и химеры синаптоподина с зеленым флуоресцентным белком (ОРР). Синаптоподин, идентификацию которого проводили по флуоресценции вРР (Рис. 7А), локализовался в цитоплазме клеток на актиновых фибриллах, что находится в соответствии с ранее опубликованными результатами. Протеинкиназа МАК-У в клетках линии ЖЛ-Н1299 характеризовалась окраской цитоплазматических везикулярных структур (Рис. 7Б). На периферии клетки, где плотность синаптоподин-позитивных структур невелика, явно наблюдалось преимущественное расположение МАК-У-позитивных везикул вдоль синаптоподин-позитивных фибрилл. Такой характер совместной окраски косвенно подтверждает взаимодействие протеинкиназы МАК-У и синаптоподина.

3.3. Анализ взаимодействия протеинкиназы МАК-У и синаптоподина в дрожжах

Для всестороннего подтверждения взаимодействия протеинкиназы МАК-У и синаптоподина была использована двугибридная дрожжевая система. Как видно на Рис. 8, при совместной продукции в дрожжах химер ДНК-связывающего домена транскрипционного фактора САЬ4 (САЬ4ЕШ) с протеинкиназой МАК-У и активационного домена ОАЬ4 (САЬ4АБ) с синаптоподином наблюдалась активация репортерного гена ЯиЗ, что подтверждало взаимодействие МАК-У и синаптоподина. В то же время при совместной продукции химеры ОАЬ4ВР с протеинкиназой МАК-У и ОАЬ4АО, а также ОАЬ4ВО и химеры вАЬ4АО с синаптоподином активация ШяЗ отсутствовала, что свидетельствует о специфичности наблюдаемого взаимодействия.

+ЗАТ

-ЗАТ

GAL4BD-MAK-V GAL4AD-SYNPO

GAL4BD-MAK-V GAL4AD

GAL4BD GAL4AD-SYNPO

Рис. 8. Взаимодействие протеинкиназы MAK-V и синаптоподина в дрожжах. Показаны результаты анализа активации репортерного гена His3 по способности дрожжей, продуцирующих химеру GAL4BD-MAK-V или GAL4BD и химеру GAL4AD-SYNPO или GAL4AD в указанных комбинациях, к росту в присутствии 3-амино-1,2,4-триазола (+ЗАТ); (-ЗАТ) - трансформанты дрожжей, выращенные на среде без 3-амино-1,2,4-триазола.

Таким образом, было выявлено взаимодействие протеинкиназы МАК-У и синаптоподина. Учитывая роль синаптоподина в установлении и поддержании долговременной потенциации синапсов, этот результат открывает дальнейшие перспективы для изучения роли протеинкиназы МАК-У в головном мозге в свете ее возможного участия в функционировании синапсов, в процессах памяти, обучения и интеллектуального развития.

4. Взаимодействие белков МАК-У и Nedd4

4.1. Идентификация убиквитин-лигазы Nedd4 как белка-партнера по взаимодействию с MAK-V

Для идентификации белков, взаимодействующих ш vivo с полноразмерной протеинкиназой МАК-У, белковые комплексы на основе МАК-У очищались на анти-FLAG-аффинном геле из лизатов клеток PC12TetOn с индуцибельной экспрессией MAK-V-FLAG.

В

DOX 1Р:анти-FLAG

Лизаты

О* С?

анти-FLAG

aHTM-Nedd4 анти-FLAG

1Р:анти-Nedd4 +

анти-FLAG aHTH-Nedd4

4 GST-Nedd4

анти-GST

Рис. 9. Взаимодействие белков MAK-V-FLAG и Nedd4. (А) Продукты аффинной очистки (IP:анти-FLAG) и исходные лизаты клеток РС12ТеЮп, обработанных доксициклином для индукции MAK-V-FLAG (DOX+), и не обработанных доксициклином (DOX-), анализировались Вестерн-блоттингом с использованием aHTH-Nedd4 и анти-РЬАО-антител. (Б) Лизаты клеток РС12ТеЮп, обработанных доксициклином для индукции MAK-V-FLAG, инкубировались с протеин G-сефарозой с иммобилизованными aHTH-Nedd4-aHTHTeflaMH (+) или без них (-). Связавшиеся белки детектировались Вестерн-блоттингом с использованием affra-Nedd4 и анти-РЬАО-антител. (В) Лизаты клеток РС12ТеЮп, обработанных доксициклином для индукции MAK-V-FLAG, инкубировались с глутатион-сефарозой с иммобилизованными белками GST или GST-Nedd4. Связывание протеинкиназы MAK-V-FLAG детектировалось Вестерн-блоттингом с анти-FLAG-антителами. Иммобилизация белков GST и GST-Nedd4 на глутатион-сефарозе контролировалась Вестерн-блоттингом с антителами против GST.

Белок с подвижностью 115 кД, который присутствовал только в препаратах, полученных из клеток с индуцированной экспрессией MAK-V, был идентифицирован с помощью времяпролетной масс-спектрометрии как убиквитин-лигаза Nedd4 крысы. Результат масс-спектрометрического анализа был подтвержден методом Вестерн-блоттинга с aHTH-Nedd4-aHTmraaMH (Рис. 9А). Существование комплексов MAK-V/Nedd4 в клеточных лизатах было подтверждено с помощью обратной ко-иммунопреципитации на протеин G-сефарозе с иммобилизованными антителами против Nedd4 (Рис. 9Б), а также с помощью пулл-даун анализа, в котором лизаты клеток, продуцирующих MAK-V-FLAG, инкубировали с GST или химерой GST-Nedd4, иммобилизованными на глутатион-сефарозе (Рис. 9В).

