Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов устойчивости к индуктору окислительного стресса менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. штамм РСС 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов устойчивости к индуктору окислительного стресса менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. штамм РСС 6803"

На правах рукописи

003055478

Семина Мария Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ИНДУКТОРУ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА МЕНАДИОНУ У ЦИАНОБАКТЕРИИ БУМЕСНОСУХТМ БР. штамм РСС 6803

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2007

003055478

Работа выполнена на кафедре генетики биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор биологических наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук

доктор биологических наук

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Еланская

Ирина Владимировна

Кокшарова Ольга Алексеевна

Голденкова-Павлова Ирина Васильевна

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится «_»_ 2007 г. в_час. на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, 3. Факс: (095) 13289-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.Н. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Менадион (-2-метил-1,4-нафтохинон) индуцирует окислтельный стресс в клетках аэробных организмов. Ингибирующее действие хинонов обусловлено, главным образом, их одноэлектронным восстановлением до семихинонов. В реакции семихинона с кислородом регенерируется хинон и образуется супероксид, который индуцирует окислительный стресс (Hassan, Fridovich, 1979) При восстановлении хинонов по двухэлектронному механизму образуются нетоксичные гидрохиноны (Lind et al., 1982).

В клетках бактерий менадион взаимодействует с дыхательной электрон-транспортной цепью (ЭТЦ) и восстанавливается различными дегидрогеназами (Imlay, Fridovich, 1982). У фотосинтезирующих организмов менадион легко проникает в тилакоидные мембраны, где он может акцептировать электроны из фотосинтетической цепи на уровне разных компонентов (Hauska et al., 1977; Samuilov et al., 1997). Роль дегидрогеназ и оксидаз в устойчивости к менадиону клеток фотосинтезирующих организмов оставалась не ясной.

Тилакоидная мембрана цианобактерий содержит как фотосинтетическую, так и дыхательную ЭТЦ. Общими переносчиками электронов являются пул пластохинона (PQ), комплекс цитохромов b(f и пластоцианин. Фотосинтетический транспорт электронов от воды через фотосистему II (ФСП), пул PQ, комплекс шпохромов b(f и фотосистему I (ФС1) завершается восстановлением NADPH. Электроны от дыхательных субстратов поступают в ЭТЦ тилакоидной мембраны с участием НАО(Р)Н-дегидрогепазы NDH-1, сукцинатдегидрогеназы, NADH-дегидрогеназы NDH-2 (Ogawa, 1991; Cooley, Vermaas, 2001; Berry et al., 2002).

В основе противодействия клеток окислительному стрессу лежит активация генов, кодирующих ферменты антиоксидантных систем, к которым относятся супероксидцисмутазы, каталазы и пероксидазы. Кроме того, важную роль в защите клеток от ингибирующего действия хинонов играет активация генов, кодирующих дегидрогеназы, которые восстанавливают эти агенты по двухэлектронному механизму с образованием нетоксичных гидрохинонов (Lind et al., 1982). В клетках млекопитающих обнаружен эффективный механизм защиты от ингибирующего действия хинонов. Цитозольный фермент КАС)(Р)Н:хинон-оксидоредуктаза (DT-диафораза) участвует в двухэлектронном восстановлении хинонов, препятствуя их

одноэлектронному восстановлению другими ферментами (Prochaska et al., 1985). У цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis 6803) обнаружена ЫАБ(Р)Н:хинон-оксидоредуктаза, кодируемая геном drgA, которая, по ряду свойств близка к DT-диафоразам млекопитающих (Чеснавичене и др., 1994; Elanskaya et al., 1998; 2004; Matsuo et al., 1998).

Цели и задачи работы. Целью данной работы было выяснение роли генов, кодирующих дегидрогеназы и оксидазы, которые участвуют в транспорте электронов в тилакоидной мембране, в контроле устойчивости клеток Synechocystis 6803 к индуктору окислительного стресса менадиону. В задачи работы входила идентификация генов, ответственных за устойчивость к менадиону, с помощью мутантов Synechocystis 6803, лишенных функционально активных дегидрогеназ NDH-1, NDH-2, SDH, DrgA, а также цитохром- и хинолоксидаз; выяснение механизмов устойчивости к менадиону; выяснение роли гена drgA, кодирующего растворимую КАО(Р)Н.хинон-оксидоредуктазу, в регуляции электронного транспорта в тилакоидной мембране Synechocystis 6803.

Научная новизна. Впервые установлено, что устойчивость клеток цианобактерии Synechocystis 6803 к индуктору окислительного стресса менадиону контролируется генами ndhB и drgA, кодирующими, соответственно, субъединицу дегидрогеназного комплекса NDH-1 и растворимую NAD(P)H:xhhoh-оксидоредуктазу. Гены, кодирующие субъединицы дегидрогеназ NDH-2, SDH и оксидаз Ctal, Ctall и Cyd, не влияют на устойчивость клеток цианобактерии к менадиону. Показано, что устойчивость клеток Synechocystis 6803 к менадиону связана с двухэлектронным восстановлением менадиона до менадиола, которое осуществляется с участием продукта гена drgA. Впервые установлено, что продукт гена drgA, участвует в переносе электронов от цитоплазматических дыхательных субстратов в пул пластохинона тилакоидной мембраны, и уровень экспрессии гена drgA может зависеть от содержания NADPH в цитоплазме клеток цианобактерии. Впервые показано, что функция, по крайней мере, одной из дегидрогеназ, SDH или DrgA необходима для роста клеток цианобактерии в фотоавтотрофных условиях. Научная и практическая значимость работы. Полученные данные существенно расширяют современные представления о молекулярных механизмах и генетическом контроле устойчивости клеток фотосинтезирующих организмов к

ряду индукторов окислительного стресса. Данные об участии продукта гена с1^А в переносе электронов от цитоплазматических дыхательных субстратов в пул пластохинона тилакоидной мембраны имеют принципиальное значение для развития исследований и области изучения систем фотосинтетического и дыхательного транспорта электронов. Данные о механизме устойчивости клеток цианобактерий к окислительному стрессу с участием продукта гена могут найти применение в разработке новых подходов к созданию устойчивых к стрессовым воздействиям сортов генетически модифицированных растений.

Личный вклад автора. Диссертация написана лично автором с использованием собственных результатов, а также данных, полученных в совместных экспериментах. Автор глубоко признателен к.б.н. В.Г. Гривенниковой (кафедра биохимии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова) за помощь в измерениях ферментативных активностей, к.б.н. К.Н. Тимофееву (кафедра биофизики биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова) за помощь в проведении экспериментов по ЭПР-спектроскопии и В.А. Топоровой (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) за предоставление очищенного белка Б^А.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Международной конференции "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах" (Москва, 2006), Международной конференции "Грибы и водоросли в биоценозах (Москва, 2006), XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006», Международной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 2006), 12-м Международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (По, Франция, 2006).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 статьи в отечественных изданиях и 7 тезисов на различных конференциях Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 94 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок, 7 таблиц, список литературы содержит 101 цитированный источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штамм дикого типа цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 и штамм E.coli - TGI (Sambrook et al., 1989) из коллекции кафедры генетики МГУ, а также инсерционные мутанты Synechocystis 6803: DrgA - по гену drgA, несущий инсерцию гена Km-резистентности в ВатШ-сшк гена drgA, выделен на кафедре генетики МГУ (Чеснавичене и др., 1994); NDH-1 (ndhB::KmR), по гену, кодирующему NdhB-субъединицу NDH-1, получен от проф. Т. Огавы (Ogawa, 1991). Мутанты NDH-2 (ndbA:\EmR I ndbB::SpR), лишенный дегидрогеназы NDH-2 (Howitt et al., 1999); SDH (sllJ625::KmK/sll0823::Cm\ лишенный сукцинатдегидрогеназы (Cooley et al, 2000) и Ox (cta[:\KmR/ctaII:\SpR/cyd\:EmR), лишенные цитохромоксидаз Ctal, Ctall и хинолоксидазы Cyd (Howitt,Vermaas,1998) - получены от проф. В. Вермааса.

