Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение факторов устойчивости пшеницы и эгилопса в септориозу

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение факторов устойчивости пшеницы и эгилопса в септориозу"

РОССПСКАЯ АКАДИ6И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИ ЯАУЧНО-ШЖДОВАТЕЛЬСКНН МЙСТЯТУТ ЗАЭПЫ РАСЯИЯ

На правах рукописи

МАКСИМОВ Игорь Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ УСТОЙЧИВОСТИ ШЗЕНИЩ И ЭГКЛОПСА К СЕПТ0РИ03У

Специальность: 06.01.11- Защита растения от вредителей и болезней

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ШИТ- ЦСТЕШШ' 1994

л а

* (- ~ ;)

Диссертационная работа выполнена в Отделе биохимии и цитохимии Уфимского научного центра

Научный руководитель - доктор биологических наук Ямалеев А.М. Официальные оппоненты :

доктор биологических наук Громова Б. Б.-О. доктор биологических наук Одинцова И.Г. Ведущая организация - санкт-петербургский государственный аграрный университет

Защита состоится « 23 » июня 19э4г. в 10 часов на заседании Специализированного совета Д.020.01.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу:

189620, Санкт-Петербург, Пушкин-6, шоссе Подбельского, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке научно-исследовательского института защиты растений

Автореферат разослан .....199^'г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Наседкина Г.1.

ОЬЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Септоркоз, вызываемый фитопзтоген-нкм грибом Sepxorla nodorum Berk, является одним из распространенных

и ВрбДОКССНЫХ 33iОЛ^1 В2Mlii* IHiJw*П*Ц12• П*"*»! ПО*"1Klil* П216К2?ЦЫ ЭТС!» öO~~

лезнь» происходит снижение величина многих структурных компонентов урожая, вследствие чего его общие потери могу? достигать 60%. Наиболее рзпространекным методом борьбы с этим патогеном является химическая защита растений. Однако более предпочтительным для сохранения чистоты биосферы является создание сортов пшеницы, обладающих устойчивость» к патогену. В то ке время, интенсификация растениеводства приводит к упрощению таксономического состава возделываемых культур. При этом, сводится к минимуму состав вездедаваемых сортоЕ и снижается га генетическое разнообразие, что может приводить к массовым зпкгхктотиям болезней. Поэтому, изыскание в мировой флоре устойчивых к фитопатогенам форм среди диких и полукультурных видов _ пшеница, которые могут послуяить исходным материалом в создании нсвах болезнеустойт/.вых сортов, имеет первостепенное значение в селекции на иммунитет.

Молекулярные механизмы устойчивости пшеницы к септориозу nccüa-доввны крайне слабо. Считается, что устойчивость к пзтоге'Лу носит неспецифический характер. При этом, факторы неспецюйпеской устойчивости пгеницы к септориозу и их еозм.„<ная регу.у.я'ция также не изучены.

Цель и задачи исследования. Целуз исследований было комплексное изучение полиплоидных panes паеницы и эгилспса на устойтл-вость к септориозу, в свя.га с задачами практической селекции в toc-ноуральском реп'онв, а также выявление физиолого-бкохимических механизмов устойчивости пшеницы к патогену S. nodorum Berk..

В соответствии с этим оали поставлены следующие задачи:

- изучение популяции S. nodorum Юмъ уральского региона;

- »миологическая характеристика полиплоидного ряда эгилопса и пгешг i на уст йчивость к септориозу;

- изучение ге::офок.,а мягкой гшенкца в отноаежш к патогену для выявления эффективных ис 'очников устойчивости;

- выявление защитных механизмов растений пленицу при пораженки септориозом.

Научная новизна исследований. Впервые в услсеиях ~сного Урала изучена популяция S. r.odor л ЕегК. Выделены и охарактеризованы от дельные изеляты патогена.

На болъася экспериментальном материале (IC60 сбрэзцсь)в различных природных условиях асследованз роль гвнодаз га&нщя и згнлопса ь oöecnf :ении устойчивости г. возбудителю ссггориоза.

Обнарукено ионообменное связывание анионных изоформ пероксидаз с хитином - осноеным структурным компонентом клеточной стекки фито-патогенных грибов, .го предполагает возможность участия этого изо-фермента в проявлении неспецифическкх защитных механизмов растения пшеницы к септориозу. Установлено, что лектин пшеница повышав, преоксидазную активность при взаимодействии фермента с хитином.

Практическая значимость работы. Впервые проведены комплексные исследования 22 видов полиплоидного ряда Triticum (571 образец)и 23 видов полиплоидного ряда Aegllops (509 обрззцов) на устойчивость к септориозу (S. nodorum. Berk.).Выявлены устойчивые формы среда видов пшениц и эгилопса, которые могут послужить донорами устойчивости культурной пшеница к возбудителя септориоза и способны обеспечить эффективную резистентность пшеницы к данному заболевании в регионе.

Результаты исследований вносят определенный вклад в познание молекулярных механизмов защитных реакций растений и расширяют знания, необходимые для успешного решения практических задач биотехнологии и селекции растений на устойчивость к болезням.

Впервые проведены комплексные исследования защитных механизмов пшеницы при поражении септориозом. Предложен метод хроматографии растительной пероксидазы на хитине, который может найти применение в проведении работ, связанных с изучением этого фермента.

Апробация работа. Результаты работа докладывались и обсуждались на 1 Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1991),2 Всесоюзном семинаре по юмуноферментному анализу фктогормонов (Уфа, 1991), III съезде ВОФР (С.-Петербург, 1993), IV съезде ВОГКС (Минск. 1992), И Республиканской конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1993), международных конференциях "ITERLEC-14" (Calcuta, 1992), "ШЕРг£С-15" (Szeged, 1993), научной конференции "Эффективные 'приема воспроизводства плодородия почв, совершенствование технологий возделывания, создание и ьнедрение новых сортов сельскохозяйственных культур" (Уфа, 1994). По материалам диссертации опубликовано II печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и г'шодов. Работа изложен^ на 145 стр. машинописного текста, содержит 19 рисунков, I? таблиц, список литературы, включашяй 241 работу и приложение на 56 стр.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИИ.