Для доказательства взаимодействия эндогенных белков МАК-У и Nedd4 было исследовано присутствие комплексов MAK-V/Nedd4 в клетках линии CSML-0 методом ко-иммунопреципитации за анти-MAK-V и aHTH-Nedd4 антитела. Вестерн-блот анализ результатов ко-иммунопреципитации показал, что эндогенные белки MAK-V и Nedd4 действительно взаимодействуют друг с другом (Рис.10).

IP:

aHTM-Nedd4

анти-MAK-V

aHTM-Nedd4

Лизаты

шШШШР ^Щ^^т

анти-MAK-V

aHTM-Nedd4

IP:

анти-MAK-V +

aHTH-Nedd4

анти-MAK-V

Лизаты

aHTH-Nedd4

анти-MAK-V

Рис.10. Взаимодействие эндогенных белков МАК-У и Nedd4. (А) Лизаты клеток линии СБМЬ-О инкубировались с антителами против Nedd4 (анти-Иес1с14+) или без них (анти-Иес1с14-), а затем с протеин в-сефарозой. Связавшиеся белки и аликвоты лизатов анализировались Вестерн-блоттингом с антителами против МАК-У и Nedd4. (Б) Лизаты клеток линии СЭМЬ-О инкубировались с антителами против МАК-У (анти-МАК-У+) или без них (анти-МАК-У-), а затем с протеин О-сефарозой. Связавшиеся белки и аликвоты лизатов анализировались Вестерн-блоттингом с антителами против МАК-У и Nedd4.

4.2 Картирование взаимодействия МАК-У и

Доменная организация Кеёё4 грызунов типична для семейства №(М4-подобных НЕСТ-убиквитин-лигаз и представлена М-концевым мембрана-ассоциированным доменом С2, тремя триптофановыми \У\¥ доменами и С-концевым каталитическим доменом НЕСТ (Рис.11). Связывание МесШ-подобных убиквитин-лигаз с другими белками обычно

79 183 249 282 405 438 460 493 530

887

рРС97-МАКЛ/ рРС97

+ЗАТ -ЗАТ +ЗАТ -ЗАТ

рРС86-С2

pPC86-C2-WW1

рРС86-С2-\ЛЛЛП-2

рРС86-С2-Ут1-3

рРС86-\Л/УУ1-3

рРС86-\ЛЛЛ/1 -3-Н

рРС86

■ □ ■ в

в ■ ■ п

□ О ■ п

■ □ ■ ■

■ п ■ ■

■ □ ■ в

■ о ■ щ

1 66 ьь

320 340 383

714

Б ТКс

С£АЫВО>

11ВА С-концевой

домен 714

=с

714

рРС86-С2-\ЛЛ«1-3 рРС86

+ЗАТ -ЗАТ +ЗАТ -ЗАТ

рРС97-МАКЛ/

рРС97-Ы-МАК-У Щ Ц

РРС97-С-МАКЛ/ |1 [ . рРС97 | )

Рис. 11. Картирование взаимодействия между убиквитин-лигазой Nedd4 и протеинкиназой МАК-У в дрожжевой двугибридной системе. (А) Доменная структура №<1(14 мыши. Показаны мембрана-ассоциированный домен С2, триптофановые домены \\'\У и каталитический домен НЕСТ. Границы доменов указаны в аминокислотных остатках. Схема ниже иллюстрирует организацию химер ОАЬ4АО и различных фрагментов ЫеёсИ, использованных в дрожжевом двугибридном анализе. Справа показаны результаты анализа взаимодействия между химерой СгАЬ4ЕШ и протеинкиназы МАК-У (рРС97-МАК-У) и химерами САЬ4АО и различных фрагментов ЫесШ. Взаимодействие белков детектировалось по способности дрожжей расти в присутствии 3-амино-1,2,4-триазола (+ЗАТ); (Б) Доменная организация протеинкиназы МАК-У мыши. Показаны каталитический домен Э_ТКс, убиквитин-ассоциированный домен иВА и С-концевой домен. Схема ниже иллюстрирует организацию химер ОАЬ4ВО и протеинкиназы МАК-У, или ее Ы- и С-концевых фрагментов, которые были использованы в дрожжевом двугибридном анализе. Справа показаны результаты анализа взаимодействия между химерой ОАЬ4АО и фрагментом Ие(М4, состоящем из домена С2 и трех триптофановых доменов \У\У (рРС86-С2-\У\¥1-3) и химерами ОАЬ4ВО и МАК-У или ее фрагментов. Взаимодействие белков детектировалось, как описано в (А).

опосредуется ШШ доменами убиквитин-лигаз и мотивом РУ их партнеров по взаимодействию. Однако первичная последовательность белка МАК-У не содержит мотив РУ, что предполагает неканонический механизм связывания №с!с14 с этой протеинкиназой. Действительно, анализ взаимодействия МАК-У с различными делеционными мутантами ИесШ в дрожжевой двугибридной системе показал, что со стороны №ё(14 это взаимодействие опосредуется доменами С2 и \V\V1. При этом только ХУХУ домены не способны обеспечивать связывание с МАК-У (Рис. 11 А). Эксперименты с делеционными мутантами МАК-У выявили участие М-конпевого домена МАК-У, содержащего каталитический и ЦВА домены, но не уникального С-концевого фрагмента протеинкиназы, в связывании с КесИ4 (Рис. 11 Б).

