Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение эволюционно-вариабельных участков β '-субъединиц бактериальных РНК-полимераз

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарова, Наталья Александровна, Москва

ч V/

г

) о

институт молекулярной генетики российской академии наук

гг

На правах рукописи

ЗАХАРОВА Наталья Александровна

изучение эволюционно-вариабельных участков р'-субъединиц бактериальных рнк-полимераз

(03.00.03 - молекулярная биология)

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.Г. Никифоров

кандидат биологцческих наук

К.В. Северинов

Москва -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................10

1.1. Общие сведения о структуре РНК-полимеразы Е. coli и стадиях транскрипционного цикла.........................................................................................10

1.2.а-субъединица РНК-полимеразы Е. coli.................................................................15

1.3. ß-субъединица РНК-полимеразы Е. coli.................................................................26

1.4. ß'-субъединица РНК-полимеразы Е. coli................................................................37

1.5. a-70-субъединица РНК-полимеразы Е. coli...........................................................48

1.6. Заключение................................................................................................................53

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................54

2.1. Бактериальные штаммы...........................................................................................54

2.2. Источники препаратов геномной ДНК...................................................................54

2.3. Плазмиды...................................................................................................................55

2.4. Питательные среды и условия выращивания бактерий........................................56

2.5. Компетентные клетки и трансформация бактерий................................................56

2.6. Выделение плазмидной и геномной ДНК..............................................................57

2.7. Использование ферментов в молекулярном клонировании.................................57

2.8. Денатурирующий электрофорез ДНК и выделение фрагментов ДНК из гелей.57

2.9. Денатурирующий электрофорез РНК.....................................................................58

2.10. Денатурирующий электрофорез белков...............................................................58

2.11. Олигонуклеотиды и определение первичных последовательностей ДНК.......58

2.12. Цепная полимеразная реакция (ЦПР)...................................................................59

2.13. Делеционный мутагенез гена гроС.......................................................................60

2.14. Сборка РНК-полимеразы из отдельных субъединиц..........................................62

2.15. Выделение РНК-полимеразы Н. pylori.................................................................62

2.16. Определение аминокислотной последовательности белка.................................63

2.17. Моноклональные антитела и иммуноблоттинг...................................................63

2.18. Реакция транскрипции in vitro...............................................................................64

2.19. Реакция абортивной инициации............................................................................65

2.20. Аффинное мечение РНК-полимеразы..................................................................66

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение СООН-концевого эволюционно-вариабельного

района ß'-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli.................................................68

3.1.1. Получение делеций в вариабельном районе гена гроС Е. coli и картирование антигенной детерминанты моноклональных антител................68

3.1.2. Свойства гроС-мутантов in vivo...........................................................................70

3.1.3. Сборка мутантных РНК-полимераз in vitro.........................................................72

3.1.4. Транскрипционная активность мутантных РНК-полимераз.............................74

3.1.5. Расщепление РНК-продукта в тройных элонгационных

комплексах мутантными ферментами.................................................................77

3.1.6. Влияние связывания антител с РНК-полимеразой на

реакцию транскрипции in vitro.............................................................................81

3.2. Исследование структурной организации генов гроВ/С

e-группы протеобактерий.........................................................................................88

3.2.1. Филогенетический анализ участков стыковки генов гроВ и гроС из

s-группы протеобактерий......................................................................................88

3.2.2. Выделение РНК-полимеразы Н. pylori................................................................94

выводы........................................................................................................................юо

ЛИТЕРАТУРА................................................................................................................102

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. ДНК-зависимая РНК-полимераза Escherichia coli играет центральную роль в процессе транскрипции генов бактерии. Это сложный белковый комплекс с молекулярным весом 450 кДа, состоящий из корфермента (а2(3р'), обладающего каталитической активностью, и ст-субъединицы, необходимой для специфичного узнавания промоторов и эффективной инициации транскрипции. Наши знания о функциональной роли различных участков субъединиц РНК-полимеразы весьма ограничены. Мультисубъединичное строение и большие размеры РНК-полимеразы затрудняют применение прямых структурных методов для изучения фермента. Использование рентгеноструктурного анализа пока дало лишь общую форму фермента (Polyakov et al., 1995).