Объектом, нз котором проводились исследования, бил', растения родов ТгШсия Ь. и Ае^Иорз Ь.

В лабораторных опытах поверхностно стерилизованные семена проращивали нз стерилизованных субстратах в комнате нз СЕетошощэдке (фотопериод 16 ч, освещенность 12-16 тыс. лк.).

Заражение растений проводили опрыскиванием их суспензией спор (1 млн/ мл) в стерильной дистиллированной воде с 0,15 Твин-20 [Соске, 19701. Для этого использовался изолят патогена Еыделеныя из местной популяции гриба,а также смесь распространенных в восточно- . европейской рарнине изолятов гриба предоставленных сотрудниками ВНИИФ (Больше Вязекы) Гогава Т.И. и Пыжиковой Г.В.. Развитие болезни оценивая! по площади развития инфекционных пятен яа листовой • поверхности, в условиях лзборзтории з отрезках листьев и в полевых условиях на третьем и флаговом листе, а также на колосе.

Для изучения функциональной активности ядер клеток пшеницы исыльзовался цитсфлуорометрический метод с применением акридинового оранжевого (Сердюк, 19861.

Содержание ИУК и АБК в растительном материале определяв методом иммуноферментного анализа (ЙФА), описанным Кудояровой Г.Р. с соавторами (Кудоярова и др., 19863.

Для определения содержания АЭГ. использовали метод ИФА разработанный в яагей лзборзтории 1Хайруллин и др., 1992).

Ферментные экстракты свободней, клеточностеночной и ионосвя-заяной пероксидаз получали с методике Е'гезУл и М111ег 119741.

Изсфермзнты персксадази определяли с -рименением изоэлектрофо-хуссирования <ЮО) белков ь полиакрилзмидном геле (ПААГ). Перокси-дазйзя активность определялась с помощью специфических субстратов в присутствии герекиси вогородз

'.таты закладывались в 3-х повторах ели воспроизводились. Ко^ттъатерауй статисткчееху» обработку данных проводили по стандартным ^рогрзгглам. :.'з р;:сукхах показана сиибка средней.

РЕЗУЛЬТАТУ И ОЕОУЩШКИЕ

' .Изучение распространенности септоряоза в ЮКноуральс..<5и регионе. Нами Сыл проведен анализ рзстителлюго материала с симптомам листового поражения сет:дзтяюзем зслучзЕнмги из районов хгр-^к-

теркзуккдахся различными эколого-геогрз^'ле скими особенностями.

АЛ г» па ллоошш rtt» тж гт/л поо r>r»u vtit <рот-1Пт»»гл»г>»#а Сл irv»<n*ur»v/>ft

y'JWVIWMWUUtUtM WbCML*« it^fi+t-K^ Hj Л U IVJb/^/nlWI'llli WotlVVW * J Vll.4lUUtWltWI|

возвышенности, СеБерноЯ лесостепи, ПредурзльсксЯ степи. Методом ИЗОЛЯЦЖ ПЙТСГеКЗ КЗ КИфЩИрОЕЗННЫХ ТКЗН8Й И КуЛЬТИЕКрОВЗКИЯ микроорганизмов на кзртофельно-глюкозн^м агаре из растительного материала собранного нами было выделено я идентифицировано несколько видое фитопзтогенов из которых наибольиее распространение имели Еызывзюцие фуззриозно-гельминтоспориозные пятнистости и септориоз. Нами замечено, что септориозкые пятнистости рзспрострзненные е Кжно-уральском регионе вызывзются двумя еидзми септориальных грибов, из которых наибольиее распространение име.\ гриб £. nodorai.

2.Устойчивость к септориозу и геномный состав пшеницы и эталоне». Имунологическая характеристика полиплоидного ряда TRITICUM.

Подрод Trltlcum. Секция URARTU, включающая одноименный вид Т. urartu. показала Еысокую устойчивость к патогену, за исключением 2-х образцов, у которых поражение Флзгоеого листа в полевых условиях превышало 20%.

Секция DIC0CC0IDES состоит из двух групп еидов - полбы и голозерные тетрзплоиды. Виды секции проявили восприимчивую реакция к пзгогену за исключением T.dicoccoldes. Отличительной чертой полб является высокая устойчивость колоса к патогену.

Секция TRITICUM включает две группы видов - спельты и голозерные гексаплоиды. Спельты проявили относительно устойчивую реакцию к порзжению патогеном, а голозерные гексаплоиды сильно поражались. Необходимо отметить, что единичные обра?цы Т. compactum. были устойчивы к S. nodoruni.

Подрод Boeotlcua Mlgusch. et Doroi. Секция M0N0C0CCUM состоит из однозернянок и голозерных дипловдов. Секция отличается -етероге нностью по устойчивости к патогену. Среди образцов вида Т. boeotlcum были образцы, на которых патоген развивался слабо (К-14384 и К-1S424), и образцы сильнопоражаемые. В отличие от этого вида Т. monococcum более устойчив к септориозу.

Секция TIMOITEEVII состоит из двух груш видов - полбы и голозерные тетрзплоиды. Вида этой секция тысокоустойчивы к S. nodorura. Голозерный тетраплоид Т. mllitlnae показал средневосприимчивуо реакцию к септориозу колоса.

Секция Klfcarae состоит из группы видов спельта, включающей единственный вид T.klharae характеризующейся устойчивость» к патогену как в поле, так и в условиях лаборатории.

йьшунологяческая характеристика видов рода Aegilopa.

