Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение физиологических свойств бактерии Rhodococcus erythropolis штамм Ас-858 Т для оптимизации условий получения углеводородразрушающего биопрепарата

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение физиологических свойств бактерии Rhodococcus erythropolis штамм Ас-858 Т для оптимизации условий получения углеводородразрушающего биопрепарата"

На правах рукописи

Костина Елена Геннадьевна

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИИ ЛНОВОСОССиБ ЕЯУТНЯОРОЫБ ШТАММ Ас-858 Т ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДРАЗРУШАЮЩЕГО БИОПРЕПАРАТА

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 5 ДЕК 2008

Саранск - 2008

003454240

Работа выполнена в ГОУВПО "Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева"

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ревин Виктор Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ковалева Тамара Андреевна

доктор биологических наук, профессор Русанов Александр Михайлович

Ведущая организация: Ульяновский государственный университет

Защита диссертации состоится ". ¡9 " огШд/л г- в " Ю " часов на заседании диссертационного совета Д 212. 117. 12 при ГОУВПО "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева" по адресу: 430032, г. Саранск, ул. Ульянова, 26, корп. "б", конференцзал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУВПО "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева".

Автореферат диссертации разослан ИРЛт^ года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук С.А. Ибрагимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы До недавнего времени вызывающие умеренный интерес ученых нокардиоформные актинобактерии оказались очень перспективным объектом для исследования. Эти микроорганизмы распространены повсеместно, что связано с их чрезвычайной биохимической пластичностью. Они обладают целым комплексом тактических приемов выживания. Эти указанные качества определили ценность нокардиоформов для решения многообразных экологических и биотехнологических задач (Van Hamme JD„ Ward O.P., 2001; Jung J.G., Park C.H., 2004). Бактерии рода Rhodococcus играют важную роль в процессах почвообразования, в обогащении биоценозов витаминами и другими физиологически активными соединениями (Нестеренко O.A. и др., 1985). Одним из перспективных направлений прикладного использования родококков является биоремедиация почв, а также очистка сточных вод, загрязненных нефтепродуктами (Van Hamme J.D. et. al., 2001; Jung IG. et. al, 2004). Способность этих бактерий эмульгировать и деградировать углеводороды в значительной степени обусловлена особенностями строения их клеточной оболочки, которая имеет липофильный характер, т.е. высокую афинность к гидрофобным субстратам (Tsitko I.V. et. al., 1999). Состав и метаболизм клеточных липидов влияет на адаптацию этих микроорганизмов к неблагоприятным факторам (Куюкина М С. и др., 2000), и изменяется в ходе развития клеток (Коронелли Т.В., 1984). Поверхностная активность и гидрофобный характер способствуют взаимодействию между микроорганизмами и нерастворимым субстратом, что дает возможность преодолеть ограниченную диффузию при его транспорте в клетку (Карпенко Е В и др., 2006).

Таким образом, полезность бактерий Rhodococcus sp. для развивающейся биотехнологии и их высокий научный и коммерческий потенциал, прежде всего как нефтеокисляющих . микроорганизмов, обуславливают необходимость совершенствования методов их культивирования для получения активной культуры и исследования влияния отдельных факторов на синтез липидов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование физиологических свойств штамма Rhodococcus erythropolis Ас-858 Т и возможности его использования в качестве биопрепарата для деградации углеводородных загрязнений.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи-

1. Изучить изменение липидного состава клеток R. erythropolis в процессе роста на средах разного состава;

2. Подобрать оптимальные условия для накопления биомассы, липидов и максимальной секреции внеклеточных гликолипидов;

2. Изучить рост культуры и изменение фосфолипидного состава клеток R. erythropolis в условиях полунепрерывного культивирования на минеральной среде с гексадеканом и среде с избытком питательных компонентов;

3. Исследовать процесс биодеградации углеводородов бактериями R. erythropolis в условиях периодического и полунепрерывного культивирования;

4. Исследовать возможность использования бактерий R. erythropolis в качестве биопрепарата для биоремедиации почв, загрязненных нефтепродуктами (в частности дизельным топливом).

Научная новизна работы.

Впервые исследован состав фосфолипидов клеток R. erythropolis штамм ВКМ Ас-858 Т при различных условиях культивирования. Изучено накопление клеточных и внеклеточных липидов и изменение фосфолипидов R. erythropolis в зависимости от состава питательной среды и условий культивирования Показано, что в процессе

культивирования независимо от условий качественный состав фосфолипидов не меняется, однако наблюдается изменение их количественного соотношения: доля фосфатидилэтаноламина снижается, в то время как доля дифосфатидилглицерина и объединенной фракции фосфатидилсерина и фосфатидилинозита возрастает.

Выявлено, что ростовые процессы и накопление липидов стимулируют низкие концентрации ионов кальция, железа (II) и углеводородов.

Проведен подбор условий полунепрерывного культивирования на различных средах.

Показана возможность использования культуральной жидкости бактерий R. erythropolis в качестве биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных сред.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные данные расширяют знания о биологических свойствах актинобактерий рода Rhodococcus и представления об участии клеточных и внеклеточных липидов в процессах деградации углеводородных субстратов, что позволяет разрабатывать научно-обоснованные подходы к биоремедиации нефтезагрязненных сред.

Предложена технология практического использования бактерий R. erythropolis для биодеградации нефтепродуктов на основе культуральной жидкости.

Связь работы с научными программами.

Представленные результаты были получены в ходе исследований, проведенных в рамках научно-практических работ при поддержке: программы «Развитие' научного потенциала высшей школы 2006-2008» РНП.2.1.17708 «Моделирование и кинетический анализ процессов деструкции лигноцеллюлозных субстратов и ксенобиотиков с участием ферментов и липидов»; гранта Роснауки по поддержки молодых ученых, шифр 2006-РИ-19.0/001/079 «Исследование свойств лигнолитических ферментов гриба Partus tigrinus и их роли в биодеградации растительных отходов и токсичных веществ»

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены для обсуждения на международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); на Огаревских чтениях в Мордовском государственном университете имени Н.П. Огарева (Саранск, 2006); на 10-ой Пущинской школе конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2006); на IV Съезде общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); на научной конференции «Первые чтения памяти профессора O.A. Зауралова» (Саранск, 2007); на школе-семинаре молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007); на международной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (г. Киев, Украина, 2007); на международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007); VII Республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано ¿8 печатных работ, в числе которых 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на /ъг страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает ff рисунков и /3 таблиц. Список цитируемой литературы включает ^¿источников, в том числе на иностранных языках.

Благодарность. Выражаю искреннюю благодарность и признательность научному руководителю, доктору биологических наук, заслуженному деятелю наук РФ Ревину Виктору Васильевичу за внимание помощь в подготовке диссертации. Особую благодарность выражаю кандидату биологических наук Атыкян Нелли Альбертовне и всему коллективу кафедры биотехнологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева за помощь и поддержку при выполнении данного исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая ценность полученных результатов, указан личный вклад соискателя.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Общая характеристика и применение алканотрофных бактерий рода

Rhodococus sp.

В главе представлены культурально-морфологическая и физиолого-биохимическая характеристики бактерий рода Rhodococus. Представлен обзор основных работ, посвященных липидному составу клеток родококков. Описаны примеры практического применения актинобактерий Rhodococus sp и препаратов на их основе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 2. Объекгг и методы исследования

Объектом исследования служили клетки Rhodococcus erythropolis штамм ВКМ Ас - 858 Т (типовой штамм вида) и липиды выделенные из них. Авторы вида: (Gray et Thornton, 1928; Good fellow et Alderson, 1979). Культура Rhodococcus erythropolis BKM Ac - 858 T получена из Чешской коллекции микроорганизмов, источник выделения: почва.

Исходную культуру микроорганизмов поддерживали путем периодических пассажей на глюкозо-пептонной агаризованной среде.

Для приготовления инокулята R. erythropolis культивировали в перемешиваемых условиях (200 об" ) в течение 2 суток на мясо-пептонном бульоне, в конических колбах Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл среды.

Дальнейший рост микроорганизма проводили глубинным способом на модифицированной среде Таусона. Инокулят вносили в количестве 5 мл на 100 мл среды. Микроорганизмы культивировали при 28°С в течение 8 суток в перемешиваемых условиях на качалке (220 об"1).

В экспериментах по исследованию влияния ионов кальция на накопление биомассы и липидсинтезирующую способность при росте на модельном субстрате в среду добавляли СаС12*ЗН20 в концентрациях (в пересчете на Са2+) 2, 4, 6, 24, 36, 48, 120 мг/л. Контролем служила среда без добавления Са2+. В качестве единственного источника углерода в среду добавлялся 1% гексадекана.

В опытах по влиянию концентрации гексадекана на рост и накопление клеточных липидов R. erythropolis Ас-858 Т к основной минеральной среде добавляли гексадекан в концентрациях 1, 5 и 10 %.

При культивировании на опытном субстрате (дизельное топливо) проводили исследование по влиянию ионов железа на липидсинтезирующую активность R.

erythropolis. Для этого в среде культивирования варьировали содержание ионов Fe2+ и Fe1*, используя соответствующие их соли от 2 до 8 мг/л.

В экспериментах по влиянию рН на липидсинтезирующую активность бактерию выращивали при различных значениях рН (6,0; 7,0; 8,0).

В опытах по исследованию влияния концентрации дизельного топлива (ДТ) на накопление общих клеточных липидов и внеклеточного гликолипида варьировали его содержание в среде культивирования от 1 до 8%.

В экспериментах по полунепрерывному культивированию выращивание R. erythropolis осуществляли по отьемно-доливному методу с использованием модульного биотехнологического оборудования серии ОКА-MI МФ-05К на мясо-пептонном бульоне (МПБ) и минеральной среде Таусона с гексадеканом (1%) в качестве единственного источника углерода в 2-х реакторах, в условиях различной концентрации кислорода в среде 48 мкмоль СЬ/мл и 144 мкмоль 02/мл.

Возможность использования интродуцированной популяции бактерий R. erythropolis для очистки почвы от нефтепродуктов изучали на чашках Петри, содержащих по 30 г черноземной почвы, загрязненной дизельным топливом в количестве 40 г ДТ/ 1кг почвы. Загрязненную почву обрабатывали культуральной жидкостью, которую вносили в чашки Петри в количестве 1, 5 и 10 мл (105 жизнеспособных клеток в 1 мл).

Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Bradford М.М., 1976).

Содержание биомассы определяли весовым методом.

Липиды из клеток бактерий экстрагировали методом Блайя-Дайера (Bligh Е. et al., 1959). Качественный анализ смеси липидов анализировали методом микротонкослойной хроматографии на силикагеле. Разделение на фракции проводили двумерно в системах Брокхьюза (Broeckhuyse R.M., 1968). Идентификацию отдельных фракций фосфолипидов (ФЛ) проводили, используя специфические окрашивающие реагенты, "свидетели" и значения Rf. Определение микроколичеств ФЛ проводили по методу Васьковского с соавторами (Vaskovsky V.E. et al., 1975).

Содержание в культуральной жидкости внеклеточных гликолипидов определяли антроновым методом

Содержание углеводородов в культуральной жидкости контролировали ИК-фотометрическим методом с помощью концентратомера «КН-2м» (Россия) (ПНД Ф 14.1:2:4.168-2000).

Остаточное содержание углеводородов в почве определяли гравиметрическим методом (ПНД Ф 16.141.-04).

Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывали с использованием электронных таблиц Microsoft Excel 2000 и пакета программ STAT 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА 3. Физиологические основы регулирования роста и синтеза липидов у Rhodococcus erythropolis

Для изучения влияния Са2+ на рост культуры R. erythropolis варьировали его содержание в среде от 2 до 120 мг/л. В качестве контроля служила среда без Са2+. Исследование влияния ионов Са2+ на рост и образование липидов клетками R. erythropolis ВКМ Ас - 858Т показало, что как в контрольном, так и во всех опытных вариантах наиболее активный прирост биомассы наблюдался до четвертых суток культивирования (рисунок 1, а).

-О мг/л - 4 мг/л

-2 мг/л ■ 6 мг/л

-О мг/л —■—2 мг/л - 4 мг/л —х— 6 мг/л

(а) (б)

Рисунок 1 - Накопление биомассы (а) и общих клеточных липидов (б) клетками Я. егучИгоро1а Ас-858 Т при низких концентрациях Са 2+в

среде

Начиная с 6 суток наблюдалась тенденция снижения уровня биомассы, что совпадало с литических процессов. Сопоставление опытных и контрольного варианта выявило, что в условиях отсутствия Са2* в питательной среде выход биомассы был незначительным, а добавление ионов кальция стимулировало рост бактерий. Максимальный выход биомассы и накопление клеточных липидов (почти в 1,5 раза больше, чем в контроле) наблюдалось при концентрации в среде ионов Са2+ равной 4 мг/л (рисунок 1, б), причем наибольшее содержание липидов характерно для клеток в стационарной фазе роста. Дальнейшее увеличение концентрации ионов Са2+ в среде культивирования привело к снижению выхода биомассы и содержания общих липидов в клетках (рисунок 2).

