Изучение эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, с помощью пептидных фаговых библиотек

Туманова, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, с помощью пептидных фаговых библиотек
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, с помощью пептидных фаговых библиотек"

На правах рукописи

Туманова Ольга Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ ЭПИТОПОВ, УЗНАВАЕМЫХ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ ВИЧ-1 МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ 2F5 И 2G12, С ПОМОЩЬЮ ПЕПТИДНЫХ ФАГОВЫХ

БИБЛИОТЕК

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биоинженерии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ильичев А.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Локтев В Б. кандидат биологических наук Беклемишев А Б.

Ведущая организация Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Защита состоится « 24 » декабря 2004 г. в _9_часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559 (тел. 3832-36-74-28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан ноября 2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Нейтрализующие антитела к поверхностным гликопротеинам gpl20 и gp41 являются основной частью защиты организма хозяина от ВИЧ-1, а их появление особенно важно для ограничения распространения внеклеточного вируса. В последние годы значительные успехи достигнуты в разработке вакцин, индуцирующих клеточный иммунный ответ, однако не получено вакцинных кандидатов, которые воспроизводимо стимулировали бы в организме образование антител, нейтрализующих первичные изоляты ВИЧ-1 различных субтипов (Amara et al, 2001; Montefiori and Evans, 1999; Parren et al, 1999). Моноклональные антитела 2F5 и 2G12 (Buchacher et al., 1994), нейтрализуют in vitro лабораторные штаммы и первичные изоляты ВИЧ-1, относящиеся к различным генетическим субтипам, и защищают макак от передачи SHTV (Parren et al., 2001). К настоящему времени пройдена первая стадия клинических испытаний терапевтической вакцины против ВИЧ-1, включающей эти МКА (Armbruster et al., 2002). Эпитопы, узнаваемые МКА 2F5 и 2G12, рассматриваются как важные компоненты разрабатываемых кандидатных полиэпитопных вакцин (Coeffier et al, 2001; Liao et al, 2000).

Эпитоп, узнаваемый МКА 2F5, впервые был определен методом картирования с использованием синтетических пептидов. Он включает в себя шесть а.о. (ELDKWA), расположенных недалеко от С-конца эктодомена белка gp41 (Muster et al, 1993a). Последовательность ELDKWA достаточно консервативна (хотя не абсолютно) среди ВИЧ-1 изолятов, относящихся к различным генетическим субтипам, что является важным аргументом при разработке вакцин (Muster et al, 1993a; Muster et al., 1994; Trkola et al, 1995). Моноклональное антитело 2G12 узнает уникальный эпитоп на поверхности гликопротеина gpl20, который непосредственно не относится к сайтам связывания рецепторов на этом белке (Moore and Но, 1993; Ugolini et al, 1997). Однако до настоящего времени эпитоп, узнаваемый МКА 2G12, не определен, показано только, что его структура зависит от конформации поверхностного гликопротеина gp 120 и от гликозилирования остатков аспарагина в С2-, СЗ-, С4-доменах и У4-петле.

Существует мнение, что иммуногены, экспонирующие эпитопы выше перечисленных МКА в виде имитаторов структуры нативных поверхностных гликопротеинов ВИЧ-1, вероятно будут индуцировать гуморальный иммунный ответ, мимикрирующий нейтрализующие свойства одного или нескольких моноклональных антител (Trkola et al, 1995; Coeffier et al., 2001). Поэтому изучение антигенной структуры

белков gp41 и gpl20, а также получение пептидов-

-ИМ^ТЭТРРОП -1ТШТПП88, JTmptTTltTiTT WA

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ КИБЛИОТЕКА

2F5 и 2G12, является важной фундаментальной задачей и имеет большое значение для разработки новых профилактических средств против ВИЧ-1.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было получение и исследование коллекции пептидов, специфично взаимодействующих с нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, узнающими эпитопы на поверхности гликопротеинов gp41 и gpl20.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

- провести аффинную селекцию фаговой пептидной библиотеки с моноклональными антителами 2F5 и 2G12;

- подтвердить специфичность взаимодействия пептидов, экспонируемых на поверхности отобранных в результате аффинной селекции бактериофагов, с изучаемыми МКА методом ИФА, и определить аминокислотные последовательности таких пептидов;

- изучить иммуногенные свойства представленных в составе нитчатого бактериофага пептидов, взаимодействующих с МКА 2F5, и определить нейтрализующую активность антисывороток против пептидов-имитаторов эпитопа 2F5 in vitro;

- на основании состава отобранных по связыванию с МКА 2G12 пептидов, определить значимые для взаимодействия с МКА аминокислотные остатки, и предложить вариант локализации конформационного эпитопа, узнаваемого этим МКА, на поверхности гликопротеина gpl20 ВИЧ-1.

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе проведено изучение эпитопов поверхностных гликопротеинов gpl20 и gp41 ВИЧ-1, узнаваемых МКА 2G12 и 2F5, с использованием комбинаторных фаговых библиотек. Применение метода аффинной селекции позволило отобрать из представительной пептидной фаговой библиотеки варианты пептидов, соответствующих антигенным детерминантам или имитирующих их по связыванию с изучаемыми антителами 2F5 и 2G12.

Получена коллекция пептидов, специфично взаимодействующих с МКА 2F5. Все отобранные пептиды отличаются в различной степени по аминокислотной последовательности от природного 2F5-эпитопа (A/ELDKWA/G/N), но сохраняют способность связываться с исследуемым антителом и являются имитаторами этого эпитопа. Впервые для иммунизации животных использовали нитчатые бактериофаги, в

составе минорного белка которых экспонированы пептиды-имитаторы 2F5-эпитопа RDWSFDRWSLSEFWL, GRSFLDRWSKVPRDP, YFCYANCDKWVLKGD,

RNVPPIFNDVYWIAF. Показана вируснейтрализующая активность сывороток кроликов и мышей, иммунизированных вышеперечисленными бактериофагами, in vitro.

Рассмотрены возможные варианты состава эпитопа, узнаваемого МКА 2G12. На основании определенных аминокислотных последовательностей пептидов, взаимодействующих с МКА 2G12, впервые предсказаны а. о., являющиеся значимыми для распознавания МКА 2G12 эпитопа, расположенного на поверхности белка gpl20 ВИЧ-1 и, возможно, входящие в его состав. Проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка gpl20 из изолятов и штаммов ВИЧ-1, чувствительных и устойчивых к нейтрализации МКА 2G12. Показано, что предсказанные нами а.о., являются достаточно консервативными у изолятов, нейтрализуемых этим антителом. Высказана гипотеза о том, что устойчивость к нейтрализации обусловлена конформационными изменениями в области эпитопа, связанными с вариабельностью а.о. Ser393, П1Г394, Тгрз95; Thr415 и Ргс>4|7 Отмечена значимость гликозилирования остатков аспарагина в положениях 295, 332 и 392 для формирования исследуемого эпитопа.

Полученные данные об иммуногенности пептидов-имитаторов 2Р5-эпитопа, экспонируемых на поверхности нитчатого бактериофага, и результаты локализации эпитопа, узнаваемого МКА 2G12, в будущем могли бы быть полезны для создания вакцины против ВИЧ.

Апробация работы

Материалы исследований по теме диссертации представлены на следующих международных конференциях: Xй and XIth Symposium on HIV Infection, 1999, 2001, Toulon, France; «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» 1999,2000, С.-Петербург, Россия; "Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics", dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine, September 25-27,2003, Kyiv, Ukraine.

Публикации

По материалам диссертации были опубликованы три печатные работы и оформлено два патента.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из семи разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и

«Список литературы». Работа изложена на 148 станицах машинописного текста и включает 28 рисунков, 6 таблиц и список литературы, содержащий 219 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Аффинная селекция

Для проведения аффинной селекции была использована фаговая пептидная библиотека fuse5-15 mer, содержащая пептиды длиной 15 а о., экспонированные в составе минорного белка оболочки нитчатого бактериофага (Scott and Smith, 1990). Для получения пептидов-имитаторов белка gp41 ВИЧ-1 аффинную селекцию проводили с МКА 2F5, которое узнает консервативный для генетически различных изолятов ВИЧ-1 эпитоп на поверхности белка gp41 (Buchacher et al., 1994) Чтобы отобрать разнообразные варианты специфичных клонов в первом и втором раундах селекции использовали насыщающее по отношению к фаговым частицам количество МКА (10 мкг/мл). Для создания конкуренции между фагами за связывание с МКА и отбора наиболее специфичных вариантов пептидов в третьем раунде селекции использовали меньшее по отношению к фагам количество антител (1.5 нг). Обогащение фаговой популяции определяли по возрастанию процента выхода фагов после каждого раунда селекции (табл. 1), рассчитанного из отношения количества фагов, элюированных после проведения раунда селекции (output), к внесенному количеству фагов (input).

Из обогащенной фаговой библиотеки после проведения каждого раунда аффинной селекции с МКА 2F5 случайным образом отбирали индивидуальные фаговые клоны (табл. 1). Были проведены две независимые аффинные селекции с МКА 2F5. По результатам двух селекции отобрали 157 клонов (табл. 1).

Из библиотеки fuse5-15 mer были также отобраны пептиды, которые специфично взаимодействуют с МКА 2G12. Проведено два раунда аффинной селекции с МКА 2G12. В первом раунде использовали избыточное по отношению к фаговым частицам количество МКА, чтобы отобрать все варианты связывающихся фагов. Во втором раунде для отбора наиболее специфичных фагов элюат после первого раунда не амплифицировали, а инкубацию с МКА 2G12 проводили при комнатной температуре в течение 4 ч. Результаты селекции представлены в табл. 1.

Таким образом, в результате трех аффинных селекции, проведенных с МКА 2F5 и 2G12, были получены две коллекции нитчатых бактериофагов, состоящие из 157 и 105 индивидуальных фаговых клонов, соответственно.

