Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение функции межклеточного транспорта и свойств транспортных белков клостеровируса желтухи свеклы

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение функции межклеточного транспорта и свойств транспортных белков клостеровируса желтухи свеклы"

« Г,;'. 1

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени МП. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ФОЛИМОНОВ Алексей Сергеевич

ШУЧЕНИЕ ФУНКЦИИ МЕЖКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА И СВОЙСТВ ТРАНСПОРНЫХ БЕЛКОВ КЛОСТЕРОВИРУСА ЖЕЛТУХИ СВЕКЛЫ

03.00.06 - Вирусошч ми

Автореферат диссертации на соискание ученом степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в отделе биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик РАН, профессор И.Г.Атабеков доктор биологических наук А.А.Аграновскин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Н.П.Родионова кандидат биологических наук В.ГЛунин

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардт РАН

Защита состоится '¡2?" 1998 года в / ^ час. на

заседании Диссертационного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан . 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

В.Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема распространения вирусной инфекции внутри зараженного растения в настоящее время является одной из наиболее активно изучаемых в молекулярной вирусологии растений. Исследование биохимических аспектов транспорта вируса имеет не только очевидное теоретическое, но и практическое значение, поскольку резистентность рас гении к вирусам в большинстве случаев связана именно с блоком транспорта, и знание механизма взаимодействий вируса и клетки в процессе распространения инфекции может послужить основой для разработки эффективных методов борьбы с вирусными заболеваниями сельскохозяйственных культур.

За последние несколько лет в молекулярной вирусологии растений произошел значительный прогресс в понимании процесса межклеточного и системного транспорта вирусной инфекции. Была выработана и подтверждена многочисленными экспериментальными данными общая концепция вирусного транспорта, согласно которой перемещение инфекции из клетки в клетку является активным процессом, в котором ключевую роль играют вирус-кодирусмые транспортные белки (ТБ).

Объектом настоящей работы является вирус желтухи свеклы (ВЖС), типовой представитель рода Скмегау/гих семейства С!<к1сгоу1'п'//ас. Среди ( > )РНК-содержащих вирусов растений, клостеровирусы выделяются рядом структурных и биологических особенностей. Они имеют морфологически полярные сверхгнбкие нитевидные внрионы (Agranov,sky е! д/., 1995), которые содержат молекулу геномной РНК очень большого размера, 15-20 тысяч нуклеошдов. Клостеровирусы вызывают флоэмно-ограниченные инфекции в растениях и переносятся насекомыми-векторами полуперсистентно. Одной из характерных особенностей клостеровирусов является присутствие в их геномах гена белка размером около 65 кДа, который гомологичен клеточным белкам теплового шока семейства ШР70 (А£гапоу$ку еI а!., 1991). Вероятно, ген шапероноподобного белка был захвачен предком клостеровирусов в результате РНК-рекомбинации с клеточной мРНК. Высказывалось предположение, что этот белок может отвечать за транспорт вирусной инфекции из клетки в клетку (Agranovsky еI а!.. 1991; Agranovsky, 1996).

Цель и залами исследования. Целью настоящей работы было исследование функции шапероиоподобного 65К белка ВЖС и отработка методов его иммунологической диагностики в растениях. В ходе исследования решались следующие задачи:

■ получение мышиных мопоклональных антител (МА) к 65К, и проверка их специфичности;

■ получение генетических конструкций на основе вектора с каулимовирусным 35S промотером, экспрессирующих полноразмерный белок 65К ВЖС и его N-концевой фрагмент для использования в экспериментах по комплементации транспортной функции потексвируса (X вируса картофеля, ХВК) ш vivo;

■ получение химерных генетических конструкций на основе инфекционной кДНК гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) PHKß, в которых гены тройного блока (ТБГ) замещены геном 65К ВЖС;

■ исследование транспортной функции химерного (ВШМЯ/ВЖС) вируса в растениях Chenopodium.

Научная новизна н практическая ценность работы. В настоящей patioic впервые были получены высокоспецифические моноклональные антитела к С-концевому 13К фрагменту белка 65К ВЖС. Показано, что 65К ВЖС, экспрессированный в клетках растений после их бомбардировки плазмидой с геном 65К под контролем 35S промотора, способен комплементировать функцию транспорта мутанта потексвируса. Получен химерный вирус ВШМЯ/ВЖС. способный к заражению и накоплению в растениях.

