Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение фикоэритрин-содержащих "пурпурных" цианобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Усова, Татьяна Валентиновна, Санкт-Петербург

61: М-3/У32-3

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

УСОВА Татьяна Валентиновна

ИЗУЧЕНИЕ ФИКОЭРИТРИН-СОДЕРЖАЩИХ "ПУРПУРНЫХ" ЦИАНОБАКТЕРИЙ (МОРФОЛОГИЯ, СТРОЕНИЕ АНТЕННОГО КОМПЛЕКСА,

ФОТОАДАПТАЦИЯ)

03.00.07 - микробиология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель д.б.н., проф. А.В. Пиневич

Санкт-Петербург 1999

Список использованных сокращений

АФЦ - аллофикоцианин

АФЦ В - аллофикоцианин В

ФБ - фикобилин

ФБВ - фикобиливиолин

ФБП - фикобилипротеин

ФБС - фикобилисома

ФС - фотосистема

ФЦ - фикоцианин

ФЦБ - фикоцианобилин

ФУБ - фикоуробилин

ФЭ - фикоэритрин

фЭБ - фикоэритробилин

ФЭЦ - фикоэритроцианин

Содержание

стр

Введение...............................................................................................................................6

Глава I. Обзор литературы

I. 1. ФБП.................................................................................................................11

-1.1.1. Хромофоры..............................................................................................16

I. 1.2. Апопротеины..............................................................................................21

1.1.3. Функциональная роль...............................................................................24

I. 2. ФБС.................................................................................................................25

1.2.1. Архитектура...............................................................................................26

I. 2. 2. Функциональные свойства........................................................................32

I. 2. 3. Регуляция биогенеза..................................................................................38

I. 3. ФЭ-содержащие "пурпурные"цианобактерии............................................48

Глава II. Материал и методы исследования

И. 1. Объекты.......................................................................................................58

II. 2. Методы культивирования...........................................................................58

II. 3. Методы морфологического анализа

II. 3.1. Световая микроскопия и морфометрия..................................................62

II. 3.2. Электронная микроскопия......................................................................62

II. 4. Методы физиолого-биохимического анализа

II. 4.1. Определение сухого веса.........................................................................64

II. 4.2. Получение бесклеточных препаратов.....................................................64

II. 4.3. Определение состава и удельного содержания ФБП............................65

II. 4.4. Получение очищенного препарата ФЭ...................".................................65

II. 4.5. Определение хромофорного состава ФЭ................................................66

II. 4.6. Определение полипептидного состава ФБС..........................................67

II.5. Статистическая обработка результатов......................................................68

Глава III. Результаты исследований и обсуждение

III. 1. Стратегия скрининга и составление коллекции штаммов "пурпурных"

цианобактерий............................................................................................70

III. 2. Общая морфология......................................................................................88

III. 3. Ультраструктура........................................................................................90

III. 4. Состав и удельное содержание ФБП.........................................................95

III. 5. Хроматическая адаптация...................................:......................................97

III. 6. Молекулярный состав и морфология ФБС Pseudanabaena sp.

С ALU 861.....................................................................................................101

Заключение.....................................................................................................................112

Выводы.............................................................................................................................115

Список литературы......................................................................................................117

Приложение 1. Световые микрофотографии прижизненных препаратов

ФЭ-содержащих "пурпурных" цианобактерий.................................130

Приложение 2. Электронные микрофотографии ультратонких срезов

ФЭ-содержащих "пурпурных" цианобактерий.................................137

Приложение 3. Спектры поглощения ФБП-содержащей фракции

"пурпурных" цианобактерий..............................................................144

Приложение 4. Спектры поглощения ФБП-содержащей фракции

"пурпурных" цианобактерий (культивирование под зеленым и красным светофильтрами, комплементарная хроматическая адаптация).............................................................................................169

Введение

Согласно современным воззрениям, фототрофия является свойством архаических фенотипов. Хемотрофия представляет собой вторичное явление; она, по-видимому, возникла в результате редукции пигментных систем в различных линиях фототрофов (Woese et al., 1985). Молекулярные механизмы фототрофии имеются у представителей доменов Bacteria и Archaea. Эукариоты, составляющие третий домен, лишены самостоятельной способности к фототрофии, но могут использовать продукты фототрофного биосинтеза эндосимбионтов - цианобактерий, цианелл и пластид.