Клетки Synechocystis 6803 выращивали фотоавтотрофно при постоянном освещении (40 мкЕ м"2 с"2)и температуре 30°С в минеральной среде BG11 (Rippka et al., 1979). В отдельных экспериментах клетки выращивали фотогетеротрофно (в присутствии 10 мМ глюкозы и 20 мкМ DCMU при интенсивности освещения 5 мкЕ м"2 с'2) или фотомиксотрофно (10 мМ глюкозы, 40 мкЕ м'2 с"2). При выращивании мутантов цианобактерии в твердую среду добавляли необходимые антибиотики в следующих концентрациях (мкг/мл): канамицин (Km) -100; эритромицин (Em), хлорамфеникол (Cm) и спектиномицин (Sp) - 20; гентамицин (Gm) -4; в жидкую среду - Km - 50; Sp, Cm, Em - 10, Gm - 2 мкг/мл. Для выращивания мутанта NDH-1 в среду роста добавляли HEPES (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-2-(этансульфоновая кислота) (10 мМ, рН 8,0) и NaHC03 (5 мМ). Антибиотики в среду LB для Е. coli добавляли в соответствии со стандартной методикой (Маниатис и др., 1984). В качестве ингибиторов электронного транспорта использовали реагенты продукции фирмы "Sigma" (США): менадион, диносеб и DCMU. Пороговые концентрации ингибиторов для штаммов цианобактерии определяли на чашках с твердой средой, содержащих различные концентрации ингибиторов. Для получения биомассы культуры

цианобактерий выращивали в колбах объемом 1000 мл с продувкой воздухом, обогащенным СОг (2%), в течение 3-7 суток.

Трансформацию Е. coli проводили по стандартному методу (Маниатис и др., 1984). В работе использовали плазмиды: pBHS (pUC19, несущая фрагмент ДНК Synechocystis 6803 (1,2 тпн) с геном drgA; рНР45 (GmR) и pSL762 (CmR ). Трансформацию клеток Synechocystis 6803 проводили по методу, описанному ранее (Grigorieva & Shestakov, 1982). Сегрегацию трансформантов Synechocystis 6803 осуществляли путем последовательного субклонирования на твердой среде с повышающимися концентрациями антибиотика (мкг/мл): Km - от 10 до 100 с шаг ом 20, Gm - от 1 до 4 с шагом 1, Cm - от 5 до 25 с шагом 5. Сегрегацию мутаций контролировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Молекулярное клонирование и ПЦР проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984), либо согласно методикам, рекомендованным фирмами-производителями реактивов. Экспрессию генов изучали методом Northern-блоттгибридизации и ОТ-ПЦР как описано ранее (Еланская и др., 2003).

ЫАЭ(Р)Н:С>о-редуктазную и КАО(Р)Н:диносеб-редуктазную активности регистрировали соответственно при 340 нм (по снижению поглощения NADPH или NADH, е = 6,2 мМ'-см"1) и при 470 нм (поглощение восстановленного диносеба г = 6,9 mM''-см"1) в реакционной смеси, содержащей 20 мМ Tris -НС1, рН 7,5; 100 мкМ NAJDPH или NADH и акцепторы электронов (100 мкМ Qo или 50 мкМ диносеб) при 30° на спектрофотометре Hitachi-557 ("Hitachi , Ltd", Япония). Дегидрогеназную активность измеряли по восстановлению МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид) до формазана (Еланская и др., 2004). Очищенные мембраны выделяли из клеток цианобактерии по модифицированному методу Mi et al. (1995). Экспрессированный в клетках Е. coli и очищенный методом Ni-аффинной хроматографии белок DrgA-12His был любезно предоставлен В.А. Топоровой (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН).

Кинетику фотоивдуцированных окислительно-восстановительных превращений Р700 регистрировали при комнатной температуре с помощью ЭПР-спектрометра 3-см диапазона РЕ-1307 (Черноголовка, Россия). В ячейку помещали 0,35 мл суспензии клеток (или мембран) при концентрации хлорофилла 50 мкг на 1

мл. ЭПР сигнал I генерировали импульсным освещением (0,1 с) суспензии клеток белым светом (2000 мкЕ-м"2-с"'). Конечный сигнал от Р700+ представляет собой результат суммирования 20-40 индивидуальных сигналов, полученных в ответ на отдельное освещение. Условия ЭПР: мощность СВЧ 20 мВт, амплитуда модуляции 0,3 мТ, частота модуляции 100 кГц, постоянная времени 10 мкс. DCMU (20 мкМ), менадион (20 мкМ), менадиол (20 мкМ), NADPH (100 мкМ) и очищенный белок DrgA-12His (в конечной концентрации 100 мкг/мл) добавляли непосредственно перед регистрацией спектров ЭПР.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Дегидрогеназная активность в клетках дикого типа и мутантов.

Дегидрогеназную активность клеток оценивали по их способности восстанавливать соли тетразолия (например, МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид) до формазана (Mosmann, 1983). Максимальное подавление дегидрогеназной активности наблюдалось у мутанта, лишенного функционально активного комплекса NDH-1 (рис. 1).

Рисунок 1. Восстановление МТТ клетками дикого типа (WT) и мутантов NDH-2, SDH, DrgA, NDH-1 (фотоавтотрофные условия роста, оптическая плотность культур составляла 1,5 ед. при 750 нм).

Существенный вклад в суммарную дегидрогеназную активность клеток вносит продукт гена drgA, тогда как вклад NDH-2 и SDH заметно ниже. Таким образом, ЫАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктаза, кодируемая геном drgA, наряду с

комплексом N011-1, является одной из важных дегидрогеназ, функционирующих в клетках БупесИосуяНз 6803 в фотоавтотрофных условиях роста

Устойчивость к менадиону клеток дикого типа и мутантов. Мутант по гену лишенный ЫА1)(Р)Н:хинон-оксидоредуктазы и мутант по гену МИВ, лишенный В-субъединицы комплекса Ы1Ш-1, характеризуются повышенной чувствительностью к менадиону. Мутанты с нарушением сукцинатдегидрогеназы, ЫАВ(Р)Н-дегидрогеназы ЫБН-2, а также мутант Ох, лишенный хинолоксидаз и цитохромоксидаз, по устойчивости к менадиону не отличались от клеток дикого типа. В фотогетеротрофных условиях роста все штаммы были более чувствительны к менадиону, чем в фотоавтотрофных условиях (Табл. 1).

Таблица 1. Устойчивость клеток дикого типа и мутантов к менадиону в фотоавтотрофных и фотогетеротрофных условиях роста

Штамм Ингибирующая концентрация менадиона (мкМ)*

Фотоавтотрофный рост** Фотогетеротрофный рост ***

20 6

2,5 0,8

ШН-1 2,5 Нет роста

ЫОН-2 20 б

80Н 20 6

Ох 20 6

ЫОН-1/Ог&А 2 Нет роста

2,5 0,8

2,5 0,8

*Минимапьная концентрация ингибитора, подавляющая рост клеток на твердой среде ** При интенсивности освещения 40 мкЕ м"2 с"2

***В присутствии 10 мМ глюкозы и 20 мкМ ОСМи при интенсивности освещения 5 мкЕ м"2 с"2

Мутант, лишенный функционально активного комплекса N011-1, не рос в присутствии глюкозы в фотогетеротрофных условиях (С^а\уа, 1991). Поскольку >ШН-1 участвует в дыхательном и в циклическом фотосинтетическом транспорте электронов, а также необходим для концентрирования СО2, чувствительность КОН-1-мутанта к менадиону может бьггь связана с нарушением электронного транспорта в тилакоидной мембране. Функция Б^А-белка оставалась не ясной.

Введение мутации по гену йтщА в геном мутантов по дегидрогеназам и оксидазам. Чтобы подтвердить, что продукт гена действительно отвечает за устойчивость клеток к менадиону, а также с целью изучения функции этого гена, мутация по гену была введена в клетки штаммов, лишенных других

дегидрогеназ и оксидаз. Поскольку указанные мутанты уже несли один или более генов антибиотикоустойчивости, были сконструированы рекомбинантные плазмиды, в которых ген с1^А был инактивирован встраиванием гена устойчивости к дополнительному антибиотику (Рис. 2).