Таблица I. Результаты аффинной селекции фаговой пептидной библиотеки fuse5-15-meг с МКА 2Г5 и 2G12

МКА Раунд селекции Input Output Выход, %' Кол-во протестированных клонов Кол-во ИФА-гюложитель-ных клонов % ИФА-положительных клонов Кол-во отсеквенироваиных клонов

т; т* я 1 2,5x10" 1,68x10" 6,7-КГ „ 19 8 42,1 11

* я я к V II 1,47x10" 1,2x10" Мб't02 14 10 71,4 13

ч 01 и Ш 3,45x10" 5,24x10s 8,7 -10 2 31 26 83,9 24

"к N в I 2,5x10" 3,7x10' 1,48 -10 J 31 16 51,6 -

в а и 4) II 8,5x10" l^xlO" 1,26' 10 * 1 31 27 87,1 -

5 о III 2,25x10" 4,9x10' 21,7 31 28 90,3 16

Всею

- н S I 4x10" 6,65x10" Tii- * f. ч £ 48 29 60,4 29

<ч я X II 2,8x1 С 1,07x10^ I >v >c* - £ 57 51 89,5 37

О f4 5 о p. r

Всего 105 80 66 1 1

1 - Выход рассчитывается из отношения количества фагов, элюированных после проведения селекции (output), к взятому в селекцию

количеству фагов (input) и выражается в процентах

* - выход фагов в III раунде рассчитывали как соотошение числа фагов в элюате к числу взятых для селекции молекул

. иммуноглобулинов (6х 109 молекул), выраженное в процентах.

Рис 1. Пример взаимодействия отобранных бактериофагов с МКА 2Б5 (А) и 2012 (В) в ИФА. В качестве отрицательного контроля взят фаг йке2, который не экспонирует рандомизованный пептид. Цифрами по оси X указаны номера пептидов, экспонируемых на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки.

4 5 6 7 8 9 Номер последовательности

Номер последовательности

2. Характеристика антигенных свойств отобранных клонов и определение аминокислотного состава экспонируемых пептидов

Для того чтобы отобрать фаговые клоны, специфично взаимодействующие с МКА 2F5 и 2G12, сначала иммобилизовали изучаемые МКА в лунках иммунологического планшета, затем добавляли соответствующие индивидуальные фаговые штоки, после чего выявляли связавшиеся фаги с помощью поликлональных анти-М13 антител. Результаты взаимодействия фаговых клонов с МКА 2F5 и 2G12 приведены на рис. 1 (А, В). Превышение значений оптической плотности над контролем в несколько раз позволяет считать, что отобранные фаговые клоны специфично взаимодействуют с МКА, используемыми для проведения аффинной селекции.

По результатам ИФА было отобрано 115 и 80 фаговых клонов, экспонирующих пептиды, взаимодействующие с МКА 2F5 и 2G12, соответственно (табл. 1). В таблице 1 приведены данные о количестве ИФА-положительных клонов в каждом из раундов аффинной селекции. Увеличение процента положительных клонов от раунда к раунду также подтверждает, что в результате проведенной селекции происходит обобщение исходной фаговой библиотеки 2F5- и 2G12-специфичными бактериофагами.

Чтобы охарактеризовать полученные коллекции, проводили определение нуклеотидной последовательности одноцепочечной фаговой ДНК в области встраивания рандомизованного олигонуклеотида методом Сэнгера для 64 и 66 отобранных клонов, взаимодействующих с МКА 2F5 и 2G12, соответственно (табл. 1).

3. Изучение отобранных пептидов-имитаторов эпитопа белка gp41 (ВИЧ-1), узнаваемого вируснейтрализующим антителом 2F5

По результатам секвенирования одноцепочечной фаговой ДНК 64 клонов, оказалось, что 65% отобранных бактериофагов несут на своей поверхности пептиды, которые имеют одинаковую структуру (рерЗ). На рисунке 2 приведено сравнение аминокислотных последовательностей пептидов между собой и определены их общие структурные мотивы. Аминокислотные остатки DK/RW являются консенсусными, поскольку замена лизина (К) на аргинин (R) чаще всего не влияет на взаимодействие антигена с антителом (Ерошкин, 1988).

Анализ сходства аминокислотных последовательностей пептидов с последовательностью белка gpl60 (предшественника gp41) ВИЧ-1 изолята ВН10 был проведен с помощью компьютерной программы (Eroshkin et al, 1995). В большинстве случаев отобранные нами пептиды, содержащие мотив DRW, имели гомологию с его

фрагментом 662-671 а.о. (рис. 2). По-видимому, аминокислотные остатки LeU663, Asp6M, Lys665, Тгрббб, определенные нами, участвуют в связывании МКА 2F5 с gp41 и входят в состав соответствующего эпитопа. Наши результаты согласуются с результатами, полученными другими исследователями (Muster et a!., 1993a; Trkola et a/., 1995). Все отобранные пептиды в различной степени отличаются по аминокислотной последовательности от природного -эпитопа но сохраняют

способность связываться с исследуемыми антителами, т.е. являются имитаторами этого эпитопа. Аминокислотные последовательности пептидов рер4, рер5 и рер12 (рис. 2), как уже было отмечено, не имеют сходства с эпитопом 2F5, но имитируют его по связыванию с антителами. Эти последовательности мы называем «истинными» миметиками. Фаги, экспонирующие на своей поверхности рер5 (рис. 2), эффективно взаимодействуют с МКА 2F5 и не вытесняются во 2-ом и 3-ем раундах, когда конкуренция между фагами за связывание с МКА усиливается.

550 660 670

др160 QQE|EQEHE|HplWNlFNITNWLwyIKL

pep Г (phi) YFCYANC^V1^0 5

pep 3 (ph3) RDWSeB|slsee11' 41

pep 11 WGH|daHBg|vGS 2

pep 5 (ph5) HVPP|FN|VYflAF 3

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей пептидов (pepl, pep2...), экспонированных на поверхности отобранных бактериофагов, с последовательностью белка gpl60 ВИЧ-1 (штамм ВН10). Цветом выделены совпадающие аминокислотные остатки. Бактериофаги, используемые для иммунизации лабораторных животных, указаны в круглых скобках (phi, ph3...). Справа цифрами обозначено количество бактериофагов, экспонирующих данные пептиды.

3.4.1. Иммунизация лабораторных животных

В дальнейшем было проведено исследование иммуногенных свойств отобранных пептидов-имитаторов 2Р5-эпитопа, экспонированных на поверхности нитчатых бактериофагов. Отметим, что изучение иммуногенности 2F5-3imT0na или его пептидных имитаторов, представленных в составе нитчатого бактериофага, ранее не проводилось другими исследователями.

Нами была проведена иммунизация лабораторных животных (кролики и мыши) бактериофагами, экспонирующими пептиды RDWSFDRWSLSEFWL (ph3, рерЗ), GRSFLDRWSKVPRDP (ph9, pep9), YFCYANCDKWVLKGD (phi, pepl) и RNVPPIFNDVYWIAF (ph5, pep5) (рис. 2).

В сыворотках иммунизированных кроликов и мышей были обнаружены антитела, Специфично взаимодействующие с рекомбинантным белком gp41 ВИЧ-1 (ЧФ «Капель», Москва). Наилучшие результаты были получены при иммунизации кроликов бактериофагом ph3 (RDWSFDRWSLSEFWL), в сыворотках животных определялись антитела к gp41 ВИЧ-1 (титр 1: 800 и 1:50) через 21 неделю от начала иммунизации. При введении этого бактериофага мышам, титр антител в среднем по группе

составил 1 : 640. Антитела к белку gp41 также были обнаружены в сыворотках мышей, иммунизированных фагами phi и ph9. Наибольшие титры выявлены в группе животных, которым вводили бактериофаг ph9, несущий на своей поверхности пептид-имитатор GRSFLDRWSKVPRDP (от 1 : 640 до 1 : 5120). Иммуногенность пептида pepl (YFCYANCDKWVLKGD) в составе фага phi оказалась на мышах выше, чем у кроликов.

3.4.2. Нейтрализация ВИЧ-1 in vitro

Реакцию нейтрализации проводили с сыворотками крови кроликов (21 неделя от начала иммунизации) при разведении сывороток 1 : 10 и различных дозах вируса (ВИЧ-1 штамм ГКВ-4046, 104 TCIDso и 100 ТСШ50) на культуре чувствительных клеток В качестве отрицательного контроля для каждого кролика использовали сыворотку крови, отобранную до начала иммунизации. Из результатов, представленных на рис. 3, видно, что сыворотки крови кроликов первой и второй групп содержат антитела, способные нейтрализовать ВИЧ-1. При увеличении дозы вируса до 104 TCID50 нейтрализующая активность исследуемых сывороток снижалась. Сыворотка крови кролика третьей группы не нейтрализовала лабораторный штамм ВИЧ-1, используемый нами для постановки реакции нейтрализации, при дозе вируса

Сыворотки крови мышей были также исследованы на способность нейтрализовать ВИЧ-1 in vitro. Реакцию нейтрализации проводили при дозах вируса 103 ТСГО50И 104

Вирус ВИЧ-1 штамм ГКВ 4046, доза -100 TCID„

2 2* К1 К2

Иммунизированные кролики

Рис. 3. Нейтрализующая активность сывороток крови кроликов.

Цифрами обозначены номера сывороток кроликов из первой (1 и 1*) и второй (2 и 2*) групп, иммунизированных ph 3 и ph 5, соответственно. К1 и К2 - сыворотки кроликов контрольной группы, иммунизированных бактериофагом М13тр10, не экспонирующим пептид. Процент снижения прироста белка р24 специфической сывороткой (1:10) по сравнению с сывороткой того же животного, взятой до начала иммунизации, приводится для дозы вируса 100

Рис. 4. Нейтрализующая активность сывороток крови мышей.