Секция POLíEIPES Еклкчает в сбой состэе 9 видоз среда которых наблюдаются некоторая вариабельность по признаку устойчивости к возбудителю. Так вида Ае. irabellulata, Ае. oyata, Ае. trlarl3tata, Ае. colunnarls, Ле. blimclalís были восприимчивы к патогену. Виды Ае. Kotschyl, Ае. variabilis, Ае. triunelalla, Ае. recta, в основ-НСМ t OiiJH* ¿'СТСЙЧКВУ К ВОЗОу>íí*Tdлю евгттерцезз.

Секция CYLINDROPYHUM состоит из 2х видов, характеризующихся наличие.*, образцов с высокоустойчивой реакцией к патогену

Секция SITOPSIS включает пять видов которые различаются по устойчивости к патогену. Так Ae.longlsslma, Ае. sharor.ensls, Ае. blcornls поражались патогеном в средней а в некоторых случаях сильной степени, тогда как Ае. speltolúe3, Ае. auaherl были устойчивы к патогену.-

Секция VERTEBRaTA. еключющзя 5 в""ов характеризуется восгтриим~ чнвой реакцией к патогену. Однако имеются л васокоустойчивыв образцы. Так на образцах К-493, ;.-494, К-333 из Нагорного Карабаха пато-rei- развивался слабо

Ге:;с:л1 шеищи я эгилопез и их роль а проявлении устойчивости к возбудителю септориоза колоса птешщц. Гексаплоидные пшеницы включают три генома: AUBD. Геном Аиведет свое происхождение от дикой однозернянки Т. 'arartu ГКонэрев и др., 1974; Dvorak et al., 19831. Э^пт вид проявил высокоустойчигуа реакцию к септориозу в полевых .условиях, а в лабораторных - среднюю восприимчивость. Геном В происходит от видоз секции Sytops 1з рода Aegllops (КснараЕ и др., 1976!. Объедигение генома /и с геномом эгилопса Ае. longlsslma из секции Sltlpsls привело к становлению тетчаплоидинх видов пшениц с геномным состаьом А"В (Конарез, Пеневэ, 1975; Мак-Кей, 1989; Яу-коесупй, 1976]. Порученные нами результаты по оценке ендов секции Sltopsls (таблицы.I и показывают гетерогенность как в целом секции, так и внутри видов по устойчивости к S. noderúa. Можно заметить, что соразцы Ае. longlsalira, Ае. blcornls обладает слабой устойчивостью к пдтегену. Характерной особенность» Ае. long!s3lma явл-зется гысокчя устойчивость колоса. Тетрзплоидные поллч с геном-14!" co"t8eom <.UB проявили довольно восприимчивую peí'"'/,".!.) к !тг1т0-гену. Вероятно, еосприкмчиь.:ть тетраплоидов с геномом A'Jb объяс-НЯ0?"Я тем, что ь формировании первичных тетрзялоидсн участвовали восприимчивые ттредковые форп Т. urartu а/или Ае." loruglealma, а высокая коло^сгая устойчивость, вероятно, прквзгесена от стоил предкоя.

Таблица I

Кэдунологичесхзя характеристика предположительных доноров геномов пшеницы

к возбудителю септориоза

Взд 2п Геном % образцов с иаллом поражения

Полевые исследования Лабораторные исследования

Всего изучено образцов 1 2 3 4 Всего изучено образцов 1 2 3 4

I Т. игат. и Аи 9 22.0 55.6 22.2 — .8 12.5 25.0 37.5 25.0

2 Ае. 10П£1!5Ч1!ГЛ 14 Б1 7 — 14.3 58.2 28.5 6 16.6 16.6 66.6 —

3 Ае. 8йагопепз1э 14 8аИ 4 — 75.0 25.0 — 2 — — 100 —

4 Ае. Ысош1з 14 БЬ 3 __ __ 33.3 66.7 1 __ — — 100

Ае. 1аизсЬ11

5 ззр.гаизсЬП 14 С 37 — 8.1 51.3 40.6 32 3.1 25 31.2 40.6

б ззр^гапяиШа 14 Б 60 13.3 50.0 31.7 5 .0 58 18.9 20.8 25.8 34.5

7 Т.ЬоеоПсш! 14 АЬ 7 - 20.0 60.0 20.0 7 44.0 - ' 14.2 42.8

8 Т.йопососсиш 14 АЬ 20 10.0 70.0 20.0 - 6 16.6 83.4 - -

9 Ае. зреПо1с1ез 14 Б 14 57.0 21.0 21.0 9 77.8 22.2 — —

10 Ае. аисЬег! 14 Б 3 ¿3.3 66.6 — — 1 —Т — 100 —

Таблица 2

Иглтаологаческзя характеристика секций рода ТгШст и АедИорз к возбудители септориозз