Время культивирования, сут

—•—0 мг/л -х- 48 мг/л

-24 мг/л -120 мг/л

-36 мг/л

14 12

Я 10

5 Ю

3

—•—0 мг/л -х- 48 мг/л

2 4 6 8 К Время культивирован»!, сут

-24 мг/л —*—Збыг/л -120 мг/л

(а) (б)

Рисунок 2 - Накопление биомассы (а) и общих клеточных липидов (б) клетками Я. егуЛгоро!^ Ас-858 Т при высоких концентрациях Са 2+ в среде

Таким образом, низкие концентрации ионов Са2+ (2-4 мг/л) стимулируют рост и накопление общих липидов культурой Я. егуЛгороЬз, в то время как высокие концентрации соли несколько ингибируют. Наблюдаемый эффект по влиянию Са2+ на липидсинтезирующую активность и рост Л. егуЛгороИх может быть связан со следующими явлениями. Как известно поступление ионов Са2+ в клетку происходит по

кальциевым каналам. Внутри клетки Са+ является универсальным вторичным мессенджером и участвует в ряде важных метаболических процессов, в том числе, в синтезе АТФ, в активации протеинкиназы С, фосфолипаз А2 и С. Таким образом Са2* необходим для жизнедеятельности клеток, однако стимулирующий эффект кальция наблюдается до определенных концентраций. Это связано с тем, что для нормального функционирования клетки необходима низкая концентрация ионов кальция, в то время как накопление кальция в цитозоле как показано в работе (Крутецкой З.И. и др., 2003) приводит к гибели клетки, что мы вероятно и наблюдали в наших опытах с высокими концентрациями Са3+.

Ионы кальция также изменяют заряд на мембране, соответственно меняются условия метаболизма клетки. Кроме этого они способствуют образованию мостиков -«сшивок» между соседними клеточными оболочками. Доказательством этому положению может служить наблюдение образования клеточных агломератов. Учитывая это, становится понятными невысокие показатели роста и липидсинтезирующей активности штамма (в клеточных агломератах метаболически активным будет, прежде всего, наружный слой, тогда как внутри расположенные клетки будут постоянно испытывать дефицит питательных веществ и трудности, связанные с выделением продуктов метаболизма в окружающую среду) (Бева! 1.0., Вапа11.М., 1997).

Используя среду с 4 мг/л Са2 в качестве основы, на следующем этапе мы варьировали концентрацию гексадекана от 1 до 10% (У/У). Проведенное исследование показало (рисунок 3, а), что при добавлении 1 и 5 % гексадекана динамика прироста биомассы и накопления общих клеточных липидов была сходной.

2 4 6 8 Время культивирования,сут

г Ю

0 2 4 6 8 10 Врем» культивирования, сут

-1% ■ (а)

- 5% -*-1(№

-1% -*-5% ■ (б)

Рисунок 3 - Влияние концентрации гексадекана в среде культивирования на накопление биомассы (а) и образование общих клеточных липидов (б) клетками Л. егуЛгоро1Ь Ас-858 Т

При этом выход биомассы был на 30% выше в варианте с добавлением 1% гексадекана. Увеличение содержания гексадекана до 10% приводило к снижению физиологической активности культуры, что выражалось в снижении интенсивности роста. Возможно, это связано с дестабилизацией мембраны в ходе растворения гексадекана в липидном бислое и нарушением, прежде всего, транспортных процессов. Максимальное содержание общих клеточных липидов в клетках /?. егуЛпороШ Ас-858 Т наблюдалось на 6 сутки роста в вариантах с 1 и 5 % гексадекана (рисунок 3, б). При этом в варианте с 1% гексадекана их содержание было немного выше. При добавлении в

среду максимальной концентрации гексадекана синтез липидов ингибировался и их содержание в клетках было почти в 2 раза ниже.

Фосфолипиды играют существенную роль в регуляции поступления химических веществ, в том числе углеводородов, через наружную клеточную мембрану. Известно, что различные фракции фосфолипидов, входящие в состав клеток, имеют разные метаболические и функциональные активности. Поэтому, мы проводили исследование качественного и количественного состава фосфолипидов клеток родококков в процессе роста.

В ходе наших исследований были идентифицированы следующие фракции фосфолипидов: дифосфатидилглицерин (ДФГ), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидилсерин + фосфатидилинозит (ФС + ФИ). Рост микроорганизма во всех вариантах опыта сопровождался изменениями в соотношении фосфолипидов, без изменения их качественного состава. Исследования показали (рисунок 4, 5), что доля фракции ДФГ увеличивалась, особенно в стареющих клетках (на 55% в контрольном и на 32-33% в вариантах с 4 и 6 мг/л Са2+). Суммарное содержание ФС + ФИ в контроле и опытных вариантах возрастало в 2 раза. Содержание ФЭА наоборот снижалось в процессе культивирования. Согласно современным представлениям, наличие в клетках значительных количеств ФЭА свидетельствует о фазе активного роста, когда активно протекает образование мембран, и происходит активация процессов клеточного метаболизма (Феофилова Е.П. и др., 1987). Так, в контрольном варианте доля ФЭА постепенно снижалась с 44 до 19 %, в варианте с 4 мг/л Са2+ - с 56 до 34%, т.е. последний вариант характеризуется более активными ростовыми и метаболическими процессами, что коррелирует и с другими полученными результатами. Количество ФГ в процессе роста изменялось незначительно Увеличение концентрации гексадекана в ростовой среде до 5-10 % приводило к более высокому содержанию фракций ДФГ и ФГ в бактериальных клетках, по сравнению с культурой, выращенной на среде с 1% гексадекана, что свидетельствует, вероятно, о снижении проницаемости оболочки бактериальных клеток для углеводородов. В то время как клетки, растущие на среде с 1% гексадекана, характеризовались более высокой долей ФЭА. В варианте с 5% гексадекана доля ФЭА в процессе культивирования снижалась с 38,1 до 21,3%, в варианте с 10% - с 32,1 до 19,3%. Содержание ДФГ к 8 суткам возрастало более чем в 1,5 раза. Доля суммарной фракции ФС + ФИ увеличивалась в варианте с добавлением 5 % гексадекана с 37,4 до 48,4%, в варианте с 10% - с 40,3 до 47%.

В следующей серии экспериментов изучали фосфолипидный состав клеток Яйск/ососа« егуЛгоро115 в процессе полунепрерывного культивирования на МПБ и минеральной среде Таусона, оптимизированной на предыдущих этапах.

Анализ качественного состава фракций фосфолипидов, полученных из культуры клеток Яйог/ососс!« егуМгороНз выращенных на МПБ показал наличие преимущественно фракции фосфатидилэтаноламина, на долю которого приходилось более 75%, что коррелирует с более активными ростовыми процессами в данных условиях.

Остальные фосфолипиды были представлены в следовых количествах, вследствие чего определение их количественного содержания не представлялось возможным. При росте родококков на среде с гексадеканом из клеток были выделены ФЭА, ФГ, ФС, ФИ, ДФГ (таблица 1).

(а)

60 50 40 30 20 10-0

I И«1

ДФГ

(б)

ДФ1

(В)

ДФГ

□ О мг/л И 24 мг/л

12 мг/л 04 мг/л Шбмг/л 336 мг/л О 48 мг/л □ ! 20 мг/л

(Г)

Рисунок 4 - Изменение фосфолипидного состава клеток егуЛгороШ Ас-858 Т в ходе роста при различных концентрациях Са2+ на вторые (а), четвертые (б), шестые (в),

восьмые (г) сутки

ДФГ ФГ ФЭЛ ФС+ФИ

(а)

60

ДФГ ФГ ФЭ А ФС+ФИ

(б)

ДОГ ФГ ФЭ А ФС+ФИ

(В)

ДФГ ФГ ФЭА ФС+ФИ

□ 1 % гексадекана В 5% гексадекана К 10% гексадекана

(0

Рисунок 5 - Изменение фосфолипидного состава клеток Л. егуЛгоройз Ас-858 Т при культивировании на средах с различными концентрациями гексадекана на вторые (а), четвертые (б), шестые (в), восьмые (г) сутки роста

Изучив закономерности накопления липидов клетками родококков при росте на гексадекане, на следующем этапе наших исследований изучали липидсинтезирующую активность данных микроорганизмов при культивировании на сложном органическом субстрате - дизельном топливе.

Таблица 1 - Содержание фракций фосфолипидов, в % от общего содержания фосфолипидов в культуре Ююйососсш егуЛгороШ ВКМ Ас-858 Т

Фракции фосфолипидов Содержание кисло рода в питательной среде

48 мкмоль 02/мл 144 мкмоль 02/мл

1 этап 2 этап 3 этап 1 этап 2 этап 3 этап

ДФГ 8,0±0,7 8,5+0,8 9,0±0,8 5,8+0,6 7,8±0,8 8,0+0,7

ФС+ФИ 42,5 ±2,5 43,2±2,8 44,6±2,4 35,7±2,9 37,1±2,8 38,4±2,9

ФЭА 34,4±2,8 33,6±2,7 32,1±2,9 39,6±2,1 35,1+2,5 33,9±2,4

ФГ 16,1±1,5 14,7±1,2 14,3±1,3 18,9+1,5 20,0±1,8 19,7±1,7

Для этого проводили культивирование микроорганизма на минеральной среде Таусона, заменив модельный источник углерода на дизельное топливо, и варьируя его концентрацию от 1 до 8 % . Было показано, что пики прироста биомассы изучаемого микроорганизма в исследованных вариантах приходятся на разные сутки культивирования (таблица 2). Так в ходе культивирования с 1, 2 и 3 % углеводородов максимальное количество биомассы наблюдается к 4 суткам культивирования в варианте с 1% ДТ с плавным снижением к 8 суткам роста. Увеличение концентрации ДТ от 4 % до 8% приводит к более позднему достижению пика накопления биомассы (на 6 сутки роста). Такой характер образования биомассы, вероятно, связан со смещением стационарной фазы роста культуры в результате замедления развития микроорганизма в вариантах с неблагоприятными условиями. При этом также наблюдается меньший выход биомассы, что, вероятно, связано с ингибированием роста культуры высокими концентрациями ДТ.

Таблица 2 - Влияние концентрации дизельного топлива на рост КИоАососсиз __егуЛгоро!^ Ас-858 Т_

Концентрация ДТ, % Биомасса, г/л

Время культивирования, сут

2 4 6 8

1 0.69+0.03 7.47 + 0.35 5.30 ± 0.24 2.10 + 0.09

2 0.77+ 0.03 7.37 ± 0.29 5.63 + 0.27 2.50 ±0.12

3 0.85+ 0.04 7.12 + 0.34 6.75 ± 0.32 2.60 ±0.12

4 0.41+0.02 1.50 + 0.07 3.40 ±0.16 1.65 ±0.06

5 0.27 ±0.01 1.40 ±0.06 2.60 ±0.12 1.70 ±0.08

8 0.33+0.01 1.50 + 0.06 2.00 ±0.09 2.20 ±0.09

Таким образом, наиболее неблагоприятными для роста культуры оказались варианты с концентрациями дизельного топлива 4-8 %, где максимальные количества биомассы в 2 раза ниже таковых в опытах с оптимальными концентрациями, 1-3 %.

Анализ динамики изменения содержания общих клеточных липидов (ОЛ)

(таблица 3) выявил, что количество ОЛ во всех вариантах значительно возрастает с 4 по 6 сутки, достигая пика к 6 суткам роста, что особенно заметно в вариантах с низкими концентрациями дизельного топлива, В период с 6 по 8 сутки доля ОЛ незначительно уменьшается. В целом, максимальное содержание общих клеточных липидов было обнаружено в вариантах с 1 и 2 % дизельного топлива и составило соответственно - 12,8 и 12,4 % по отношению к величине биомассы на 6 сутки роста.