Сыворотки мышей первой группы, иммунизированных ph3, экспонирующим рерЗ -RDWSFDRWSLSEFWL, обозначены вертикальной штриховкой; светло-серым цветом и диагональной штриховкой - сыворотки второй (ph9, pep9 - GRSFLDRWSKVPRDP) и третьей (phi, pepl - FCYANCDKWVLKGD) групп, соответственно. Черным цветом выделены сыворотки мышей контрольной группы, которых иммунизировали фагом М13тр10; белым - мышиная сыворотка (интактная).

и различных разведениях (1 : 10 и 1 : 20) сывороток, полученных из крови через 43 недели (для первой и третьей групп мышей), и через 21 неделю (для второй группы) после начала иммунизации. Результаты для дозы вируса представлены на рис.

4. Данные по нейтрализации ВИЧ-1 сыворотками крови мышей первой и третьей групп (рис. 4) сравнимы с результатами, полученными для сывороток крови кроликов, иммунизированных бактериофагом При увеличении дозы вируса до 104 TCIDso

ингибирование прироста белка р24 уменьшается в среднем до 40%.

Обобщая полученные данные, можно сделать вывод, что при иммунизации кроликов и мышей бактериофагами (ph3), экспонирующими на своей поверхности пептид-имитатор RDWSFDRWSLSEFWL (рерЗ), в сыворотках крови животных определяются специфические антитела к gp41, нейтрализующие ВИЧ-1 in vitro Следует отметить, что после трехкратной иммунизации мышей пептидом-имитатором GRSFLDRWSKVPRDP (ph 9, рер9) без использования адъюванта, ингибирующая активность сывороток крови мышей составляла около 95% при дозе вируса Полученные результаты

указывают на достаточно высокую иммуногенность данного пептида-имитатора. Бактериофаг, экспонирующий пептид YFCYANCDKWVLKGD (pepl), при иммунизации мышей индуцировал образование антител, нейтрализующих лабораторный штамм ГКВ-4046 ВИЧ-1. Вируснейтрализующая активность полученных антисывороток составила 9299%. Отсутствие ингибирующей активности в сыворотках крови кроликов, иммунизированных тем же фагом (Phi, pepl), можно объяснить индивидуальными особенностями иммунного ответа у данного вида животных.

Интересными оказались результаты по нейтрализации ВИЧ-1 in vitro сыворотками крови кроликов, иммунизированных фагом (ph5, вторая группа), экспонирующим пептид рер5 - RNVPPIFNDVYWIAF (рис. 3), который является "истинным миметиком" эпитопа, узнаваемого МКА 2F5 (ELDKWA). Несмотря на низкий титр антител (1 : 50) в

сыворотках кроликов этой группы, сыворотка одного из кроликов эффективно нейтрализовала лабораторный штамм ГКВ-4046 ВИЧ-1 при различных дозах вируса ТСГО50 и 100 ТСШ50).

Таким образом, с помощью техники фагового дисплея были получены пептиды, имитирующие ВИЧ-1 по антигенным и иммуногенным свойствам, а также

по способности индуцировать образование вируснейтрализующих антител.

4. Локализация конфирмационного эпитопа гликопротеина gpl20 ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующим моноклинальным антителом 2G12

Сравнение аминокислотных последовательностей 66 пептидов, отобранных по связыванию с МКА 2G12, с последовательностью белка gpl20 ВИЧ-1 штамма НхВс2, проведенное с помощью компьютерной программы (Eroshkin et al, 1995), показало, что не существует линейной гомологии между отобранными нами пептидами и последовательностью белка gpl20. Полученный результат соответствует данным других исследователей (Buchacher et al., 1994; Trkola et al,1996b; Moore and Sodroski, 1996) о том, что эгштоп, узнаваемый МКА 2G12, является конформационным. До настоящего времени неизвестно, состоит ли данный эпитоп только из аминокислотных остатков, расположенных на поверхности белка gpl20, или в его состав помимо а.о. gpl20 также входят разветвленные цепи Сахаров, либо 2012-эпитоп формируется исключительно из углеводных структур, образующихся за счет гликозилирования остатков аспарагина в С2-, СЗ-, С4-доменах и У4-петле белка gpl20.

Рассматривая вариант, предполагающий, что эпитоп 2G12 состоит только из аминокислотных остатков белка gp120, экспонированных на поверхности, мы использовали два независимых подхода, предложенных для анализа аминокислотных последовательностей пептидов, отобранных по связыванию с МКА из фаговой библиотеки. Один из них разработан сотрудником ГНЦ ВБ "Вектор" Иванисенко ВА., другой - израильскими учеными (Enshell-Seijffers et al, 2003).

В основе алгоритма, предложенного Иванисенко В. А., лежит способ компьютерного конструирования пептидов, имитирующих участки поверхности белков. Данная программа создает базу данных, состоящую из всех возможных пептидов (длиной 15 а.о.), составленных из аминокислотных остатков, экспонированных на поверхности белка gpl20, с учетом длины пептидной связи. Для каждого из экспонированных на поверхности белка gpl20 аминокислотных остатков строили области вокруг их С р - атомов с радиусом, равным половине среднего расстояния между - атомами соседних а.о. в

последовательностях белков. Таким образом, все возможные цепочки аминокислотных остатков (длиной 15 а.о.), области которых пересекались, принимали за потенциальные пептиды-имитаторы.

Согласно этому алгоритму, на первом этапе было проведено сравнение аминокислотных последовательностей отобранных пептидов между собой и определены

их общие структурные мотивы (рис. 5). На основании сходства структурных мотивов аминокислотные последовательности были разделены нами на две группы (рис. 5). В первой группе консервативными являются а.о. Pro, Ser и Тгр. Во второй группе можно выделить структурный мотив Phe-Tyr-Arg-Leu, хотя а.о. Туг и Leu не всегда являются консервативными. Отметим, что а.о. Pro, Trp и Ser также встречаются в этой группе.

Сравнение отобранных из фаговой библиотеки аминокислотных последовательностей (рис. 5) с пептидами из созданной базы данных, с учетом физико-химической близости аминокислот, позволило предложить вариант локализации эпитопа, узнаваемого МКА 2G12. Проведенный анализ показал, что структурные мотивы отобранных пептидов соответствуют аминокислотным остаткам, расположенным у основания петель

Lys42i), нескольким а.о. У4-петли (Ser393, ТЬгзм, Тгрзм и Thr^s) и из С4-консервативного района (LeU342), Данные аминокислоты удалены друг от друга в последовательности, но сближены в пространстве и образуют на поверхности gpl20 эпитоп связывания МКА 2G12.

В качестве альтернативного подхода мы использовали метод определения структуры конформационных эпитопов, описанный (Enshell-Seijffers et al, 2003). Компьютерный алгоритм, включает следующие стадии: (1) подсчет количества наиболее часто встречающихся специфичных аминокислотных пар среди пептидов, отобранных по связыванию с МКА из фаговой библиотеки; (2) определение пар, наблюдаемая частота встречаемости которых в пептидах достоверно превышает теоретически ожидаемую частоту встречаемости этих пар при статистическом распределении (статистически значимые пары); (3) поиск тандемов, соответствующих статистически значимым парам, на поверхности антигена (используя модель его третичной структуры), в результате чего определяются кластеры, состоящие из связанных статистически значимых пар; (4) анализ кластеров и исключение неподходящих кластеров (Enshell-Seijffers et al, 2003).

В соответствии с изложенным алгоритмом нами составлена база данных, состоящая из пептидов, для которых отношение сигнала в ИФА с МКА 2G12 к отрицательному контролю (fuse2) превышает 2.5. Таких пептидов оказалось 56. Затем каждый из пептидов был представлен в виде эквивалентных тандемных пар аминокислотных остатков. Поскольку контакты между МКА и антигеном осуществляются через функциональные мотивы боковых групп, консервативные остатки были сгруппированы в шесть функциональных групп аминокислот и представлены (здесь и далее по тексту) в однобуквенном обозначении:

Обозначение пептида

Последовательность

Первая группа

pep 3 pep 24 pep 25 pep 8 pep 26 pep 34 pep 10 pep 11 pep 6 pep 5 pep 7 pep 13

Вторая группа pep 9

pep 18 pep 14 pep 16 pep 15 pep 17 pep 33 pep 27 pep 4 pep 12 pep 23 pep 36 pep 28 pep 30 pep 31 pep 29 pep 32 pep 19 pep 20 pep 22 pep 21 pep 1 pep 2

(5)

(3) (2)

(4) (2)

(2)

WGFTAGLg|SIl|gA

lyvgeial||dgppl crus|radv||svc

S*GSF1P3GDLGG

cafcefl|raygvf§

n|agsvd§nfgiwvr

rgagvmLsvi" DWfLgVpgL: cvgcmpfsI Avsgvigsgs!

AGSSfAADFSFi PVIAlgpgEANM

HRVCASgLLgFSg|§| VGAFGpfSsVLQS girafsgas|§Jdvr

avcgldslretmgsc WRVKNFLqf4|PLW

y|agev§fdlgrlea

PCMRYLgAGiJvgG

* VPD|SLRVLGGAALV CAFDSGFFgSVgCAR

PEfq^gLSQVYLSP AYFFgFDPAS||Y§T LCAVISRFTVGADBf

emcaivi aypprs dvlp hssvvfpg

epgpdgllaiIl!

rc§g£g lrvlp grpfamsllal ymhv acgvpffv areygt wkgatthfa

idcsrgr |hlf3vg [5pfflrg ;P

ifppisp [gilf ggyr LSDS

Рис. 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей пептидов, узнаваемых МКА 2G12 Выделены совпадающие аминокислотные остатки (общие структурные мотивы) В скобках указано количество пептидов с такой последовательностью

Таким образом, 56 пептидов в сумме составили 785 аминокислотных пар, представляя 132 различные пары из 169 возможных (учитывая 13 аминокислотных категорий).