Корфермент РНК-полимеразы может быть денатурирован до отдельных субъединиц и затем ренатурирован с сохранением ферментативной активности. Однако, отдельные субъединицы РНК-полимеразы не обладают каталитической активностью. Сведения о роли отдельных субъединиц получены в опытах по химическим сшивкам, аффинной модификации субстратами, а также в результате генетического анализа мутаций в генах, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы, и изучения дефектов мутантных РНК-полимераз in vitro.

По современным представлениям, а-субъединица РНК-полимеразы принимает участие во взаимодействии с рядом факторов регуляции транскрипции. Димер а-субъединицы является первым компонентом при сборке фермента из

отдельных субъединиц. Кроме того, а-субъединица взаимодействует с участками промотора, расположенными за областью -35, и таким образом участвует в сайтспецифичном узнавании промотора.

Две самые большие ß- и ß'-субъединицы, не гомологичные между собой, являются наиболее эволюционно-консервативными среди субъединиц РНК-полимеразы. При сравнении аминокислотных последовательностей этих субъединиц q их гомологами из различных источников обнаруживается ряд почти инвариантных районов, которые чередуются с областями, значительно отличающимися по последовательности. Эволюционно-консервативные участки расположены в одинаковой последовательности у всех известных организмов, что позволяет предположить сходство в структурной организации всех РНК-полимераз.

Гены гроВ и гроС эубактерий и архебактерий, кодирующие соответственно ß- и ß'-подобные субъединицы РНК-полимеразы, организованы в оперон, причём гроВ всегда предшествует гроС. Однако, было обнаружено, что в геномах хлоропластов и цианобактерий гомологи ß'-субъединицы кодируются двумя генами (Xie et al., 1989; Hu et al., 1990; Bergsland et al., 1991), а в геномах некоторых архебактерий гомологи ß- и ß'-субъединиц кодируются двумя генами (Berghover et al., 1988; Puhler et al., 1989; Leffers et al., 1989). Следовательно, ß'-субъединицы хлоропластов и цианобактерий и каждая из ß- и ß'-субъединиц некоторых архебактерий представлены в виде двух отдельных полипептидов, независимо входящих в состав РНК-полимеразы. На основании данного факта возникло предположение о доменной организации ß-и ß'-субъединиц. Это предположение

было подтверждено экспериментально. Было показано, что все известные сайты разрывов в гомологах Р и Р' субъединиц, обнаруженные в различных организмах, могут быть искусственно представлены в РНК-полимеразе Е. coli, без потери функциональной активности in vitro (Severinov et al., 1996). По имеющимся в настоящее время данным, Р-субъединица состоит по крайней мере из четырёх, а Р' из трёх независимых доменов (Severinov et al., 1996).

р'-субъединица вовлечена в большинство функций РНК-полимеразы. Она участвует в организации каталитического центра фермента (Zaychikov et al., 1996, Mustaev et al., 1997), формирует один из центров связывания антибиотика стрептолидигина (Severinov et al., 1995, В). Мутации в р'-субъединице изменяют терминационные (Weilbaecher et al., 1994) и элонгационные свойства РНК-полимеразы (Heisler et al., 1996) и влияют на способность фермента взаимодействовать с факторами, регулирующими транскрипцию. В гене гроС получены точечные мутации, нарушающие каталитическую функцию фермента (Zaychikov et al., 1996), и мутация, значительно понижающая стабильность открытого промоторного комплекса (Heisler et al., 1996). СООН-концевой фрагмент Р'-субъединицы участвует во взаимодействии с фактором активации транскрипции бактериофага N4 (Miller et al., 1997).

Р-субъединица участвует в организации инициаторного центра фермента (Grachev et al., 1987 А, В) и формирует центры связывания антибиотиков рифампицина и стрептолидигина (Zillig et al., 1977) и эффектора строгого контроля ppGpp (Glass et al., 1986). Мутации в р-субъединице изменяют терминационные свойства РНК-полимеразы (Landick et al., 1990) и влияют на способность фермента

взаимодействовать с факторами, регулирующими транскрипцию. В гене гроВ получены точечные мутации, нарушающие переход фермента из стадии инициации в стадию элонгации транскрипции (Kashlev et al., 1990; Mustaev et al., 1991).