На основании данных молекулярного секвенирования рибосомальных РНК сделан вывод о монофилетическом происхождении пластид и общности их предка с предками цианелл (эндосимбионтов Glaucocystophyceae) и оксигенных фототрофных бактерий - цианобактерий и прохлорофит (Pinevich, 1997).

Среди осуществляющих оксигенный фотосинтез бактерий (Oxyphotobacteria) основное место занимают цианобактерии. Согласно данным молекулярной палеонтологии, они составляют обособившуюся примерно 3,5 млрд. лет назад эволюционную ветвь и объединяют, при относительно узком спектре генной дивергенции, формы с контрастными морфологическими и физиолого-биохимическими признаками. Происхождение цианобактерий связано с приобретением биохимического механизма окисления воды, являющегося основополагающим звеном в процессе фотосинтеза современных растений. Благодаря способности к выделению молекулярного кислорода цианобактерии обеспечили переход к аэробным условиям в биосфере, что стимулировало развитие

большинства современных форм жизни (Tandeau de Marsac, 1991). Цианобактерии являются первичными продуцентами органики и формируют основу пищевой пирамиды в Мировом океане. Многие цианобактерии восстанавливают молекулярный азот, чем вносят значительный вклад в биологическую продуктивность природных сообществ (Glazer, 1984).

Большое разнообразие цианобактерий позволило им широко расселиться в пределах биосферы. Помимо морских, пресноводных и почвенных свободноживущих форм встречаются экзо- и эндосимбионты протистов, грибов, растений и животных (Reuter, Müller, 1993).

Эукариотные и прокариотные организмы, осуществляющие оксигенный фотосинтез, имеют две фотосистемы (ФС1 и ФС2), ферментный комплекс НгО-дегидрогеназы и основной светособирающий комплекс. Структура ФС высоко консервативна, полипептидный состав реакционных центров оксигенных фототрофов гомологичен таковому у аноксигенных фототрофов (Olson, Pierson, 1987). В то же время основной светособирающий комплекс сильно варьирует по структуре и специфике функционирования (Glazer, 1983). Эволюция оксигенных фототрофов прослеживается на уровне светособирающих антенн (Пиневич, 1991). Существует предположение, что прародительская форма одновременно содержала генетические детерминанты нескольких типов этого комплекса (Bhattacharya, Mediin, 1995). В результате последующей дивергенции сформировались светособирающие антенны 3-х основных типов: 1) хлорофилл а/Ь-белковый комплекс, характерный для прохлорофит и хлоропластов-пластид высших растений, зеленых и эвгленовых водорослей; 2) хлорофилл а/с-белковый комплекс "хромопластов" диатомовых, бурых и хризомонадных водорослей; 3) ФБС цианобактерий, цианелл и "родопластов" красных водорослей и криптомонад.

Светособирающие антенны третьего типа образованы ФБП и существенно отличаются от других тем, что располагаются на цитоплазматической поверхности мембран тилакоидов (Grossman et al., 1993а), а в случае криптомонад- в интратилакоидном пространстве, где они образуют высшие агрегаты еще не установленной архитектуры (Tandeau de Marsac, 1991). Апопротеины хлорофилл a/b-белкового комплекса прохлорофит не проявляют иммунологического родства с апопротеинами главной светособирающей антенны хлоропластов (Bullerjahn et al., 1987), и они предположительно сформированы в результате глубокой дивергенции исходного полипептида (Пиневич, 1991).

У большинства изученных в настоящее время цианобактерий главным фотосинтетическим пигментом является хлорофилл а, имеющий максимумы поглощения in situ при 440 и 680нм. Способность цианобактерий занимать экологические ниши с различными условиями освещения связана с присутствием вспомогательных фотосинтетических пигментов. Кроме универсально присутствующих (окси)каротиноидов к ним в первую очередь относятся ФБП -компоненты основного светособирающего комплекса, ФБС. Существуют экспериментальные данные, указывающие на дополнительную роль ФБС как структурной матрицы для функционирования нитрогеназы и гидрогеназы (Бекасова, 1993). Полифункциональность ФБС выражена в их способности служить резервным источником связанного азота (Wyman et al., 1985).

Индивидуальная окраска цианобактерий является результатом взаимного наложения абсорбционных полос трех типов пигментов: зеленого хлорофилла а, желто-оранжевых каротиноидов и ФБП красного или синего цвета (Pinevich et al., 1997b).