бгдА бгдА

бгдА

Рис. 2. Инсерционная инактивация гена ^¿А

Для инактивации гена drgA в клетках мутанта NDH-2 использовали полученную ранее конструкцию (Чеснавичене и др., 1994). Для

инактивации гена drgA у мутанта NDH-1 (ndhB::KmR) была сконструирована рекомбинантная плазмида pBHS::CmR, несущая drgA с инсерцией Стк-кассеты. Для трансформации мутантов SDH (sltl625::KmR/sll0823::CmR) и Ox (cta/::KiriR/ с tall:: Sp R/cyd:: Е mR) была сконструирована рекомбинантная плазмида pBHS::GmR, несущая drgA с инсерцией GmR-Kaccerbi. Инсерционная инактивация гена drgA в составе плазмиды pBHS Е. coli встраиванием кассеты с соответствующим геном антибиотикоустойчивости была подтверждена с помощью рестрикционного анализа рекомбинантных плазмид.

Для сегрегации мутации по гену drgA в клетках Synechocystis 6803 клоны трансформангов последовательно пересевали на среды, содержащие повышающиеся концентрации соответствующего антибиотика. Из клонов, растущих при высоких концентрациях антибиотиков, выделяли тотальный препарат ДНК и анализировали его методом ПЦР с праймерами для гена drgA. Электрофоретический анализ амплифицированных фрагментов показал, что у двойных мутантов NDH-1/DrgA, NDH-2/DrgA и Ox/DrgA дикая копия гена drgA (0,6 тпн) была полностью заменена мутантной копией: drgA::CmK (2,2 тпн), drgA::KmR (2,4 тпн) и drgA::GmR (3,1 тпн), соответственно. Получить полностью сегрегированный мутант SDH/DrgA не удалось ни в фотоавтотрофных условиях (в присутствии и в отсутствие КаНСОз"), ни в фотомиксотрофных условиях. В клетках всех проверенных клонов сохранялась как дикая копия гена (0,6 тпн), так и мутантная (3,1 тпн). Таким образом, присутствие хотя бы одного из продуктов этих генов необходимо для поддержания роста клеток цианобактерии в фотоавтотрофных условиях

Введение мутации по гену drgA в штаммы NDH-2 и Ох повышало порог чувствительности к менадиону двойных мутантов с 20 мкМ до 2,5 мкМ (в фотоавтотрофных условиях роста). Чувствительность к менадиону двойного мутанта NDH-1/DrgA повышалась с 2,5 мкМ до 2 мкМ. Таким образом, введение мутации по гену drgA повышает чувствительность двойных мутантов к менадиону (Табл 1).

Ферментативные активности в бесклеточных препаратах дикого типа и мутанта DrgA. Показано, что продукт гена drgA восстанавливает нигроароматические ингибиторы (например, диносеб) с образованием токсичных промежуточных соединений (Elanskaya et al., 1998). Согласно данным Matsuo et al. (1998), продукт гена drgA восстанавливает хиноны и является NAD(P)H:xhhoh-оксидоредуктазой. Для изучения функции продукта гена drgA были измерены NAD(P)H:xHHOH-peflyirra3HaH и N A D(P)H: диносеб-реду ктазная активности у дикого типа и мутанта DrgA. Как хинон-, так и диносебредуктазная активность была выше с NADPH, чем с NADH, в качестве донора электронов Около 60% НАО(Р)Н:хинон-редуктазной активности и вся КАО(Р)Н:диносеб-редуктазная активность связаны с функцией продукта гена drgA (Табл. 2).

Таблица 2. КАО(Р)Н:хинон-редуктазная и №\Г)(Р)Н:диносеб-редуктазная активности в бесклеточных препаратах дикого типа (WT) и мутанта DrgA Synechocystis 6803.

Акцептор Qo- редуктазная активность (нмоль/мин на 1мг белка) Диносебредуктазная активность (нмоль/мин на 1мг белка)

NADPH NADH NADPH NADH

Бесклеточные препараты WT 162 35.7 23 1.1

DrgA 78 27.5 0 0

Мембранная фракция WT 28 н.о. 0 н.о.

DrgA 14 н.о. 0 но.

Растворимая фракция WT 474 н.о. 56 н.о.

DrgA 210 н.о. 0 н.о.

н.о. - не определяли

Профиль гидрофобности гипотетического продукта гена drgA свидетельствует о том, что он не является интегральным мембранным белком. Вся NAD(P)H: диносеб-реду ктазная активность и большая часть NAD(P)H:xhhoh-редуктазной активности сосредоточены в растворимой фракции клеток дикого типа Synechocystis 6803 (Табл. 2). Поскольку белок DrgA не обнаружен среди белков

периплазмы цианобактерии, можно заключить, что он расположен в цитоплазме и не образует прочной связи с мембранами цианобактерии.

Влияние менадиона на скорость послесветового восстановления реакционного центра фотосистемы I (Р700*) в клетках дикого типа и мутантов. Продукт гена отличается высокой хинонредуктазной активностью, а в качестве донора электронов использует преимущественно ЫАОРН. Для проверки предположения о том, что Б^А может участвовать в переносе электронов от ЫАБРН в пул пластохинона тилакоидной мембраны БупесЬосузШ 6803, а также с целью изучения механизма действия менадиона на транспорт электронов в тилакоидной мембране цианобактерии, была изучена кинетика окисления-восстановления реакционного центра ФС1 (Р700) методом ЭПР-спектроскопии.

При освещении клеток белым светом Р700 ФС1 окисляется, что выражается в возрастании амплитуды ЭПР-сигнала. После выключения света окисленный реакционный центр ФС1 (Р700+) быстро восстанавливался в клетках дикого типа и всех мутантов (Рис. 3, контроль) за счет притока электронов из пула Р<3, в который они поступают как от ФСП, так и от дыхательных субстратов с участием дегидрогеназ (М1 е1 а!., 1994).

Дикий ТИП DrgA NDH-1 NDH-2 SDH

ори 0/116 ** 0р19 Контроль

._/ 0,22 ом «Jo рез**— DCMU

J4- ОрбО ори DCMD+ шяядхок

орз B*i 4ыкл Свет 0/Ш Bici ^выкл Свет ор< таг 0(121 Et-jf ^ЫКЛ B*i ^ЫКЛ BKlf ^ЫКП Свет Свет Свет DCMU+ мекаднол нн 0.1 с

Время

Рис. 3. Кинетика окисления-восстановления Р700+, зарегистрированная методом ЭПР-спектроскопии в фотоавтотрофно выращенных клетках дикого типа и мутантов DrgA, NDH-1, NDH-2 и SDH.

При добавлении DCMU блокируется поток электронов от ФСП, и электроны поступают в пул PQ за счет циклического транспорта с участием ФС1, а также от дыхательных субстратов с участием дегидрогеназ. Скорость восстановления Р700+ после его фотоокисления белым светом в присутствии DCMU в клетках мутантов NDH-1 и DrgA была ниже, чем в клетках дикого типа и мутантов NDH-2 и SDH (Рис. 3, DCMU). У мутанта NDH-1 низкая скорость послесветового восстановления Р700+ вызвана нарушением циклического транспорта электронов через ФС1 и транспорта электронов от дыхательных субстратов (Mi et al., 1995). Замедленное восстановление Р700+ в клетках DrgA-мутанта свидетельствует об участии продукта гена drgA в восстановлении пула PQ в клетках Synechocystis 6803. Таким образом, в отсутствие активности ФСП электроны поступают на PQ и далее на Р700+, главным образом, за счет дегидрогеназного комплекса NDH-1 и КАО(Р)Н:хинон-оксидоредукгазы, кодируемой геном drgA.

При добавлении менадиона скорость восстановления Р700+ в клетках дикого типа и мутантов NDH-1, NDH-2 и SDH существенно возрастала, тогда как у мутанта DrgA восстановление Р700+ резко замедлялось (Рис. 3, DCMU+менадион). Если менадион был предварительно восстановлен дитионитом натрия по двухэлектронному механизму до менадиола (гидрохинон), восстановление Р700+ ускорялось у всех мутантов, включая DrgA (Рис. 3, DCMU+менадиол). На основании этих данных можно заключить, что продукт гена drgA восстанавливает менадион до менадиола по двухэлектронному механизму, а менадиол, по-видимому, является донором электронов в пул PQ тилакоидпой мембраны Synechocystis 6803.

Экспрессия гена drgA. В экспериментах по Northern блоттгибридизации с тотальной РНК, выделенной из фотоавтотрофно растущих клеток дикого типа, зонд drgA дает положительный гибридизационный сигнал с двумя транскриптами (Рис. 4), Один из них (0,6 тпн) соответствует по размеру РЖ, синтезированной на матрице гена drgA. Второй транскрипт (около 1,3 тпн) по размеру соответствовал суммарной РНК, считанной с гена drgA и расположенного перед ним гена slrl 718, который имеет гомологию с генами сотеВ-семейства (Kaneko et al., 1996) (Рис. 5).