Для каждой аминокислотной пары из отобранных пептидов было подсчитано наблюдаемое количество и рассчитано теоретически ожидаемое количество а.к. пар, основываясь на их равновероятной встречаемости - Пг А, где А - количество аминокислотных пар в сети пептидов, пг - ожидаемая частота а.к. пары для полностью случайных пептидов), и определено отношение экспериментально наблюдаемой частоты встречаемости а.к. пар к значению теоретически ожидаемой частоты с погрешностью. Таким образом, для десяти наиболее часто встречающихся пар в пептидах, восемь (ии, Ои, ИО, 00, 2И, И2, 02 и РИ) являются статистически более избыточными, чем теоретически было предсказано (рис. 6 (а)). Если полученные данные упорядочить по убыванию соотношения экспериментально наблюдаемой и теоретически ожидаемой частот, то можно определить достоверно избыточные пары (2У, У2, ОЛ, 2И, 2Р, УВ, 02 и И2), несмотря на более низкую наблюдаемую частоту встречаемости некоторых из приведенных пар (рис. 6 (Ь)). Отметим, что такие пары, как 2И, И2 и 02 присутствуют в обоих выборках, и могут быть основой для формирования кандидатных кластеров аминокислотных остатков, образующих предсказываемый 2О12 эпитоп.

Определив основной набор статистически значимых пар (88Р), следующим этапом работы был поиск тандемов, соответствующих 88Р, на поверхности gpl20 (используя модель его третичной структуры (К«юг^ et al, 1998)). При формировании кластера аминокислотный остаток одной из нар является связанным с а.о. второй пары, который, в свою очередь, связан с а.о. третьей пары и т.д. В таблице 2 представлен результат поиска тандемов, соответствующих определенным нами статистически значимым парам, на поверхности gpl20 и указано расстояние между Са - атомами для этих пар. Нами определено пять кластеров. Подробный анализ расположения на поверхности gpl20 кластеров - кандидатов в эпитоп 2О12, проведенный на основании литературных данных, привел нас к выводу, что аминокислотные остатки, определенные кластерами В, С, Э и Е, не могут входить в состав эпитопа, распознаваемого МКА 2О12. Таким образом, из пяти кластеров, определенных нами, наиболее вероятным кандидатом в предсказываемый эпитоп будет кластер А, поскольку он является самым представительным по разнообразию типов пар и количеству участвующих в его формировании а.о. (10, 15). Кластер А расположен на поверхности внешнего домена gpl20, в области соответствующей эпитопам, которые распознаются антителами, нейтрализущими

то ои ио оо ги иг ви ог ив ри

аминокислотные пары

ш \г ел яи 2р ув ау са ог су иг

аминокислотные пары

Рис 6. Определение статистически значимых пар. Сравнение теоретически рассчитанной (темные столбики) и наблюдаемой (светлые столбики) частот встречаемости тандемных пар, сортированных по порядку убывания наблюдаемой частоты (а) и по убыванию соотношения рассматриваемых частот (Ь) .

первичные изоляты и ТС1А штаммы В ИЧ-1.

Предсказанный кластером А эпитоп образуется из пяти сегментов полипептидной цепи белка gpl20 и состоит из аминокислотных остатков Тгрззв, Ьеиз42, ТЪгз58, Цезбо, ТЬгз88, Ьеиэ9о, РЬезя, 80:393, ТЬгзм, Тгрз«, РЬез^, Пе^м, Ниш, Ьеоц6, РЬе417 (рис. 7). При

сравнении состава кластера А с нашими результатами предсказания 2012-эпитопа с помощью компьютерной программы Иванисенко В. А. оказалось, что девять из пятнадцати предсказанных аминокислотных остатков белка gpl20 совпадают. Общими

являлись а.о. Ьзи, Ьеизи, РЬезя, Бегззз, ТЬгз«, Тфзи, Ищи, Ьеи^б, РЬац7 (рис. 7). Таким

образом, сходимость результатов предсказания состава изучаемого эпитопа при использовании двух различных подходов составила 60 %. Вероятнее всего, именно эти а.о. будут определять конформацию эпитопа, необходимую для связывания МКА 2G12 с белком gpl20, в случае, если рассматриваемый эпитоп состоит только из аминокислотных остатков этого бежа. Предсказанный нами эпитоп ориентирован по направлению к

Таблица 2 Кластеры аминокислотных остатков белка gpl20, рассматриваемые как кандидаты в эпитоп, узнаваемый МКА 2G12 В круглых скобках через запятую указано кокичество различных видов пар и чисто входящих в кластер аминокислотных остатков

Пара А о вр120 Расстояние между Са-атомами. А Пара А о gpl20 Расстояние между Са-атомами, А

ЪМ \V338 - 1.342 6 34 го N»/96-1236 6 05

ги %'зз8 -Ьзэд 7 98 го - 8274 7 66

ги - 1414 6 29 ги W96-V27s 617

ии 1-342 - Ьз^о 7 75 ои Т2З6 " N'2^5 7 98

иг Ьз42 " ^зи 743 ио Ь72 " §274 7 10

ои Тзч - Ьбо 643 ОС ои ^274 - 3 79

00 Тз58 " Т394 7 34 ог Й274 " ?277 5 71

ог Т358 - \\'з<)5 5 85 О 00 §274 - Т283 6 25

ог Т358- Рз96 415 иг ^275 -Р'277 6 56

ио ЬбО " 5393 6 07 ио ^275 " Т28З 7 86

ио ЬбО " Т394 4 51 го 5*277 • 1*278 3 80

иг ЬбО " ^395 610

V) ои Т388 - 1-390 5 60

ог Т"з8к"Рз9| 5 49 ог ^ 347 - Гз96 7 96

ои Тз88-Ь4]б 8 00 ои Т358 " ЬбО 643

< иг 1-390 - Рз91 3 79 00 Т"358 " Т394 7 34

ьи Ьз90 ' 1414 8 00 ог Т358 - Wз95 5 85

го ^391 - §391 6 37 ог Т34 " Рз96 4 15

00 §393 ' Т394 3 78 00 Т358 - Б465 4 43

ог Э393 - \\'з9< 6 97 ио ЬбО " Т394 4 51

ог Т394 " ^'395 3 80 30 иг ЬбО * ^395 610

ог Тз94 " Р*396 714 е ио ЬбО " 6 95

ио 1)14 " Т415 3 80 с ии ЬбО " 1467 4 52

ии 1414 " 1-416 6 30 ог Т394 - Рз9б 7 14

ои Т415 " 1-416 3 80 ои " 1467 6 63

0Р Т4Ц - Р417 6 62

ир 1-416 " ?417 3 83

ои йзбч-Чгп 7 66

ри Рз(,9 - V 3-2 5 10 го р93 " Т236 7 68

ио Чт-Ъп 3 82 гр ^93 " Р238 4 61

иг ^372 " р383 7 87 го ^93 - 6:37 6 02

гу Р?83 " У384 3 82 ОР Т236 - Р238 7 26

ги Рзхз - 1420 451 ^

и УВ УВ Уз 84 " 1^419 Уз84 " К4Ц 4 92 714 ы

Ряс 7. Поверхность молекулы д>120 ВЙЧ-1 (изображена светло-серым цветом). Серым и темно-серым цветом отмечены аминокислотные остатки, которые предсказаны в соответствии с составом кластера А. Темно-серым цветом выделены а.о., которые оказались общими по результатам предсказания эпитопа2012 обоими методами.

остатков этого белка. Предсказанный нами эпитоп ориентирован по направлению к клетке-мишени во время связывания с рецептором СЭ4. Следовательно, МКА Ю12 могло бы стерически препятствовать дальнейшему взаимодействию мембранного комплекса с корецептором, предотвращая, таким образом, проникновение вируса в клетку.

Далее была проведена оценка консервативности предсказанных а.о. белка gpl20 ВИЧ-1 у семнадцати чувствительных и шестнадцати устойчивых к нейтрализации МКА 2С12 .изолятов. На основании сделанного нами выравнивания аминокислотных последовательностей gpl20 изолятов и штаммов ВИЧ-1 с известными, по литературным данным, свойствами относительно этого МКА (фрагмент выравнивания приведен на рис. 8), мы пришли к выводу, что консервативность указанных нами а.о. отличалась у чувствительных и устойчивых к нейтрализации изолятов. У изолятов, нейтрализуемых МКА 2С12, полностью консервативными оказались а.о. белка gpl20, такие как Ьеидо» Ьеизэо, РЬеэд, ТЬгэ94 И Ьеи^б. Консервативность остальных а.о. превышала 88%.

Устойчивость к нейтрализации, с нашей точки зрения, может быть обусловлена конформационными изменениями в области эпитопа, связанными с вариабельностью а.о. Бегзм, ТЬтзя, Trp395, Thr4ls и Рго4П

Рассмотрим другой вариант, предполагающий, что 2G12-3numon формируется исключительно из углеводных структур, образующихся за счет гликозилирования аминокислотных остатков аспарагина в С2-, СЗ-, С4-доменах и V4-nemne белкаgpl20. Например, исследование мутантных форм белка gpl20 выявило, что данный эпитоп разрушается при замещении гликозилированных остатков аспарагина у основания V3-петли (Asilas) и в N-концевой области петли V4 (АзПзя И ASII397) (Trkola et al., 1996b). Большинство предсказанных сайтов N-связанного гликозилирования в положениях 295, 332, 392, 386, 397 и 448 могут участвовать в связывании МКА 2G12, поскольку располагаются достаточно близко один к другому, что позволяет сформировать эпитоп (Kwong et al, 2000; Kwong et a/., 1998; Sanders et eil., 2002).

Отобранные из фаговой библиотеки в результате аффинной селекции с МКА 2G12 пептидные последовательности специфично взаимодействуют с моноклональным антителом и, следовательно, потенциально могут выступать как структурные миметики углеводного эпитопа. Нами был проведен поиск известных по литературным данным аминокислотных последовательностей пептидов-имитаторов, отобранных по связыванию с антиуглеводными антителами. Особое внимание было уделено поиску последовательностей, имитирующих маннозу, поскольку известно, что предсказанные сайты N-связанного гликозилирования в положениях 295, 332, 392, 386 и 448 содержат олигосахариды, состоящие только из маннозы (Trkola et al, 1996b; Scanlan et al., 2002; Sanders et al, 2002).