"ид 2п Геном * образцов с баллом поражения

Полэшв исследования Лабораторные исследования

Всего 1 2 3 4 Есего 1 2 3 4

кзучеио изучено

образцов образцов

ГгШс» £3

I игаПи 14 1 и 9 22.0 55.6 22.2 — 8 12.5 25.0 37.5 25.0

2 Мсоссо1(1ез 28 АиВ 216 5.5 27.6 42.3 24.4 138 5.0 11.6 36.2 47.2

3 ТгШсип 42 АиВЙ 291 4.8 18.9 36.4 39.9 89 2.2 20.2 43.8 33.8

'« ЙСР.СОССиГ! 14 А° 28 7.1 ЬО.0 32.1 10.3 14 28.5 35.9 7.1 28.5

5 Т1порПееу11 28 АЬ0 26 50.0 42.3 7.7 — 18 55.5 <14.5

6 К1Ьзгзе 42 А°йЬ 1 100 — — — ■ 1 — 100 —

Aegllops

1 Ро1уейез Си-С13 295 1Л 28.8 . 43.4 26.1 106 30.2 23.6 25.5 20.7

п с. ' СуИпйгоругия и -ии 63 8.2 49.2 33,2 9.5 57 43.8 15.8 28.1 12.3

3 сот^орутга И 2 ~ 50.0 50.0 — 2 50.0 - - 50.0

4 БПорз! 2 31 27.5 17.2 31.0 24.3 29 27.5 17.2 31.0 24.3

5 УзгХеЬгага ¡НХ2! 118 6.7 25.4 29.6 38.3 _и 104 11.5 23.0 31.0 34.5

Переход тетраплоздов с геномным состзеом а"в на гексзплоидный уровень связан с присоединением генома D. Считается доказанным, что носителями исходного генома D являются представители вида Ае. tauschll [Конарев и др., 1974; Peacock, 19811, состоящего из двух рззясвядаэстйй: Ае. tauschll ssp. i-ausbll и Ае. tauschll ssp. strangulata. Эти разновидности существенно отличзлись друг от друга по устойчивости к сегчзриозу. Подвид asp. strangulata более устойчив к S. nodorum и в пределзх разновидности имеются образцы, на которых патоген слабо развивается.

Перспективными для отдаленной гибридизации являются образцы близкородственного с Ае. tauschll вида Ае. cylindrlca, которые могут образовывать в естественных условиях спонтанные гибриды с мягкой пшеницей (Зигберман, 19711. Анзлиз устойчивости к септоркозу выявил Еысокоустойчиные образца Ае. cylindrlca с отсутствием развитая патогена на растениях.

Предполагается, что донором генома А^ подрода Boeotlcua является предковзя фор;,13 вида Т. boeotlcua [Конарев и др, 19741. Образцы этого вида были слабоустойчивы к s.nodorira. Особенно отчет.яиво это проявлялось при изучении развития болезни в лабораторных условиях. Культурный днпловд Г. пгапоеоссия был устойчив к патогену. Переход на тетраплоидный уровень в пределах данного подрода произошел благодаря присоединению к геному Л*? генома G, донором которого является предкоЕзя форма Ае. speltoides или близкородственная Ае. ausherl {Конарев и др., 19711.

Изучение секта? Tlmopheevll выявило высокую устойчивость представителей этой секции к септориозу колоса. Однако, среди образцов этой секции имелись и восприимчивые формы. Другой представитель тетраплоидоч с геномной структурой AbG, - культур:^. вид Т. tlmopheevll характеризовался высокой устойчивостью к патогену. Голозерный мутант Т. tlmopheevll, Т. militlrae показал слабоустойта-вую реакцию. Присоединештем генома Д от Ае. taushli ssp. strandulata к одному из обрззцов Т. tteopheevl получен исскуствен-ный вид Т. klhai^e, характеризупшйся устойчивой к изучаемому пзто-veny реакцией, что несомненно свя-знс с влиянием генома G.

-93. Некоторые иолекулярные иеханизмн устойчивости пшеницы к

септориозу.

Исследование фитогормонов ИУК и АБК в механизмах устойчивости пшеницы к септориозу. Известно, что ответ растения на разные стрессовые воздействия среда, и в том числе патогенез, регулируется фитогормонами [Муромцев и др.,19871. В сеязи с этим, мы исследовал;: количественный баланс фитогор. энов ИУК и АЕК в проростках контрастных по устойчивости к септориозу сортоз яровой пшеницы при инфицировании их Б. псбогия. Заражение проростков восприимчивого сорта пшеница Саратовская 29 грибом Б. побогит приводило к подъем!' содержания ИУК на вторые сутки после инфицирования в 1,6 раза, затем уровень фатогормона резко снижался до контроля, после чего вновь происходило постепенное и значительное . накопление ИУК в Сольных растениях. В проростках устойчивого сорта Диамант кз третьи сутки после заражения содержание ауксинов погашалось в 4,6 раза по сравнению с контролем, затем падало и в погпедупцие сроки фиксации существенных отличий от контроля в содержании ИУК не наблюдалось.

Повышение содержания ИУК в конечные стадии патогенеза на восприимчивом сорте Саратовская 29, лероятно, подразумевает подавление защитных реакций растения-хозяина. В отличие от этого, отсутствие различий е содержании ИУК в контрольных к инфицирозан-них проростках устойчивого сорта в конечные стада патогенеза предполагает включение определенных механизмов устойчивости, в которых, вероятно, ауксин играет немаловажную роль.

Во взаимоотноиениях пшеница - 3. побогия нгми изучалась также динамика содержания АЕК, которая является, наряду с ИУК, регулятором определенных кетаболичзских процессов в клетках. Нами выявлено, что на 2 сутки после заражения наблюдается увеличение у^вня АБК ь 3 р'.Зо в восприимчивом сорте Саратовская 29 и более чем на порядок в устойчивом сорте Диамант, в сраЕнекни с контролем. В последукепэ даты фксзции на.»« не наблюдалось существенно: изменений ь уровне АЕК в инфицироЕанкых растение относительно контроля как в устойчивом, так и в восприимчивом сорта*. Резкое с>г,е ккания \ЕК в начале инфицирования, вероятно, связано с разьим-;.'. здатных реакций растения (Косзковская, Маяд-збу-

Известно, что сспряженносг! изменения концентрации ИУК и - АБК

Рис.1. Динамика отношения ИУК/АБК в заражениях Б. пойогап проростках тшеккца. в % к контролю (100%). Сорт Саратовская 29 (---); Сорт Диамант (-—).