Таблица 3 - Влияние концентрации дизельного топлива в среде культивирования на синтез липидов клетками штамма /?. егуЛгороИБ

Ас-858 Т

Концент- Общие липиды, % к биомассе Экзогликолипиды, г/л

рация Время культивирования, сут

ДТ, % 4 6 8 4 6 8

1 5.10 ±0.24 12.80±0.61 10.00 ±049 0.42 ±0.02 0.70 ±0.03 0.67±0 03

2 5.97 ±0.24 12.40±0 57 11.00 ±0.53 0.64 + 0.03 1.00 ±0.04 0 82±0.04

3 5.90 ±0.28 9.90 ± 0.47 10.00 ±0 48 0.55 ±0.02 0.91 ±0.02 0.73±0.03

4 7.30± 0.35 9.40 ±0.45 8.50 ±0.39 0.30 + 0.01 0.34 ±0.01 0.26±0.01

5 5.70 ±0.27 6.00 ±0.28 5.90 ±0.28 0.26 ±0.01 0.37 ±0.01 0.22±0.01

8 5.30 ±0.18 6.00 + 0.28 5.30 ±0.25 0.20 + 0.01 0.25 ±0.01 0.21±0.01

При более высоких концентрациях дизельного топлива процесс синтеза липидов, как и рост клеток, ингибируются вследствие токсичного действия углеводорода. При исследовании фосфолипидного состава клеток родококков при культивировании на дизельном топливе выявлены следующие фракции: ДФГ, ФГ, ФЭА, ФИ и ФС. При этом было показано, что качественных изменений в составе фосфолипидов в процессе роста не происходит. Наибольшие количества экзогликолипидов накапливались к 6 суткам роста с последующим снижением, что, вероятно, связано с закислением среды и активацией автолитических процессов в клетках. Максимальные количества гликолипидов были обнаружены в вариантах с 2 и 3 % ДТ на 6 сутки и составили соответственно 1,00 и 0,91 г/л.

Таким образом, культура Я. егуЖгороИх Ас-858 Т накапливает максимальные количества веществ с поверхностно-активными свойствами, что определяет их способность эффективно эмульгировать и транспортировать углеводороды. Увеличение концентрации углеводородов негативно сказывается на росте и биосинтетических способностях культуры.

ГЛАВА 4. Оптимизация процессов периодического и полунепрерывного культивирования ЯАог/ососсиз егу&гороШ с целью получения биопрепаратов

В ходе предыдущих исследований нами было показано, что наилучший рост культуры родококков в условиях периодического культивирования наблюдается при интенсивном перемешивании (со скоростью не менее 200 об/мин), что связано с необходимостью постоянного снабжения культуры кислородом для окисления, в первую очередь, углеводородов. Поэтому дальнейшие эксперименты по получению активных форм препаратов на основе /?. егуЛгороШ при периодическом культивировании проводились при данной скорости перемешивания.

Изучение влияния начального значения рН питательной среды на биосинтез

биомассы и липидов алканотрофными бактериями /?. егучкгороИ.ч (рисунок 6, 7) показало, что во всех вариантах опыта при разных значениях рН прирост биомассы наблюдался до четвертых суток роста, затем происходило снижение содержания биомассы.

Наибольшее количество биомассы (до 6 г/л) накапливалось при начальном рН 7,0. Максимальное накопления экзогликолипидов и ОЛ также наблюдалось при рН 7,0 к шестым суткам в фазу стационарного роста. Концентрация гликолипидов в культуральной жидкости составила 0,73 г/л, а общих клеточных липидов - 16,3% от биомассы. Смещение рН в кислую и щелочную сторону снижало как скорость роста, так и выход экзогликолипидов, что обусловлено как прямым, так и косвенным действием ионов водорода на клетку. Исследование динамики изменения рН в культуральной жидкости свидетельствует о том, что рост штамма сопровождается подкислением среды, в результате в стационарной фазе роста культуры рН во всех вариантах примерно одинаков (5,3-5,4), что, по-видимому, обусловлено накоплением кислых экзогликолипидов.

рИ

2 4 6 8 1( Время культивирован!«, сут

-рН6,0 —-— р! 17,0 —рН8,0

(а)

О 2 4 6 8 10

Время культивирования, сут

—рНбО -•— р||7,0 -*- рН8,0

(б)

Рисунок 6-Накопление биомассы (а) и изменение рН (б) в процессе роста Я. егуЛгороШ в зависимости от начальных значение рН

I о

3

2 4 6 8 Время культивирования, сут

Время культивирования, сут

-рН6,0 ■

рН 8,0

- рН 7,0 - »- рН 8,0 —рН 6,0 —•— рН 7,0

(а) (б)

Рисунок 7- Влияние начальных значений рН на образование Ыик1ососси.$ егу1кгороШ общих клеточных липидов (а) и экзогликолипидов (б)

Таким образом, оптимальной для роста и синтеза липидов Я. егуЛгороИз является среда с начальным значением рН 7 0. При этом имеет место увеличение содержания

как общих липидов в клетках, так и экзогликолипидов, что вызывает изменение гидрофобных свойств клеток и способствует более активному использованию из окружающей среды гидрофобного субстрата.

Из литературы известно, что у многих микроорганизмов окисление углеводородов происходит под действием трехкомпонентного алкангидроксилазного ферментного комплекса, состоящего из мембраносвязанной алканмонооксигеназы и двух растворимых белков - рубредоксина и рубредоксинредуктазы. Рубредоксин представляет собой железопротеид. Отмечается, что синтез алкангидроксилазы у Pseudomonas oleovorans осуществляется при наличии достаточного количества ионов железа в среде культивирования (Пирог Т.П. и др., 2005). Поэтому, для выяснения влияния ионов железа на рост R. erythropolis и накопление общих клеточных липидов и экзогликолипидов нами было проведено исследование влияния солей Fe2+ (FeS04*7 Н20) и Fe3+ (FeCb*6 Н20). Проведенные исследования показали также, что добавление в среду 2-4 мг/л ионов Fe2+ и Fe3+ оказывало положительное влияние на рост и липидсинтезирующую активность культуры (рисунок 8, 9). Дальнейшее повышение содержания в среде Fe2+ и Fe3+ незначительно снижало липидсинтезирующую активность культуры.

я

Время культивирования, сут -2 мг/л —■—4 мг/л —*— 8 мг/л

(а)

0,6 0,4 0,2 О

0 2 4 6 8 10 Время культивирования, сут

—•— 2 мг/л —"—4 мг/л — 8 мг/л (б)

Рисунок 8 - Влияние содержания в среде Ре2+ на образование общих клеточных липидов (а) и экзогликолипидов (б) клетками Я. егуЛгороИх

а

О

20l 15 105

2 4 6 8 Время культивирования, сут

-2 мг/л — *— 4 мг/л ■

(а)

- 8 мг/л

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Рисунок 9 - Влияние содержания в среде Fe

липидов (а) и экзогликолипидов (б) клетками R. erythropolis

Время культивирования, сут —•—2 мг/л — 4 мг/л —*—8 мг/л (б)

3+ на образование общих клеточных

Максимальное образование биомассы наблюдалось в вариантах с 4 мг/л Fe"\ Наибольшее накопление общих клеточных липидов также отмечено при культивировании на среде с оптимальной для роста концентрацией ионов Fe Содержание экзогликолипидов в культуральной жидкости на шестые сутки роста с 4 мг/л Fe2+ составило 0,79 г/л, что на 25% выше, чем в варианте с 4 мг/л Fe3+.

Таким образом, как и у других изученных ранее бактерий Bacillus subtilis, Pseudomonas sp. (Desai J.D., Banat I.M., 1997) и Rhodococcus sp., образующих биосурфактанты, у изученного нами штамма соли железа стимулируют как синтез экзогликолипидов, так и образование общих клеточных липидов. Внесение в среду ионов Fe2+ в концентрации 4 мг/л сопровождается увеличением скорости роста и синтеза экзогликолипидов, что свидетельствует о функционировании в клетках R. erythropolis алкангидроксилазного ферментного комплекса, содержащего рубредоксин.

Целью следующей серии экспериментов являлась оптимизация процессов полунепрерывного культивирования клеток R. erythropolis, которую осуществляли по отъемно-доливному методу с использованием модульного биотехнологического оборудования серии ОКА-MI МФ-05К. Изначально засев ферментеров проводили односуточной культурой, выращенной на мясопептонном бульоне, инокулят вносили 10% от объема среды (1 этап). Оптимальное время культивирования составило 4 суток, после чего отмечено снижение скорости роста вследствие перехода культуры в стационарную и литическую фазы. При достижении 4 суток производили слив культуральной жидкости, оставляя в качестве инокулята сначала 10% (2 этап), а затем 5% от первоначального объема (3 этап).

Кинетические расчеты, проведенные при изучении ростовых процессов культуры R. erythropolis на среде с избытком питательных компонентов (МПБ), показали, что скорость роста максимальна в варианте с содержанием в среде растворенного кислорода 144 мкмоль Oj/мл (рисунок 10). Оптимальным вариантом отьемно-доливного культивирования является содержание в среде растворенного кислорода 144 мкмоль Ог/мл и использование 5-10% инокулята (2-3 этап).

1 этап 2 этап 3 этап

Время культивирования, ч —■—48 мкмоль02/мл —Ж— 144 мкмоль 02/мл

Рисунок 10 - Кривая абсолютной скорости роста культуры R. егуЛгороШ на МПБ при различной степени насыщения кислородом

Накопление внеклеточного белка также максимально в варианте с содержанием в среде растворенного кислорода 144 мкмоль СЬ/мл на второй и третьей стадии культивирования. В течение же первой стадии роста динамика накопления белка в обоих вариантах отличается незначительно.

Таким образом, наиболее интенсивный рост культуры, накопление биомассы и образование внеклеточного белка Юю(1ососсш егугкгороШ в условиях полунепрерывного культивирования на среде с избытком питательных компонентов (МПБ) обеспечиваются при содержании в среде растворенного кислорода 144 мкмоль СЬ/мл и использовании 5-10% инокулята. В тоже время низкая степень аэрации приводит к недостатку растворенного кислорода в среде и ингибированию процессов жизнедеятельность в клетке.

Также изучали закономерности роста Ююс1ососсих егуЛгороЬэ на минеральной среде с гексадеканом в условиях полунепрерывного культивирования.

Было выявлено, что максимальная скорость роста в вариантах с различным насыщением среды кислородом на всех трех стадиях культивирования наблюдается через 24 часа (рисунок 11). Пик накопления биомассы наблюдается при использовании 10% инокулята, выращенного на среде Таусона (2 этап). При этом культивирование на минеральной среде с гексадеканом по сравнению с МПБ приводит к незначительному накоплению биомассы и недостоверному различию в кривых в зависимости от степени насыщения среды кислородом.

1 этап 2 этап 3 этап

Время культивирования, ч —■— 48 мкмоль 02/мл —ж— 144 мкмоль 02/мл

Рисунок 11 - Кривая абсолютной скорости роста культуры Я. егуЛгороШ на среде Таусона с гексадеканом при различной степени насыщения кислородом

Наиболее высокое содержание белка наблюдалось в течение первых часов культивирования, далее происходило значительное уменьшение данного показателя. Максимальное содержание внеклеточного белка наблюдалось на первые сутки второго этапа культивирования, что подтверждает сделанный ранее вывод о том, что оптимальным вариантом отъемно-доливного культивирования на среде с гексадеканом является использование 10% инокулята, выращенного на той же среде (2 этап).

При исследовании содержания клеточных липидов в биомассе, было обнаружено, что количество суммарных липидов при росте культуры на МПБ существенно не

изменялось от интенсивности аэрации среды, и составило в среднем 6,7% (от сырой биомассы) при содержании кислорода в среде 48 мкмоль/мл и 7,2% при концентрации кислорода 145 мкмоль/мл, а в случае использования минеральной среды с гексадеканом - 10,2% и 11,3% соответственно

Таким образом, проведенные исследования показали, что в процессе полунепрерывного культивирования /?. егуЛгороНя на среде Таусона максимальная скорость роста наблюдается в течение первых суток культивирования при использовании 10% инокулята, выращенного на минеральной среде Таусона с 1% гексадекана (2 этап).

ГЛАВА 5. Изучение возможности использования биопрепаратов на основе культуральной жидкости бактерий И. егуАггороИъ для биоремедиации нефтезагрязненных сред

Биоремедиация - это применение технологий и устройств, предназначенных для биологической очистки почв и водоемов, т.е. для удаления из почв и воды уже находящихся в них загрязнителей. Особый интерес представляют исследования, касающиеся биологического восстановления загрязнённых нефтью и нефтепродуктами водных акваторий и территорий суши. Разработка и совершенствование технологий биоремедиации, особенно почв, загрязненных различными поллютантами, в настоящее время являются областью активных прикладных и фундаментальных исследований. Одними из перспективных деструкторов нефтепродуктов являются микроорганизмы, относящиеся к роду /?йое/ососсыз. Это обусловлено продуцированием широкого спектра ферментных комплексов и липофильной природой их клеточной оболочки.

Было показано, что исследуемый штамм НИос1ососсиз егуЛгороИ5 Ас-858 Т способен расти и развиваться на жидких минеральных средах, содержащих гексадекан и смесь углеводородов (ДТ) в качестве единственного источника углеродного питания. Исследование по уменьшению доли растворенного и эмульгированного гексадекана в процессе отьемно-доливного культивирования свидетельствует о достаточно эффективном снижении его концентрации на протяжении всего времени культивирования (рисунок 12).