Систематическое получение мутаций в генах, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы, и биохимический анализ мутантных ферментов позволят соотнести известные изменения в первичной последовательности этих субъединиц с функциональными дефектами мутантных РНК-полимераз. Это даст возможность смоделировать третичную структуру каждой из субъединиц в составе целого фермента и углубит наши знания о механизмах действия и регуляции РНК-полимеразы.

Цели работы и задачи исследования. Целью данной работы являлось

выяснение функциональной роли СООН-концевого эволюционно-вариабельного района Р'-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli и структурной организации РНК-полимеразы патогенной желудочной бактерии Helicobacter pylori. В работе ставились следующие задачи: (а) картирование антигенной детерминанты и изучение механизма подавления транскрипции моноклональными антителами, взаимодействующими с Р'-субъединицей РНК-полимеразы Е. coli; (б) исследование функциональной роли протяжённого эволюционно-вариабельного района Р'-субъединицы при помощи делеционного мутагенеза и изучение свойств полученных мутантных ферментов in vitro; (в) выделение РНК-полимеразы из штамма 26695 Helicobacter pylori; (г) определение и сравнение последовательностей участков стыковки генов гроВС протеобактерий, родственных Helicobacter pylori. \

Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что протяжённый СООН-концевой эволюционно-вариабельный район ß'-субъединицы не является необходимым для основных каталитических функций РНК-полимеразы Е. coli in vitro. В гене гроС получен ряд перекрывающихся делеций, приводящих к уменьшению скорости элонгации транскрипции мутантными ферментами. Для одного из полученных мутантных ферментов показано, что делеция в вышеуказанном районе ß'-субъединицы понижает эффективность расщепления РНК-продукта в тройном элонгационном комплексе. Впервые выделена РНК-полимераза из патогенной желудочной бактерии Helicobacter pylori, и показано, что ß и ß'-субъединицы данного фермента представляют собой единый полипептид. Установлено, что слияние генов гроВС характерно для всех исследованных в данной работе бактерий, принадлежащих роду Helicobacter. Показано, что ß и ß'-субъединицы РНК-полимераз бактерий, принадлежащих родам Campylobacter и Arcobacter, кодируются двумя генами (гроВ и гроС), причём эти гены не разделены спейсером, как характерно для большинства изученных бактерий, а перекрываются.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста и содержит 17 рисунков и 2 таблицы. Библиография включает в себя 158 названий, в том числе 4 русских и 154 иностранных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Настоящий обзор посвящен анализу данных о структуре фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. coli.

1.1. Общие сведения о структуре РНК-полимеразы Е. coli и стадиях транскрипционного цикла.

РНК-полимераза Е. coli состоит из каталитически активного корфермента, в состав которого входят две а-субъединицы, одна р- и одна Р'-субъединица с молекулярными массами 36.5, 151 и 155 кДа соответственно. Для специфичного связывания с промоторами и инициации транскрипции необходим голофермент -комплекс корфермента с одной из нескольких ст-субъединиц (для большинства промоторов это а-70 с молекулярной массой 70.2 кДа).

Транскрипционный цикл разделяют на несколько стадий. Первая стадия начинается с присоединения а-субъединицы к корферменту, т.е. с образования голофермента. Затем последовательно происходят: специфичное узнавание промотора и образование закрытого промоторного комплекса, плавление участка матрицы, содержащего точку инициации транскрипции (Siebenlist et al., 1980) и образование открытого промоторного комплекса (Reznikoff, 1977), инициация цепи РНК, уход фермента с промотора и диссоциация сг-субъединицы (Hansen et al., 1980 А, В), элонгация РНК-продукта и, наконец, терминация РНК-продукта и диссоциация фермента от матрицы.