Триптофановые домены КесИ4-подобных убиквитин-лигаз обычно связываются с мотивом РУ их партнеров по взаимодействию, а с более низкой аффинностью - с последовательностями фосфосерин-пролин и фосфотреонин-пролин. Иногда взаимодействие убиквитин-лигаз семейства ЫеёсМ с их субстратами опосредуется адапторными белками, содержащими мотив РУ. Протеинкиназа МАК-У не содержит мотив РУ, но домен \V\V1 убиквитин-лигазы №сМ4 участвует в связывании МАК-У. Тот факт, что в проведенных экспериментах делеционный мутант №(И4, содержащий только домены (\У\У1-\\Г\УЗ) не связывался с МАК-У, позволяет предположить, что это взаимодействие характеризуется низкой аффинностью. Так как протеинкиназа МАК-У фосфорилирована в клетках, можно предположить, что \V\V1 домен убиквитин-лигазы Кеёс14 может связываться с низкой аффинностью с последовательностями фосфосерин-пролин и/или фосфотреонин-пролин в белке МАК-У, а домен С2 стабилизирует комплекс МАК-У/ТЧесЫ4.

4.3. МАК-У подвергается протеасомиой деградации

Обнаружение физического взаимодействия между белками МАК-У и КесЫ4 дало основания предполагать, что МАК-У является субстратом убиквитин-лигазы №(И4. Так как прямые экспериментальные доказательства убиквитинирования протеинкиназы МАК-У отсутствуют, было исследовано, подвержена ли протеинкиназа МАК-У в клетке протеасомной деградации. Клетки РС12ТеЮп с индуцибельной экспрессией МАК-У-РЬАС были обработаны ингибитором протеасом А1ЛЛ и аликвоты суммарных клеточных лизатов были проанализированы Вестерн-блоттингом с анти-РЬАО-антителами. При этом наблюдалось увеличение содержания белка МАК-У одновременно с появлением анти-РЬАС-иммупореактившлх полос с большим молекулярным весом, что типично для убиквитинированных белков, подверженных протеасомной деградации (Рис. 12А). Этот

ALLN DOX

анти-FLAG

анти-а-тубулин

K48R K63R

анти-MAK-V

анти-NPT p»— анти-а-тубулин I ——

Рис. 12. Протеинкиназа МАК-\ подвергается убиквитин-зависимой протеасомной деградации. (А) Обработанные (йОХ+) или не обработанные доксициклином (ООХ-) клетки РС12ТеЮп были инкубированы с ALLN (АИИ+) или без АЬЬЫ (АЫИ-) в течение 8 ч. Показаны результаты Вестерн-блот анализа суммарных клеточных лизатов с анти-РЬАО-антителами. (Б) Клетки линии НЕК293 были котрансфицированы плазмидой, кодирующей МАК-У-РЬАО и плазмидой, кодирующей убиквитин дикого типа (и>?), или его мутант К48Я (К48К) или его мутант К63Я (КбЗЯ) с РЬАв-эпитопом. Показаны результаты Вестерн-блоттинга суммарных клеточных лизатов с антителами против МАК-У. Для контроля базального уровня экспрессии МАК-У-РЬАО мембрана была окрашена антителами против неомицин фосфотрансферазы II (анти^РТ), которая кодируется вектором для продукции МАК-У-РЬАО.

результат указывает на то, что MAK-V подвергается протеасомной деградации в клетках. Кроме того, была проведена котрансфекция клеток линии НЕК293 плазмидой, кодирующей белок MAK-V-FLAG, и плазмидой, кодирующей убиквитин дикого типа или его мутанты K48R и K63R, дефектные по формированию цепей полиубиквитина. При этом наблюдалось значительное повышение уровня белка MAK-V-FLAG только в случае его совместной продукции с убиквитином, содержащим мутацию K48R, которая оказывает доминантно-негативный эффект на убиквитинирование и протеасомную деградацию белков (Рис. 12Б). Полученные результаты указывают на то, что белок MAK-V убиквитинируется in vivo с образованием цепей, сформированных через Lys48 убиквитина, и подтверждают, что белок MAK-V подвержен в клетке протеасомной деградации.

4.4. Nedd4 не участвует в протеасомной деградации MAK-V

Для выяснения, является ли Nedd4 убиквитин-лигазой для протеинкиназы MAK-V, были проведены реакции убиквитинирования in vitro с использованием белка MAK-V-FLAG, выделенного из клеток PC12TetOn, и различных Е2-убиквитин-конъюгирующих ферментов. При анализе продуктов реакций методом Вестерн-блогтинга были обнаружены высокомолекулярные анти-убиквитин-реактивные белки в продуктах реакций с участием Е2-ферментов Ubc5a, 5Ь и 5с, специфичных для ЕЗ-убиквитин-лигазы Nedd4, которая присутствовала в препарате MAK-V-FLAG (Рис. 13А). Однако не были обнаружены анти-MAK-V или aHTH-FLAG-HMMyHOpeaKTHBHbie полосы с молекулярным весом, соответствующим убиквитинированной протеинкиназе MAK-V (данные не приведены), что

17

оЗ- о> o^oi? J?" oS> ф

v-P vP ч-p Ч-У-

Э

■4- MAK-V-FLAG

без микроРНК контрольная микроРНК к Nedd4 микроРНК

.6Ч чУ . .6- -У

MAK-V-FLAG -

] MAK-V-FLAG-(Ub)„

анти-FLAG

aHTM-Nedd4

анти-а-тубулин

Рис.13. Nedd4 не убиквитинирует протеинкиназу MAK-V. (А) Зависимость убиквитин-лигазной активности, выделяемой в комплексе с MAK-V-FLAG, от Е2-ферментов в реакциях убиквитинирования in vitro. Показаны результаты Вестерн-блот анализа с использованием конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена для детекции убиквитинированных белков (X-(Ub)ri). Затем эта же мембрана была окрашена анти-РЬАО-антителами для детекции протеинкиназы MAK-V-FLAG. (Б) Истощение Nedd4 не влияет на стабилизацию MAK-V-FLAG в клетках при инкубации с ингибиторами протеасом. Клетки PC12TetOn с индуцибельной экспрессией MAK-V-FLAG или их клональные производные, экспрессирующие контрольную микроРНК или микроРНК к Nedd4, были обработаны доксициклином для индукции MAK-V-FLAG и инкубировались с ALLN или MG132 в течение 8 ч, или не инкубировались с ингибиторами протеасом (-). Показаны результаты Вестерн-блот анализа суммарных клеточных лизатов с анти-FLAG (анти-FLAG) и aHTH-Nedd4 (mmu-Nedd4) антителами. Для контроля нагрузки образцов на гель мембрана была окрашена антителами против а-тубулина (анти-а-тубулин).