Количество обоих трапскриптов существенно не менялось при инкубации клеток ВупесЪосуяНз 6803 с менадионом (Рис. 4, а, дорожка 2), или диносебом (Рис. 4. дорожка. 4), однако пропорционально возрастало при внесении глюкозы в среду роста (Рис. 4, дорожки 3, 5).

Зч

6 ч

I \ь

- I. > Т1Ш

- - 0.6 ;

(!) - фотоавтотрофно выращенные клетки;

(2) - инкубация с менадионом (5 ,мкМ);

(3) - инкубация с глюкозой (10 мМ);

(4)- инкубация с диносебом (5 мкМ);

(5) - инкубация с менадионом и глюкозой;

(6) - инкубация с хлорамфеникодоМ (5 мкМ).

Рис. 4. Результаты МогШега-блйт гибридизации суммарной РНК 5упеско<у8№ 6803 с зондом (1г%/1 (а) и с зондом 165 РНК (6).

НатН} ВатН1 Н1т1 Мрп!

—г*-I-'"—

+ - Г г

\\ ч:". |-П№ ^...

зЫШ &$А

ИраI

—1—г-

ахрХ

0,6 ин

1,3 тпн

Рис. 5. Схема района гена на хромосоме ¡¡утсИосузяб 6803.

Для оценки уровней экспрессии drgA и slr!718 в разных условиях роста был использован метод ОТ-ПЦР (Рис. в). Оба гена, drgA н slrl7l8, экснрессировались в фотоавтотрофиьгх условиях роста {¡'не. 6, дорожка 1). В фотомиксоторофных условиях (свет, глюкоза) экспрессия обоих генов существенно возрастала (Рис, 6, дорожка 2). Ü клетках, инкубированных в темноте в течение 24 часов, уровень экспрессии drgA и slr!7I8 был очень низким (Рис. 6, дорожка 3), однако он резко возрастал, если kj стки инкубировали в темноте в присутствии глюкозы (Рис, б, дорожка 4). Инкубация клеток на свету в присутствии менадиона или диносеба не вызывала индукнии экспрессии drgA и sir¡7¡8 (Рис. 6, дорожки 5, 6).

slrl718

drgA

á С Фпп

11.1.

II .i 11

1 2 3 4 S 6

Рис. 6. Эeктрофореграмmа ПЦР-фрагментов, амплифицировййных с обратных транскриптов с помощью прайм еров для slrl 718 и drgA (а), и относительные уровни Эксюессии генов drgA и $1г1718 (б) в разных условиях роста. Суммарная РНК выделена из фотоавтотрофно выращенных клеток (1) и клеток, инкубированных в течение 6 ч на свету с 10 мМ глюкозы (2), в темноте без глюкозы (3) в темноте с 10 мМ пиокозы (4), на свету с 5 мкМ менадиона, и на свету с 5 икМ диносеба (6). В качестве маркера использовали 100 bp DNA Ladder.

Поскольку s фотоавтотрофных условиях роста, а также в присутствии глюкозы в клетках увеличивается содержание дыхательных субстратов, можно

предположить, что уровень экспрессии и $1г1718 зависит от содержания ЫАБРН в цитоплазме клеток цианобактерии.

Изучение функции гена с помощью очищенного белка ОгёА-12Ш$,

экспрессированного в клетках Е. со1и Для изучения функции гена был использован очищенный белок БгдА, имеющий на конце 12 гистидиновых остатков (белок был экспрессирован в клетках Е.соН и очищен В.А. Топоровой в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) Рекомбинантная плазмида содержала С1аУХко\ фрагмент хромосомной ДНК цианобактерии, несущий полноразмерньш ген в составе вектора

экспрессии рТгс-99А.

Контроль

ЫАОРН

ОгиА

МАОРН ОгдА

Менадион

Менадион ЫАОРН Менадион ОгдА Менадион МАйРН РгдА

2 <

¡^ыт

^--ц-щ щ

вкл выкл вкл выкл вкл выкл

све с зе сяет

н

Рис. 7. Кинетика окисления-восстановления Р700 в изолированных тилакоидных мембранах мутанта Э^А при освещении бельм светом в присутствии Б СМИ

Белок ВгдА-12Н18, выделенный из клеток Е.соН после индукции 1РТв и очищенный с помощью №-аффинной хроматографии, обладал высокой

хинонредуктазной активностью (53,0 и 37,0 мкмоль/мин на мг белка с NADPH и NADH, соответственно, в качестве доноров электронов) и диносебредуктазной активностью (14,7 и 6,5 мкмоль/мин на мг белка с NADPH и NADH, соответственно).

Очищенный белок DrgA-12His был использован в модельных экспериментах для изучения с помощью ЭПР-спектроскопии послесветового восстановления Р700+ в изолированных тилакоидных мембранах мутанта DrgA. Эксперименты проводились с добавлением DCMU, чтобы исключить влияние электронов, поступающих от ФС II. Как видно из Рис. 7, добавление донора электронов NADPH или очищенного белка DrgA-12His не вызывало существенных изменений кинетики окисления-восстановления Р700. Однако добавление очищенного белка в сочетании с NADPH приводило к заметному ускорению послесветового восстановления Р700+, причем этот эффект усиливался в присутствии менадиона. Таким образом, белок DrgA участвует в переносе электронов от NADPH на пул PQ в тилакоидной мембране цианобактерии. Менадион, по-видимому, является промежуточным переносчиком электронов в этом процессе.

ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ устойчивости мутантов по дегидрогеназам DrgA, NDH-1, NDH-2 и SDH к индуктору окислительного стресса менадиону показал, что в фотоавтотрофных условиях роста мутанты DrgA и NDH-1, лишенные, соответственно, NAD(P)H:xmioH-oKCHHope,5yKTa3bi и NADPH-дегидрогеназы типа 1, характеризуются повышенной чувствительностью к менадиону В отсутствии NDH-1 ингибирующий эффект менадиона может быть связан с нарушением дыхательного и циклического транспорта электронов через ФС1 (Mi et al., 1992; 1995), тогда как роль продукта гена drgA оставалась не ясной.

Изучение влияния менадиона и менадиола на скорость восстановления реакционного центра ФС1 (Р700+) с помощью ЭПР-спектроскопии в клетках дикого типа и мутантов позволило заключить, что продукт гена drgA участвует в двухэлектронном восстановлении менадиона до менадиола Таким образом белок

DrgA может препятствовать одноэлектронному восстановлению менадиона, вызывающему окислительный стресс (Рис. 8).

Ингибирующий эффект менадиона обычно связывают с окислительным стрессом, который возникает в результате образования супероксида в ходе циклических реакций одноэлектронного окисления-восстановления хинонов (Thor et al., 1982). Полученные результаты свидетельствуют о том, что устойчивость к менадиону клеток Synechocystis 6803 связана со способностью продукта гена drgA восстанавливать экзогенные хиноны до гидрохинонов, а также с функцией дегидрогеназного комплекса NDH-1, который участвует в дыхательном и циклическом фотосинтетическом транспорте электронов через ФС1.

Окислительный стресс

Рис. 8. Предполагаемая роль КАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктазы, кодируемой геном в защите клеток цианобахтерий от ингибирующего действия менадиона.

Таким образом, растворимая ЫАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктаза, кодируемая геном drgЛ, участвует в защите клеток 8упесИосу$Ш 6803 от ингибирующего действия менадиона, а также осуществляет биоактивацию нитроароматических соединений (Чеснавичене и др., 1994; Екпзкауа й а1., 1998). Оба этих свойства белка В^А характерны для КАВ(Р)Н:хинон-оксидоредуктазы (ОТ-диафоразы) млекопитающих, и возможно, что О^А является функциональным гомологом БТ-диафоразы в клетках БупескосузШ 6803. Однако в отличие от генов, кодирующих БТ-диафоразы животных и человека (Ывша!, 2000), экспрессия гена drgA не индуцируется в присутствии менадиона или нитроароматических соединений.