Оказалось, что в пептидах, имитирующих углеводные структуры, часто встречаются такие а.о. как Tip, Phe и Туг. Пептиды, имитирующие маннозу, часто содержали YPY, WYPY, RYGRY мотивы (Oldenburg et al., 1992; Scott et al, 1992; Cunto-Amesty et al, 2001). Аминокислотные остатки, такие как Trp, Phe, Arg и Туг часто встречаются в отобранных нами пептидах, однако в чистом виде ни один из вышеперечисленных мотивов нами не был обнаружен. Возможно, что МКА 2G12 распознает уникальную структуру, образованную на поверхности gpl20 несколькими простыми олигосахаридами. Тогда отобранные нами пептиды являются уникальными имитаторами этой структуры, поскольку специфично взаимодействуют с МКА 2G12 в ИФА. Однако это предположение

gpl20 ВИЧ-1

ШВЬ

KWNNT I Q—К

|---К

E-KE-

---A-

---D

о----

0----

T-S-

D-GK Q----

Q—O----R-

B.U3 MN В US.92US077 В US.92US143

B.BR.92BR021

C.DJ DJ259A C.ZA DU151 C.&A.DU179 C.ZA.DU422

D UG.92UG005

F.BR.BZ162

AE.TH.CM235

AE.TH.CM238

АБ.ТН.92TH01

O.CA9

О CM HVPS1B0 SIVcpzUS

о- — Q—К

---o-

CD4 CD4

Il *

[KQIA...SKLREQFGN.NKT.IIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFÏCgSTCf [h-VV. . .EQ—KYWN-. .N-.---NS-----L—T—----A------j

QKVV...KQ--THW..

—V.

-vv. G—V. KIVA. fc-KVV. —V.

---V.

yKV- . R—T .

.1------E-.. —.-V-NH-----

.T------D-. . —.-V-TS-----

----M-----R-

. I--G----T.---. -A-N----------M------------1TH

. E--SHY-E- Л T-.----N-----L--TT------------iTSC-j

—V. E-VR. R—V.

• A—KSH-P-. .A- . -K-NS-----L—TM-----R------aTScj

---V...E---I>H-.K.---. -V-NS-------JL-

RKVR. ..E--KTL-RT. .AN.-T-QP-----L—T-------------[

S-T3- E-VK.. K~K-HY...---. -E--PP----1,-VT------RG-----

E—К- FEVR. . .K--Q-H-P-. .--.-K-NS-----L--T--'----R------#TSl

-S- I-VK. . .E----HY. . .---.IK-EP------L-VT------R------BPPK

3-V-. . .KK---LL.N.-T--T-RP--------T-------------?jTSG

0--Kf D-VK.. .AE-FSH-P- .A. -Q-NS-----L-VTM-H-I-K------DTSP.

-----VT. . .E--K-H-. - .---.---QPP- —-L--TM-H---R------§T"pi

R--EP-. —'VT.. .G--K-H-.- .---.---QPP----L--TM-H---R------ST-fcJ

—EV R-VT. . . E- -K-H-. I. -R- .---Qpp----L - - TM - H---R------fT-

KR/\ —T-. . ERY-LJNYT-SVNl-TFNHSl AG-D-FTTYM-.---H------STS!

E-A Q-T-. . IRY-NLVNQTE-V- •---SRT----A-VSUI H---И---—-gTS<

T-EKt^-YTLEIIK-EANLTivV.....ELI.PNA-----V-NMML---------§Т1Г|

> i I

342 366 390

V4 loop

|..F.NST.WSTEGS..,NNTEGS.

.V.-G-TS--SN...........

|N. V.---. -NETNWLGA---G-N.

.,.-KN.D-IK.-..,-D-K5N.

. DTI .G—

j. . .N-N-_______.. .-----.. .M

. .RL-H-.. . .—T. . .KGN.....»

...---....-E-...-STE-E..G

..YR-G-.-YWN-TR1E-G---LN.---1

..NG-D-.-NDTWK...DT-. N .DN-.E-.HGN-.TR...-F--SNS.T--.SK8-G^•.-Q. ...-G--LN,..

..NDT—..........—NT-N. .G—

...._______--N. .. DDG-ER. .N.-

....---. -GDTEM. .----ESN NN-

.......Stf..............G—

W. .G-H-WNN-T—. ......NN-

.DG---.RNN---, . . .SN. ..N.GH-

.L. -D-. -LNATOQP. —......N--

JT.. -......EN-

.. .—D. . .V.- . . . .L.FNE.S .GK-N-..

......D—9H.

EY...VDNK . . .-...-STGMN.

. I .GN-. -K-M-G. . .C-----..

.T.ENG..NM--H...---N....

.I.GNK..TI--C...-G.....

.-ECNN..T-CQGNNIT-DN-T.. ..INCTKSGCQ-IF...GSN-TN.. [NNÎD-T. . .TIT............

395

CD4 CD4 binding Il I CRIKQÏINMWGKVGKAMYAPPISGQIRCSS -----------R—Q-------Q-V-K-E-

-----------R—R-------K-V---Z-

---------RT-Q-------Q-V-S-V-

-----MV----E—R----A---EN-T-N-

-----------e__r-------K-I-T-K-

R------------R-------E-N-T-K-

-----------B--P-------A-N-T-K-

-----------E--R-------E-N-T-K-

-----------G-----------A-L-Q---.Й1 —

----MV----E—RT---A—A-N-T-N-.£---435

К---------GA-Q---------R-N-V- 447

К----V----GA-Q-«--------R-N-V-.Й---42S

к---------СЛ-Q---------R-N-V-.|---440

L—VVRS-MRGG^GL-----R-NLT-R- JS---459

KLR-LVRS-M-GESRI-----P-NLT-H- Щ---4*>4

--R--V-Q-MR---GIF----F-VLS-N-NÏTGM 4 21

î'nc. 8. Фрш мент выравнивания аминокислотных последова1ельнос!ей белков gpl20 различных изолятов ВИЧ-Относительно НхВ2 штамма (район 337-451 а о.). Мзоляш, чувствительные к нейтрализации МКА 2G12, обозначены слева серым цветом; устойчивые к нейтрализации - цветом не выделены. Символами ЛАА и * отмечены сайш N-связанного гликозилирования белка gpl20 и цистенновые а о., образующие дисульфидные мостики, соответственно. Темно-серым цветом выделены аминокислошые остатки, участвующие в формировании предсказанного нами эпитопа, узнаваемою МКА 2G12, серым - а о. аспарагина, гликозилирование которых является важным для взаимодейС!вия МКА 2GI2 с белком йр!20 ВИЧ-1.

требует дальнейшего экспериментального подтверждения. Только по результатам изучения иммуногенных свойств пептидов, полученных нами в результате аффинной селекции с МКА 2012, можно будет сделать вывод, какой из пептидов является лучшим имитатором углеводного эпитопа, и будут ли антитела, образование которых стимулировано введение этого пептида лабораторным животным, обладать свойствами, присущими для МКА 2012. Проведение такого рода исследований не входило в задачи данной диссертационной работы.

Рассмотрим последний вариант, предполагающий, что изучаемый нами эпитоп является смешанным, те. в его состав помимо а.о. белка gpl20 также входят разветвленные углеводные структуры. Включение углеводных структур в состав эпитопа, вероятно, объясняет его уникальность и редкую встречаемость 2012-подобных антител в сыворотках ВИЧ-инфицированных. Результаты проведенного нами выравнивания устойчивых и чувствительных к нейтрализации МКА 2012 изолятов также могут свидетельствовать о том, что 2012-эпитоп вряд ли состоит только из углеводных структур. Некоторыми авторами на основании проведенных биохимических исследований была отмечена значимость гликозилирования остатков аспарагина в положении 295 и 332, (8сап1ап е1 а1, 2002). Однако изолят 92КЩЮ9, относящийся к В-субтипу и группе изолятов, нейтрализуемых МКА 2012, в одном из значимых сайтов гликозилирования содержит аминокислотные замены которые приводят к

разрушению одной из составляющих углеводного 2О12-эпитопа, предсказанного в работе (8сап1ап е1 а1, 2002). Авторы объясняют чувствительность изолята 92КЩЮ9 к нейтрализации тем, что рядом образуется дополнительный сайт гликозилирования

который компенсирует утраченный олигосахарид при формировании эпитопа (8сап1ап е1 а1, 2002). Если следовать этим рассуждениям, то логично было бы предсказать, что изоляты АЕ.ТН.СМ238 и АЕ.ТН.92ТН01, имеющие замены в том же сайте гликозилирования, что и изолят 92КГОЮ9, будут чувствительными к нейтрализации МКА 2012, поскольку все остатки аспарагина в положении 295,334 (вместо 332), 392,386 и 448 гликозилированы. Однако эти изоляты относятся к группе устойчивых к нейтрализации МКА 2012, также как лабораторный штамм ММ и педиатрические изоляты 92Ш077 и 92И8143, белки gp120 которых также гликозилированы по всем пяти упомянутым положениям. Отметим, что к группе устойчивых относятся 4 изолята, принадлежащих к различным генетическим субтипам (В.ВК92ВК021, С.Ш.Ш259А, Э.и0.92И0005 и Р.ВК.Б2162), у которых отсутствуют простые олигосахариды в позиции 392, тогда как гликозилированы. Наконец, адаптированный к росту на Т-клеточных

линиях лабораторный штамм 8Б2 оказался слабо чувствительным к нейтрализации МКА 2G12 (Тгко1а ^ о/.,1996Ь), несмотря на "правильное" гликозилирование белка gpl20. Перечисленные изоляты имеют аминокислотные замены в области предсказанных нами аминокислотных остатков (рис. 8), поэтому можно сделать предположение, что эпитоп, узнаваемый МКА 2G12, состоит из определенных нами а.0. Ьеиз42, Ьеизэд, РЬез9ь Бехзэз,

и, возможно, включает некоторые мотивы простых олигосахаридов, присоединенных К Ая1295, А5Пззг ИЛИ АвПзэг. Углеводная составляющая эпитопа, вероятно, имитируется пептидами, которые содержат структурный мотив БУЯЬ (пептиды из второй группы выравнивания аминокислотных последовательностей, отобранных нами по результатам аффинной селекции (рис. 5)). Именно этим можно объяснить, что а.о. £р120 РЬе38з, ТуГз84> Азди, Пе42о И 1^421, входящие в кластер В (табл. 2), были ошибочно предсказаны обоими методами, примененными нами для анализа экспериментально полученных данных, однако были исключены нами из дальнейшего рассмотрения на основании известных результатов конкурентного анализа МКА 2G12 и МКА 17Ь.