1 этап 2 этап 3 этап

100

24 48 72 % 24 48 72 96 24 48 72 96 Время культивирования, ч

О 48 мкмоль 02/мл Ш 144 мкмоль 02/мл

Рисунок 12 - Влияние степени насыщения кислородом на изменение доли растворимого и эмульгированного гексадекана при росте культуры Я. егу:кгороИ5

При этом интенсивность убыли растворенного и эмульгированного гексадекана практически пропорциональна степени насыщения среды кислородом и максимальна при содержании кислорода в среде 144 мкмоль/мл. Это связано с тем, что с увеличением концентрации кислорода, растворенного в питательной среде, увеличивается, вероятно, и активность монооксигеназы, а, соответственно, и степень окисления гексадекана.

Также в своей работе мы исследовали возможность практического использования данных бактерий в виде культурапьной жидкости в качестве биопрепарата для ремедиации нефтезагрязненных почв. Для этого черноземную почву, загрязненную дизельным топливом, подвергали обработке культуральной жидкостью Л. егуЛгороЬз Ас-858 Т. Содержание экзогликолипида в культуральной жидкости составляло 0,9 г/л.

Данные по убыли углеводородов приведены в таблице 4.

Изучение влияния интродукции бактерий Ююс1ососси5 в почву, загрязненную дизельным топливом, показало, что наибольшая убыль углеводородов наблюдается в 3 варианте обработки (3,3*104 КОЕ/г почвы) - к 7 суткам содержание ДТ снижается на 13 %. В 1 и 2 вариантах опыта (с внесением, соответственно, 3,3*И)3 и 1,7*104 КОЕ/г почвы) к концу первой недели обработки составляет менее 5%. Также следует отметить, что в 1 варианте опыта степень деградации углеводородов на всем протяжении обработки была низкой, так к концу пятой недели остаточное содержание углеводородов в почве составило 32 г ДТ/кг почвы, что лишь на 20% ниже по сравнению с исходным уровнем загрязнения. В то время как в 3 варианте к окончанию пятой недели обработки убыль углеводородов составила 35 %, что на 23% и 8% выше по сравнению с 1 и 2 вариантами. В контрольном варианте (без внесения клеток К. егунИгороНх) содержание углеводородов к окончанию эксперимента составило 38,1 г ДТ/кг почвы, что менее чем на 5% ниже по сравнению с исходным значением, т.е. колеблется в пределах ошибки опыта.

Таблица 4- Деградация дизельного топлива в загрязненной почве при ее обработке культуральной жидкостью Я. егуМгороИз Ас-858 Т

Вариан- Остаточное содержание ДТ

ты 1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 неделя 5 неделя

внесе- г/кг % г/кг % г/кг % г/кг % г/кг %

ния поч- поч- поч- поч- поч-

культу- вы вы вы вы вы

ральной

жид-

кости

Вариант 39,00 97,50 37,00 92,50 37,00 92,50 35,00 87,50 32,00 80,00

1 ± ± ± ¿К ± + ± ± ± ±

0,58 1,51 1,81 4,53 1,70 4,25 1,64 4,11 1,40 3,49

Вариант 38,00 95,00 35,00 87,50 33,00 82,50 30,00 75,00 28,00 70,00

2 ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

1,41 3,56 1,71 4,28 1,48 3,71 1,44 3,60 '1,34 3,34

Вариант 35,00 87,50 32,05 80,10 29,00 72,50 27,00 67,50 26,07 65,17

3 ± ± ± + ± ± ± ± ± ±

1,68 4,20 1,53 3,83 1,42 3,54 1,32 3,30 1,27 3,17

На основании проведенных исследований нами предложена схема использования биопрепарата Я. егуЛгороГи Ас-858 Т в природных условиях при биоремедиации почвы, загрязненной дизельным топливом. При исходном уровне загрязнения почвы дизельным топливом 120 г/м2 почвы рекомендуемая доза внесения препарата на 1 м2 составляет 1 л (в 1 л содержится 108 жизнеспособных клеток). При этом внесение препарата рекомендуется сопровождать проведением рекультивационных работ по обогащению верхних слоев почвы кислородом, что в свою очередь ускорит процессы окисления углеводородов микроорганизмами. Ожидаемая степень деградации углеводородов дизельного топлива за летний период составит не менее 35%.

Таким образом, в результате проведенной работы показана возможность применения культуральной жидкости бактерий Я. егуЛгороИз Ас-858 Т в качестве биопрепарата для деградации нефтепродуктов (дизельного топлива) загрязненной почвы.

ВЫВОДЫ

1. Изучение физиологических особенностей Я. егуЛгороШ Ас-858 Т показало, что низкие концентрации Са2+ (2-6 мг/л) и углеводородов (1-3%) стимулируют накопление биомассы Я1юс1ососсиз егуЛгоро!^ Ас-858 Т, в то время как высокие концентрации ингибируют рост. Оптимальной для роста и накопления общих клеточных липидов является среда с 1% углеводородов и 4 мг/л Са2+.

2. Максимальный синтез внеклеточных гликолипидов, основных биоПАВ Я. егуЛгороИх, наблюдается при культивировании микроорганизма на среде с 2-3% дизельного топлива и начальным значением рН 7,0. Стимулирующий эффект на увеличение выхода экзогликолипидов оказывают ионы Ре(Н) в концентрации 4 мг/л.

3. Культивирование на гидрофобных субстратах стимулирует более интенсивное накопление общих клеточных липидов, внеклеточных гликолипидов.

4. В результате изучения фракционного состава фосфолипидов клеток Я. егуМгороШ, выращенных на средах с гидрофобными субстратами были обнаружены и идентифицированы следующие фракции: дифосфатидилглицерин, фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фофатидилинозит. В процессе роста Я егуЛгороИв Ас - 858 Т качественный состав фосфолипидов не изменялся, однако наблюдалось изменение количественного соотношения фосфолипидов - уменьшение доли фосфатидилэтаноламина, при этом доля кардиолипина и фракции (фосфатидилсерина + фофатидилинозита) возрастала.

5. Выявлена корреляция между степенью окисления гексадекана и степенью насыщения кислорода в среде. Более высокая концентрация растворенного кислорода в среде увеличивает долю продуктов окисления гексадекана, что связано, вероятно, с действием окислительных ферментов.

6. В результате проведенных экспериментальных исследований показано, что культуральную жидкость Я. егуАгороШ Ас-858 Т можно использовать для биоремедиации почвы, загрязненной дизельным топливом. При этом к 35 суткам обработки концентрация углеводородов снижается на 35%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Костина Е.Г., Ревин В.В., Атыкян Н.А. Деструкция углеводородов нефти

культурой ЯВОТЮСОССт ЕЯГГНЯОРОШ ВКМ Ас-858 Т // Проблемы

биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Материалы междунар.

науч. конф. Саратов, 14-16 сентября 2005г. Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. С. 2829.

2. Костина Е.Г., Ревин В.В., Атыкян H.A. Культивирование клеток RHODOCOCCUS ERYTHROPOL1S Ас-858 Т на ферментационной установке «ОКА-М1» II 10-ая Путинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Путинского научного центра РАН "Биология - наука XXI века": Тез. докл. науч. конф. Пущино, 17-21 апреля 2006г. Пущино: Изд-во Путинский научный центр РАН, 2006. С. 196.

3. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Ревин В.В. Утилизация углеводородов нефти клетками RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS Ас-858 Т II Управление качеством образования, продукции и окружающей среды: Материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции (5-6 июля 2007 г., Бийск). Бнйск, 2007. С. 228-229.

4. Федин A.A., Уткина Е.С., Атыкян H.A., Костнна Е.Г., Ревин В.В. Влияние pH и концентрации ионов Са(Н) и Fe(II и III) на синтез биоПАВ нефтеокисляющими микроорганизмами // Материалы научной конференции "XXXV Огаревские чтения": в 2 ч. 4.2: Естественные и технические науки. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2007. С. 6.

5. Костина Е.Г., Ревин В.В., Атыкян H.A. Изменение фосфолипидного состава клеток RHODOCOCCUS ERYTHROPOUS в процессе роста на углеводородном субстрате // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии, посвященного памяти директора-основателя Института биохимии и генетики В.Г. Конарева «Биомика-наука XXI века» (9-15 сентября 2007 г., Уфа). Уфа, 2007. С.68-69.

6. Kostina E.G., Atykjan N.A., Revin V.V. Role of calcium ions in lipids synthesizing ability of RHODOCOCCUS ERYTHROPOUS VKM Ас-858 T // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov (20-22 septemer 2007, Kyiv, Ukraine). Kyiv, 2007. P. 128.

7. Костнна Е.Г., Атыкян H.A., Ревин B.B. Оптимизация культивирования RHODOCOCCUS ERYTHROPOUS в полунепрерывных условиях // Материалы международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (10-12 октября 2007 г., Ростов-на-Дону). Ростов-на-Дону, 2007. С. 140.

8. Костина Е.Г., Атыкян Н.А, Ревин В.В. Влияние ионов кальция на липидсинтезирующую способность RHODOCOCCUS ERYTHROPOUS Ас-858 Т // Материалы 11-ой Пущинской международной школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (29 октября-2 ноября 2007г., Пущино). Пущино: Изд-во Пущино, 2007. С. 147-148.

9. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Надежина О.С., Ревин В.В. Убыль углеводородов при раздельном и совместном культивировании RHODOCOCCUS ERYTHROPOUS и LENTINUS TIGRINUS // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (27-29 ноября 2007 г., Киров). Киров, 2007. С.203-205.

10. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Ревин В.В., Якуббаев Х.Ш., Федин A.A. Культивирование бактерий RHODOCOCCUS ERYTHROPOUS в полунепрерывных условиях // Материалы научной конференции "Первые чтения памяти профессора O.A. Зауралова". Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2007. С.76-79.

11. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Ревин В.В. Изучение возможности использования RHODOCOCCUS ERYTHROPOUS для биодеградации дизельного топлива // Современные наукоемкие технологии, 2008, №2. С.91-92.

12. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Ревин В.В. Изменение липидного состава клеток RHODOCOCCUS ERYTHROPOL1S при культивировании на среде с гексадеканом // Сборник материалов международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения доктора биологических наук, профессора, основателя кафедры биохимии Е.В. Сапожниковой «Биология: теория, практика, эксперимент». Саранск, 2008. С.228-

13. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Ревин В.В. Отработка условий полунепрерывного культивирования клеток RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS на среде с гексадеканом // Материалы международной научной конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (15-18 мая 2008 г., Саранск). Саранск: Изд-во Морд, ун-та, 2008. С.386-387.

14. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Ревин В.В. Влияние кальция на фосфолипидный состав клеток бактерий RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г., Новосибирск). Новосибирск: Изд-во Арта, 2008. С. 151.

15. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Ревин В В. Разработка биопрепарата на основе бактерий RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS для биоремедиации нефтезагрязненных почв // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (15-16 сентября 2008 г., Казань). Казань, 2008. С. 57-58.

16. Костина Е.Г., Атыкян H.A., Ревин В.В. Влияние ионов кальция на биосинтез липидов RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS // Вестник Российской Военно-медицинской Академии. Приложение 2 (Часть 2). 2008. Т. 23. №З.С. 339.

17. Костина Е.Г., Атыкян H.A. Разработка нефтеразрушающего биопрепарата на основе бактерий RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS II Материалы X научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева: в 2 ч. 4.2: Естественные и технические науки. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2008. С. 31-32.

18. Ревин В.В., Атыкян H.A., Костина Е г., Гоготов И.Н. Влияние кальция на изменение состава липидов клеток RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS Ас-858 Т в процессе периодического и полунепрерывного культивирования на средах с различной концентрацией гексадекана // Вестник ОГУ. 2008. №11. С. 143-149.

231.