Полученные в данной работе результаты позволяют предположить, что экспрессия гена, кодирующего DrgA Synechocystis 6803, может регулироваться уровнем NADPH в цитоплазме. Возможно, что у фотосинтезирующих организмов функция растворимой ЫАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктазы необходима, главным образом, для окисления NADPH, в условиях, когда он не может эффективно окисляться в цикле Кальвина, тогда как у гетеротрофных организмов наиболее важной функцией DT-диафораз может являться детоксикация ксенобиотиков.

В клетках Synechocystis 6803 осуществляется координированная экспрессия генов drgA и slrl718, что может свидетельствовать о координации функций, выполняемых продуктами этих генов в клетках цианобактерии. Согласно компьютерным базам данных, slrl718 кодирует гипотетический белок, состоящий из 241 аминокислотного остатка, который не имеет протяженных гидрофобных районов. Гипотетический белковый продукт slrl 718 имеет около 60% гомологии с продуктом гена сотВ цианобактерии Nostoc sp. РСС 7120 (Kaneko et al., 2001). Гены семейства сотВ широко распространены среди различных групп бактерий и кодируют 2-фосфосульфолактатфосфатазу, которая участвует в биосинтезе кофермента М. Наиболее близкий СотВ фермент фотосинтезирующих организмов — фосфогликолатфосфатаза (PGP). У фотоавтотрофных бактерий и в хлоропластах растений PGP дефосфорилирует фосфогликолат, который образуется при фотодыхании при взаимодействии рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы/ оксигеназы с кислородом (Wingler, 2000). По-видимому, функция гена slrl718 жизненно необходима для клеток цианобактерии, т.к. предпринятые в нашей лаборатории попытки получить полностью сегрегированный мутант по этому гену оказалась пока безуспешными.

Эксперименты с очищенным белком DrgA-12His показали, что функция растворимой КАВ(Р)Н:хинон-оксидоредуктазы может быть связана с переносом электронов от NADPH в пул PQ тилакоидной мембраны Synechocystis 6803. Таким образом, DrgA является основным претендентом на роль диафоразного домена комплекса NDH-1, который до сих пор не обнаружен у цианобакгерий (Battchikova et al., 2005; Zhang et al., 2004; 2005). Проведенные в нашей лаборатории предварительные эксперименты по изучению послесветового восстановления Р700+ в тилакоидных мембранах мутанта NDH-1 в присутствии белка DrgA-12His

показали, что функция DrgA, скорее всего, не зависит от NDH-1. По-видимому, продукт гена drgA представляет собой альтернативную дегидрогеназу, способную переносить электроны от цитоплазматических дыхательных субстратов в мембранный пул PQ.

ВЫВОДЫ

• Мутации в гене drgA, кодирующем МАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктазу (DrgA), и в гене ndhB, кодирующем субъединицу ЫАО(Р)Н-дегидрогеназы NDH-1, повышают чувствительность клеток цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 к менадиону. Мутации в генах, кодирующих NADH-дегидрогеназу NDH-2, сукцинатдегидрогеназу (SDH) и оксидазы Ctal, Ctall и Cyd не влияют на устойчивость клеток цианобактерии к менадиону.

• Введение мутации по гену drgA повышает чувствительность к менадиону мутантов по дегидрогеназе NDH-2 и оксидазам. Двойной мутант SDH/DrgA нежизнеспособен, т.е. наличие хотя бы одной из дегидрогеназ, SDH или DrgA, необходимо для фотоавтотрофного роста клеток цианобактерии.

• Ген drgA транскрибируется совместно с геном slrl718, кодирующим кислую фосфатазу СошВ-семейства. Экспрессия drgA и slrl718 подавляется при инкубации клеток в темноте и индуцируется в присутствии глюкозы. Менадион и диносеб не влияют на уровень экспрессии генов drgA и sir 1718.

• Продукт гена drgA восстанавливает менадион по двухэлектронному механизму, препятствуя одноэлектронному восстановлению, приводящему к окислительному стрессу. Чувствительность к менадиону у мутанта по гену ndhB, кодирующему субъединицу комплекса NDH-1, может быть связана с нарушением транспорта электронов в тилакоидной мембране.

• Мутант по гену drgA характеризуется сниженной NAD(P)H:xhhoh-редуктазной активностью, отсутствием ЫА£>(Р)Н:диносеб-редуктазной активности и низкой скоростью послесветового восстановления реакционного центра фотосистемы I (Р700+).

• Экспрессированный в клетках Е coli белок DrgA-12His осуществляет перенос электронов от NADPH в пул пластохинона в изолированных тилакоидных мембранах Synechocystis 6803. Менадион ускоряет этот

процесс и, по-видимому, является промежуточным переносчиком электронов. Таким образом, продукт гена drgA является ЫАЮ(Р)Н:пластохинон-оксидоредуктазой, способной передавать электроны от цитоплазматических дыхательных субстратов в пул пластохинона тилакоидной мембраны.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

• И. В Еланская, В Г Гривенникова, В В Грошев, Г. В. Кузнецова, M Е. Семина, К H Тимофеев. Роль ЫАВ(Р)Н:хшюн-оксидоредуктазы, кодируемой геном drgA, в восстановлении экзогенных хинонов в клетках цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Биохимия т. 69, № 2,2004, с. 172-178.

• ИВ Карандашова, ME. Семина, Е.М Муронец, И.В Еланская. Экспрессия гена drgA, кодирующего НАВ(Р)Н:хинон-оксидоредуктазу, в клетках цианобактерии Synechocystis sp.PCC 6803. Генетика, т. 42, №8, 2006, с. 13601364.

• ME Семина, Е.Д Абраменко, ЕМ Муронец, К. Н. Тимофеев, И. В Еланская Молекулярный механизм устойчивости к менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Вестник МГУ, сер. Биология, № 1, 2007, с. 9-13.

• И.В Еланская, И В Карандашова, Г.В Кузнецова, Е.М. Муронец, М.Е. Семина, Ю В. Титаева, КН. Тимофеев Молекулярные механизмы устойчивости цианобактерии к ингибиторам фотосинтеза и солевому стрессу. Материалы международной конференции "Грибы и водоросли в биоценозах - 2006", Москва, 2006, с. 55.

• ИВ Еланская, Е.А. Абраменко, ME. Семина, ЕМ. Муронец, КН. Тимофеев. Молекулярные механизмы устойчивости к менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Материалы международной конференции "Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах", Москва, 2006, с. 75.

• I Elanskaya, G Kuznetsova, Е Muronetz, M. Semina, K.Timofeev. NAD(P)H:quinone oxidoreductase encoded by drgA gene participâtes in régulation of light-mduced electron transport through Photosystem I in Synechocystis sp. PCC

6803. Abstr. 12th Intern. Symp. on Phototrophic Procaryotes. Pau, France, 2006, p. 93.

• Семина M.E., Абраменко Е.Д. Роль генов, кодирующих дегидрогеназы, в контроле устойчивости клеток цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 к индуктору окислительного стресса менадиону. Материалы Международной конференции "Генетика в России и мире". Москва, 2006, с. 177.

• Е. Д. Абраменко , М Е. Семина . Ген drgA контролирует устойчивость к индуктору окислительного стресса менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Тезисы докладов XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006». Секция Биология. М. 2006. с. 4-5.

• ИВ. Еланская, И.В. Карандашова, Г В. Кузнецова, Е.М. Муронец, ME. Семина, Ю.В Титаева, К Н. Тимофеев. Молекулярная генетика устойчивости цианобактерий к стрессовым факторам. Материалы Международной конференции «Молекулярная и прикладная генетика», Минск, 2005. с. 85.

• И. В Еланская, И. В Карандашова, Г. В Кузнецова, М. Е Семина, М Хагеманн. Генетический контроль устойчивости к стрессовым факторам у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. В сб. Актуальные проблемы генетики. Материалы 2-й конференции МОГиС им. Н. И. Вавилова. Москва, 2003, с. 70-72.

Подписано в печать 14.03.2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 647 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семина, Мария Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Механизмы действия ингибиторов хинонного типа.

1.1. Ингибирование электронного транспорта.

2. Механизмы защиты от ингибирующего действия хинонов.

2.1. Антиоксидантные системы.

2.2. Восстановление хинонов с участием НАБ(Р)Н:хинон-оксидоредуктаз

3. Электрон-транспортная цепь тилакоидной мембраны цианобактерий.

3.1. Фотосинтетическая ЭТЦ.

3.2. Дыхательная ЭТЦ.