Таким образом, на основании проведенного исследования нами были впервые предсказаны аминокислотные остатки

Ьеи41£ И РГО417), являющиеся значимыми для распознавания МКА 2G12 эпитопа, расположенного на поверхности белка gp120 ВИЧ-1 и, возможно, входящие в его состав. Отмечена важность гликозилирования остатков аспарагина в положениях 295, 332 и 392 для формирования исследуемого эпитопа. Эпитоп расположен близко к сайту связывания корецептора, но не перекрывает его. Отмечена также высокая консервативность предсказанного нами района среди вариабельной поверхности gp120 у изолятов, нейтрализуемых МКА 2G12. Результаты выравнивания аминокислотных последовательностей белка gp120 изолятов, устойчивых к нейтрализации этим МКА, выявили высокую вариабельность а.о.

выводы

1. Методом аффинной селекции получены две коллекции нитчатых бактериофагов, включающие 115 и 80 фаговых клонов, экспонирующих пептиды, которые взаимодействуют с вируснейтрализующими моноклональными антителами 2F5 и 2G12 к белкам gp41 и gpl20 ВИЧ-1, соответственно. Показано взаимодействие этих пептидов с МКА 2F5 и 2G12 в ИФА.

2. Определен аминокислотный состав 64 пептидов, отобранных по связыванию с МКА 2F5, и выявлена гомология аминокислотных последовательностей большинства исследованных пептидов с фрагментом 662-671 а.о. белка gpl60 ВИЧ-1. Все отобранные пептиды отличаются в различной степени по аминокислотной последовательности от природного 2F5-эпитопа (A/ELDKWA/G/N). но сохраняют способность связываться с исследуемым антителом и являются имитаторами этого эпитопа.

3. Впервые показаны иммуногенные свойства пептидов-имитаторов 2F5-эпитопа RDWSFDRWSLSEFWL, GRSFLDRWSKVPRDP, YFCYANCDKWVLKGD, RNVPPIFNDVYWIAF, представленных в составе нитчатых бактериофагов. Продемонстрирована вируснейтрализующая активность сывороток кроликов и мышей, иммунизированных вышеперечисленными бактериофагами, in vitro.

4. На основании аминокислотных последовательностей 66 пептидов, взаимодействующих с МКА 2G12, впервые предсказаны аминокислотные остатки (Ьеиз«, LeusM, Phe39i, Бе^з, ТЬгзм, Тгрзм, Thr«is, LeU4i6 и РГО417). являющиеся

значимыми для распознавания МКА 2G12 эпитопа, расположенного на поверхности белка gpl20 ВИЧ-1 и, возможно, входящие в его состав. Выявлена значимость гликозилирования остатков аспарагина в положениях 295, 332 и 392 для формирования исследуемого эпитопа.

5. На основании выравнивания аминокислотных последовательностей белка gpl20 из изолятов и штаммов ВИЧ-1, чувствительных и устойчивых к нейтрализации МКА 2G12, показано, что предсказанные нами а.о., являются достаточно консервативными у изолятов, нейтрализуемых этим антителом.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Туманова О.Ю.. Кувшинов В. Н., Азаев М. Ш., Машарский А. Э., Климов, А. П. Козлов Н. А., Ильичев А. А., Сандахчиев Л. С. Получение пептидов-имитаторов эпитопа белка gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), узнаваемого вируснейтрализующими антителами 2F5.// Молекуляр. биол. 2001., Т.35., N. 1, С.146-151.

2. Туманова О.Ю.. Кувшинов В. Н., Ильичев А. А., Некрасов Б.Г., Иванисенко В.А., Козлов А.П., Сандахчиев Л. С. Локализация конформационного эпитопа гликопротеина gpl20 ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующими моноклональными антителами 2G12. //Молекуляр. биол. 2002., Т.36., N. 4, С.657-663.

3. Туманова О.Ю.. Кувшинов В.Н., Орловская И.А., Проняева Т.Р., Покровский А.Г., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Иммуногенные свойства пептидов имитаторов эпитопа белка gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), узнаваемого нейтрализующим антителом 2F5.// Молекуляр. биол., 2003, N 3, стр. 556-560.

Патенты:

1. Туманова О.Ю.. Кувшинов В. Н., Меламед Н.В., Ушакова Т.А., Машарский А. Э., Ильичев А. А., Климов Н.А., Козлов А.П., Сандахчиев Л. С. Пептиды-имитаторы консервативного эпитопа белка gp41 ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующими

моноклональными антителами 2F5. // Патент РФ N2179980- БЮЛЛ. изобр. N6 от 27.02.02.

2. Туманова О.Ю.. Кувшинов В. Н., Некрасов Б.Г., Михайлова В.К., Ильичев А. А., Сандахчиев Л. С. Пептиды имитаторы консервативного эпитопа белка gpl20 вируса иммунодефицита, человека типа 1, узнаваемого вируснейтрализующими моноклональными антителами 2G12 // Патент РФ N2184780.-БЮЛЛ. изобр. N19 от 10.07.02.

Тезисы мат ериалов конференций:

1. Туманова О.Ю., Кувшинов В.Н., Ильичев А.А., Козлов А.П. Получение имитаторов нейтрализующего эпитопа белка gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) // Материалы 7-ой Международной конференции "Спид, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 24-28 мая, 1999, "Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы", Т. 3, N 1, стр. 43.

2. Tumanova O.Y.. Kuvshinov V.N., Ilyichev A.A. Searching peptides mimicking the conserved neutralizing epitope on gp41 of Human Immunodeficiency Virus Type-1 using random phage epitope libraries // Abstracts of Xй Symposium on HIV Infection, France, Toulon, Junel7-19,1999, P.P.2.2.

3. Туманова О.Ю., Кувшинов В.Н., Азаев М.Ш., Машарский А.Э., Климов Н.А., Ильичев А.А., Козлов А.П. Исследование иммуногенных свойств имитаторов нейтрализующего эпитопа белка gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) //Материалы 8-ой Международной конференции "Спид, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 19-24 мая, 2000, "Русский журнал ВИЧ/ СПИД и родственные проблемы", Т. 4, N. 1, стр.29.

4. Туманова О.Ю., Некрасов Б.Г., Кувшинов В.Н., Иванисенко В.А., Ильичев А.А. Использование пептидных фаговых библиотек для изучения антигенной структуры белка gpl20 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) // Материалы 8-ой Международная конференция "Спид, рак и родственные проблемы", Санкт-

Петербург, 19-24 мая, 2000, "Русский журнал ВИЧ/ СПИД и родственные проблемы", Т. 4, N. 1, стр. 30.

5. Tumanova O.Y., Nekrasov B.G., Kuvshinov V.N., Ivanisenko V.A., Ilyichev A.A. Using combinatorial phage peptide libraries for studing antigenic structure of HIV-1 gpl20 protein // "Digest reports of the IV"1 ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on "Basic Science in ISTC Activities"» Academgorodok, Novosobirsk, 23-27 april,2001,p.H4.

6. Tumanova O.Y., Nekrasov B.G., Kuvshinov V.N., Ivanisenko V.A., Ilyichev A.A. Using combinatorial phage peptide libraries for studing antigenic structure of HTV-l gpl20 protein. // Thesis ofthe XI -th Symposium on HIV Infection, June 14-16, Toulon, France, 2001, ppNB13.

7. Туманова О.Ю., Кувшинов В.Н., Ильичев А.А. Антигенные и иммуногенные свойства пептидов-имитаторов эпитопа белка gp41 ВИЧ-1, узнаваемого нейтрализующими антителами 2F5. // Материалы шестой Всероссийской научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002", "Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии", С.-Петербург 20-23 мая, 2002, Медицинская иммунология, 2002, Т. 4, N2, стр. 262.

8. Tumanova O.Yu. Characterization of HIV-1 Neutralizing Epitopes with Phage-Displayed Peptides. // Abstract book "Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics", dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS ofUkraine, September 25-27,2003, Kyiv, Ukraine, В 82, p. 222.

Соискатель

Туманова О.Ю.