Подписано в печать 13 11.08. Объем 1,5 п л. Тираж 100 экз. Заказ № 1741. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Костина, Елена Геннадьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИМЕНЕНИЕ АЛКАНОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS SP

1.1 Культурально-морфологическая характеристика бактерий рода Rhodococcus sp,

1.2 Физиология и биохимия алканотрофных бактерий Rhodococcus sp

1.3 Липидный состав клеток актинобактерий Rhodococcus sp

1.4 Применение бактерий рода Rhodococcus sp

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объект исследования

2.2 Реактивы и материалы

2.3 Культивирование бактерий Rhodococcus erythropolis

2.4 Определение концентрации белка

2.5 Определение количества биомассы

2.6 Экстракция липидов из клеток бактерий Rhodococcus erythropolis

2.6.1 Выделение общих липидов

2.6.2 Выделение фосфолипидов

2.7 Хроматографические методы анализа

2.7.1 Микротонкослойная хроматография фосфолипидов

2.7.2 Количественное определение фосфолипидов

2.8 Антроновый метод определения экзогликолипидов

2.9 Определение содержания углеводородов в культуральной жидкости

2.10 Гравиметрический метод определения массовой концентрации углеводородов в пробах почв

2.11 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕГУЛИРОВАНИЯ РОСТА И СИНТЕЗА ЛИПИДОВ У RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS

3.1 Влияние концентрации Са+ на рост и липидсинтезирующую активность культуры Rhodococcus erythropolis Ас-858Т при культивировании на среде с гексадеканом

3.2 Влияние концентрации гексадекана на рост и липидсинтезирующую способность клеток Rhodococcus erythropolis Ас-858 Т

3.3 Исследование липидсинтезирующей активности клеток Rhodococcus erythropolis при полунепрерывном культивировании на богатой органической и оптимизированной минеральной средах

3.4 Влияние концентрации углеводородов (дизельного топлива) на рост и образование липидов культурой Rhodococcus erythropolis Ас-858 Т

ГЛАВА 4. ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССОВ ПЕРИОДИЧЕСКОГО И ПОЛУНЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ

4.1 Получение активных форм биопрепарата на основе Rhodococcus erythropolis при периодическом культивировании

4.1.1 Эксперименты по влиянию начального значения рН на рост и липидсинтезирующую активность R. erythropolis

4.1.2 Эксперименты по влиянию ионов железа на рост и липидсинтезирующую активность R. erythropolis

4.2 Оптимизация процесса полунепрерывного культивирования клеток Rhodococcus erythropolis

4.2.1 Изучение полунепрерывного культивирования R. erythropolis в условиях избытка питательных компонентов

4.2.2 Полунепрерывное культивирование Rhodococcus erythropolis на оптимизированной минеральной среде с гексадеканом в качестве единственного источника углерода

4.2.3 Изменение содержания клеточных липидов Rhodococcas erythropolis при полунепрерывном культивировании на средах с различными источниками углерода

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ БАКТЕРИЙ Д. ERYTHROPOLIS ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ СРЕД

5.1 Использование клеток Rhodococcus erythropolis для ремедиации нефтезагрязненных вод

5.1.1 Изменение доли растворенного и эмульгированного модельного субстрата (гексадекана) в процессе роста клеток Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-858 Т в жидких средах

5.1.2 Изменение доли растворенных и эмульгированных углеводородов дизельного топлива в процессе роста клеток Rhodococcus erythropolis Ас-858 Т в жидких средах

5.2 Использование биопрепарата на основе Rhodococcus erythropolis для ремедиации нефтезагрязненных почв

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧИКОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение физиологических свойств бактерии Rhodococcus erythropolis штамм Ас-858 Т для оптимизации условий получения углеводородразрушающего биопрепарата"

Актуальность темы. До недавнего времени вызывающие умеренный интерес ученых нокардиоформные актинобактерии оказались очень перспективным объектом для исследования. Эти микроорганизмы распространены повсеместно, что связано с их чрезвычайной биохимической пластичностью. Они обладают целым комплексом тактических приемов выживания. Эти указанные качества определили ценность нокардиоформов для решения многообразных экологических и биотехнологических задач (Van Hamme J.D., Ward О.Р., 2001; Jung J.G., Park C.H., 2004). Бактерии рода Rhodococcus играют важную роль в процессах почвообразования, в обогащении биоценозов витаминами и другими физиологически активными соединениями (Нестеренко О.А. и др., 1985). Одним из перспективных направлений прикладного использования родококков является биоремедиация почв, а также очистка сточных вод, загрязненных нефтепродуктами (Van Hamme J.D. et. al., 2001; Jung I.G. et. al., 2004).Способность этих бактерий эмульгировать и деградировать углеводороды в значительной степени обусловлена особенностями строения их клеточной оболочки, которая имеет липофильный характер, т.е. высокую афинность к гидрофобным субстратам (Tsitko I.V. et. al.,1999). Состав и метаболизм клеточных липидов влияет на адаптацию этих микроорганизмов к неблагоприятным факторам (Куюкина М.С. и др., 2000), и изменяется в ходе развития клеток (Коронелли Т.В., 1984). Поверхностная активность и гидрофобный характер способствуют взаимодействию между микроорганизмами и нерастворимым субстратом, что дает возможность преодолеть ограниченную диффузию при его транспорте в клетку (Карпенко Е.В. и др., 2006).Таким образом, полезность бактерий Rhodococcus sp. для развивающейся биотехнологии и их высокий научный и коммерческий потенциал, прежде всего как нефтеокисляющих микроорганизмов, обуславливают необходимость совершенствования методов их культивирования для получения активной культуры и исследования влияния отдельных факторов на синтез липидов.Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование физиологических свойств штамма Rhodococcus eiythropolis Ас-858 Т и возможности его использования в качестве биопрепарата для деградации углеводородных загрязнений.Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Изучить изменение липидного состава клеток R. erythropolis в процессе роста на средах разного состава; 2. Подобрать оптимальные условия для накопления биомассы, липидов и максимальной секреции внеклеточных гликолипидов; 3. Изучить рост культуры и изменение фосфолипидного состава клеток R. eiythropolis в условиях полунепрерывного культивирования на минеральной среде с гексадеканом и среде с избытком питательных компонентов; 4. Исследовать процесс биодеградации углеводородов бактериями R. erythropolis в условиях периодического и полунепрерывного культивирования; 5. Исследовать возможность использования бактерий R. eiythropolis в качестве биопрепарата для биоремедиации почв, загрязненных нефтепродуктами (в частности дизельным топливом).Научная новизна работы.Впервые исследован состав фосфолипидов клеток R. erythropolis штамм ВКМ Ас-858 Т при различных условиях культивирования. Изучено накопление клеточных и внеклеточных липидов и изменение фосфолипидов R. erythropolis в зависимости от состава питательной среды и условий культивирования. Показано, что в процессе культивирования независимо от условий качественный состав фосфолипидов не меняется, однако наблюдается изменение их количественного соотношения: доля фосфатидилэтаноламина снижается, в то время как доля дифосфатидилглицерина и объединенной фракции фосфатидилсерина и фосфатидилинозита возрастает.Выявлено, что ростовые процессы и накопление липидов стимулируют низкие концентрации ионов кальция, железа (II) и углеводородов.Проведен подбор условий полунепрерывного культивирования на различных средах.Показана возможность использования культуральной жидкости бактерий R. eiythropolis в качестве биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных сред.Научно-практическая значимость работы.Полученные данные расширяют знания о биологических свойствах актинобактерий рода Rhodococcus и представления об участии клеточных и внеклеточных липидов в процессах деградации углеводородных субстратов, что позволяет разрабатывать научно-обоснованные подходы к биоремедиации нефтезагрязненных сред.Предложена технология практического использования бактерий R. erythropolis для биодеградации нефтепродуктов на основе культуральной жидкости.Связь работы с научными программами.Представленные результаты были получены в ходе исследований, проведенных в рамках научно-практических работ при поддержке: программы «Развитие научного потенциала высшей школы 2006-2008» РНП.2.1.17708 «Моделирование и кинетический анализ процессов деструкции лигноцеллюлозных субстратов и ксенобиотиков с участием ферментов и липидов»; гранта Роснауки по поддержки молодых, ученых, шифр 2006-РИ-19.0/001/079 «Исследование свойств лигнолитических ферментов гриба Panus tigrinus и их роли в биодеградации растительных отходов и токсичных веществ» Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены для обсуждения на международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); на Огаревских чтениях в Мордовском государственном университете имени Н.П. Огарева (Саранск, 2006); на 10-ой Пущинской школе конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); на IV Съезде общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); на научной конференции «Первые чтения памяти профессора О.А. Зауралова» (Саранск, 2007); на школе-семинаре молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007); на международной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (г. Киев, Украина, 2007); на международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007); VII Республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2008).Публикации. По теме диссертации опубликовано J_8 печатных работ, в числе которых 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 19 рисунков и J_3 таблиц. Список цитируемой литературы включает 222 источника, в том числе 106 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Костина, Елена Геннадьевна

выводы

1. Изучение физиологических особенностей Я. егугЪгороИз Ас-858 Т показало, что низкие концентрации Са (2-6 мг/л) и углеводородов (1-3%) стимулируют накопление биомассы Якойососсиз егуОнгороШ Ас-858 Т, в то время как высокие концентрации ингибируют рост. Оптимальной для роста и накопления общих клеточных липидов является среда с 1% углеводородов и 4 мг/л Са2+.

2. Максимальный синтез внеклеточных гликолипидов, основных биоПАВ Я. егу^гороШ, наблюдается при культивировании микроорганизма на среде с 2-3% дизельного топлива и начальным значением рН 7,0. Стимулирующий эффект на увеличение выхода экзогликолипидов оказывают ионы Ре(П) в концентрации 4 мг/л.

3. Культивирование на гидрофобных субстратах стимулирует более интенсивное накопление общих клеточных липидов, внеклеточных гликолипидов.

4. В результате изучения фракционного состава фосфолипидов клеток Я. егуМгороШ, выращенных на средах с гидрофобными субстратами были обнаружены и идентифицированы следующие фракции: дифосфатидилглицерин, фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фофатидилинозит. В процессе роста Я. егу^гороИз Ас -858 Т качественный состав фосфолипидов не изменялся, однако наблюдалось изменение количественного соотношения фосфолипидов - уменьшение доли фосфатидилэтаноламина, при этом доля кардиолипина и фракции (фосфатидилсерина + фофатидилинозита) возрастала.

5. Выявлена корреляция между степенью окисления гексадекана и степенью насыщения кислорода в среде. Более высокая концентрация растворенного кислорода в среде увеличивает долю продуктов окисления гексадекана, что связано, вероятно, с действием окислительных ферментов.

6. В результате проведенных экспериментальных исследований показано, что культуральную жидкость Я, епПкгороШ Ас-858 Т можно использовать для биоремедиации почвы, загрязненной дизельным топливом. При этом к 35 суткам обработки концентрация углеводородов снижается на 35%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костина, Елена Геннадьевна, Саранск

1. Андреева И.С. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биоремедиации почв и водной среды / И.С. Андреева, Е.К. Емельянова, С.Н. Загребельный, С.Е. Олькин, И.К. Резникова, В.Е. Репин // Биотехнология. -2006. -№1.~ С. 43-52.

2. Андреева И.С. Утилизация углеводородов психротолерантными штаммами- деструкторами / И.С. Андреева, Е.К. Емельянова, С.Е. Олькин, И.К. Резникова, С.Н. Загребельный, В.Е. Репин // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. - Т. 43, №2. - С. 223-228.

3. Арзуманян В.Г. Степень галофильности Rhodococcus erythropolis и Halobacterium salinarum определяется парциальным давлением кислорода / В.Г. Арзуманян, H.A. Воронина, В.К. Плакунов, С.С. Беляев // Микробиология. 2000. - Т. 69, №2. - С. 290-292.

4. Аристархова В.И. Нокардиоподобные микроорганизмы / В.И. Аристархова. М.: Наука, 1989. - 248 с.

5. Аушева Х.А. Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок. Автореф.дис.канд. тех. наук / Х.А. Аушева. Москва: РХТУ, 2007. - 20 с.

6. Бабошин М.А. Кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens / М.А. Бабошин, З.И. Финкельштейн, Л.А. Головлева // Микробиология. 2003. - Т. 72, №2. - С. 194-198.

7. Белоусова Н.И. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах / Н.И. Белоусова, А.Н. Шкидченко // Прикладная биохимия и микробиология. -2004. Т.40, №3. - С. 312 - 316.

8. Беляев С.С. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей / С.С. Беляев // Микробиология. -1999.-Т. 68, №1. С. 40-44.

9. Бергельсон Л.Д. Препаративная биохимия липидов / Л.Д. Бергельсон, Э.В. Дятловицкая, Ю.Г. Молотковский. М.: Наука, 1981. - 256с.

10. Бердичевская M.B. Особенности физиологии родококков, разрабатываемых нефтяных залежей / М.В. Бердичевская // Микробиология.-1989 Т.58, №1. - С. 60-65.

11. Болдырев A.A. Биомембранология / A.A. Болдырев, Е.И. Кяйвяряйнен, В.А. Илюхина. Петрозаводск: Изд-во Кар НЦ РАН, 2006. -226 с.

12. Вельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы / В.В. Бельков // Биотехнология,- 1995.- №3.- С. 20-27.

13. Волде М.И. Сапротрофные бактерии в почвах, загрязненных нефтью / М.И. Волде // Межд. конф. студ.и аспирантов по фундам. наукам «Ломоносов-1996», Москва, 1996 г.: Тез. докл. Почвоведение.- М., 1996. -С.14.