не позволяет связать наблюдаемое полиубиквитинирование с МАК-У-РЬАО. Для подтверждения вывода о том, что МАК-У не является субстратом Nedd4, была проанализирована зависимость содержания белка МАК-У от уровня убиквитин-лигазы Nedd4 в клетках РС12ТеЮп. Были получены клоны продуцирующих МАК-У-РЬАО клеток РС12ТеЮп, которые экспрессировали микроРНК к гену Nedd4 крысы, либо контрольную микроРНК. Экспрессия микроРНК к Nedd4, в отличие от контрольной микроРНК, приводила к значительному понижению уровня белка Nedd4. При этом инкубация клеток с

18

ингибиторами протеасом MG132 и ALLN вызывала одинаковую стабилизацию белка МАК-V-FLAG независимо от наличия Nedd4 в клетках (Рис. 13Б). Таким образом, полученные экспериментальные данные также указывают на то, что протеинкиназа MAK-V не является субстратом убиквитин-лигазы Nedd4.

Далее, в результате анализа влияния избыточной продукции убиквитин-лигазы Nedd4 на стабильность белка MAK-V не было обнаружено различий в уровнях белка MAK-V, продуцируемого в транзиторно трансфицированных клетках линии НЕК293 совместно с белком Nedd4 или его дефектным по убиквитин-лигазной активности мутантом Nedd4(CS) (Рис. 14А). Также не было обнаружено изменений в кинетике деградации белка MAK-V в этих клетках после блокирования циклогексимидом белкового синтеза de novo (Рис. 14Б). Полученные результаты указывают на то, что Nedd4 не является убиквитин-лигазой для протеинкиназы MAK-V и не регулирует ее стабильность в клетке.

MG 132

MAK-V-FLAG

myc-Nedd4

+ + + + wt CS wt CS

анти-FLAG

анти-тус

aHTH-Nedd4

анти-а-тубулин

§ 0,9

і" § ».є

I 0,5

I 0,4

0,3

0,2

0,1

0

Рис.14. №сМ4 не влияет на уровень белка МАК-У. (А) Клетки линии НЕК293 были трансфицированы плазмидой для продукции МАК-У-РЬАО (МАК-У-РЬАС+) совместно с плазмидой для продукции белка Nedd4 с тус-эпитопом или его каталитически неактивного мутанта

Nedd4(CS) с пус-эпитопом (СУ). Для контроля использовались нетрансфицированные клетки (-). Клетки обрабатывались ингибитором протеасом МС132 перед лизисом (Ма32+) или не обрабатывались (Ма32-). Показаны результаты Вестерн-блот анализа суммарных клеточных лизатов с анти-И-АО-антителами (анти-РЬЛО). Белок Nedd4 детектировался с помощью антител против Nedd4 (анти-Мес!<]4). Экзогенно продуцируемый белок mJ'C-Nedd4 детектировался с помощью анти-тус-антител (анти-тус). (Б) Количественная оценка уровня белка МАК-У-РЬАО в клетках линии НЕК293, котрансфицированных плазмидой для продукции МАК-У-РЬАО и плазмидой для продукции белка Nedd4 (№с1с14 №/) или его мутанта Nedd4(CS) (Мес1с14(С5)) после обработки циклогексимидом в течение указанного времени в часах (ч).

—^-Nedd4wt —в.....Nedd4{CS}

4.5. Nedd4регулирует функции MAK-Vнезависимо от убиквитин-лигазной активности

Ранее было установлено, что протеннкнназа MAK-V регулирует движения конвергентного удлинения и формирование глаз и мозга эмбрионов Xenopus laevis, подавляя канонический Wnt сигнальный путь через р-катенин и активируя неканонический Wnt сигнальный путь через протеинкиназу JNK. В соответствии с ранее опубликованными данными, инъекция мРНК mak-v в 2 дорсо-анимальных бластомера на стадии 4-8 клеток приводила к серьезным морфогенетическим нарушениям на стадии 38 развития (Рис. 15). Инъекция мРНК Nedd4 или каталитически неактивного мутанта Nedd4(CS) не вызывала никаких явных нарушений развития. Однако совместная инъекция мРНК mak-v и Nedd4 подавляла ингибирующий эффект протеинкиназы MAK-V на движения конвергентного удлинения в эмбрионах X. laevis. Подобный эффект наблюдался и при совместной инъекции мРНК mak-v и каталитически неактивного мутанта Nedd4(CS) (Рис.15). Таким образом, Nedd4 регулирует функции протеинкиназы MAK-V независимо от убиквитин-лигазной активности.

Можно предположить, что Nedd4 ингибирует активность MAK-V в результате связывания N-концевой части протеинкиназы, содержащей каталитический и UBA-домены, необходимые для активности АМРК-подобных протеинкиназ. Однако возможны и другие механизмы опосредованной Nedd4 супрессии MAK-V, которые предстоит исследовать.

Nedd4 участвует в сигнальных каскадах Notch и IGF-1R, a MAK-V регулирует Wnt сигнальный путь. Эти сигнальные каскады тесно скоординированы и контролируют пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток как в развивающемся эмбрионе, так и

MAK-V

MAK-V + MAK-V + Nedd4 Nedd4(CS)

Рис. 15. №<Ш4 подавляет ингибирующее влияние увеличенной экспрессии

протеинкиназы МАК-У на движения конвергентного удлинения независимо от убиквитин-лигазной активности. мРНК так-у, Nedd4, или их комбинации

инъецировали в два дорсо-анимальных бластомера на стадии 4-8 клеток. Показан внешний вид эмбрионов на стадии 38 развития.