Качественный состав ФБП и их относительное содержание существенно влияют на окраску цианобактерий. Как правило, преобладают ФЦ, вследствие чего клеточные массы приобретают сине-зеленый цвет.

Помимо сине-зеленых встречаются "пурпурные" цианобактерии, окраска которых в основном связана с высоким относительным содержанием ФЭ. Это преимущественно тропические, морские и океанические, одноклеточные и нитчатые организмы. -Высокое содержание ФЭ у таких цианобактерий определяется конститутивным синтезом пигмента. "Пурпурные" пресноводные формы встречаются реже.

Изучение цианобактерий данной пигментной группы важно по ряду причин. Во-первых, высокое относительное содержание ФЭ предполагает особую организацию основного светособирающего комплекса, что интересно в плане изучения эволюции и поливариантности оксигенного фотосинтетического аппарата. Во-вторых, ФЭ-содержащие "пурпурные" цианобактерии, которые обитают в зоне умеренного климата, в настоящее время крайне слабо исследованы, и их анализ может расширить существующие представления о биологическом разнообразии и географическом распространении оксигенных фототрофов. В практическом отношении они могут рассматриваться как источник ФЭ для изготовления флуоресцирующих зондов, находящих применение в иммунодиагностике (ФБП отвечают весьма высоким требованиям, так как удается регистрировать специфическое излучение даже от отдельных молекул, см.: Glazer, 1984). Наконец, они весьма перспективны в парфюмерном производстве и кондитерской промышленности, где очевидна тенденция перехода от искусственных красителей к природным (Guerrero et al., 1990).

Целью настоящей работы является комплексное исследование ФЭ-содержащих "пурпурных" цианобактерий, основным источником выделения которых служит фитопланктон пресноводных водоемов Северо-Западного региона Российской Федерации.

В задачи работы входили создание коллекции и анализ

- клеточной морфологии,

- улыраструктуры ламеллярной системы,

- качественного состава и количественного содержания ФБП,

- способности к адаптивному синтезу ФБП,

- организации ФБС

культивируемых ФЭ-содержащих "пурпурных" штаммов, а также рассмотрение вопросов эволюционной физиологии и классификации цианобактерий данной пигментной группы.

Глава I. Обзор литературы 1.1. ФБП

ФБП- это пигменты, обусловливающие характерную окраску красных и криптомонадных водорослей, цианелл и цианобактерий. Эта группа белков имеет ряд особенностей, способствующих их успешному изучению. Прежде всего, ФБП обладают интенсивным светопоглощением в видимой области спектра и яркой флуоресценцией (O'hEocha, 1962). Количество ФБП в клетках цианобактерий может достигать 25% сухого веса, или 40-60% суммарного растворимого белка (Bennet, Bogorad, 1971; Glazer, 1977). Они требуют сравнительно простых методик для выделения и относительно стабильны при хранении. Открытые более 150 лет назад (первые ссылки относятся к 1836 и 1843 гг.), ФЦ цианобактерий и красных водорослей были первыми растительными белками, полученными в чистом виде.

ФБП обнаруживаются как у прокариот, так и у эукариотных организмов. Хотя появление ФБП у эукариот не сопровождалось существенным изменением их молекулярной организации (для С-ФЦ и АФЦ красных водорослей и цианобактерий гомология достигает 70-80%), анализ данных первичной структуры ФБП дает основание предполагать, что они, подобно цитохрому с, могут служить филогенетическими маркерами.

Хромофорными группами этих белков являются ФБ- линейные тетрапирролы, близкие по строению к билинам желчи (биливердину и билирубину). Хромофоры ФБП ковалентно связаны с апопротеинами типа глобина.

Классификация ФБП, принятая в настоящее время, учитывает специфическую окраску этих соединений и их химическую структуру.

Описаны три основных класса ФБП: ФЭ- красные пигменты с максимумом поглощения при 565нм, ФЦ- синие пигменты с максимумом поглощения при 620нм и АФЦ- сине-зеленые пигменты с максимум поглощения при 625нм (табл.1).