14. Волченко H.H. Гидрофобность клеток как критерий отбора бактерий , продуцентов биосурфактантов / H.H. Волченко, С.Г. Карасёв, Д.В. Нимченко, Э.В. Карасёва // Микробиология. - 2007. - Т. 76, №1. - С. 126-128.

15. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции / Р. Геннис : Пер. с англ. М.: Мир, 1997. - 624 с.

16. Глазачева JLE. Клеточные приспособления Rhodococcus rhodochrous и Rhodococcus ruber, усваивающих пропан и «-бутан / JT.E. Глазачева, И.Б. Ившина, A.A. Оборин // Микробиология. -1990 Т. 59, №2. -С. 301-306.

17. Градова Н.Б. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных почв / Н.Б. Градова, И.Б. Горнлва, Р. Эддауди, Р.Н. Салина // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, №3.-С. 318-321.

18. Гузев B.C. Влияние масляной кислоты на физиологическую активность углеводородокисляющих родококков / B.C. Гузев, М.И. Волде, И.С. Куличевская, JI.B. Лысак // Микробиология. — 2001. Т. 70, №3. - С. 313-320.

19. Гузев B.C. Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве / B.C. Гузев, Э.М. Халимов, М.И. Волде, И.С. Куличевская // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 2. —С. 154-159.

20. Гусев M.B. Микробиология / M.B. Гусев, JI.А. Минеева. М.: Мир, 1987.- 118с.

21. Донова М.В. Трансформация стероидных соединений актинобактериями (обзор) / М.В. Донова // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. - Т. 43, №1. - С. 5-18.

22. Егоров Н.С. Сравнение липидного состава R-, S- и М-вариантов Rhodococcas rubropertinctus / Н.С. Егоров, Т.В. Коронелли, Е.С. Милько, P.A. Степанова, Б.В. Розынов, М.Г. Плетенко // Микробиология. — 1986. Т. 55, Вып. 2. - С. 227-230.

23. Еловикова Е.А. Иммунофлуоресцентный анализ в экологических исследованиях бактерий рода Rhodococcus / Е.А. Еловикова // IV Молод. Науч. конф. Ин-та биол. «Актуальные проблемы биологии», Сыктывкар, 1112 апр., 1996: Прогр. и тез.- Сыктывкар, 1996. С.44.

24. Жегневская JI.B. Изучение биодеградации углеводородов нефти / Л.В. Жегневская, В.Б. Барахнина // Матер. 47 научн.-техн. конф. студ., аспирантов и мол. ученых Уфим. гос. нефт. техн. ун-та, Уфа, 1996 г. Т.1.-Уфа, 1996.-С. 124.

25. Жуков Д.В. Изучение биодеградации углеводородов нефти штаммами рода Rhodococcus / Д.В. Жуков, В.П. Мурыгина, C.B. Калюжный //

26. Конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 14-16 сентября 2005г.: Тез. докл.- Саратов, 2005. С.22-23.

27. Звягинцева И.С. Влияние солености среды на деструкцию нефтяных масел нокардиоподобными бактериями / И.С. Звягинцева, М.Н. Поглазов, М.Т. Готоева, С.С. Беляев // Микробиология. -2001. -Т.70, №6. С. 657-666.

28. Ившина И.Б. Биология бактерий рода Rhodococcus, усваивающих пропан и н-бутан: Автореф.дис.канд. биол. наук / И.Б. Ившина. -Киев,1982.-21 с.

29. Ившина И.Б. Биосинтез свободных аминокислот родококками / И.Б. Ившина, Г.И. Безматерных / Биосинтез вторичных метаболитов: Тезисы докл. Всесоюзн. конф. Пущино,1987. С. 33-34.

30. Ившина И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, P.A. Пшеничнов, A.A. Оборин. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. -125 с.

31. Ившина И.Б. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И.Б. Ившина, М.В. Бердичевская, JI.B. Зверева // Микробиология. 1995.- Т.64, №4. С.507-513.

32. Ившина И.Б. Новые экологически безопасные биосурфактанты родококков / И.Б. Ившина, Д. Филп, М.С. Куюкина и др. / Матер. Междун. конф., посвящ. памяти акад. A.A. Баева. 20-22 мая 1996. -М., 1996. С. 161

33. Ившина И.Б. Эффективное извлечение цезия клетками бактерий рода Rhodococcus / И.Б. Ившина, Т.А. Пешкур, В.П. Коробов // Микробиология. -2002. Т. 71, №3. - С. 418-423.

34. Ившина И.Б. Биотрансформация ß-ситостирола и его сложных эфиров актинобактериями рода Rhodococcus / И.Б. Ившина, В.В. Гришко, Е.М. Ноговицина, Т.П. Кукина, Г.А. Толстиков // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т.41, №6. - С. 626 - 633.

35. Квасников Е.И. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах / Е.И. Квасников, Т.М. Клюшникова. - Киев: Наук, думка, 1981. —131 с.

36. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М. Кейтс. М.:Мир, 1975. - 322 с.

37. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография: в 2 т. Т.2. / Ю. Кирхнер. -М.: Мир, 1981.-523 с.

38. Козлов C.B. Биологическая характеристика бактериальных штаммов активных продуцентов нитрилгилролизующих ферментов. Автореф.дис.канд. биол. наук / C.B. Козлов. - Пермь: Институт экологии и генетики микроорганизмов, 2007. - 24 с.

39. Коломыцева М.П. Гетерогенность Rhodococcus opacus 1СР как ответ на стрессовое воздействие хлорфенолов / М.П. Коломыцева, И.П. Соляникова, E.JI. Головлев, JI.A. Головлева // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т.41, №5, - С. 541-546.

40. Комарова Т.И. Роль низкомолекулярных азотистых соединений в осмотолерантности бактерий родов Rhodococcus и Arthrobacter / Т.И. Комарова, Т.В. Коронелли, Е.А. Тимохина // Микробиология. 2002. - Т. 71, №2.-С. 166-170.

41. Комов В.П. Биохимия / В.П. Комов, В.Н. Шведова. М.: Дрофа, 2004.-638 с.

42. Коронелли Т.В. Проникновение углеводородов в клетки микроорганизмов / Т.В. Коронелли // Успехи микробиологии. 1980. - №1ё5. -С. 99-111.

43. Коронелли Т.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоцинозов водных экосистем разных климатических зон / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, В.В. Ильинский, Т.И. Комарова, О.В. Поршнева // Микробиология. 1984. - Т. 63, Вып. 5. - С. 917-923.

44. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов / Т.В. Коронелли. -М.: Изд-во Моск. ун-та, 1984. 160 с.

45. Коронелли T.B. Определение активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов, меченых тритием / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, М.И. Семененко // Прикл. биохим. и микробиология. 1988. -Т.24, №2. - С. 203-207.

46. Коронелли Т.В. Распространение миколатов трегалозы в родококках / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, М.Н. Алексеева // Микробиология. 1988. - Т. 57, Вып. 5. - С. 886-781.

47. Коронелли Т.В. Образование миколатов трегалозы родококками в зависимости от возраста клеток и источника углерода / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, С.Г. Батраков // Микробиология. 1990. — Т. 59, Вып. 5. - С. 777781.

48. Коронелли Т.В. Полярные липиды углеводородокисляющих бактерий / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, С.Г. Юферова, В.В. Ильинский, О.Б. Чивкунова, Б.В. Розынов // Микробиология. 1993. - Т. 62, Вып. 2. - С. 231-237.

49. Коронелли Т.В. Экофизиологические основы и практический опыт интродукции углеводородокисляющих бактерий в природные экосистемы / Т.В. Коронелли // Конф. «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду», 17-19 мая 1994 г.: Тез. докл.-М., 1994.- С.53.

50. Коронелли Т.В. Принципы и методы итенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде / Т.В. Коронелли // Прикл. биохим. и микробиология.-1996.-Т.32, №6. С.579-585.

51. Коронелли Т.В. Интродукция бактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью / Т.В. Коронелли,Т.И. Комарова, В.В. Ильинский, Ю.И. Кузьмин, Н.Б. Киреанов, A.C. Яненко // Прикл. биохим. и микробиология.- 1997.- Т.ЗЗ, №2. — С. 198-201.

52. Крутецкая З.И. Механизмы внутриклеточной сигнализации / З.И. Крутецкая, O.E. Лебедев, JLC. Курилова. СПб.: Изд-во С. Петерб. Ун-та, 2003. - 208 с.

53. Куликова A.K. Эпоксидирование газообразных алкенов культурой Rhodococcus erythropolis 3/89 / A.K. Куликова, A.A. Беззубов, A.M. Безбородов // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. - Т.29, №4. — С. 512-515.

54. Куликова А.К. Выделение и характеристика пропанассимилирующих бактерий / А.К. Куликова, Е.В. Летунова, A.M. Безбородов // Прикладная биохимия и микробиология. — 1993. — Т.29, №3. — С. 431 -436.

55. Куликова А.К. Окисление органических соединений пропанмонооксигеиазой Rhodococcus erythropolis 3/89 / А.К. Куликова, A.M. Безбородов II Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т.36, №3. — С. 267-271.

56. Куликова А.К. Ассимиляция пропана и свойства пропанооксигеназы Rhodococcus eiythropolis 3/89 / А.К. Куликова, A.M. Безбородов II Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т.37, №2. — С. 186- 189.

57. Куюкина М.С. Влияние состава клеточных липидов на формирование неспецифической антибиотикорезистентности алканотрофных родококков / М. С. Куюкина, И. Б. Ившина, М.И. Рычкова, О.Б. Чумаков // Микробиология 2000. - Т.69, №1. - С.62-69.

58. Куюкина М.С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение. Автореф.дис.докт. биол. наук / М.С. Куюкина. Пермь: Институт экологии и генетики микроорганизмов, 2006. - 23 с.

59. Лысак Л. В. Экзогликаны почвенных бактерий родов Arthrobacter и Rhodococcus / Л. В. Лысак, С. Е. Горин, Т. Ф. Вустина // Микробиология. -1992. Т.61, №4. - С. 622 - 627.

60. Максимов А.Ю. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococccns sp. gt 1 / А.Ю. Максимов, M.B. Кузнецова, Г.В. Овечкина, C.B. Козлов, Ю.Г. Максимова,

61. B.А. Демаков // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т.39, №1. —1. C. 63 68.

62. Марченко Н.Д. Исследование плазмидного состава штаммов Rhodococcus opacus / Н.Д. Марченко //Рукопись ВИНИТИ. -1990. №642, вып. 90.- 4с.

63. Милехина Е.И. Углеводородокисляющая микрофлора заводняемых нефтяных месторождений Татарии с различной минерализацией пластовых вод / Е.И. Милехина, И.А. Борзенков, Ю.М. Миллер, М.В. Иванов // Микробиология. -1991.- Т. 60, №1 С. 747-755.

64. Милько Е.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс дисоциации / Е.С. Милько, Н.С. Егоров. М.: Наука, 1991. - 326 с.

65. Милько Е.С. Гидрофильно-гидрофобные и адгезивные свойства диссоциантов Rhodococcus rubropertinctus / Е.С. Милько, Егоров Н.С. // Микробиология. 1994. - Т. 63, вып. 2. - С. 382-384.

66. Назина М.В. Образование нефтевытесняющих соединений микроорганизмами из нефтяного месторождения Дацин (КНР) / М.В. Назина,

67. Д.Ш. Соколова, Я.Ф. Сюэ, С.С. Беляев, М.В. Иванов // Микробиология. -2003. Т.72, №2. - С. 206 - 211.

68. Нестеренко O.A. Жирнокислотный состав некоторых корине- и нокардиоподобных бактерий /O.A. Нестеренко, J1.B, Андреев, Т.М. Ногина и др. // Микробиол. журн. -1980.- Т.42, №3.-С.288-293.

69. Нестеренко O.A. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / O.A. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Киев: Наук, думка, 1985. -336 с.

70. Новицкая Г.В. Методическое руководство по тонкослойной хроматографии фосфолипидов / Г.В. Новицкая. М.: Наука, 1972. - 64 с.

71. Определитель бактерий Берджи: В 2-х т. Т.2 / Под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, П. Смита, Д. Стейли, С. Уильямса М.: Мир, 1997. - 368 с.

72. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Дж. Перт. М.: Мир, 1978. - 332с.

73. Пешкур Т. А. Аккумуляция цезия актинобактериями рода Rhodococcus: Автореф. дис. .канд. биол. наук. / Т.А. Пешкур. Пермь, 2002. -22 с.

74. Пирог Т.П. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти / Т.П. Пирог, Т.А. Шевчук, И.Н. Волошина, H.H. Грегирчак // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т.41, №1. — С. 58 — 63.