соответствует представлениям о взаимовлиянии концентраций ©:то-гормонов, определяющих гормональный статус растения [йаПаЬ'лу, ЫогШоз, 1985; Акимова, 1938 Усмзнсв и др., 1990; ]. В связи с , этим, нами был проведен сравнительный анализ баланса ИУК'АБК в тканях устойчивого и восприимчивого сортов пшеница при патогенезе, в сравнении с этим показателем у контрольных растений. На рис. 1 показано изменение этого показателя в ходе патогенеза. В начальные фаз- развития патогена гормональный баланс у обоих сортов сдвинут в сторону повышенного содержания АЕК. В последующие фазы патогенеза происходит сдвиг эт го показателя в сторону повы-сенного содержания КУК. Несмотря на тс, что содержанке ИУК в проростках устойчивого сорта на поздних стадгтх не превышает уровня контрольных растений, тенденция к повышению отношения ИУК/АБК наблвдзется при септориоз«? на обоих сортах. Существенный подъем этого показателя в восьризгмчлвом сорте псхазывает глзбув сбалансированность метаболических процессов в растении. На устойчи-

Рис. 2. Характер изменения отнесения ИУК/АБК в р-'чвивакщихся зерновках лиеницы сорта Саратовская 29 под влиянием . септориоза колоса в сравнении с контролем (100%).

вом ,:орте при аналогичном характере изменения баланса фитогормо-нов, амплитуда колебания слабее, что может свидетельствовать о его больней гомеостатичности, по сражению с восприимчивым.

Известно, что ©¡тогормоны участвует также в регуляции форми-роЕания репродуктивных органов растения [Понтович, 1978; Чзйла-хян, 19391 , когда есть больаая вероятность поражения колоса сеп-ториозом. В связи с этим, мы исследовали характер из?генекия содержания свободг-шх ИУН и АБК в зерновках пшеницы сорта Саратовская 29 в ходе созревания семян при инфицировании Колосьев Б. пойогиа для выявления специфичности гормонального баланса ИУК/АЕ. В ю^з патогенеза. Ин^кш^рс-Взние колосьев проводил:! на б-й день после массового цветения ппеницы. Колосья с рззвивакцимися семенами Фиксировались на 7, 8, 9, и, 21 я 27 дни после цветения (1, 2, 3, 4, 5, и б, точки фиксации).

Исследование показателя отношения ИУК/АБК в ходе патогенеза в сравнения с этим показателем у контрольных растений показало, что, как и в случае с проростками, .в колосьях инфицированных растений происходит изменение отношения ИУК/АБН от высокого содержания АБК в начальные фазы инфицирования до многократного пре-ишения содержания КУК в последуйте фазы пзтогенеза (рис.2). Вероятно, накопление ауксинов в растениях при патогенезе, вызванном Б.побогиш, является особенностью паразитированкя этого гриба на пшенице и может быть связано как со способностью гриба продуцировать МУК в среду гкобыльский и др., 1969), так и "принудительной" индукции грибом накопления собственно растительной КУК.

ИУК/АБК, % 450

400

350

300

250

200

150

ЮоЦ-рр-г

50

II

I 2

Точки 5 2 фиксации

Роль пероксадазы в устойчивости пшеницы к септориозу. Перокси-даза(ЕС. 1.11.1.7.)- фермент, широко распространенный в жкеых организмах. Изменение активности фермента может быть показателем ответа растения на стресс [Gordon, et al., 1983]. В свяьи с этим, проводились детальные исследования активности пероксидазы различной локализации в клетке, а так ж« динамика активности изоформ при заражении контрастных по устойчивости к S. nodorua сортов пшеница.

, На рис.3 показано изменение удельной активности пероксидаз.. е контрольных, и зараженных S. nodorvm проростках пшеницы. Можно заметать, что уровень активности пероксидазы в интактных растениях устойчивого сорта Диамант превышал значение этого показателя у восприимчивого. Заражение вызывало повышение активности фермента как на восприимчивом, так и на устойчивом сортах, причем, в устойчивом сорте наблюдалось резкое накопление удельной активности пероксидазы при патогенезе, тогда как на восприимчивом сорте эта изменения происходили с запаздыванием.

В дальнейшем, в зараженных растениях нами определялась активность фермента с различной локализацией в клетсах растений -свободной , ионносвязанной и связанной с клеточной стенкой (соответственно экстрагируемой 0,1 М фосфатным буфером, 1 М NaCl и экстрагируемой из клеточных стенок растений после их обработки целлхаазой и пектиназой). Оказалось, что при патогенезе происходит более сильное повышение активности ионосвязаниой и ¡слеточ-ностеночной пероксидазы, в сравнении с растворимой.

Одной из характерных особенностей пероксидазы является множественность молекулярных форм, присутствующих в растительной клетке (Титов, 19753. При этом, роль отдельных изоферментов в метаболизме растительной клетки, в том числе и при патогенезе не известна (Ito et al., 19911. В связи с этим мы провели анализ изменения активности изоформ пеооксидаа- при заражении устойчивого к септориозу сорта Диамант. На рис. 4 показано изменение изофэр-ыентных спектров контрольных и инокулированкых проростков. Как видно, инфицирование растений патогеном приводит к усилению активности анионых пероксидаз и не наблюдаются различия в акткчности катионных изоформ. Такая же закономерность проявляется и на восприимчивом сорте, но при этом степень активации анионных изоферментов при патогенезе значительн ниже, чем у устойчивого сорта.