3.2Л. Доноры электронов для дыхательной ЭТЦ.

3.2.2. МАО(Р)Н-дегидрогеназы.

3.2.2.1. NAD(P)H -дегидрогеназа типа 1 (NDH-1).

3.2.2.2. NADH-дегидрогеназа типа 2.

3.3. Сукцинатдегидрогеназа.

3.4.Комплекс цитохромов b/.

3.5. Цитохромоксидазы дыхательной цепи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы и плазмиды.

Условия роста.

Трансформация Escherichia coli.

Трансформация Synechocystis 6803.

Выделение плазмидной ДНК методом кипячения (Holmes, Quigley, 1981)

Выделение хромосомной ДНК из клеток цианобактерий.

Ферментативная обработка ДНК.

Электрофорез в агарозном геле.

Элюирование ДНК из агарозного геля.

Полимеразная цепная реакция.

Измерение МТТ-редуктазной активности.

Выделение тилакоидных мембран из клеток Synechocystis 6803.

Измерение ферментативной активности.

ЭПР спектроскопия.

Northern-блоттгибридизация.

ОТ-ПЦР.

Компьютерная обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Дегидрогеназная активность в клетках дикого типа и мутантов.

Анализ устойчивости к менадиону клеток дикого типа и мутантов.

Конструирование двойных мутантов.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC19::cfrg/i::Cm pBHS::CmR).

Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC 19::drgA::GmR pBHS::GmR).

Трансформация клеток мутантов NDH-1, SDH, NDH-2 и Ox.

Проверка сегрегации мутаций.

Физиологические характеристики двойных мутантов.

Анализ устойчивости к менадиону.

Ферментативная активность в бесклеточных препаратах дикого типа и мутанта DrgA.

Восстановление Р700+ в клетках дикого типа и мутантов.

Экспрессия гена drgA.

Изучение функции гена drgA с помощью очищенного белка DrgA-12His.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов устойчивости к индуктору окислительного стресса менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. штамм РСС 6803"

Хиноны, такие как менадион (2-метил-1,4-нафтохинон) и плумбагин (5-гидрокси-2-метил-1,4-нафтохинон), индуцируют окислительный стресс в клетках аэробных организмов. Ингибирующее действие хинонов обусловлено одноэлектронным восстановлением до семихинонов. Семихинон может взаимодействовать с молекулярным кислородом с регенерацией исходного хинона и образованием супероксида, который индуцирует окислительный стресс (Hassan, Fridovich, 1979). При восстановлении хинонов по двухэлектронному механизму образуется нетоксичный гидрохинон (Lind et al., 1982).

У фотосинтезирующих организмов менадион может влиять на транспорт электронов, как в фотосинтетической, так и в дыхательной электрон-транспортной цепи (далее ЭТЦ). Липофильные хиноны с низкими окислительно-восстановительными потенциалами, такие как менадион и плумбагин, легко проникают в тилакоидные мембраны цианобактерий и хлоропластов растений, где они могут акцептировать электроны из фотосинтетической цепи на уровне разных компонентов. У цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis 6803), дыхательная и фотосинтетическая системы транспорта электронов совмещены в тилакоидной мембране. Общими переносчиками, являются пул пластохинона (PQ), комплекс цитохромов и пластоцианин. Главными компонентами дыхательной ЭТЦ являются дегидрогеназный комплекс NDH-1, окисляющий преимущественно NADPH и восстанавливающий пул PQ, и цитохромоксидаза, которая восстанавливает кислород до воды. В восстановлении пула пластохинона также принимают участие дегидрогеназный комплекс NDH-2, окисляющий NADH (Howitt et al., 1999), и сукцинатдегидрогеназа (SDH), окисляющая сукцинат и функционирующая главным образом в темноте (Cooley, Vermaas, 2000). Фотосинтетическая ЭТЦ содержит два типа реакционных центров: фотосистему I (ФС1) и фотосистему II (ФСП). Нециклический фотосинтетический транспорт 6 электронов от воды через ФСК, пул PQ, комплекс цитохромов b$f и ФС1 приводит к восстановлению NADPH. В отсутствие активности ФСН в тилакоидной мембране может осуществляться циклический транспорт электронов вокруг ФС1, в котором участвует дегидрогеназный комплекс NDH-1, окисляющий NADPH и возвращающий электроны в фотосинтетическую ЭТЦ через PQ и комплекс цитохромов b$f.

В основе противодействия клеток окислительному стрессу лежит активация защитных систем, к которым относится ряд ферментов, таких как супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы. Кроме того, важную роль в защите клеток как прокариотических, так и эукариотических организмов от ингибирующего действия хинонов играют дегидрогеназы, способные осуществлять двухэлектронное восстановление этих агентов с образованием нетоксичных гидрохинонов (Lind et al., 1982). В клетках млекопитающих обнаружен эффективный механизм защиты от токсического действия хинонов. Цитозольный фермент КАБ(Р)Н:хинон-оксидоредуктаза (DT-диафораза) восстанавливает хиноны по двухэлектронному механизму, препятствуя их одноэлектронному восстановлению другими ферментами (Prochaska et al., 1985; Tedeschi et al., 1995). Функциональный гомолог DT-диафоразы -МАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктаза, кодируемая геном drgA, - был обнаружен у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 (Чеснавичене и др., 1994; Elanskaya et al., 1998; Matsuo et al., 1998). У нефотосинтезирующих организмов менадион взаимодействует, главным образом, с дыхательной ЭТЦ. У фотосинтезирующих организмов менадион может акцептировать электроны из фотосинтетической ЭТЦ на уровне ферредоксин:КАОР+-оксидоредуктазы, ФС1, ФСИ и комплекса цитохромов 6/ (Hauska, 1977; Samuilov et al., 1997). Роль дегидрогеназ и оксидаз в устойчивости к менадиону клеток фотосинтезирующих организмов оставалась не ясной.

Целью данной работы было выяснение роли генов, кодирующих дегидрогеназы и оксидазы, в контроле устойчивости клеток цианобактерии Synechocystis 6803 к индуктору окислительного стресса менадиону.

В задачи работы входило:

- идентификация генов, ответственных за устойчивость к менадиону, с помощью мутантов Synechocystis 6803, лишенных функционально активных дегидрогеназ NDH-1, NDH-2, SDH, DrgA, а также цитохром- и хинолоксидаз;

- выяснение механизмов устойчивости к менадиону;

- выяснение роли гена drgA, кодирующего растворимую NAD(P)H:xhhoh-оксидоредуктазу, в регуляции электронного транспорта в тилакоидной мембране Synechocystis 6803.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Семина, Мария Евгеньевна

выводы

• Мутации в гене drgA, кодирующем ЫАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктазу (DrgA), и в гене ndhB, кодирующем субъединицу NAD(P)H-дегидрогеназы NDH-1, повышают чувствительность клеток цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 к менадиону. Мутации в генах, кодирующих NADH-дегидрогеназу NDH-2, сукцинатдегидрогеназу (SDH) и оксидазы Ctal, Ctall и Cyd не влияют на устойчивость клеток цианобактерии к менадиону.

• Введение мутации по гену drgA повышает чувствительность к менадиону мутантов по дегидрогеназе NDH-2 и оксидазам. Двойной мутант SDH/DrgA нежизнеспособен, т.е. наличие хотя бы одной из дегидрогеназ, SDH или DrgA, необходимо для фотоавтотрофного роста клеток цианобактерии.

• Ген drgA транскрибируется совместно с геном sir 1718, кодирующим кислую фосфатазу ComB-семейства. Экспрессия drgA и sir 1718 подавляется при инкубации клеток в темноте и индуцируется в присутствии глюкозы. Менадион и диносеб не влияют на уровень экспрессии генов drgA и sir 1718.

• Продукт гена drgA восстанавливает менадион по двухэлектронному механизму, препятствуя одноэлектронному восстановлению, приводящему к окислительному стрессу. Чувствительность к менадиону у мутанта по гену ndhB, кодирующему субъединицу комплекса NDH-1, может быть связана с нарушением транспорта электронов в тилакоидной мембране.

• Мутант по гену drgA характеризуется сниженной NAD(P)H:xhhoh-редуктазной активностью, отсутствием НАВ(Р)Н:диносеб-редуктазной активности и низкой скоростью послесветового восстановления реакционного центра фотосистемы I (Р700+).