во взрослом организме. В то же время остаются не до конца изученными молекулярные механизмы, обеспечивающие взаимодействие этих сигнальных путей. Выявленное в работе взаимодействие протеинкиназы MAK-V с убиквитин-лигазой Nedd4 не только впервые создает механистическую основу для интеграции Nedd4 в Wnt сигнальный путь, но может интегрировать сигнальные пути Wnt, Notch и IGF-IR через взаимодействие MAK-V с Nedd4. Это открывает дальнейшие перспективы для изучения роли протеинкиназы MAK-V в эмбриональном развитии позвоночных и в канцерогенезе.

ВЫВОДЫ

1. Аяти-апоптотическая функция протеинкиназы MAK-V в клетках PC12TetOn с индуцибельной экспрессией MAK-V мыши не связана с регуляцией фосфорилирования кофилина 1 и степени активации сигнальных путей протеинкиназ ERK1/2 и Akt.

2. Впервые показано, что белок MAK-V способен локализоваться на мембранах клетки, что может иметь функциональное значение.

3. Синаптоподин впервые выявлен как белок, взаимодействующий с протеинкиназой MAK-V.

4. Протеинкиназа MAK-V убиквитинируется in vivo с образованием цепей, сформированных через Lys48 убиквитина, и подвержена в клетке протеасомной деградации.

5. ЕЗ убиквитин-лигаза Nedd4 впервые выявлена как партнер по взаимодействию с протеинкиназой MAK-V.

6. ЕЗ убиквитин-лигаза Nedd4 не участвует в убиквитинировании протеинкиназы MAK-V, но регулирует ее функции in vivo по убиквитин-лигаза-независимому механизму.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Калиниченко СВ, Коробко ЕВ, Коробко ИВ. Мембранная локализация протеинкиназы MAK-V. Биохимия. 2008;73(3):342-348.

2. Korobko IV, Kalinichenko SV, Korobko EV, Ninkina NN, Kiselev SL, Buchman VL. Pro-survival activity of the MAK-V protein kinase in PC 12 cells. Cell Cycle. 2010;9(20):4248-4249.

3. Калиниченко СВ, Вихрева ПН, Коробко ИВ. Взаимодействие протеинкиназы MAK-V и синаптоподина. Биохимия. 2011 ;76(2):238-244.

4. Kalinichenko SV, Itoh К, Korobko EV, Sokol SY, Buchman VL, Korobko IV. Identification of Nedd4 E3 ubiquitin ligase as a binding partner and regulator of MAK-V protein kinase. PLoS One. 2012;7(6):e39505.

Тезисы конференций:

1. Вихрева ПН, Калиниченко СВ, Коробко ИВ. Взаимодействие АМРК-подобной протеинкиназы MAK-V и убиквитин-лигазы Nedd4. XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Россия, Москва, 11-15 февраля 2008 г., сборник тезисов, с. 109.

2. Kalinichenko SV, Vikhreva PN, Korobko IV. Study of the interaction between MAK-V proteinkinase and Nedd4 ubiquitin ligase. International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov. Russia, Moscow-Pushchino, September 28-October 2,2009. Abstract book, p. 230.

3. Kalinichenko SV, Vikhreva PN, Korobko IV. Study of the interaction between MAK-V proteinkinase and Nedd4 ubiquitin ligase. International symposium "Control of gene expression and cancer". Russia, Moscow, June 21th-25th, 2010. Proceedings, section "Cancer", p. 74

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю И.В. Коробко за чуткое руководство, за неоценимые научные и практические советы, а также за критическое чтение диссертации;

С.Ю. Соколу (Mount Sinai School of Medicine, г. Нью-Йорк, США) за организацию экспериментов с эмбрионами лягушки, позволивших выявить функциональность взаимодействия белков MAK-V и Nedd4;

Р.Х. Зиганшину (ИБХ РАН, г. Москва) за проведение масс-спектрометрического анализа; Е.В. Коробко и Е.Ю. Лысюк (ИБГ РАН, г. Москва) за помощь в работе с культурами клеток; а также всем сотрудникам Отдела генной терапии рака ИБГ РАН за моральную поддержку, советы и помощь в работе, теплую и дружескую атмосферу в коллективе.

Заказ № 81-П/10/2012 Подписано в печать 23.10.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,2

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калиниченко, Светлана Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Семейство АМРК-подобных протеинкиназ.

2.1.1. Протеинкиназы AMPK/SNFl/SnRKl.

Строение и регуляция АМРК.

Функции AMPK/SNFl/SnRKl.

2.1.2. Протеинкиназы MARK/Par

Строение MARK.

Регуляция MARK.

Функции MARK/Par-1.

2.1.3. Протеинкиназы BRSK/SAD-1.

2.1.4. Протеинкиназы NUAK.

2.1.6. Протеинкиназы SIK.

2.1.7. Протеинкиназа MELK.

2.1.8. Протеинкиназы NIM 1 и SNRK.

2.1.9. Протеинкиназа MAK-V/HUNK.

Функции MAK-V.

Участие MAK-V в онкогенезе.

2.2. Убиквигин-лигазы Nedd4 и Nedd4-2.

2.2.1. Убиквитинирование белков.

2.2.2. Семейство Nedd4-noAo6Hbix убиквитин-лигаз.

2.2.3. Идентификация и строение Nedd4.

2.2.4. Функции Nedd4.

Регуляция стабильности и активности внутриклеточных белков.

Регуляция мембранных рецепторов, ионных транспортеров и ассоциированных с мембранами белков.