75. Пирог Т.П. Синтез поверхностно-активных веществ при росте штамма Rhodococcus erythropolis ЕК-1 на среде с гексадеканом / Т.П. Пирог, И.Н. Волошина, C.B. Игнатенко, Р.И. Вильданова-Марцишин // Биотехнология. 2005. - №6. - С. 27-36.

76. Плешакова E.B. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры / Е.В. Плешакова, Е.В. Дубровская, О.В. Турковская // Биотехнология. 2005. - №1. - С.42-50.

77. Плешакова Е.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путем стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры / Е.В.Плешакова, Н.Н.Позднякова, О.В. Турковская // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т. 41, №6. - С. 634 - 639.

78. Пырченкова И.А. Выбор и характеристика активных психротропных микроорганизмов деструкторов нефти / И.А. Пырченкова, А.Б. Гафаров, И.Ф. Пунтус, А.Е. Филонов, A.M. Воронин // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. — Т.42, №3, - С. 298 - 305.

79. Рогачёва С.М. Респираторная активность микробных клеток Rhodococcus rhodochrous М8, продуцирующих нитрилгидролизующие ферменты / С.М. Рогачёва, О.В. Игнатов // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т.37, №3, - С. 326 - 331.

80. Рубан Е.Л. Микробные липиды и липазы / Е.Л. Рубан. — М.: Наука, 1977.-218 с.

81. Рубашко Г.Е. Оптимизация процесса деградации флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 111 ! Г.Е. Рубашко, М.П. коломыцева, Л. А. Головлёва // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - т.42, №4. С. 448-451.

82. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды / А. Сассон М.: Мир, 1987.-411 с.

83. Сваровская Л.И. Активность почвенной микрофлоры в условиях нефтяных загрязнений / Л.И. Сваровская, Л.К. Алтунина // Биотехнология. — 2004.-№3.-С. 63-69.

84. Сидоров Д.Г. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл / Д.Г. Сидоров, И.А. Борзенков, Е.И. Милехина, С.С. Беляев, М.В. Иванов // Прикл. биохим. и микробиология. -1998. -Т.34, №3. С. 281-286.

85. Синолицкий М.К. Выделение нитрилгидратазы из клеток Rhodococcus rhodochrous М8 и опредиление N-концевой аминокислотной последовательности субъединиц / М.К. Синолицкий, C.B. Полтавская, С.М.

86. Рогачева, И.В. Севрюгина, С.П. Воронин // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ, №4. - С. 383 - 387.

87. Современная микробиология. Прокариоты / Ред. И. Лингелер, Г. Древе, Г. Шлегель. М.: Мир, 2005. Т.2. 493с.

88. Тарасов А.Л. Использование Н2О2 в качестве источника кислорода бактериями родов Pseudomonas и Rhodococciis / А.Л. Тарасов, И.А. Борзенков, Е.И. Милехина, И.С. Мысякина, С.С. Беляев // Микробиология. -2004. Т. 73, №4. -С. 465-471.

89. Хабибуллина Ф.М, Исследование способности нефтеокисляющих бактерий утилизировать углеводороды нефти / Ф.М. Хабибуллина, A.A. Шубаков, И.Б. Арчегова, Г.Г. Романов // Биотехнология. 2002. - №6. — С. 57-62.

90. Черепица C.B. Определение инспектируемых параметров дизельных топлив / C.B. Черепица, С.М. Бычков, А.Н. Коваленко, А.Л. Мазаник, Н.М. Макоед, H.H. Гремяко, Д.Е. Кузменков, Я.Л. Лучнина // Химия и технология топлив и масел. 2003. - №6. - С. 45-48.

91. Шкидченко А.Н. Биодеградация углеводородов нефти в открытых системах / А.Н. Шкидченко, Е.С. Иванова // Конф. «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», 14-16 сентября 2005г.: Тез. докл.- Саратов, 2005. С.57-58.

92. Шульга А. Н. Внеклеточные липиды и поверхностно-активные свойства бактерии Rhodococcus eiythropolis в зависимости от источника углеродного питания / А. Н. Шульга, Е. В. Карпенко, С. А. Елисеев // Микробиология. 1990. - Т. 59, Вып. 3. - С. 443-447.

93. Ягафарова Г.Г. Испытания биопрепарата «Родотрин» для ликвидации нефтяных загрязнений / Г.Г. Ягафарова, Э.М. Гатауллина // Баш. хим. ж. 1995. Т.2, №3-4. С. 69-70.

94. Ягафарова Г.Г. Новый нефеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis / Г.Г. Ягафарова, И.Н. Скворцова // Прикл. биохим. и микробиология. 1996. -Т.32, №2. - С. 224-227.

95. Allen C.C.R. Metabolism of naphthalene, 1-naphthol, indene, and indole by Rhodococcus sp. strain NCIMB 12038 / C.C.R. Allen, D.R. Boyd, M.J. Larkin, K.A. Reid, N.D. Sharma, K. Wilson // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. - P. 151-155.

96. Alvarez H. M. Formation of intracytoplasmic lipid inclusions by Rhodococcus opacus strain PD630 / H.M. Alvarez, F. Mayer, D. Fabritius, A. Steinbüchel // Arch. Microbiol.-1996. Vol .165. - P.377-386.

97. Alvarez H.M. Accumulation of storage lipids in species of Rhodococcus and Nocardia and effect of inhibitors and polyethylene glycol / H.M. Alvarez, R. Kalscheuer, A. Steinbüchel // Fett Lipid.- 1997.- Vol. 99. P. 239-246.

98. Alvarez H.M. Accumulation and mobilization of storage lipids by Rhodococcus opacus PD630 and Rhodococcus ruber NCIMB 40126 / H.M. Alvarez, R. Kalscheuer, A. Steinbüchel // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2000. -Vol.54.-P. 218-223.

99. Alvarez H.M. Biosynthesis of fatty acids and triacylglycerols by 2,6,10,14-tetramethyl pentadecane-grown cells of Nocardia globerula 432 / H.M. Alvarez, M. F. Souto, A. Viale, 0. H. Pucci // FEMS Microbiol. Lett.- 2001. -Vol. 200.-P. 195-200.

100. Alvarez H.M. Triacylglycerols in prokaryotic microorganisms / H.M. Alvarez, A. Steinbüchel // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. -Vol. 60. -P.367-376.

101. Angelova B. Hydroxylation of androstenedione by resting Rhodococcus •sp. cells in organic media / B. Angelova, S. Mutafov, T. Avramova, I. Dimova, L. Boyadjieva// Process Biochem. 1996. - Vol. 31, №2. - P. 179-184.

102. Bell K. S. The genus Rhodococcus/ K. S. Bell, J. C. Philip, D. W. J. Aw, N. Christofi // J. Appl. Microbiol.-1998. -Vol. 85.-P.195-210.

103. Berridge M.J. Calcium a life and death signal / M.J. Berridge, M.D. Bootman, P. Lipp // Nature. - 1998. - Vol. 395. - P.645-648.

104. Bligh E. Rapid method of total lipid extraction and purification / E. Bligh, W. Duer // Can. J. Biochim. Physical. 1959. - V.37. - P. 911- 917.

105. Bock C. Degradation and bioconversion of aliphatic and aromatic hydrocarbons by Rhodococcus ruber 219 / C. Bock, R.M. Kroppenstedt, H. Diekmann//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol. 45. - P. 408-410.

106. Bortolini O. Biotransformatuon on steroid nucleus of bile-acid / O. Bortolini, A. Medici, S. Poli // Steroids. 1997. - Vol. 62, № 8-9. - P. 564-577.

107. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein-bye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248 - 254.

108. Briglia M. Rhodococcus percolatus sp. nov., a bacterium degrading 2,4,6- trichlorophenol / M. Briglia, F.A. Rainey, E. Stackebrandt et. al. // Int. J. Syst. Bacteriol. -1996. Vol.46. - P. 23-30.

109. Butler W.R. High-performance liquid chromatography analysis of mycolic acids as an aid in laboratory identification of Rhodococcus and Nocardia species / W.R. Butler, O. Kilburn, G.P. Kubica // J. Clin. Microbiol. 1987. -Vol. 25, № 11. - P. 2126-2131.

110. Butler W.R. Mycolic Acid Analysis by High-Performance Liquid Chromatography for Identification of Mycobacterium Species / W.R. Butler, L.S. Guthertz 11 Clin. Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 14, № 4. - P. 704-726.

111. Cooper D.G. Enhanced production of surfactin from B. subtilis by continuous product removal and metal cation additions / D.G.Cooper, C.R.

112. Macdonald, S.J.B. Duff, N. Kosaric // Appl. Environ. Microbiol. 1981. V.42. №3. P.408-412.

113. Dabbs E.R. Plasmid-borne resistance to arsenate, arsenite, cadmium and chloramphenicol in a Rhodococcus species / E.R. Dabbs, G.J. Sole //Mol. Gen. Genet. (MGG). -1988. Vol. 211. -P. 148-154.

114. Deeb R.A. Temperature effects and substrate interactions during the aerobic biotransformation of BTEX mixtures by toluene-enriched consortia and Rhodococcus rhodochrous / R.A. Deeb, L. Alvarez-Cohen // Biotechnol. Bioeng. -1999. -Vol. 62.-P. 526-536.

115. Desai J.D. Microbial production of surfactans and their commercial potencial / J.D. Desai, I.M. Banat // Microbial. Mol. Biol. Rev. 1997. - Vol. 61, №1. - P. 47-64.

116. Espyny M.J. Nutritional requirements of a biosurfactant producing strain Rhodococcus sp. 51T7 / M.J. Espuny, S. Egido, J. Rodok, M.E. Mercade, A. Manresa // Biotechnol. Lett. 1996. - Vol. 18. - P. 521-526.

117. Esteve- Nunez A. Biological Degradation of 2,4,6- Trinitrotoluene / A. Esteve- Nunez, A. Caballero, J.L. Ramos // Microbiol, and Mol. Biol. Rev.- 2001. -Vol. 65, №3.-P. 335-352.

118. Femandes P. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments / P. Fernandes, A. Cruz, B. Angelova, H.M. Pinheiro, J.M.S. Cabral // Enz. Microb. Technol. 2003. - Vol. 32, № 6. - P. 688-705.

119. Ferraro D. J. Structural Basis for Regioselectivity and Stereoselectivity of Product Formation by Naphthalene 1,2-Dioxygenase / D. J. Ferraro, A. L. Okerlund, J. C. Mowers, S. Ramaswamy // J. Bacteriol. 2006. - Vol. 188. - P. 6986-6994.

120. Finnerti W. The biologi and genetics of the genus Rhodococcus / W. Finnerti //Annu. Rev.Microbiol. -1992. -Vol. 46.- P. 193-218.

121. Fuller M.E. Aerobic gram- positive and gram-negative bacteria exhibit differential sensitivity to and transformation of 2,4,6 trinitrotoluene (TNT) / M.E. Fuller, J. Manning // Curr. Microbiol. - 1997. - Vol. 35. - P. 77-83.

122. Gadda G. Characterization of cholesterol oxidase from Streptomyces hydroscopicus and Brevibacterium sterolicum / G. Gadda, G. Wels, L. Pollegioni, S. Zucchelli, D. Ambrosius, M. Pilone, S. Ghisla // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 1, №250.-P. 369-376.

123. Gakhar L. Structure and Increased Thermostability of Rhodococcus sp. Naphthalene 1,2-Dioxygenase / L. Gakhar, Z. A. Malik, C. C. R. Allen, D. A. Lipscomb, M. J. Larkin, S. Ramaswamy // J. Bacterid.- 2005. Vol. 187, № 21. -P. 7222-7231.

124. Gibson D. T. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology / D. T Gibson, R. E. Parales // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. -Vol.11.-P. 236-243.

125. Goodfellow M. The actinomycete-genus Rhodococcus: a home for the "rhodochrous" complex/ M. Goodfellow, G. Alderson// J. Gen. Microbiol. -1977. Vol.100, №1.-P. 99-122.

126. Goodfellow M. Introduction to chemosystematics / M. Goodfellow , D.E. Minnikin // Chemical Methods in Bacterial Systematics / Sos. Appl. Bacterid.-1985.-Vol. 20.-P. 1-15.

127. Gurtler V. Can whole genome analysis refine the taxonomy of the genus Rhodococcus? / V. Gurtler, B. C. Mayall, R. Seviour // FEMS Microbiol. Rev. -2004. Vol. 28. - P. 377-403.

128. Habe H. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria / H. Habe, T. Omori // Biosci. Biotechnol. Biochem. -2003. Vol. 67. - P. 225-243.