• Экспрессированный в клетках Е. coli белок DrgA-12His осуществляет перенос электронов от NADPH в пул пластохинона в изолированных тилакоидных мембранах Synechocystis 6803. Менадион ускоряет этот процесс и, по-видимому, является промежуточным переносчиком электронов. Таким образом, продукт гена drgA является NAD(P)H:плacтoxинoн-oкcидopeдyктaзoй, способной передавать электроны от цитоплазматических дыхательных субстратов в пул пластохинона тилакоидной мембраны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семина, Мария Евгеньевна, Москва

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж, под редакцией Баева А.А. и Скрябина К.Г. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование.//-1984.-М.Мир.

2. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран.//-1989.-М.Наука.

3. Чеснавичене Э.А., Еланская И.В., Барцевич В.В., Шестаков С.В. Молекулярный анализ нового гена, контролирующего устойчивость цианобактерии Synechocystis 6803 к метронидазолу и нитрофенольным гербицидам.//-1994.-Докл. Наук.-334(5):657-659.

4. Badger M.R., Spalding M.H., Leegood R.C., Sharkey T.D., von Caemmerer S. C02 acquisition, concentration and fixation in cyanobacteria and algae. In

5. Advances in Photosynthesis: Physiology and Metabolism.//-2000.-Dordrecht: Kluwer Acad. Publ.- 9:399-434.

6. Battchikova N., Zhang P., Rudds S., Ogawa Т., and Aro E.M. ^identification of NdhL and Ssll690 (NdhO) in NDH-1 L and NDH-1 M complexes of Synechocystis sp. strain PCC 6803.//-2005.-280(4):2587-2595.

7. Bendall D.S., and Manasse R.S. Cyclic photophosphorylation and electron transport.//- 1995.-Biochim. et Biophys. Acta.-1229: 23-38.

8. Berry S., Schneider D, Vermaas W.F.J., Rogner M. Electron transport routes in whole cells of Synechocystis sp. strain PCC 6803: the role of the cytochrome bd- type oxidase.//-2002.-Biochemistry.-41:3422-3429.

9. Biggins J. Respiration in blue-green algae.//-1969.-J. Bacteriol.-99:570-575.

10. Bowler Ch., Montagu M., Inze D. Superoxide dismutase and stress tolerance. //-1992,-Plant Phisiol. Plant Mol. Biol.-43:83-l 16.

11. Brandt U, Kerscher S, Drose S, Zwicker K, Zickermann V. Proton pumping by NADH:ubiquinone oxidoreductase. A redox driven conformational change mechanism.//-2003.-FEBS Lett.-545(1):9-17.

12. H.Broedel S.E. and Wolf R.E.Jr. Genetic tagging, cloning, and DNA sequence of the Synechococcus sp. strain PCC 7942 gene (gnd) encoding 6-phosphogluconate dehydrogenase.//-1990.-J. Bacteriol.-172(7):4023-4031.

13. Bryant C. and Deluca M. Purification and characterization of an Oxygen-intensitive NAD(P)H nitroreductase form Enterobacter cloacae//-1990.-J. Biol. Chem.-266(7):4119-4125.

14. Cenas N., Anusevicius Z., Beronaite D., Bachmanova G.I., Archakov A.I., and Ollinger K. //-1994.-Arch. Biochem. Biophys.-315:400-406.

15. Chesis P.L., Levin D.E., Smith M.T., Ernster L., Ames B.N. Mutagenicity of quinones: pathways of metabolic activation and detoxification.//- 1984.-Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-6(81): 1696-1700.

16. Chiou T.J., Zhang J., Ferrans V.J., Tszeng W.F. Cardiac and renal tozicity of menadione in rat.//-1997.-Toxicology.-31:124(3): 193-202.

17. Cooley J.W., Howitt C.A., Vermaas W.F J. Succinate: quinol oxidoreductases in the the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: presence and function in metabolism and electron transport.//-2000.-J. Bacteriol.-3(182):714-722.

18. Gardner P. Superoxide production by the mecobacterial and pseudomonad quinoid pigments phiocol and pyocyanine in human lung cells//-1996.- Arc. Biochem. and Biophys.-333(l):267-74.

19. Farr S. and Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium.il-1991 .-Microbiol. Rev.-55(4):561-585.

20. Friedrich Т. and Weiss H. Modular evolution of the respiratory NADH:ubiquinone oxidoreductase and the origin of its modules.//-1997.-J Theor Biol.-187(4):529-540.

21. Freidrich Т., Scheide, D. The respiratory complex I of bacteria, archaea and eukarya and its module common with membrane-bound multisubunit hydrogenases.//-2000.-FEBS Lett.-479(l-2): 1-5.

22. Forti G. NADPH-cytochrome / reductase from spinach.//-197l.-Meth. Enzymol .-23:447-451.

23. Graham D.E., Graupner M., Xu H., White R.H. Identification of coenzyme M biosynthetic 2-phosphosulfolactate phosphatase. A member of new class of Mg2+-dependent acid phosphatases.//-2001.-Eur. J. Biochem.-268:5176-5188.

24. Hagemann M., Richter S., Mikkat S. The ggtA gene encodes a subunit of the transport system for the osmoprotective compound glucosylglycerol in Synechocystis sp. strain РСС 6803.//-1997.-J. Bacteriol.-179:714-720.

25. Hassan H.M., Fridovich I. Intracellular production of superoxide radical and of hydrogen pyroxide by redox active compounds.//-1979,-Arch.Biochem Biophys.-l 96:385-395.

26. Hauska. Plasto- and ubiquinone as translocators of electrons and protons through membranes: a facilitating role of the isoprenoid side chain.//-1977.-FEBS Lett.-79(2):345-7.

27. Hinterstoisser В., Missbichler A., Pineau В., Peschek G. A. Detection of chlorophyllide in chlorophyll-free plasma membrane preparations from Anacystis nidulans.ll- 1988,-Biochem. Biophys. Res. Commun.-l54:839-846.

28. Holmes D.S. and Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids.//-1981.-Anal. Biochem.-114: 193-197.

29. Howitt C.A. and Vermaas W.F.J. Quinol and cytochrome oxidases in the the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.//-1998.-Biochemistry.-37:17944-17951.

30. Howitt C.A., Udall P.K, Vermaas W.F.J. Type 2 NADH dehydrogenases in the the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 are involved in regulation rather than respiration.//-1999.-J. Bacteriol.-13(181):3994-4003.

31. Jaiswal A.K. Regulation of genes encoding NAD(P)H:quinone oxidoreductases.//.-2000.-Free Radic Biol Med.- 29:254-262.

32. Joseph P., Long DJ 2nd, Klein-Szanto A.J., Jaiswal A.K. Role of NADPH:quinone oxidoreductase 1 (DT diaphorase) in protection against quinine toxicity.//-2000.-Biochem. Pharmacol.- 60:207-214.

33. Kaplan A., Reinhold L. C02 concentrating mechanisms in photosynthetic microorganisms.//- 1999.-Annu Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol.-50:539-570.

34. Kim K., Lee J., Park K., Kim M.J., Chung J.H. Mechanism of menadione-induced cytotoxicity in rat platelets .//-1996.-Toxicology and Applied Pharmacology.-138(1): 12-19.

35. Kleczkowski L.A. Inhibitors of photosynthetic enzymes carriers and metabolism.//-1993.-Plant Physiol. Plant Mol. Biol.-45:339-367.

36. Lane D.J., Stackebrandt E., Goodfellow, M. 16S/23S rRNA sequencing Nucleic acid techniques in bacterial systematics.//-1991.-ChichesterUnited Kingdom:John Wiley & Sons.-l 15-175.

37. Lind C., Hochstein P.and Ernster L.DT-diaphorase as a quinone reductase: a cellar control device against semiquinone and superoxide radical formation.//-1982.-Arch. Biochem. Biophys.-216:178-185.

38. Maeda S., Badger M., Price G.D. Novel gene products associated with NdhD3/D4-containing NDH-1 complexes are involved in photosynthetic C02 hydration in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942.//-2002.-Mol. Microbiol.-43:425-435.

39. Matsuo M., Endo Т., Asada K. Isolation of a novel NAD(P)H-quinine oxidoreductase from the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803.//-1998.-Plant Cell Physiol.-39(7):751-755.