Сортировка транспортируемых белков.

Участие в вирусном почковании.

2.2.5. Функции и регуляция убиквитин-лш азы Nedd4-2.

2.3. Актин-связывающий белок синаптоподин.

3. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Реактивы.

4.2. Бактериальные штаммы, среды, антибиотики.

4.3. Приготовление компетентных клеток E.coli.

4.4. Трансформация компетентных клеток E.coli.

4.5. Выделение плазмидной ДНК.

4.6. Электофорез ДНК в агарозном геле.

4.7. Плазмидные конструкции.

4.7.1. Конструирование плазмид для in vitro транскрипции Nedd4 и Nedd4(C854S).

4.7.2. Конструирование плазмид для продукции белков как химер с глутатион-S-трансферазой в E.coli.

4.7.3. Конструирование плазмид для продукции микроРНК к гену Nedd4.

4.7.4. Плазмиды для анализа белок-белковых взаимодействий в дрожжах.

4.8. Секвенирование.

4.9. Электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле.

4.10. Вестерн-блот анализ.

4.11. Получение бактериальных лизатов, содержащих рекомбинантные белки GST, GST-Nedd4 и GST-C-MAK-V.

4.12. Анализ GST-пулл-даун.

4.13. Получение аффинного матрикса с иммобилизованным С-концевым фрагментом протеинкиназы MAK-V.

4.14. Получение фракции периферических мембран.

4.15. Аффинная очистка белков на матриксе GST-C-MAK-V.

4.16. Масс-спектрометрический анализ.

4.17. Анализ связывания белков из фракции периферических мембран головного мозга мыши с полноразмерной протеинкиназой MAK-V.

4.18. Получение и очистка анти-MAK-V антител.

4.19. Культивирование клеток, трансфекция.

4.20. Количественный анализ уровня белка MAK-V-FLAG в клетках, обработанных циклогексимидом.

4.21. Биохимическое фракционирование клеток.

4.22. Получение суммарного клеточного лизата.

4.23. Очистка протеинкиназы MAK-V-FLAG и взаимодействующих с ней белков из клеток РС12ТеЮп.

4.24. Ко-иммунопреципитация MAK-V-FLAG за анти-№сМ4-антитела.

4.25. Ко-иммуиопреципитация эндогенной протеинкиназы MAK-V за anTH-Ncdd4-антитсла и эндогенной убиквитин-лигазы Nedd4 за анти-МАК-У-антитела.

4.26. Анализ убиквитинирования in vitro.

4.27. Иммуноцитохимический анализ.

4.28.Эксперименты с использованием дрожжей.

4.28.1 Штаммы дрожжей.

4.28.2. Среды и реактивы для культивирования дрожжей.

4.28.3. Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.

4.28.4. Анализ мембранной локализации протеинкиназы MAK-V в дрожжах.

4.28.5. Анализ взаимодействия MAK-V и синаптоподина в дрожжевой двугибридной системе.

4.28.6. Анализ взаимодействия белков MAK.-V и Nedd4 в дрожжевой двугибридной системе.

4.29. Эксперименты с использованием эмбрионов X. laevis.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Изучение влияния протеинкиназы MAK-V на статус фосфорилирования кофилина 1 и активацию сигнальных путей протеинкиназ ERK1/2 и Akt в клетках РС12ТеЮп с индуцибельной экспрессией протеинкиназы MAK.-V.

5.2. Мембранная локализация протеинкиназы MAK-V.

5.2.1. Биохимическое фракционирование клеток с индуцированной экспрессией протеинкиназы MAK-V.

5.2.2. Эндогенный белок MAK-V ассоциирован с клеточными мембранами.

5.2.3. Мембранная локализация протеинкиназы MAK-V в дрожжах.

5.3. Взаимодействие протеинкиназы MAK-V с синаитоподином.

5.3.1. Очистка и идентификация белков, взаимодействующих с С-концевым доменом протеинкиназы MAK-V.

5.3.2. Установление аутентичности белков и анализ специфичности взаимодействия с С-концевым доменом MAK-V.

5.3.3. Взаимодействие синаптоподина с полноразмерной протеинкиназой MAK-V.

5.4. Взаимодействие протеинкиназы MAK-V и убиквитин-лигазы Ncdd4.

5.4.1. Идентификация Nedd4 как белка-партнера по взаимодействию с протеинкиназой MAK-V.

5.4.2. Картирование взаимодействия между MAK.-V и Nedd4.

5.4.3. MAK-V подвергается протеасомной деградации.

5.4.4. Nedd4 не участвует в протеасомной деградации MAK-V.

5.4.5. Nedd4 регулирует функции MAK-V независимо от убиквитин-лигазной активности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение интерактома протеинкиназы MAK-V с целью характеризации ее функциональных свойств"

Протеинкиназы представляют собой одно из крупнейших суперсемейств эукариотических белков. Они ф о с фор ил и ру ют белковый субстрат, катализируя перенос у-фосфата с АТР на гидроксильную группу остатков серина, треонина или тирозина. Такая модификация может изменять ферментативную активность белка-субстрата, его внутриклеточную локализацию или взаимодействие с другими белками. Протеинкиназы являются медиаторами большинства сигнальных путей в эукариотической клетке и контролируют многие клеточные процессы, включая метаболизм, транскрипцию, прогрессию клеточного цикла, перестройку цитоскелега, клеточную подвижность, дифференцировку и апоптоз. Они играют ключевую роль в межклеточной коммуникации во время эмбрионального развития, в поддержании гомеостаза, в функционировании нервной и иммунной систем. Протеинкиназы индуцируют и поддерживают механизм долговременной потенциации синаптической передачи, лежащей в основе памяти и обучения.