Данные спектрометрии принято использовать как критерий чистоты и нативности ФБП. Спектры поглощения ФБП четко отражают различные межмолекулярные взаимодействия, в них выявляется связь между оптическими свойствами молекулы и ее химической структурой. Характер спектров поглощения ФБП зависит от многих факторов, к которым относятся: (1) число конъюгированных двойных связей в молекулах хромофоров, (2) качественный и количественный состав хромофоров и апопротеинов, (3) геометрия хромофоров, обеспечиваемая ковалентными и иными взаимодействиями с апопротеином, (4) ассоциация с белковым микроокружением, результатом которой может быть протонирование/депротонирование хромофоров и образование полярных и гидрофобных связей, и (5) экситонное взаимодействие сближенных до малых расстояний хромофорных молекул.

Исследование иммунохимических свойств ФБП позволило разделить последние на три класса неродственных белков. К первому из них относятся АФЦ и АФЦ В. Они не проявляют высокого иммунохимического родства с другими ФБП. Второй класс составляют С-ФЦ, 11-ФЦ и ФЭЦ. К третьему классу принадлежат В-, С- и Я-ФЭ. Иммунологическое родство проявляется также при сравнении ФБП цианобактерий и красных водорослей, что свидетельствует о высокой степени консерватизма их антигенной структуры.

Таблица 1

Распространение и спектральные характеристики ФБП цианобактерий и красных водорослей ( по: Стадничук, 1990)

ФБП Максимум Распространение

поглощения, нм

АФЦ 650, 610 (плечо) Универсален

АФЦВ 671, 618 Ряд штаммов цианобактерий (типичен для

АпаЬаепа эр. и БупесИососсиз эр.)

С-ФЦ 615-625 Цианобактерии, некоторые виды красных

водорослей

Я-ФЦ 620, 555 Большинство красных водорослей

И1-ФЦ 533, 554,615 Морские ЭупесИососст ер.

ФЭЦ 568 Ряд штаммов цианобактерий

С-ФЭ 560-565 То же

Ь-ФЭ 545, 563(плечо) Некоторые виды красных водорослей

В-ФЭ 498, 545 То же

Я-ФЭ 498, 540, 565 Большинство красных водорослей

Си-ФЭ 498, 540-565 Ряд штаммов цианобактерий (преимущественно

морских)

Молекулы ФБП содержат как общие для каждого класса, так и специфические антигенные детерминанты. Кроме того, антигенные детерминанты полипептидных цепей ФБП существенно отличаются друг от друга. Хромофорные группы располагаются внутри белковых глобул и не взаимодействуют с антителами (Стадничук, 1990).

В клетках цианобактерий ФБП присутствуют в различных сочетаниях, что позволяет отнести изученные штаммы к нескольким пигментным типам (рис. 1). Цианобактерии первого типа содержат только АФЦ и С-ФЦ; эта группа является наиболее многочисленной. Штаммы второго типа помимо названных синих пигментов содержат ФЭЦ, однако основным ФБП остается С-ФЦ. Третий тип можно определить как "С-ФЭ содержащий", причем количество ФЭ в клетках достигает 90% суммы ФБП. Четвертый и пятый типы - это те, у которых вместо С-ФЭ имеется один из Си-ФЭ. Наконец, шестой тип характеризуется одновременным присутствием С-ФЭ и Си-ФЭ.

i тип

II тип

III тип

IV тип

V тип

VI тип

си-оэ

С-ФЭ

С-ФЦ

АФЦ

Рис. 1. Типы сочетаний ФБП у цианобактерий (по: Стадничук, 1990).

1.1.1. Хромофоры

Хромофорными простетическими группами ФБП служат линейные тетрапирролы - ФБ. Окраска этих соединений определяется протяженностью системы конъюгированных двойных связей: при увеличении резонансной структуры главный максимум поглощения смещается в коротковолновую часть видимого спектра.

На положение максимума поглощения билинового хромофора влияет конформационное состояние последнего и характер его взаимодействия с апопротеином (Grossman et al., 1993а). Образование ковалентной связи с апопротеином модифицирует структуру ФБ. Заметное влияние на спектр поглощения оказывает также хромофор-хромофорное взаимодействие внутри ФБП.

Известно четыре вида ФБ (рис. 2). Наиболее распространенным является ФЦБ, он встречается у наибольшего числа ФБП. Наименее распространен ФБВ, обнаруженный лишь в составе ФЭЦ.

Хромофоры ФЦБ и ФЭБ по химической структуре являются изомерами, различающимися только положением двойной связи: у ФЦБ она находится в метиленовом мостике между пиррольными