40. Mi H., Endo Т., Schreiber U., Asada K. Donation of electrons form cytosolic components to the intersystem chain in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 7002 as determined by the reduction of P700.//-1992,-Plant Cell Physiol.-33(8): 1099-1105.

41. Mi H., Endo Т., Oqawa Т., Asada К. Thylakoid membrane-bound, NADPH-specific pyridine nucleotide dehydrogenase complex mediates cyclic electron transport in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.//-1995.-Plant Cell Physiol.-36(4): 661-668.

42. Molitor V., Trinka M., Peschek G. A. Isolated and purified plasma and thylakoid membranes of the cyanobacterium Anacystis nidulans contain immunologically cross-reactive aa3-type cytochrome oxidase.//-1987.-Curr. Microbiol.-14:263-268.

43. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.//-1983.-J. Immunol. Methods.-65:55-59.

44. Nakamura M., Hyashi T. One- and two-electron reduction of quinones by rat liver subcellular fractions.//- 1994.-J. Biochem.-l 15(6).i 141-1147.

45. Ogawa T. A gene homologous to the subunit-2 gene of NADH dehydrogenase is essential to inorganic carbon transport of Synechocystis PCC 6803.//-1991.-Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-88:4275-4279.

46. Pearce J., Leach С. K., Carr N. G. The incomplete cirtic acid cycle in the blue-green alga Anabaena variabilis.//- 1969.-J. Gen. Microbiol.-49:301-313.

47. Peschek G.A., Hinterstoisser В., Wastyn M., Kunter O., Pineau В., Missbichler A., Lang J. Chlorophyll precursors in the plasma membrane of a cyanobacterium, Anacystis nidulans.//-1989.- J. Biol. Chem.-246:11827-11832.

48. Peschek, G.A., Obinger C., Paumann M. The respiratory chain of blue-green algae//-2004.-Physiol. Plant.-120: 358-369

49. Pils D., Schmetterer G. Characterization of three bioenergetically active respiratory terminal oxidases in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.//-2001. FEMS Microbiol. Lett.-203:217-222.

50. Price GD, Klughammer В., Ludwig M., Badger M.R. The functioning of the C02 concentrating mechanism in several cyanobacterial strains: a review of general physiological characteristics, genes, proteins and recent advances.//-1998.-Can. J. Bot.-973-1002.

51. Price G.D., Maeda S., Omata Т., and Badger M.R. Modes of active inorganic carbon uptake in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942.//-2002.-Funct. Plant Biol.-29:131-149.

52. Pritsos C.A., and Gustafson D.L. Xantine dehydrogenase and its role in cancer hemoteraphy.//-1994.-Oncol Res.-6(10-11):477-481.

53. Prochaska H. J., De Long M. J., Talalay P.On the mechanism of induction of cancer-protective enzymes: a unifying proposal.//-1985.-Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-82:8232-8236.

54. Prommeenate P., Lennon A.M., Markert C., Hippler M., Nixon P.J. Subunit composition of NDH-1 complexes of Synechocystis sp. PCC 6803.//-2004.-J. Biol. Cem.-27(279):28165-28173.

55. Radjendirane V., Joseph P., Lee Y., Kimura S., Klein-Szanto A. J. P., Gonzales F.J., Jaiswal A.K. Disruption of the DT diaphorase (NQOl) gene in mice leads to increased menadion toxicity.//-1998.-J. Biological Chemistry.-273(13):7382-7389.

56. Rich P.R. Electron and proton transfers//-1984,-Biohym. Biophys. Acta.-768:53-79.

57. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria.//-1979.-J. Gen. Microbiol-111:1-61.

58. Samuilov V.D., Barsky E.L., Kitashov A.V. Hill reaction in pea chloroplasts: contribution of photosystem II and photosystem I to ferricyanide reduction.//-1997.-M. Biochem.-62(8):909-913.

59. Scandalios J.G. Response of plant antioxidant defence gene to environmental stress.//-1990,-Adv. Gen.-28:1-41.

60. Shibata M., Katoh H., Sonoda M., Ohkawa, H., Shimoyama, M., Fukuzawa, H., Kaplan, A., and Ogawa, T. Genes essential to sodium-dependent bicarbonate transport in cyanobacteria: Function and phylogenetic analysis.//-2002.-J. Biol. Chem.-277:18658-18664.

61. Schmetterer G. Cyanobacterial respiration. The Molecular Biology of Cyanobacteria//-1994,-Kluwer Academ. Publ. Dordrecht.(Netherlands).-409-435.

62. Schmetterer G., Algae D. and Gregor W. Deletion of cytochrome с oxidase genes from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.//-1994.-42:43-50.

63. Shutz К., Happe Т., Troshina 0., Lindblad P., Leitao E., OlivieraP. Tamagnini P. Cyanobacterial H2 production a comparative analysis.//-2004.-Planta.-218:350-359.

64. Seal S.N., Rose Z.B. Characterization of phosphoenzyme intermediate in the reaction of phosphoglycolate phosphatase.//-1987.-J. Biol. Chem.-262:13496-13500.

65. Smeitink J, Sengers R, Trijbels F, van den Heuvel L. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase.//-2001.-J Bioenerg Biomembr.-33:259-266.

66. Smith A.J., London J., Stanier R.Y. Biochemical basis of obligate autotrophy in blue-green algae and thiobacilli.//-1967.-J. Bacteriol.-94:972-983.

67. Sun J.S, Tsuang Y.H., Huang W.C, Chen L.T., Hang Y.S., Lu F.J. Menadione-induced cytotoxicity to rat osteoblasts//-1997.-Cell Mol Life Sci.-(11-12):967-976.

68. Sparla F., Tedeschi G., Pupillo P., Trost P. Cloning and heterologous expression of NAD(P)H:quinone reductase of Arabidopsis thaliana, a functional homologue of animal DT-diaphorase.//-1999.-FEBS Letters.-463:382-386.

69. Youn-Sook Cho, Mee-Jeong Kim, Joo-Young L. and Jin-Ho C. The role of thiols in protectiong against simultaneous toxicity of menadione to platelet plasma and intracellular membranes//-1997.-Toxicol. Scien.-280(3):1335-1340.

70. Tamagnini P., Axelsson R., Lindberg P., Oxelfelt F., Wunschiers R., Lindblad P. Hydrogenases and hydrogen metabolism of cyanobacteria.//-2002,-Microbiol. and Mol. Biol. Rev.- 66:1-20.

71. Tedeschi G., Shiuan Ch., and Vincent M. DT-diaphorase: redox potential, steady-state, and rapid reaction studies.//-1995.-J. of Biol.Chem.-270(3): 1198-1204.

72. Thor H., Smith M. Т., Hartzell P., Bellomo G., Jewell S. A., Orrenius S. The metabolism of menadione (2-methyl-l,4-naphthoquinone) by isolated hepatocytes.//-l 982.-J. Biologycal Chemistry.-257(20): 12419-12425.

73. Trost P., Bonera P., Scagliarini S., Pupillo P. Purification and properties of NAD(P)H: (quinone-acceptor) oxidoreductase of sugarbeet cells.//-1995.-Eur. J. Biochem.-234:452-458.

74. Vermaas, W.F.J. Molecular-genetic approaches to study photosynthetic and respiratory electron transport in thylakoids from cyanobacteria.//-1994.-Biochim. Biophys. Acta.-l 187:181-186.

75. Vermaas W., Shen G., Styring S. Electrons generated by photosystem II are utilized by an oxidase in the asence of photosystem I in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.//-1994.-Febs letters.-337:103-108.

76. Vermaas W. Molecular genetics of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: principles and possible biotechnology applications.//-1996.-J. App. Phyc. -8:263-273.

77. Zhang P., Battchikova N., Paakkarinen V., Katoh H., Iwai M., Ikeuchi M., Pakrasi H., Ogawa Т., Aro E-M. Isolation, subunit composition and interaction of the NDH-1 complexes from Thermosynechococcus elongatus BP-1.//-2005.- J. Biochem.-390:513-520.

78. Wingler A., Lea P.J., Quick W.P., Leegood R.C. Photorespiration: metabolic pathways and their role in stress protection.//-2000.-Phil. Trans. R. Soc. Lond. В.- 355:1517-1529.1. БЛАГОДАРНОСТИ

79. Выражаю также благодарность сотруднику Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Топоровой Викторие Александровне за предоставление экспрессированного в клетках E.coli и очищенного белка DrgA-12His.