Результаты могут иметь практическое значение для дальнейшего изучения принципов функционирования вирусных ТБ и, в частности, транпоргных белкос клостеровирусов.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на cobmccthov заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отделг биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. А.Н Белозерского 16 марта 1998 г. Материалы исследований, представленных в работ! докладывались на международных конференциях: "X International Congress о Virology", Иерусалим, Израиль 1996, "75 Years of Phytopathological and Resistanci Research in Aschersleben" Ашерслебен, Германия, 1995, на Ш Российскол симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, Россия, 1995.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 иски пых работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список литературы", список цитируемой литературы включает более 200 публикаций.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Моноклинальные ам имела к С-кшшспому пептиду р65 ВЖС

Ранее в нашей лаборатории была получена поликлональная антисыворотка к 65К белку ВЖС. Однако, специфичность этой сыворотки была невысока из-за сильной перекрестной реакции с белками здоровых растений (Agranovsky с! а, 1997). Для получения высокоспецифичных антител к 65К ВЖС, пригодных для дальнейшего изучения локализации вирусного белка в растениях, была предпринята попытка создания гибрпдомных линии, продуцирующих моноклональные антитела (МЛ). Для иммунизации мышеи использовался препарат С-концевого фрагмента 65К ВЖС с мол.весом 13 кДа, очищенного с помощью ЬИ-ИТА хроматографии с последующим переводом в физиологический буфер прямым диализом (Agranovsky с! а/., 1997). В результате были получены несколько гибридных клонов, один из которых (гибридомиая линия 5В10) продуцировал антитела к 13-кДа фрагменту. Полученные МА принадлежали к подклассу 1£01 и взаимодействовали в сэндвич-ИФА как с очищенными препаратами 13К и полноразмерного 65К, так и с экстрактами зараженных ВЖС (но не здоровых) растений (результат не показан). На иммуноблоте образцов растений ТеПа$ота ехрата МА 5В10 выявляли единственную зону белка с молекулярной массой около 65 кДа, специфичную для зараженных растений (Рис.1).

Таким образом, полученные антитела обладают весьма высокой специфичностью; мы предполагаем использовать их в дальнейшем для экспериментов по изучению внутриклеточной локализации 65К ВЖС методами иммуноэлектронной микроскопии.

1 1 3

Рис. 1. Иммуноблотинг препаратов суммарного белка из листьев здоровых (1) и инфицированных ВЖС (2) растении Тагч^ота схранча с моноклинальными антителами к С-концевому пептиду 65К ВЖС. Дорожка 3 - препарат очищенного рекомбинантного белка 65К ВЖС, взятого в качестве контроля.

2. Экспресснрующие конструкции

В настоящей работе для изучения вирусного транспорта были использованы инфекционный кДНК клон Х-вируса картофеля (ХВК) pPVX.GUS, содержащий 35S промотер и репортерный ген p-глюкуронидазы (Chapman et al., 1992), и его дефектный по транспорту мутант pPVX.GUS-Bsp, содержащий сдвиг рамки в гене 25 кДа белка (Morozov et al., 1997). В качестве положительного контроля бралась смесь pPVX.GUS-Bsp и плазмиды pRT-PVX.25K, экспрессирующей ген полноразмерного 25К ХВК (Рис. 2). На основе вектора pRTlOO нами были получены плазмиды pR.T-BYV.65K и pRT-BYV.65K-Asp, экспресснрующие полноразмерный 65К ВЖС и его N-концевой фрагмент из 114 аминокислот, соответственно (Рис. 2).

На основе кДНК РНКр гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) нами были получены химерные конструкции, в которых ген 65К ВЖС замещал либо весь ТБГ (pNDp-65K), либо ген ТБГ-1, кодирующий белок 58К (pNDp-65K.dc) (Рис. 3). В pNDP-65K.dc за геном 65К следовала З'-концевая часть гена pb, гены pd и рс, а также З'-нетранслируемая область. В pNDp-65K ген 65К ВЖС на З'-конце попадал в трансляционную рамку с четырьмя гетерологичными триплетами, и таким образом продукт трансляции содержал четыре дополнительных остатка на С-конце (Arg-Ser-Met-Glu). В РНКр ВШМЯ между генами ра и pb находится участок, целостность которого влияет на репликацию и стабильность вирусной РНК; субгеномные промотеры генов рс и pd находятся в 3'-

концевой части кодирующей последовательности гена pb (Petty and Jackson, 1990; Zhou and Jackson, 1996). В конструкции pND(3-65K.dc эти участки были сохранены для обеспечения экспрессии всех четырех генов химерной PHKfi (СБ, 65К, pd и |к); в конструкции pNDP-65K могла происходить экспрессия только двух геном (СБ и 65(C).