Интересными, на наш взгляд являются работы, проведенные по взаимовлиянии фитогормонсв и пероксидаз. Известно, что ауксин и

4.0 Э.& 3.4 3.0

?.е 2.2 i.aj

1.4 1.0

I.& 1.4 Г.О 0.6J

ед/г. Оелхэ

"5-1-I I Г

I

т

л

f^-f- -i

1-I Y

т^'т

-Дни пселе зарагеяяя

Дня посла * ззрааянля

Рис.З. Динамика удельной сктжтюстл перокелдазц в контрольных (—) и зарзжетпих {■— ) S. r.cdona проростках пленили устойчивого сорта Диамант (а) и восприк-янвого Саратовская 29 «3)

ЛБК ¡гогут регулировать пероксидззяув активность, через усиление синтеза еРКК фер.;ента [Pennon, et al., 19703. Вероятно, наб.:вдае-!шэ кг;,я изменения в начальные фазы развития болезни в уровне КУК и ДЕК также могут приводить к активзщг! (синтезу) анионных пе-роксидаз. В дальнейшем, после запуска защитных механизмов, снижение содержания КУК до уровня контроля когэт происходить за счет временного включения пзроксидззно-сксадазной систеш, деградируп-щей фатогораокы з более шсокоЯ степени з тканях устойчивого сорта, в сравнения с восприимчивые.

beCÖ

"lcymf

SWS KBS

ПЯЙ

sm

tssx

SSE

pH2ß

Y pH 11,0

г сутки

3 су«и

Icytcn

Рис.4. Изсферментные спектры пероксидаз контрольных (К) и инфицированных (0) спорами S. r.odorua проростков пшеницы сорта диамант зафиксирован!« на 1-4 сутки после заражения

Активность: .-1 слабая;

средняя;

■2ЕЭ

сильная

Еыявление способности ашюкых пероксидаз псеницц связыватся с хитиноц. ПоЕыаение патогензависикой активности анионных изофер-иентса пероксидазы мо^зт произойти вследствие способности этих кзоферментов взаимодействовать с метаболитам патогена и его инфекционными структурами, что должно приводить к локализации этого фермента на месте проникновения шфзкционных образований гриба.

йзвестно, что одним из структурных полимеров клеточной стенки грибных микроорганизмов является хи.ин. В исследованиях Siegel 119571 предполагается, что хитин может служить матрицей для полимеризации фенольных соединений в лигнин с непосредственным участием растительной пероксидазы. При этом известно, что хитин не входит в состав клеток еыссих растений.

В связи с этим, ыц исследоЕали способность пероксидазы ше-пицы связываться с хитином, используя метод жидкостной колоночной хроматографии. Сорбция фермента : »водили в 0,1 И фосфатном буфере pH 6,5. Отмыеку от неспецкфических белков проводили тем же буфером. Затем, проводили злиции исносвязанных белков 1К КаС1. ЙЭФ

ПО

ш.

А1

2,0

11,5

р,,» к электтзоФореграммы изозоэнзимов пероксидззы8пие

шшы после хсс1*атогрзфп1 на хитине: I- обрззец грубого экстракта до 5с?ШЕГет;П - изофетагента не сорбируясиеся на хитин в 0,1 М ОВ; III -образец солевого НаС1) элезтз.

Актиеность: г

слабая; с^яя средняя; сильная

образцов хрсмзтографнческих фракци* показало.

что способностью

непосредственного взаимодействия с хитином обладают анионные пе-рсксидазы. Эксперименты, в которых та определяли степень десорбции изоферментов, в зависимости от концентрации ионов На в среде, используя фосфорнокислую и хлористую соль натрия, показали, что степень (де)сорбции фермента зависит от конкой силы буфера, определяемой концентрацией положительно заряженных :;оков натрия. Таким образом, мы определили, что связь растительного фергзптз с оспсв:т};м углевод}-™! полимером клеточной стенки фитопатогенних грлбоз имеет ионообменный характер.

Известно, что фермент пероксидаза является гликопротеинсм, т.е. содержит в. своем составе колэкулн углеводов [Андреева В.А., 1938]. В рзстениях пненицы присутствует белок - лектин, который способен специфически свягизэться с углеводами. Анализируя оста-точнуа пероксидззнуи ахтавность на- хлтске после десорбции ее раствором 1 М НаС1, мз обнаружили, что часть активности остается после' солевой элисш. ?.!ы предположили, что лектин обладает способность» связываться одним участком с пероксидззой а другим с хитине?«,. в силу чего и остается часть активности пзрехеидазы на хитине после его промывки 1 М НзС1.

Для проверка этого предпологения ми предварительно сорбировала на хйтиз препарат лектккз из ззредетей пшеницу.

В качестве контрольна! вариантов использоезли хитин инкубированный с бычьим сывороточным альбумином (неспецифический белок) и яичным лизоцимом (специфично взаи-модействупций с хитином белок не лекти-новой природа). Затем связанный с белками сорбент инкубировали с пероксидазой. После отмывки сорбента 100 «а буфере»-! определяли активность фермента,

Рис.6. Усиление

W * nwvi« » U^UHIU/I UA *******W * *» __

200- пероксидазы, * пероксидазной актив-

ности на хитине,пред-150- варительно инкубирован-

ной агглютинином зародышей пшеницы Контроль- бычий сыворо точный альбумин (EGA)

100

хитин+

БСА

хитин+ АЗП

связавшегося с ытином при посредничесхво исследеланных белков. На рис.5 приведено распределение активности фермента на сорбенте, с предварительно связанными белками. Как видно, лектин тшеницц может в некоторой степеш; повышать сорбцию пероксидазы на хитин и служить, таким образом, своеобразным посредником в этих процессах.

Известно, что одам из основных механизмов защиты растений от гр::бних фитопатогенов является формирование Еокруг инфекционных структур гриба устойчивого к фермекгзтиеному расцеплен;аз растительного полимера - лигнина (Barber, Ride, ' 19323. Одновременно с этим, при лигилфжации образуются и токсические для грпб-1шх клеток растателышэ метаболиты фенольной природа (Куч, 19853. Этот механизм защиты растений, Ееро.:лзо, приобретает специфическую направленность, благодаря тому, что с пояЕ.'..нием в расти-тельннх тканях микроорганизмов, содержащих хитин иди его олигоме-ры, автоматически появляется мишень для связывания анионных растительных пероксидаз, осувдствляпцих защитную функцию. Ве'юят-ео, таким образом, срабатывает один из главных защитных механизмов растительной клетки от грибных Ситопатогенов, проявляются в нужом месте и в нужное время.