129. Haroune N. Metabolism of 2-Mercaptobenzothiazole by Rhodococcus rhodochrous / N. Haroune, B. Combourieu, P. Besse, M. Sancelme, A. Kloepfer, T. Reemtsma, H. D. Wever, A.-M. Delort // Appl Environ Microbiol. -2004. Vol. 70, №10. -P. 6315-6319.

130. Heipieper H.-J. Adaptation of Pseudomonas putida S12 to ethanol and toluene at the level of fatty acid composition of membranes / H.-J. Heipieper, J.A.M. de Bont // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60. - P. 4440-^1444.

131. Hoskisson P.A. Antibiotic production, accumulation of intracellular carbon reserves, and sporulation in Micromonospora echinospora (ATCC 15837) / P. A. Hoskisson, G. Hobbs, G. P. Sharpies // Can. J. Microbiol. 2001. - Vol.47. -P.148-152.

132. Iwabuchi N. Relationships between colony morphotypes and oil tolerance in Rhodococcus rhodochrous / N. Iwabuchi, M. Sunairi, H. Anzai, M. Nakajima, S. Harayama // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66, №11. - P. 5073-5077.

133. Jang J.Y. Isolation and Characterization of a Rhodococcus Species Strain Able to Grow on ortho- andpara-~Xy\QWQ / J.Y. Jang, D. Kim, H.W. Bae, K.Y. Choi, J.-C. Chae, G.J. Zylstra, Y.M. Kim, E. Kim // J. Microbiol.-2005. Vol.43, №4. -P. 325-330.

134. Jung I.G. Characteristics of Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1 for the biodégradation of benzene, toluene, m-xylene (BTX), and their mixtures / I.G. Jung, C.H. Park // J. Biosci. Bioeng. 2004. - V.97, № 6. - P. 429-431.

135. Kalafut T. Biotranaformation patterns of 2,4,6 trinitrotoluene by aerobic bacteria / T. Kalafut, M.E. Wales, V.K. Rastogi, R.P. Naumova, S.K. Zaripova, J.R. Wild // Curr. Microbiol. - 1998. - Vol. 36. - P. 45-54.

136. Kaprelyants A.S. Intercellular signalling and the multiplication of prokaryotes: bacterial cytokines / A.S. Kaprelyants, G.V. Mukamolova, S.S.

137. Kormer, Weichart, M. Young, D.B. Kell // Symp. Soc. Gen. Microbiol. 1999. -Vol. 57.-P. 33-69.

138. Kell D.B. Pheromones, social behaviour and the functions of secondary metabolism in bacteria / D.B. Kell, A.S. Kaprelyants, A. Grafen // Tree. 1995. — Vol. 10.-P. 126-129.

139. Kim D. Regioselective oxidation of xylene isomers by Rhodococcus sp. Strain DK 17 / D. Kim, Y.-S. Kim, J.M. Jung, G.J. Zylstra, Y.M. Kim, S.-K. Kim, E. Kim // FEMS Microbiol.-2003.- Vol.223.- P.211-214.

140. Kim J.-S. Microbial glycolipid production under nitrogen limitation and resting cell conditions / J.-S. Kim, M. Powalla, S. Lang, F. Wagner, H. Lunsdorf, V. Wray //J. Biotechnol. 1990. - Vol. 13. - P. 257-266.

141. Kulakov L. A., and M. J. Larkin Genetic organization of Rhodococcus / L. A. Kulakov, M. J. Larkin // In A. Danchin (ed.), Genomics of GC-rich grampositive bacteria. Caister Academic Press, Wymondham, United Kingdom, 2002. -P. 15-46.

142. Lang S. Surface-active lipids in rhodococci / S. Lang, J.C. Philp // Antonie van Leeuwenhoek Int. J. Cen. Mol. Microbiol. 1998. - V. 74. - P. 5970.

143. Lang S. Biological amphiphiles (microbial biosurfactants) / S. Lang // Cur. Opin. Colloid Interface Sei. 2002. - Vol. 7. - P. 12-20.

144. Larkin M. J. Applied aspects of Rhodococcus genetics / M. J. Larkin, M. R. De, L. A. Kulakov, I. Nagy // Antonie Leeuwenhoek. 1998. - Vol. 74. -P. 133-153.

145. Lechevalier M.P. Biology of actinomicetes not belonging to genus Streptomyces / M.P.Lechevalier , H. Lechevalier // Biology of Industrial

146. Microorganisms / Edit.: A. L. Demein, N.A. Solomon. Menlo Park, CA: Benjamin / Cumminds. -1985. P.315-358.

147. Lichtinger T. Biochemical Identification and Biophysical Characterization of a Channel-Forming Protein from Rhodococcus erythropolis / T. Lichtinger, G. Reiss, R. Benz // J Bacteriol. 2000. - Vol. 182, № 3. - P. 764770.

148. Marinetti G.V. Chromatographic analysis of polar lipids on silisic acid impregnated papen / G.V. Marinetti // New Biochem. Separation. 1964. - V.7. -P. 349.

149. Margesin R. Characterization of hydrocarbon degradative microbial populations in contaminated and pristine alpine soils / R. Margesin, D. Labbe, F. Schinner, C.W. Greer, L.G. Whyte // Appl. And Environ. Microbiol. - 2003. -Vol. 69, №6.-P. 3085-3092.

150. McAllister K.A. Microbial degradation of pentachlorophenol / K.A. McAllister, H. Lee, J.T. Trevors // Biodégradation. 1996. - Vol. 7. - P. 1-40.

151. Miyamoto M. Transformation of steroids by actinobacteria / M. Miyamoto, T. Iwaya, E. Itagaki // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - Vol. 1251, №2.-P. 115-124.

152. Neu T.R. Structural studies of an emulsion stabilizing exopolysaccharide produced by an adhesive, hydrophobic Rhodococcus strain / T.R. Neu, T. Dengler, B. Jann, K. Poralla //"J. Gen. Microbiol. - 1992. - Vol. 138, №12.-P. 2531-2537.

153. Niepel T. Intraspecifïc Variation of Unusual Phospholipids from Corynebacterium spp. Containing a Novel Fatty Acid / T. Niepel, H. Meyer, V. Wray, W.-R. Abraham // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180, №17. - P. 4650^1657.

154. Nishino S.F. Aerobic degradation of dinitrotoluenes and pathway for bacterial degradation of 2, 6-dinitrotoluene / S.F. Nishino, G.C. Paoli, J.C. Spain // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 2139-2147.

155. Olukoshi E.R. Importance of stored triacylglycerols in Streptomyces— possible carbon source for antibiotics / E.R. Olukoshi, N. M. Packter // Microbiol.- 1994.- Vol.140. -P.931-943.

156. Packter N. M. Ultrastructural studies of neutral lipid localisation in Streptomyces / N.M. Packter, E. R. Olukoshi // Arch. Microbiol. -1995. -Vol.164.-P.420-427.

157. Paje M.L. Degradation of benzene by a Rhodococcus sp. using immobilized cell systems / M.L. Paje, P. Marks, I. Couperwhite // World J. Microbiol. Biotechnol. 1998.-Vol. 14. - P.675-680.

158. Parales R. E. Biodégradation, Biotransformation, and Biocatalysis (B3) / R. E. Parales, N. C. Bruce, A. Schmid, L. P. Wackett // Appl. Environ. Microbiol.- 2002. Vol. 68. - P. 4699-4709.

159. Park H.-S. Degradation of Chloronitrobenzenes by a Coculture of Pseudomonas putida and a Rhodococcus sp. / H.-S. Park, S.-J. Lim, Y. K. Chang, A. G. Livingston, H.-S. Kim // Appl Environ Microbiol. -1999. Vol. 65, №3. -P.1083-1091.

160. Patrauchan M. A. Catabolism of benzoate and phthalate in Rhodococcus sp. strain RHA1: redundancies and convergence / M. A. Patrauchan, C. Florizone, M. Dosanjh, W. W. Mohn, J. Davies, L. D. Eltis // J Bacteriol. 2005. - Vol. 187, № 12.-P. 4050-4063.

161. Pinkart H.C. Cell envelope changes in solvent-tolerant and solventsensitive Pseudomonas putida strains following exposure to o-xylene / H.C. Pinkart, J.W. Wolfram, R. Rogers, D.C. White // Appl. Environ. Microbiol. -1996. Vol. 62. - P. 1129-1132.

162. Prescott J.F. Use of a virulence — associated protein based enzyme — linked immunosorbent assay for Rhodococcus egid serlogy in horses / J.F. Prescott, A.S. Fernandez, V.M. Nicholson // Eguine Vet. J. - 1996. - Vol. 28. - P. 344 -349.

163. Rainey F.A. Plyphasic evidence for the transfer of Rhodococcus roseus to Rhodococcus rhodochrous / F.A. Rainey, J. Burghatdt, R. M. Kroppenstedt et. al //Int. J. Syst. Bacteriol. -1995.-Vol. 45.-P. 101-103.

164. Rapp P. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from Rhodococcus eiythropolis grown on n-alkanes / P. Rapp, H. Bock, V. Wray, F. Wagner // J. Gen. Microbiol. 1979. - Vol. 115. - P. 491-503.

165. Ristau E. Formation of novel anionic trehalose tetraesters from Rhodococcus eiythropolis under growth- limiting conditions / E. Ristau, F. Wagner//Biotechnol. Lett. 1983. - Vol. 5. -P. 95-100.

166. Singer M.E. Growth of Acinetobacter sp. strain HOl-N on n-hexadecanol: physiological and ultrastructural characteristics / M. E. Singer, S. M. Tyler, W. R. Finnerty // J. Bacteriol.- 1985. Vol. 162. - P. 162-169.

167. Suenaga H. Directed Evolution of Biphenyl Dioxygenase; Emergence of Enhanced Degradation Capacity for Benzene, Toluene, and Alkylbenzenes / H.Suenaga, M. Mitsuoka, Y. Ura, T. Watanabe, K. Furukawa // J. Bacteriol. -2001.-Vol. 183.-P. 5441-5444.

168. Sutcliffe I.C. Cell envelope components of Rhodococcus equi and closely related bacteria / I.C. Sutcliffe // Vet Microbiol. 1997. - Vol.56. - P.287-299.

169. Sutcliffe I. C. Cell envelope composition and organisation in the genus Rhodococcus / I.C. Sutcliffe // Antonie Leeuwenhoek. 1998. - Vol.74. - P.49-58.

170. Tomioka N. Cesium accumulation and growth characteristics of Rhodococcus erythropolis CS98 said Rhodococcus sp. strein CS402 / N. Tomioka, H. Uchiyama, O. Yagi // Appl. Env. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 2227-2231.

171. Tsitko I.V. Effect of Aromatic Compounds on Cellular Fatty Acid Composition of Rhodococcus opacits / I.V. Tsitko, G.M. Zaitsev, A.G. Lobanok, M.S. Salkinoja-Salonen // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65, №2. - P. 853-855.

172. Vaskovsky V.E. Modified yunguccelis reagent for detecting phospolipids and other phosmorus compounds on thinlayer chromatograms / V.E. Vaskovsky, N.Latyshev //J. chromatogr.-1975.-V.l 15.-P.246-249.

173. Vaskovsky V.E. A universal reagent for phospholipids analysis / V.E. Vaskovsky, I. Vasondin, E.V. Kostetsky // J. Chromatogr. 1975. - V.l 14. - P. 129-141.

174. Vorbeck C. Initial reductive reactions in aerobic microbial metabolism of 2,4,6 trinitrotoluene / C. Vorbeck, H. Lenke, P. Fisher, J.C. Spain, H.-J. Knackmuss // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64, №1. - P. 246-252.

175. Wagner F. Production of surface active anionic glycolipids by resting and immobilized microbial cells / F. Wagner, J.-S. Kim, S. Lang, Z.-J. Li,

176. G.Marwede, U. Matulovie, E. Ristau, C. Syldatk // Proc. European Congress on Biotechnology. Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1984. Vol. 1. - P. 3-8.

177. Warhust A.W. Biotransformations catalysed by the genus Rhodococcus / A.W. Warhust, C.A. Fewson // Crit. Rev. Biochem. 1994. - V. 14. - P. 29-73.

178. Weber F.J. Cis/trans isomerization of fatty acids as a defense mechanism of Pseudomonas putida strains to toxic concentrations of toluene / F.J. Weber, S. Isken, J.A M. de Bont // Microbiol. 1994. - Vol. 140. - P. 2013-2017.

179. Wick L.Y. Responses of Mycobacterium sp. LB501T to the low bioavailability of solid anthracene / L.Y. Wick, A.R. de Munain, D. Springael,

180. H.Harms // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 58. - P. 378-385.

181. Zaitsev G.V. Growth of Rhodococcus opacus on mixtures of monohalogenated benzenes and phenols / G.M. Zaitsev, E.G.Surovtseva // Mikrobiolog. -2000. -Vol.69, №4. -P. 488-93.