Bspl

pPVX GUS 5'-j35SH~ МТ HEL POL [ГЙЕ^ЖГ" C.US Н~СБ~И'

pPVX GUS-Bsp 5'-|35SH MT HEL POL 1С]—|Гж|НН GUS H СБ И' pRT-PVX 25fC 5^3SS[fjgR^3'

Asp

pRT-BYV 65K 5'-]35SH 65K ¡-3'

pRT-BYV 65K-Asp 5'-|35S|Tb

Рис. 2. Схема плазмидных конструкций генома ХВК и транспортных генов под контролем 35Б промотора, которые использовались в экспериментах по бомбардировке растений.

BSMV-MD18 RNAj8(wi)

IT col S»]I Pitl

BgUI /kl

pND|S-fi5K:

Kcol

BslII

-| СБ f-f~ 6Ж j3-

pND/3-65K dc

Nco[ PstI

н сб И ^IZlij^l-

pNPPb.ai HeoI SllI

BtUI

Рис. 3. Схема плазмид РНКр ВШМЯ и гибридов РНКр ВШМЯ/ВЖС.

3. Экспрессия гена 65К ВЖС восстанавливает способность к межклеточному транспорту в Nicotiana benthamiana потексвнруса, мутантпою по гену ТГВ-1

Гистохимический анализ активности GUS в листьях растений, подвергшихся бомбардировке конструкцией pPVX.GUS-Bsp (мутант ХВК по транспорту) совместно с 35S плазмидами. экспрсссирующими iomojioi ичный ТЫ I (pRT-PVX.25K) или гетерологичные ТБ тобамовирусов и диантовирусов, показал, что транспортная функция мутантного ХВК может комилемсн троишься вирусными iснами, предоставляемыми in Irans (Moro/.ov et al., 1997). В настоящей работе метод совместной бомбардировки 358-илазмндами использовался для анализа способности вирусного белка с неизвестной функцией (65К ВЖС) комплеменI ировап. межклеточный транспорт инфекции н растениях.

С целью подтверждения эффективности экспрессии белка 65К в клетках, трансфецированных pR.T-BYV.65K, суммарный белок протопластов Nicotiana tabaewn, инокулированных этой плазмидои, был проанализирован методом иммупоблотинга (Agranovsky et al., 1997). В препаратах суммарного белка протопластов, инокулированных pRT-BYV.65K, выявлялся белок с молекулярной массой около 65 кДа, который отсутствовал в контрольных образцах протопластов, инокулированных буфером (Рис. 4).

1 2 3

►

Рис.4. Иммуноблотинг препаратов суммарного белка протопластов МсоГ/шм шЬасит, инокулированных плазмидой рЯТ-ВУУ.65К (1) и буфером (2). Дорожка 3 - препарат рекомбинантного 65К ВЖС, взятого в качестве контроля. Стрелкой отмечена зона белка массой около 65К.

Бомбардировка молодых листьев N. ЬамЬит'шпа мутантом рРУХ.Си$-В$р вызывала образование микроскопических синих пятен, состоявших из одной или нескольких клеток (Рис. 5А,Г), что отражало неспособность мутантного ХВК к распространению из первично-инфицированной клетки (Мого7.оу е1 а!., 1997). В положительном контроле, совместная бомбардировка рРУХ.СШ-Ввр и рЯТ-РУХ.25К приводила к восстановлению транспортной функции ХВК, судя по образованию заметных невооруженным глазом крупных синих пятен, состоящих из сотен клеток, в которых экспрессировался репортерный ген СШ (Рис. 5В,Е; Мого7.оу е! «/., 1997). Очаги распространения инфекции также обнаруживались при совместной бомбардировке листьев рРУХ.Ои8-В$р и рНТ-ВУУ.65К (Рис. 5Б,Д,Д'). Ограниченный транспорт мутанта ХВК, комплементируемый экспрессией 65К, наблюдался в клегках мезофилла и фичомах эпидермиса, а шкжс в клегках, ассоциированных с проводящими элементами жилки листа.