Подписано в печать 18.11.2004 Формат 60x84 1/1 6

Заказ №114 Бумага офсетная, 80 гр/м2

Печл. 1 ТИраж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. ПК. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

|234 41

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Туманова, Ольга Юрьевна

Список принятых сокращений

Введение

Научная новизна и практическая ценность работы

Публикации и апробация работы

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Фаговый дисплей. История возникновения и области применения

1.2. Фаговый дисплей природных пептидов

1.2.1. Картирование эпитопов моноклональных и поликлональных антител

1.2.2. Получение иммуногенов

1.3. Фаговый дисплей рандомизованных пептидов

1.3.1. Комбинаторные фаговые пептидные библиотеки

1.3.2. Картирование эпитопов природных антигенов и поиск их пептидных имитаторов

1.3.3. Идентификация пептидных лигандов

1.3.4. Определение субстратных последовательностей дляпротеаз

1.4. Пептиды, связывающиеся с антителами, и структурные основы пептидного узнавания

1.5. Увеличение эффективности отбора пептидов из фаговых пептидных библиотек

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, с помощью пептидных фаговых библиотек"

Вакцина, способная предотвратить заражение вирусом иммунодефицита человека или снизить уровень прогрессии заболевания у ВИЧ-1 инфицированных пациентов, является крайне необходимой для здравоохранения. Эффективная вакцина должна включать компоненты, способные индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ (McMichael and Rowland-Jones, 2001; Montefiori and Evans, 1999; Parren et al, 1999). В последние годы значительные успехи достигнуты в разработке вакцин, индуцирующих клеточный иммунный ответ, однако не получено вакцинных кандидатов, которые воспроизводимо стимулировали бы в организме образование антител, нейтрализующих первичные изоляты ВИЧ-1 различных субтипов (Amara et al, 2001; Montefiori and Evans, 1999; Parren et al, 1999). To, что антитела с таким широким спектром нейтрализующей активности действительно существуют, продемонстрировано на примере нескольких моноклональных антител человека, полученных из трансформированных вирусом Эпштейна-Барра мононуклеарных клеток периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов (Buchacher et al., 1994). Моноклональные антитела, такие как МКА 2F5 и 2G12, нейтрализуют большинство первичных изолятов ВИЧ-1 in vitro, активируют систему комплемента по классическому пути и вызывают антителозависимую клеточную цитотоксичность (Muster et al., 1993а; Parren et al, 1999; Trkola et al., 1995). Более того, эти антитела сами по себе или в комбинации друг с другом, защищают макак от передачи SHIV (Baba et al., 2000; Parren et al., 2001). Для моноклональных антител 2G12 и 2F5 в комплексе с другими антителами имеется опыт применения для пассивной иммунотерапии больных СПИДом в клиниках США и Европы. В связи с этим, эпитопы, узнаваемые МКА 2F5 и 2G12, вызывают значительный интерес у разработчиков вакцины против ВИЧ (Burton and Moore, 1998; Nabel, 2001; Parren et al, 1999). Существует мнение, что вакцина против этого патогена должна включать эпитопы для вышеперечисленных МКА или их пептидные имитаторы (Trkola et al, 1995). Интерес к имитаторам обусловлен тем, что они могли бы индуцировать образование антител, нейтрализующих первичные изоляты ВИЧ-1, относящиеся к различным генетическим субтипам. Поэтому изучение антигенной структуры белков gp41 и gpl20, а также получение пептидов-имитаторов эпитопов, узнаваемых МКА 2F5 и 2G12, является важной фундаментальной задачей и имеет большое значение для разработки новых профилактических средств против данного заболевания.

Одним из методов получения пептидов-имитаторов и изучения не только линейных, но и конформационных эпитопов вирусных белков является использование фаговых пептидных библиотек. Каждая такая библиотека содержит пептиды определенной длины и случайного аминокислотного состава, экспонированные на поверхности нитчатого бактериофага в составе одного из белков оболочки. Библиотеки сконструированы таким образом, что чужеродный пептид, находясь на N-конце рекомбинантного белка, располагается на поверхности вириона и доступен для взаимодействия с белком-лигандом, использующимся для аффинной селекции. В исследованиях по локализации вирусных антигенных детерминант в качестве белков-лигандов выступают моноклональные антитела. Таким образом, использование метода аффинной селекции позволяет отобрать из фаговой пептидной библиотеки варианты пептидов, соответствующие антигенным детерминантам или имитирующие их по связыванию с антителами. Пептиды, имитирующие эпитопы, узнаваемые нейтрализующими антителами, при иммунизации могут индуцировать образование антител, обладающих нейтрализующей активностью даже относительно "escape''-вариантов вируса (Roccasecca etal., 2001).

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

- провести аффинную селекцию фаговой пептидной библиотеки с моноклональными антителами 2F5 и 2G12; подтвердить специфичность взаимодействия пептидов, экспонируемых на поверхности отобранных в результате аффинной селекции бактериофагов, с изучаемыми МКА методом ИФА, и определить аминокислотные последовательности таких пептидов;

Научная повшна и практическая ценность работы

Получена коллекция пептидов, специфично взаимодействующих с МКА 2F5. Все отобранные пептиды отличаются в различной степени по аминокислотной последовательности от природного 2Р5-эпитопа (A/ELDKWA/G/N), но сохраняют способность связываться с исследуемым антителом, т.е. являются имитаторами этого эпитопа. Впервые для иммунизации животных использовали нитчатые бактериофаги, в составе минорного белка которых экспонированы пептиды-имитаторы 2Р5-эпитопа RDWSFDRWSLSEFWL, GRSFLDRWSKVPRDP, YFCYANCDKWVLKGD,

Рассмотрены возможные варианты состава эпитопа, узнаваемого МКА 2G12. На основании определенных аминокислотных последовательностей пептидов, взаимодействующих с МКА 2G12, впервые предсказаны а. о., являющиеся значимыми для распознавания МКА 2G12 эпитопа, расположенного на поверхности белка gpl20 ВИЧ-1 и, возможно, входящие в его состав. Проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка gpl20 из изолятов и штаммов ВИЧ-1, чувствительных и устойчивых к нейтрализации МКА 2G12. Показано, что предсказанные нами а.о., являются достаточно консервативными у изолятов, нейтрализуемых этим антителом. Высказана гипотеза о том, что устойчивость к нейтрализации обусловлена конформационными изменениями в области эпитопа, связанными с вариабельностью а.о. Ser393, П1Г394, Trp395> Thr415 и Pro4i7 Отмечена значимость гликозилирования остатков аспарагина в положениях 295, 332 и 392 для формирования исследуемого эпитопа.

Полученные данные об иммуногенности пептидов-имитаторов 2F5-эпитопа, экспонируемых на поверхности нитчатого бактериофага, и результаты локализации эпитопа, узнаваемого МКА 2G12, в будущем могли бы быть полезны для создания вакцины против ВИЧ.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации получено два патента РФ, опубликовано три печатные работы и 8 тезисов. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на следующих международных конференциях: Хш and XIth Symposium on HIV Infection, 1999, 2001, Toulon, France; «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» 1999, 2000, С.-Петербург, Россия; "Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics", dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine, September 25-27,2003, Kyiv, Ukraine.

Вклад автора

Аффинная селекция фаговой пептидной библиотеки с МКА 2G12 и 2F5, наработка индивидуальных фаговых клонов, подбор условий и изучение взаимодействия отобранных бактериофагов с МКА 2G12 и 2F5 в ИФА, определение нуклеотидных последовательностей одноцепочечной фаговой ДНК в области встраивания рандомизованного олигонуклеотида, а также исследование взаимодействия сывороток иммунизированных животных с рекомбинантным белком gp41 ВИЧ-1 выполнены лично автором. Иммунизация лабораторных животных проводилась автором совместно с в.н.с. Института клинической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск), д.м.н. Орловской И.А. и сотрудником ГНЦ ВБ «Вектор» Азаевым М.Ш. Исследование вируснейтрализующей активности сывороток иммунизированных животных в реакции нейтрализации ВИЧ-1 in vitro проводилось Проняевой Т.Р., н.с. лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ «Вектор» (руководитель - Покровский А.Г.). Предсказание локализации конформационного эпитопа, узнаваемого MICA 2G12, выполнено сотрудником ИЦиГ СО РАН к.б.н. Иванисенко В.А при участии автора, а также лично автором с использованием алгоритма, описанного в работе (Enshell-Seijffers et al, 2003).

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ГНТП России «Новейшие методы биоинженерии» по направлению «Белковая инженерия»: «Исследование механизмов белок белковых взаимодействий с использованием комбинаторных библиотек пептидов на основе нитевидных бактериофагов» (1997-1999); договоров 16/1998, 3/1999 и 3/2000 межведомственной научно-технической программы «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего».

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Туманова, Ольга Юрьевна

выводы

2. Определен аминокислотный состав 64 пептидов, отобранных по связыванию с МКА 2F5, и выявлена гомология аминокислотных последовательностей большинства исследованных пептидов с фрагментом 662-671 а.о. белка gpl60 ВИЧ-1. Все отобранные пептиды отличаются в различной степени по аминокислотной последовательности от природного 2Р5-эпитопа (A/ELDKWA/G/N), но сохраняют способность связываться с исследуемым антителом и являются имитаторами этого эпитопа.

3. Впервые показаны иммуногенные свойства пептидов-имитаторов 2Р5-эпитопа RDWSFDRWSLSEFWL, GRSFLDRWSKVPRDP, YFCYANCDKWVLKGD, RNVPPIFNDVYWIAF, представленных в составе нитчатых бактериофагов. Продемонстрирована вируснейтрализующая активность сывороток кроликов и мышей, иммунизированных вышеперечисленными бактериофагами, in vitro.

4. На основании аминокислотных последовательностей 66 пептидов, взаимодействующих с МКА 2G12, впервые предсказаны аминокислотные остатки (Ьеиз42, Ьеиз9о, Phe39i, Ser393, П1Г394, Т1Р395, Th^is, Leu4i6 и РЮ417), являющиеся значимыми для распознавания МКА 2G12 эпитопа, расположенного на поверхности белка gpl20 ВИЧ-1 и, возможно, входящие в его состав. Выявлена значимость гликозилирования остатков аспарагина в положениях 295, 332 и 392 для формирования исследуемого эпитопа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Туманова, Ольга Юрьевна, Кольцово

1. Ерошкин A.M. 1988. Матрица сходства аминокислот для поиска антигенноблизких фрагментов в неродственных белках. Молекуляр. биология 22:635-644.

2. Змушко Е.И. и Белозеров Е.С. 2000. Этиология, в ВИЧ-инфекция: руководство для врачей. СПб.: Питер, 9-25.

3. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев Н.Н., Ерошкин A.M., Петренко В.А., Сандахчиев Л.С. 1989. Получение жизнеспособного варианта фага М13 со встроенным чужеродным пептидом в основной белок оболочки. Докл. АН СССР 307:481-483.