-17-ЗАКЛШЕНИЕ

Сложность селекционной рзботы ззклкчэется в том, что человечеством практически исчерпаны запаса внутривидовой устойчивости к патогенам у Т. аезИпт. Так. нами показано, что из испытанных 205 - только 3 % сортов обладали еысокой степенью устойчивости к септориозу. Е этих условиях представляется обходимым включение в генофонд Т. аезИтит генов устойчивости от близкородственных диких я эндемичных еидов, получивших это свойство в процессе длительной и сопряженной эволюции. Наиболее перспективным в селекции на устойчивость к патогенам является получение линий с эффективными генами устойчивости путем их кнтрогрессии от видов Т. шопссо-ссия, Т.б1сосс1Е!, Т. регз1сия, Т. гаасйз, Т. зре1га, Т. игагги, Т. г1яюрЬеет11. Нельзя забывать, что надежный защитой пшеницы'. от приспосабливающегося к ней патогена является привлечение в селекцию : з иммунитет генов устойчивости от видов рода Aegllopз. .

Реализация привнесенного потенциала устойчивости пшеницы к септориозу затрагивает множество метаболических процессов растения спределякеих кеспещфпескую устойчивость.

Одними из важнейших регуляторов развития устойчивости растений к болезням являются фятогормоны. Исследования гормонального баланса ИУК/АБК в растениях пшеницы при септориозе выявило четкие различия в динамике этого показателя между устойчивом и восприимчивым сортом. При заражении растений происходило накопление ИУК в первоначальные фазы патогенеза, более существенное в устойчиво!-сорте, чем в восприимчивом.

Вероятно, этот процесс вызывает усиление активности ИУК-оксидазной/пероксидазной ферментной системы по типу обратной связи. По всей еидимости, высокий уровень ионо- и козалентно связанных пероксидаз на устойчивом сорте, что нами наблюдалось при патогенезе, вызванном Б. поболи, не позволяет проникать фятогор-ионам патогена в растение и тем самым .задерживает рост и развитие гриба. Восприимчивый сорт характеризуется недостаточным уровнем слеточностеночных и ионосвязанных пероксидаз, который не позеэля-!Т кнзкткЕирсЕэть значительнув часть ИУК, вырабатываемой грибом и татоген, в этом случае, успешно развивается. Есзмохно, что усиле-ше активности пероксидзза, мотет быть также связано с синтезом )ермента "йе поуо" я в этом процессе может принимать участке АБК, [то согласуется с полученными нами результатами, покззыезщими овышение уровня АБК в первоначальную фазу патогенеза.

В наиих исследованиях показано, что при септсриозе происходит активация анионных изоформ ферлента, способных непосредственно сорбироваться на хитине. Исследования показали, что посредником в этом процессе, гложет Еыступать лектин, повышая активность пероксидазы на хитиновой матрице. Это дает основание полагать, что фермент пероксидаза мо*ет проявлять свои защитные свойства в непосредственной близости от инфекционных структур гриба.

. Таким образом, при создании резистентных к патогенам сортов необходимо учитывать значительную роль огромного потенциала неспециЗических защитных механизмов растительной клетки и, вероятно, только сочетание эффективного действия факторов как специфической, так-и неспецифкческой устойчивости будет способствовать успешному решению задач борьбы с болезнями растений.

вывода

1. В Сжноуральском релгоне впервые изучена структура популяции возбудителя септоряоза пшеницы - Б. пойогап. Из 6 агроклиматических зон региона выделены 8 изолятов возбудителя, разлшапциеся по патогенным свойствам.

2. При заражении пшеницы Б. пойогия в растениях происходит существенное накопление ИУК и повышение функциональной активности ДНК ядер клеток, что свидетельствует о гемибиотрофном характере питания патогена.

3. Устойчивость пшеницы к септориозу в основном определяется общими неспецифическими защитными механизмам", включавдими изменение уровня фитогормонов ИУК и АБК, усиление активности ионосвя-занных и связанных с клеточной стенкой пероксидаз, накопление защитного белка лектина.

4. Установлено, что среди диплоидных видов шенкцы, включающих геномы ¿"и аь, высокой устойчивостью к Б. пойогит обладают образцы видов Т. игагги (Аи) и Т. шопососсш (Аь). Вид Т. ЬоеоИсиа является гетерогенным по устойчивости к патогену.

5. Показано различие доноров генома В(Б) по показателю устойчивости к септориозу . Геном Б =0 устойчив к патогену, аге м Б1=В. БЬ=В сильноЕосприимчквы.

6. Сильную вариабельность по устойчивости к септориозу проявил геном Б (Ае. гаизсШ). Подвид гзр. эггап^иШа более устойчив к септориозу по сравнению с ззр. гаизсЫ!.

-197. Впервые показано ионообменное связывание анионных изоформ пероксидазы пшеницы с хитином и их участие в проявлении защитных механизмов растений пшеницы к хитинсодержзщим фятопзтогензм.

8. Впервые показана принципиальная возможность влияния лектина пшеницы на активность анионных пероксидаз при их взаимодействии с хитином, что свидетельствует о многофункцион -ъностя лектинов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