Тот факт, что средний размер пятен, вызванных инокуляцией рЯТ-ВУУ.65К, был меньше, чем в случае рЯТ-РУХ.25К (Табл.1), может быть объяснен неполной совместимостью транспортной системы ХВК и 65К ВЖС, или некоторыми различиями активностей ТБ ХВК и ВЖС. При комплементации Х-ВК геном ЗОК ТБ тобамовируса, локальные очаги распространения инфекции также были меньше, чем в случае гена 25К ХВК (Могогоу е1 а1, 1997).

Таблица 1. Сравнение размеров пятен экспрессии GUS, в листьях N. benthamiana, бомбардированных частицами с 35S плазмидами.

Плазмиды Средний размер пятна (мкм) SD SE

pPVX.GUS-Bsp 25.6 6.2 0.7

pPVX.GUS-Bsp+pRT-PVX.25K 424.0 107.2 11.4

pPVX.GUS-Bsp+pRT-BYV.65K 232.2 74.6 13.0

pPVX.GUS-Bsp+pRT-BYV.65K-Asp 27.9 10.8 1.66

Конструкция pRT-BYV.65K.-Asp, содержавшая мутацию, приводящую к экспресии только 114 первых триплетов гена 65К (соответствующих примерно четверти АТФазного домена), была неспособна комплементировать транспорт-дефицитный рРУХ.ОШ-Ввр (Табл.1). Таким образом, эти данные свидетельствуют о способности клостеровирусного 65К белка комплементировать ограниченный межклеточный транспорт мутантного Х-ВК в растениях N. ЬетЬштста.

л

в

Ii

г

«

♦

•

Рис. 5. Гистохимический анализ активности GUS в листьях N. benthamiana, бомбардированных частицами с ДНК pPVX.GUS-Bsp (A), pPVX.GUS-Bsp + pRT-BYV.65K (Б) и pPVX.GUS-Bsp + pRT-BYV.25K (В) и пятна активности GUS (Г),(Д) и (Е), соответственно. (Д') - клетки центральной жилки листа (Б), экспрессирующие GUS. Маркерная линия соответствует 400 мкм.

4. Экспрессия гена 65К ВЖС в контексте химерной РНК[! ВШМЯ восстанавливает межклеточный транспорт вируса в растениях

Растения Chenopodium amaranlicolor и Ch. quinoa, которые использовались для механической инокуляции гибридов ВШМЯ/ВЖС PHKß, восприимчивы к обоим родительским вирусам (Duffus, 1973; Atabekov and Novikov, 1989). Несмотря на то, что ВЖС является полуфлоэмно-ограниченным вирусом и переносится тлями, вирус может вызывать появление локальных хлорозов при механической инокуляции листьев Chenopodium spp. (Duffus, 1973).

Инокуляция растений Ch. anwranticolor и Cli. quinoa транскригпами РНК а, р и у дикого типа приводила к образованию хлоротических и некротических пятен на 4-5 день после инокуляции (Petty el al., 1989; Petty and Jackson, 1990). Электронно-микроскопическнй анализ (ЭМА) инокулнрованных листьев выявил присутствие многочисленных палочковидных частиц ВШМЯ (Рис.6), а гибридизация тотальной РНК лиси,еп с пробами кДПК mta pb и РПКу ШПМЯ выявляла нпкомштмн-вирусной РНК (Рис.7). На листьях растений Ch. amaranlicolor и Ch. <¡union, HiioKyjinponaiiMi.ix гибридном PIIK(! ВШМЯ/ВЖО совместно с РНК <* и у. видимые симптомы инфекции не наблюдались в течение 30 дней после инокуляции. Тем не менее, химерная РНКр и РНКу ВШМЯ при ном накапливались в листьях в количествах, легко поддающихся обнаружению методом слот-блот гибридизации с зондами кДНК 65К гена и кДНК РНКу (Рис.7). Кроме того, листья, ннокулированные конструкцией pNDfi-65K.dc, содержали палочковидные частицы ВШМЯ (Рнс.6), хотя и в значительно меньших количествах по сравнению с инфекцией ВШМЯ дикого типа и (Табл.2). Аналогичные результаты были ранее получены для химерной конструкции, в которой ген 30К белка ВТМ замешал ТБГ ВШМЯ; количество вирусных частиц в этом случае было в 1000-10000 раз меньше, чем в листьях инокулнрованных РНКр дикого типа (Solovyev el al., 1996).