На основании кинетических и термодинамических измерений, а также футпршшшгов и других химических методов было обнаружено, что все стадии транскрипционного цикла сопровождаются конформационными изменениями в структуре РНК-полимеразы (Wu et al., 1976; Roe et al., 1985; Gralla et al., 1980; Straney et al., 1987). Однако, вышеперечисленные методы позволяют получить лишь косвенные данные о структуре фермента.

Единственный прямой метод исследования - рентгеноструктурный анализ. Но применение этого метода, из за больших размеров и мультисубъединичного строения РНК-полимераз, сопряжено с определёнными трудностями. Поэтому до сих пор удалось определить лишь общую форму некоторых РНК-полимераз.

В лаборатории С. Дарста (Рокфеллеровский университет, Нью-Йорк), с точностью до 23 ангстрем была определена трёхмерная структура корфермента РНК полимеразы Е. coli.

На рис. 1 изображены модели трёхмерных структур РНК-полимеразы II дрожжей (Darst et al., 1991), корфермента РНК-полимеразы Е. coli (Polyakov et al., 1995) и голофермента РНК-полимеразы Е. coli (Darst et al., 1989). Все три модели содержат структуру, которую можно сравнить с большим и указательным пальцами руки, которая окружает канал размером 25 ангстрем в диаметре. В модели голофермента РНК-полимеразы Е. coli эта структура формирует глубокий, но не замкнутый желоб на поверхности фермента, а в моделях РНК-полимеразы II и корфермента РНК-полимеразы Е. coli она образует кольцо, которое полностью окружает канал.

Рис. 1. Трёхмерные модели структур РНK-пол имеразы П дрожжей (А) (Darst et at, 1991), корфсрмеита РНК-полимеразы Е. coli (Б) (Polyakov et al., 1995) и голофермснта РНК-полимеразы Е. coli (В) (Darst et аЦ 1989).

Возможно, сходство структурных моделей РIIК - п о л и м ер аз ьт Й и корфермента РПК-полимсразы Е. coli, и отличие этих моделей от модели

голофермента РНК-полимеразы Е. coli является следствием соответствующего функционального сходства и отличия между этими ферментами. Корфермент РНК-полимеразы Е. coli и РНК-полимераза II являются функциональными аналогами. Оба фермента способны элонгировать РНК-продукт, но не могут инициировать РНК на двухцепочной ДНК-матрице. В обоих случаях, для специфичного узнавания промоторов и инициации транскрипции необходим дополнительный белок (белки). Для Е. coli это а-субъединица, а для дрожжей и других эукариот - набор основных факторов транскрипции - TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH.

На основании вышеизложенных фактов Дарст и сотрудники делают предположение, что две модели РНК-полимеразы, одна со структурой разомкнутого, другая - замкнутого кольца (или желоба), представляют соответственно промотор-связывающую и элонгирующую конформации фермента. Предполагается, что когда голофермент образует комплекс с промотором, двойная спираль ДНК попадает в структуру жёлоба. Затем, при переходе фермента в стадию элонгации, структура кольца вокруг ДНК замыкается, что обеспечивает стабилизацию элонгационного комплекса и высокую процессивность фермента. В пользу этого предположения свидетельствует известный факт структурной организации ДНК-полимераз. Структура ß-субъединицы ДНК-полимеразы, в виде кольца, охватывающего ДНК, и скользящего по ней во время репликации, известна как фактор, обеспечивающий ферменту высокую процессивность (Kong et al., 1992; Krishna et al., 1994).

На основе данных о трёхмерной структуре РНК-полимеразы и результатов футпринтингов ДНКазой I и гидроксилрадикальных футпринтингов Дарст и сотрудники строят модель конформационных перестроек, происходящих в

кор-

ферменг

голо-фермент

в

"закрытый"

промоторный

комплекс

"открытый" промоторный комплекс

элюнгационный комплекс

Ж

+1

-35 -10 Г

-35 -10

+1 Г

з +1

-35 -10

ОНО

с;

Рис. 2. Модель конформационных перестроек в молекуле РНК-полимеразы Е. coli на стадиях инициации и элонгации транскрипции. Слева изображены (а) структура замкнутого кольца в молекуле корфермента РНК-полимеразы в растворе; (б) размыкание кольца, которое происходит при присоединен