t. В качестве источников устойчивости культурной пшеницы к возбудители септориоза можно рекомендовать изученные сортообрззцы мировой коллекции ВИР: Т. aeativuni - К-37159, К-54654 (Казахстан); К-37407, К-37419 (Северная Осетия), К-5459 (Самара), К-9997 (Германия), К- 45133, К-57073 (Швеция), К-54215 (Англия), К-43152 (Италия), К-19480 (Китай), К -41997 (Кзнзда), К-5'4866 (США), К-46543 (Чили), сорта Диамант, Диас -2, Оренбургская 13, Эритросперум 35; Т. duras - сорта СИТ 88 , Омский рубин. Харьковская 46; Т. мопососсш) - К-20983 (Турция), К-213088 (Италия), К-31683, К-35915, К-35916 (Грузия); Т. dlcoccm - К-7504 (Германия), К-33226 (Ульяновск), К-7356 (Башкирия), К-7507 (Иран), К-7490 (Пермь), К-42065 (Удмуртия), К-12946 (Швейцария), К-38917 (Югославия); Т. turgldm - К-21068 (Турция), К-28661 (Китай), К-21379 (Иран); Т. perslcrm - К-11899, К-31670, К-34563 (Грузия), К-13718, К-17646, К-31810 (Армения), К-32496 (Дагестан); Т. macha - К-28170, К-28168, К-28182, К-28194 (Грузия); Т. spelta -К-1727, К-6539, К-9991, К-6535 (Германия), К-5219 (США), К-205* (Испания); Т. compactua - К-42081 (Китай), К-21937 (Перу), К-37441 (Казаг.стая), К- 39240 (Таджикистан), К-39258 (Киргизия): Т. urartu- U-363347 и и-375567

2. Для белее надежной защиты пшеницы от постоянно приспосабливающегося к ней патогена является привлечение в селекцию .-ia иммунитет генов устойчивости от видов рода Aegllopa с летом иммунологической характеристик! видов к другим болезням. Можно рекомендовать для этого перспективные образца видов секции Slropals: Ае. srpeltoidea - К-2, К-21, К-43, К-646, К-910, К-1015, IC-13H. К-1596; Ае. aucherl - К-449, К-909 (Турция); Ае. longissíma -К-202 (Израиль); Ае. sharonensla - К-203. К-9С5, К-906; Секции Vertebrata: Ае. tauachli - К-603, К-612, К-82. К-141, К-155, К-339, К-340, К-492, Н-493; Секции Cyllndropyrja: Ае. caudata -К-1001;. Ае. cilindrica - К-222, К-218, К-220, К-567, К-556,

К-685; секции Ро1уейез Ае. umbelul3ta - К-816, К-1283; Ае. trlarlstata - К-808; Ае. coluraiarls - К-550; Ае. blunclalls -К-1506, К-267; Ае. variabilis - K-S8; Ае. trluncialls - К-639, К-1182, К-1196, К-1622; Ае. recta - К-891.

3. Метод разделения изофсрм пероксидазы растений, осноезнный на обнаруженном сзойзтЕе э"зимз ионооомекно сеязыезться с хитином, рекомендуется для использования е практике исследований этого многофункционального фермента.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Максимов И. В., Хайруллин Р. М., Шакирова Ф. Ы. Изменение уровня лектина в ходе созревания семян при инфицировании колосьев пшеницы Septorla nodorum Berk.//Изучение и рациональное использование природных ресурсов : Тезисы докладов научной конференции. Уфа : БНЦ УрО АН ссср, 1991.- с.27

2.Иштирякова Ф. К., Максимов И. Б., нмалеев А. '1., Ахметов Р. Р. Связанные формы пероксидазы пшеницы при патогенезе Septorla nodorum // НоЕые методы r биотехнологии растений : тезисы докладов 1 всесоюзного симпозиума (20-22ноября 1991г., г.Пущино)., Пущино 1991.-с.63-64

3. Трошича Н. Б., Максимов И. В., Ямалеев А. М. Содержание ге-терохроматина в ядрах клеток гриба Septorla nodoruai и растений паэ-ницы в сеязи с естественной и индуцироЕэнной устойчивостью к сеп-ториозу // Известия АН, сер. биол. 1992, N 3.- с.462-465

4. Yamaleev A.M., Khalrullin R.M., Kaxlmov i.V. Investigations on wheat lectins: tolerance oí S. nodorum // Book Abatraot INTerlegt 14,- Calcutta.- 1992.- p,62.

5. Yamaleev A.M., Khalru'lln R.M., MaKslmov I.V. Dlnamlcs oí lectin accumulation In wheat seeds by septorla pathogenesis // Book oí INTERLECT 15,- Szeged, Hungary, 1993.- p.36.

6. Максимов И.В., Хайруллин P.M., Безрукова M.B., Шакирова Ф.Ы. Исследование содержания фитогормонов и лектина в связи с "стойчи-востью шеницы к грибным болезням //3-й съезд ВОФР.Тезисы докладов.- Саккт-Петорбург .- 1993.- с. 666

7. Шакирова Ф.М., Максимов V. В., Хайруллин P.M., Безрукова Ы.В. Влияние септормоза колоса на содержание фитогормонов в зерновках пиеницы в ходе их формирования // 2 конференция "Регуляторы роста и

развития растений" Тез. докл.- Москва.- 1993.-е.12.

8. Тропика Н.Б., Максимов И.В., Исаев Р.Ф., Ямалеев A.M. Влияние возбудителей грибных болезней на функциональную активность ядер

пшеницы // Микология и фитопатология, 1992 ,- Т.26(5) .- с.394-397

9. Хайруллин P.M., Шакировэ Ф.М., Максимов И.В., Безрукова М.В., Ямалеев A.M. Изменение содержания лектина, абсцизовой и индоли-луксусной кислот в растениях шеницы иаГицированкых Septorla nodorum Berk. //Физиология и биохимия культурных растений .- 1993. Т.25(2) .- с. 138-144.

10. Максимов И.В., Ямалеев A.M., Устойчивость к септориозу некоторых сортов яровой шеницы // Селекция и семеноводство.- 1993.- N. 4.- С.13-15.

11. Шакировэ Ф.Ы., Максимов И.В., Хайруллин P.M., Безрукова «.В., Ямалеев A.M., о влиянии септориоза колоса на динамику накопления лектина и содержание фятогормоноа в развивающихся зерновках шеницы // Физиология и биохимия культурных растений.- В начата

ГП «Принт* Зак. № Тираж /ос

экз.