Таблица 2. Сравнение количества вирусных частиц и РНК, накапливающихся в листьях С/иторосПчт, инокулнрованных ВЩМЯ/ВЖС гибридами.___

С. amarlicolor С. quinoa

РНК блот* ЭМА** РНК блот* ЭМА**

BSMV RNAP(wt) + + + + + + + +

pNDpb-65K.dc + + + +

pNDp-65K + Н + Н

pNDpb.Sal - - - -

* +, Наличие гибридизации; -, отсутствие гибридизации

** +++, Более 100 частиц на поле; ++, более 10 частиц на поле; + одна или

несколько частиц на поле; -, частицы не обнаруживаются; 11, не проверяли

Рис.6. Палочковидные частицы ВШМЯ в листьях СЬепоросКит, инокулированных транскриптами кДНК ВШМЯ РНКа и РНКу совместно с РНКр дикого типа (фотография слева) или химерной РНКр (pNDI5-65K.de; фотографии справа). Маркерная линия соответствует 300 им.

Таким образом, экспрессия гена 65К ВЖС, встроенного в РНК|5 ВШМЯ, очевидно, обеспечивала способность химерного вируса к ограниченному транспорту, что согласуется с данными, полученными для других гетерологичных генов ТБ (8о1оууеу е1 «/., 1996, 1997). Вместе с тем, в отличие от гибрида ВШМЯ/ВТМ, который вызывал образование мелких локальных хлорозов на инокулированных листьях (5о1оууеу т и!., 1996), полученные нами гибриды ВШМЯ/ВЖС давали бессимптомную инфекцию в инокулированном листе. Этот факт может быть объяснен необходимостью других ВЖС-специфичных белков, кроме 65К, для развития видимых симптомов на листьях растений СИепоросНит зрр.

Участие 65К белка клостеропнрусов в межклеточном транспорте

В настоящее время накоплено достаточно фактов, свидетельствующих о комлементации транспорта вирусной инфекции из клетки в клетку в системе транспорт-дефицитный вирус — гетерологичный ТБ. Эти данные предполагают, что в некоторых случаях вирусный транспорт скорее зависит от взаимодействия ТБ и хозяйских факторов, чем от гомологичных взаимодействий вирусного ТБ и вирусной РНК. Об этом свидетельствуют данные о том, что (а) комплементация вирусного транспорта может происходить при совместном заражении двумя вирусами

(Atabckov and Taliansky, 1990), (б) транспорт вирусных мутантов может осуществляться в трансгенных растениях, -жспрессирующих гетерологичные вирусные ТБ (Ziegler-Craf et al., 1991; Giesman-Cookmeyer et ill., 1995; Kaplan et al., I')95), (в) гибридные вирусы, несущие чужеродный i ch ТП, обнаруживают способноем. к локальному транспорту (De Jong and Ahlquist, 1992; Giesman-Cookmeyer el al., 1995; Solovycv el al., 1996, 1997) и (I) совместная экспрессия ipancnopi-дефинитно! о вируса н iciia неродственного ТБ, предоставляемой» in Irans в сосите идачмиды с 15S мромоюром. приводит к восстановлению транспорта (moto/ov et nl . il>(>7)

Ii

- pNDI8 RNA(i(wl)

- pNDßb.Sal

- РНК ВШМЯ

- PI IK вжс

- pNDIB RNAß(wt)

- pNDßb.Sal

- РНК ВШМЯ

- РНК ВЖС

- pNDI8 RNAß(wt)

- pNDßb.Sal

- РНК ВШМЯ

- РНК ВЖС

Рис. 7. Слот-блот РНК-гибридизация препаратов тотальной РНК, выделенных из листьев СЛ. amarant¡color, ннокулированных транскрипгами кДНК ВШМЯ РНКа и РНКу совместно с химерными ВШМЯ/ВЖС РНКР pNDp-65K.dc (I) и pNDp-65K (2). В качестве зонда использовали: (А) -кДНК 65К, (Б) - NcoI-PstI фрагмент кДНК РНКр ВШМЯ (ТБГ-1), (В) -BglH-Hindlll фрагмент кДНК РНКу ВШМЯ. Дорожка 3 - контрольные препарат!,I, обозначеные слева.