Из 518 генов протеинкиназ человека почти половина картируется в локусах хромосом, ассоциированных с различными заболеваниями. Мутации и нарушение регуляции протеинкиназ напрямую связаны с развитием многих болезней, в том числе и онкологических. Модулирование активности протеинкиназ с помощью специфических ингибиторов и активаторов является одним из подходов к терапии этих заболеваний. Ключевая роль протеинкиназ во всех аспектах клеточной физиологии и их участие в патологических процессах объясняет большой интерес к изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции и функционирования этой группы ферментов.

Протеинкиназа MAK-V относится к семейству АМРК-иодобных серин-треониновых протеинкиназ, многие представители которого выполняют высококонсервативные функции во всех эукариотических организмах, от дрожжей до человека. Однако на сегодняшний день протеинкиназа MAK.-V является одним из наименее изученных представителей семейства АМРК-иодобных протеинкиназ. При этом остаются практически неизвестными механизмы регуляции протеинкиназы MAK-V, ее мишени и молекулярные процессы, в которых она принимает участие. Принимая во внимание не вызывающую сомнений ключевую роль протеинкиназ в регуляции клеточных процессов, исследование свойств и функций протеинкиназы MAK-V является актуальным и представляет несомненный интерес.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Калиниченко, Светлана Викторовна

Основные результаты работы получены автором лично или при его непосредственном участии. Масс-спектрометрический анализ белков проведен Р.Х. Зиганшиным (ИБХ РАН, г. Москва). Биохимическое фракционирование клеток РС12ТеЮп с индуцированной экспрессией протеинкиназы MAK-V мыши и анализ ее мембранной локализации в дрожжах выполнен совместно с И.В. Коробко. Иммунофлуоресцентный анализ колокализации синаптоподина и протеинкиназы MAK-V в клетках линии NCI-H1299 проведен И.В. Коробко. Фракция периферических мембран клеток головного мозга мыши были получена П.Н. Вихревой (ИБГ РАН, г. Москва). Получение клонов клеток PC12TetOn, продуцирующих микроРНК к гену Nedd4 крысы и контрольную микроРНК, проводилось при участии И.В. Коробко. Эксперименты по трансляции мРНК генов mak-v и Nedd4 в эмбрионах X.laevis выполнены Кейджи Ито (Mount Sinai School of Medicine, г. Нью-Йорк, США) с использованием предоставленных автором плазмидных конструкций и планом эксперимента. Имена соавторов приведены в соответствующих публикациях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю И.В. Коробко за чуткое руководство, за неоценимые научные и практические советы, а также за критическое чтение диссертации;

С.Ю. Соколу (Mount Sinai School of Medicine, г. Нью-Йорк, США) за организацию экспериментов с эмбрионами лягушки, позволивших выявить функциональность взаимодействия белков MAK-V и Nedd4;

Р.Х. Зиганшину (ИБХ РАН, г. Москва) за проведение масс-спектрометрического анализа; Е.В. Коробко и Е.Ю.Лысюк (ИБГ РАН, г. Москва) за помощь в работе с культурами клеток; а также всем сотрудникам Отдела генной терапии рака ИБГ РАН за моральную поддержку, помощь в работе, теплую и дружескую атмосферу в коллективе.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе был» изучены некоторые функциональные связи протеинкиназы MAK-V в клетке. При этом были исследованы возможные механизмы анти-апоптотической активности MAK-V, проанализирована ее внутриклеточная локализация и предпринят поиск белков — партнеров но взаимодействию с последующим анализом функциональных следствий выявленных взаимодействий.

Анализ молекулярных событий, которые могли бы опосредовать анти-аиоптотическую активность протеинкиназы MAK-V в клетках РС12ТеЮп при их контакте с коллагеном IV, выявил отсутствие влияния MAK-V на статус фосфорилирования кофилина 1 и уровень активации сигнальных путей протеинкиназ Akt и ERK1/2. Полученные данные свидетельствуют о том, что анти-апоптотическая активность MAK-V в этих клетках проявляется через воздействие на другие молекулярные события. Выявление сигнальных каскадов, регулирующих возникновение, рост и развитие опухоли, имеет большую практическую ценность для терапии онкологических заболеваний. Полученные нами результаты способствуют дальнейшему изучению роли MAK-V в канцерогенезе и направляют внимание на другие возможные механизмы анти-апоптотической активности протеинкиназы MAK-V, например, па регуляцию экспрессии гена одной из матриксных мегаллопротеиназ.

Изменение внутриклеточной локализации протеинкиназ является одним из способов регуляции их активности. В данной работе было обнаружено, что значительная часть клеточного пула эндогенного белка MAK-V локализована на мембране. Анализ первичной структуры выявил в каталитическом домене белка MAK-V сайт связывания с фосфатидилинозитол-(4,5)-бифосфатом. Можно предположить, что эта последовательность опосредует взаимодействие протеинкиназы MAK-V с мембраной. Кроме того, была продемонстрирована зависимость мембранной локализации белка MAK-V от присутствия убиквитин-ассоциированного домена, регулирующего каталитическую активность и внутриклеточную локализацию других АМРК-иодобных протеинкиназ. Выявленная ассоциация белка MAK-V с мембранами может обеспечивать корректную локализацию относительно субстрата и указывает на один из возможных способов регуляции протеинкиназной активности MAK-V посредством пространственного контроля.