В дамкой работе мы использовали бомбардировку pacieumï Л'. benthamiana плазмидами с 35S промоторами и инокуляцию растений Chenopodium гибридными вирусными РНК в качестве методов для тестирования свойств гипотетического транспортного белка. 65К клостероннруса. Результаты наших экспериментов свидетельствую г о том, что 65К ВЖС способен комплементировать функции мугантных или делетированных транспортных генов потексвируса и гордеивируса, т.е. проявляет активность транспортного белка. 65К, экспрессированный в одной или нескольких клетках (в коюрые могли попаси, молекулы плазмиды при бомбардировке твердыми частицами), поддерживал ограниченный транспорт мутанта потексвируса по ТБГ-1 в соседние здоровые клетки. Опыты по инокуляции растении СкетцинНшп химерными РНК транскриптами pNDp-65K.dc дают возможность заключить, что 65К ВЖС способен комплементировать также функции гордеивирусного ТБГ-1. Следует отметить, что ТБГ-1 белки, как и 65К, обладают AI Фазной активностью in vitro, не будучи родственными белками (Rouleau et al., 1994; Kalinina et a!., 1996; Donald et al,, 1997). Возможно, чю функции транспорта у этих вирусов энергозависимы. Вместе с тем, сходные уровни накопления вирусной РНК в листьях растений, инокулированных конструкциями pNDP-65K.dc и pNDp-65K, говорят о способности 65К ВЖС функционально заменять не только продукт ТБГ-1, но и все белки ТБГ. Эти данные, на наш взгляд, все же не являются доказательством того, что 65К является необходимым и достаточным компонентом транспортной системы у клостеровирусов. Возможно, для полноценного межклеточного и системного транспорта в растениях нужны и другие кодируемые клостеровирусами белки, вероятнее всего те из них, которые консервативны в пределах данного семейства (например, 6К, 64К и структурные белки).

выводы

1. Получены моноклональные антитела к С-концевому 13К фра1мету белка 65К ВЖС, выявляющие 65К белок в зараженных вирусом растениях с высокой специфичностью.

2. На основе генома ВШМЯ получен гибридный вирус, экспрессирующий белок 65К ВЖС. Установлено, что экспрессия 65К в контексте гибридной РНКр приводит к ограниченному транспорту ВШМЯ в инокулировапных листьях растений СкепоросНит.

3. Показано, что совместная экспрессия в растениях А', /ччн/ипнипш 1епа 65К ВЖС и генома потексвируса, дефектного по транспорту, приводит к комплементации транспортной функции и обеспечиваст локальное распространение вирусной инфекции.

4. Результаты экспериментов по комплементации в двух изученных системах свидетельствуют о том, что шапероно-подобный белок ВЖС является белком межклеточного транспорта, и что транспортные функции клостеровирусов и неродственных им потеке- и гордеипирусов частично совместимы.

СПИСОК РАБОТ, ОТУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Agranovsky. A.A., Folimonova, S.Yu., Folimonov, A.S., Denisenko, O.N., and Zinovkin, R.A. (1997) The beet yellows elosterovirus p65 homologue of HSP70 chaperones has ATPase activity associated with its conserved N-termina! domain but does not interact with unfolded protein chains. J. Gen. Virol., 78, 535-542.

2. Agranovsky, A.A.. Folimonov, A.S., Folimonova, S.Yu., Morozov. S.Yu., Schienmnn, J., Lesemann, D., and Atabekov, J.G. (1998) Beet yellows elosterovirus HSP70-like protein mediates the cell-to-cell movement of a potexvirus transport-deficient mutant and a hordeivirus-based chimeric virus. ./. Gen. Virol, 79, 889-895.

3. Аграновский, A.A., Никифорова, С.Ю., Фолимонов, A.C., Витушкина, M.B., Знновкин, P.A., и Атабеков, И.Г. (1995) Вирус желтухи свеклы: каршрошшис функций, закодированных в болььшом РНК геноме. Ill Российский симп. "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 23-24 мая.

4. Agranovsky, A.A., Nikiphorova, S.Yu., Folimonov, A.S., Vitushkina, M.V., and Atabekov, J.G. (1995) Beet yellows elosterovirus: mapping functions encoded in a large RNA virus genome. Int. Symp. "75 Years of Phytopathological and Resistance Research in Aschersleben", Aschersleben, June 12-16.

5. Agranovsky, A.A., Rippmann, F., Nikiforova, S.Yu., and Folimonov, A.S. (1996) The closterovirus-encoded p65 homolog of HSP70 chaperones has properties of ATPase but does not interact with unfolded protein chains. X International Congress of Virology, August 11-16, Jerusalem, p.89.