В работе было впервые обнаружено взаимодействие протеинкиназы MAK-V с синаптоподином. Анализируя профили экспрессии генов mak-v и Synpo, можно предположить функциональную связь протеинкиназы MAK-V и синаптоподина в головном мозге. Опубликованные ранее данные свидетельствуют о возможной роли протеинкиназы MAK-V в регуляции эндоцитоза и функционировании синапсов, а анализ хромосомной локализации гена mak-v выявил его возможную ассоциацию с шизофренией, аутизмом и фенотипическими проявлениями синдрома Дауна. Синаптоподин ассоциирован с шиииковым аппаратом дендритных шипиков и регулирует формирование долговременной потенциации, лежащей в основе памяти и обучения. Обнаруженное в работе взаимодействие протеинкиназы MAK-V и синаитоподина может иметь регуляториое значение и определять локализацию MAK-V на шипиковым аппарате. С другой стороны, MAK-V потенциально может фосфорилировагь и предотвращать деградацию синаптоподина, способствуя формированию долговременной потенциации. Полученные результаты открывают дальнейшие перспективы для изучения роли протеинкиназы MAK.-V в головном мозге в свете ее возможного участия в функционировании синапсов, процессах памяти, обучения, интеллектуального развития.

В работе было впервые выявлено взаимодействие протеинкиназы MAK-V и убиквитин-лигазы Nedd4 и установлена его функциональность. В процессе изучения этого взаимодействия было показано, что уровень белка MAK-V контролируется в клетке путем протеасомной деградации, однако Nedd4 не является убиквитин-лигазой протеинкиназы MAK-V и не влияет на ее стабильность. Nedd4 регулирует функции MAK-V независимо от убиквитин-лигазной активности. Установленное влияние Nedd4 на MAK-V вместе с ранее выявленной регуляторной ролыо MAK-V в Wnt сигнальном пути впервые свидетельствует о роли в этом сигнальном пути убиквитин-лигазы Ncdd4. Более того, поскольку убиквитин-лигаза Nedd4 вовлечена в регуляцию Notch и IGF-R1 сигнальных путей, обнаруженная взаимосвязь служит основой для интеграции не только этих сигнальных путей, но и, в дополнение к ним, Wnt сигнального пути через взаимодействие между Nedd4 и MAK-V.

Полученные в работе результаты существенно расширяют наши представления о регуляции и функциональных связях протеинкиназы MAK-V и открывают перспективы для дальнейшего изучения роли MAK-V в клетке и в организме. Это, в свою очередь, является необходимой предпосылкой для установления роли протеинкиназы MAK-V в патологических процессах в организме, что абсолютно необходимо для валидации MAK.-V как молекулярной мишени для терапии и, в конечном итоге, для разработки новых стратегий лечения заболеваний человека, в которых протеинкиназа MAK-V может играть существенную роль, в частности, онкологических заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калиниченко, Светлана Викторовна, Москва

1. Коробко ИВ, Кабишев АА, Киселев СЛ. Идентификация новой протеипкиназы, специфически траскрибирующейся в опухолях мыши с высоким метастатическим потенциалом. Докл. Акад. Наук. 1997;354(4):554-556.

2. Коробко ИВ, Коробко ЕВ, Нинкина НИ, Бухман ВЛ, Киселев СЛ. Фосфорилирование протеипкиназы MAK-V в клетках млекопитающих. Докл. Акад. Наук. 2007;412:555-557.

3. Коробко ИВ. Ген протеипкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии: диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук: 03.00.26; 03.00.03. Москва, 2009. -296 с.

4. Коробко ИВ, Завалишина ЛЕ, Киселев СЛ, Райхлин ИТ, Франк ГА. Продукция протеипкиназы MAK-V/HUNK как возможный диагностический и прогностический маркер рака молочной железы человека. Арх. Патол. 2004;66(5):6-9.

5. Сорокин АВ, Ким ЕР, Овчинников ЛР. Протеасомная система деградации и ироцесинга белков. Biochemistry (Mosc). 2009;49:3-76.

6. Manning G, Whyte DB, Martinez R, Hunter T, Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 2002;298(5600):1912-1934.

7. Ghillebert R, Swinnen E, Wen J, Vandesteene L, Ramon M, Norga K, Rolland F, Winderickx J. The AMPK/SNFl/SnRKl fuel gauge and energy regulator: structure, function and regulation. FEBSJ. 2011;278(21):3978-3990.

8. Hardie DG, Ross FA, Hawley SA. AMPK: a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13(4):251 -262.

9. Woods A, Johnstone SR, Dickerson K, Leiper FC, Fryer LG, Neumann D, Schlattner U, Wallimann T, Carlson M, Carling D. LKB1 is the upstream kinase in the AMP-activated protein kinase cascade. Curr Biol. 2003;13(22):2004-2008.

10. Alessi DR, Sakamoto K, Bayascas JR. LKB1-dependent signaling pathways. Annu Rev Biochem. 2006;75:137-163.

11. Hawley SA, Boudeau J, Reid JL, Mustard KJ, Udd L, Makela TP, Alessi DR, Hardie DG. Complexes between the LKB1 tumor suppressor, STRAD alpha/beta and M025 alpha/beta are upstream kinases in the AMP-activated protein kinase cascade. J Biol. 2003;2(4):28.

12. Lizcano JM, Goransson O, Toth R, Deak M, Morrice NA, Boudeau J, Hawley SA, Udd L, Makela TP, Hardie DG, Alessi DR. LKB1 is a master kinase that activates 13 kinases of the AMPK subfamily, including MARK/PAR-1. EMBOJ. 2004;23(4):833-843.

13. Hawley SA, Pan DA, Mustard KJ, Ross L, Bain J, Edelman AM, Frenguelli BG, Hardie DG. Calmodulin-dependent protein kinase kinase-bcta is an alternative upstream kinase for AMP-activated protein kinase. Cell Metab. 2005;2(1):9-19.

14. Momcilovic M, Hong SP, Carlson M. Mammalian TAK1 activates Snfl protein kinase in yeast and phosphorylates AMP-activated protein kinase in vitro. J Biol Chem. 2006;281(35):25336-25343.

15. Hedbacker K, Carlson M. SNF1/AMPK pathways in yeast. Front Biosci. 2008;13:2408-2420.17