4. Карпенко Л.И., Веремейко Т.А., Туманова О.Ю., Пика И.С., Чикаев Н.А., Меламед Н.В., Нагайцева Н.В. , Кувшинов В.Н., Рязанкин И.А., Ильичев А.А. 2004. Проблемы презентации эпитопов ВИЧ с помощью HBcAg. Вестник РАМН (в печати).

5. Краевский А.А. 1998. Возможности химиотерапии СПИДа. Вестник РАН 68: 798- 812.

6. Максютов А.З. и Загребельный С.И. 1993. Антигенные детерминанты белков. Гуморальный иммунный ответ. Молекулярная биология. 27: 980-991.

7. Agadjanyan M., Luo P., Westerink M.A., Carey L., Hutchins W., Steplewski Z., Weiner D.B., Keiber-Emmons T. 1997. Peptide mimicry of carbohydrate epitopes on human immunodeficiency virus. Nat Biotechnol. 15: 547-551.

8. Altschuh D., Dubs M.-C., Weis E., Zeder-Lutz G., Van Regenmortel М.Н.У. 1992. Biochemistry 31: 6298-6304.

9. Armbruster C., Stiegler G.M., Vcelar B.A., Jager W., Michael N.L., Vetter N., Katinger H.W.D. A phase I trial with two human monoclonal antibodies (hMAb 2F5, 2G12) against HIV-1 .AIDS 16:227-233.

10. Atassi M.Z. 1967. Specific cleavage of tryptophyl peptide bonds with periodate in sperm whale myoglobin. Arch. Biochem. Biophys. 120: 56.

11. Atassi M.Z., Perlstein M.T., Habeeb A.F. 1971. Conformational studies on modified proteins and peptides: IV. Conformation of lysozyme derivatives modified at tyrosine or at tryptophan residues. J. Biol. Chem. 246: 3291-3296.

12. Atassi M.Z. and Samplin B.J. 1968. Immunochemistry of sperm whale myoglobin: I. The specific interaction of some tryptic peptides and of peptides containing all the reactive regions of the antigen. Biochemistry 7: 688-698.

13. Atassi M.Z. and Singhal R.P. 1970. Immunochemistry of sperm whale myoglobin: 8. Specific interaction of peptides obtained by cleavage at proline peptide bonds. Biochemistry 9:3854-3861.

14. Baribaud F., Pohlmann S., Doms R. W. 2001. The role of DC-SIGN and DC-SIGNR in HIV and SIV attachment, infection, and transmission. Virology 286:1-6.

15. Bass S.H., Green R., Wellis J.A. 1990. Hormone phage: An enrichment method for variant proteins with altered binding properties. Proteins 8: 309-314.

16. Berkowitz S.A. and Day L.A. 1976. Mass, Length, composition and structure of the filamentous bacteriophage fd. J. Mol. Biol. 102:531-547.

17. Berger E. A. 1997. HIV entry and tropism: the chemokine receptor connection. AIDS Suppl. A: S 3-16.

18. Bonnicastle L.L., Mehroke J.S., Rashed M., Gong X., Scott J.K. 1996. Probing the basis of antibody reactivity with a panel of constrained peptide libraries displayed by filamentous phage. J. Mol. Biol. 259: 747-762.

19. Burton D. R. 1997. A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 94: 10018-10023.

20. Burton D.R. and Moore J.P. 1998. Why do we not have HIV vaccine and how can we make one? Nat. Med. 4: 495-498.

21. Chakrabarti P. and Janin J. 2002. Dissecting protein-protein recognition sites. Proteins: Struct. Funct. Genet. 47: 334-343.

22. Chan D. C. and Kim P. S. 1998. HIV entry and its inhibition. Cell 93: 681-684.

23. Chan D.C., Fass D., Berger J.M., Kim P.S. 1997. Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein. Cell 89: 263-273.

24. Christian R.B., Zuckermann R.N., Kerr J.M., Wang L., Malcolm B.A. 1992. Simplified methods for construction, assessment, and rapid screening of peptide libraries in bacteriophage Ml3. J. Mol. Biol. 227:711-718.

25. Cloutier S.M., Ribeiro Chagas J., Mach J.-P., Gygi C.M, Leisinger H.-J., Deperthes D. 2002. Substrate specificity of human kallikrein 2 (hK2) as determined by phage display technology. Eur. J. Biochem. 269: 2747-2754.

26. Coombs G.S., Bergstrom R.C., Pellequer J.L., Baker S.I., Navre M., Smith M.M., Tainer J.A., Madison E.L., Corey D.R. 1998. Substrate specificity of prostate-specific antigen (PSA). Chem. Biol. 5: 475-488.

27. Cortese R., Monaci P., Nicosia A., Luzzago A., Feleci F., Galfre G., Pessi A., Tramontano A., and Sollazzo M. 1995. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Curr. Opin. Biotechnol. 6: 73-80.

28. Craig L., Sanschgrin P.C., Rozek A., Lackie S., Kuhn L.A., Scott J.K. 1998. The role of structure in antibody cross-reactivity between peptides and folded proteins. J. Mol. Biol. 281 : 183-201.

29. Cunto-Amesty G., Dam Т.К., Luo P., Monzavi-Karbassi В., Brewers C.F., Van Cott T.C., Keiber-Emmons T. 2001. Directing the immune response to carbohydrate antigens. J. Biol. Chem. 276: 30490-30498.

30. Cwirla S.E., Balasubramanian P., Duffin D.J., Wagstrom C.R., Gates C.M., Singer S.C., Davis A.M., Tansik R.L., Mattheakis L.C., Boytos C.M. 1997. Peptide agonist of the thrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine. Science 276: 1696-1699.

31. Cwirla S.E., Peters E.A., Barret R.W., Dower W.J. 1990. Peptides of phage: A vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382.

32. Dalgleish A.G., Chanh T.C., Kennedy R.C., Kanda P., Clapham P.R., Weiss R.A. 1988. Neutralization of diverse HIV-1 strains by monoclonal antibodies raized against a gp41 synthetic peptide. Virology 165: 209-215.

33. Daniels D.A. and Lane D.P. 1994. The characterization of p53 binding phage isolated from phage peptide display libraries. J. Mol. Biol. 243: 639-652.

34. De la Cruz V., Laa A., McCutchan T. 1988. Immunigenicity and epitope mapping og foreign sequences via a genetically engineered filamentous phage. J. Biol. Chem. 263: 4318-4322.

35. Delmastro P., Meola A., Monaci P., Cortese R., Galfre G. 1997. Immunogenicity of filamentous phage displaying peptide mimotopes after oral administration. Vaccine. 15: 1276-1285.

36. Demendel C., Lafaye P., Mazie J.C. 1996. Reproducing the immune response against the Plasmodium vivax merozoite surface protein 1 with mimotopes selected from a phage-displayed library. Mol. Immunol. 33: 909-916.

37. Demendel C., Rouyre S., Alzari P.M., Nato F., Longacre S., Lafaye P., Mazie J.C. 1998. Phage-displayed mimotopes elisit monoclonal antibodies spesific for a malaria vaccine candidate. Biol Chem. 379: 65-70.

38. Devlin J.J., Panganiban L.C., Devlin P.E. 1990. Random peptide libraries: A source of specific protein binding molecules. Science 249: 404-406.

39. Dong X.N., Xiao Y., Chen Y.H. 2001. ELNKWA-epitope specific antibodies induced by epitope-vaccine recognize ELDKWA- and other two neutralizing-resistant mutated epoitopes on HIV-1 gp41. Immunol. Lett. 75: 149-152.

40. Doorbar J. and Winter G. 1994. Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display. J. Mol. Biol. 244: 361-369.

41. D'Souza M.P., Milman G., Bradac J.A., McPhee D., Hanson C.V., Hendry R.M. 1995. Neutralization of primary HIV-1 isolates by anti-envelope monoclonal antibodies. AIDS 9: 867-874.

42. Dyson M. and Murray K. 1995. Selection of peptide inhibitors of interactions involved in complex protein assemblies: Association of the core and surface antigens of hepatitis В virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 2194-2198.

43. Earl P.L., Broder C.C., Doms R.W., Moss B. 1997. Epitope map of human immunodeficiency virus type 1 gp41 derived from 47 monoclonal antibodies produced by immunization with oligomeric envelope protein. J. Virol. 71: 2674-2684.

44. Eckert D.M. and Kim P.S. 2001. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition. Annu. Rev. Biochem. 70: 777-810.

45. Evans D.J., McKeating J., Meredith J.M., Burke K.L., Katrak K., John A., Ferguson M., Minor P.D., Weiss R.A., Almond J.W. 1989. An engineered poliovirus chimaera elicits broadly reactive HIV-1 neutralizing antibodies. Nature, 339: 385-8, 340.

46. Fack F., Hugle-Dorr В., Song D., Queitsch I., Petersen G., Bautz E.K. 1997. Epitope mapping by phage display: random versus gene-fragment libraries. J. Immunol. Methods 206: 43-52.

47. Feinberg H., Mitchell D.A., Drickamer K., Weis W.I. 2001. Structural basis for selective recognition of oligosaccharides by DC-SIGN and DC-SIGNR. Science 294: 2163-2166.

48. Folgori A., Tafi R., Meola A., Felici F., Galfre G., Cortese R., Monaci P., Nicosia A. 1994. A general strategy to identify mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries and human sera. EMBO Journal. 13: 2236-2243.

49. Gainor В., Putterman C., Valadon P., Spatz L., Scharff M.D., Diamond B. 1997. Peptide inhibition of glomerular deposition of an anti-DNA antibody. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 1955-1960.

50. Gauduin M.C., Parren P.W.H.I., Weir R., Barbas C.F., Burton D.R., Koup R.A. 1997. Passive immunization wiyh a human monoclonal antibody protects hu-PBL-SCID mice against challenge by primary isolates of HIV-1. Nat. Med. 3: 1389-1393.

51. Geysen H.M., Rodda S.J., Mason T.J. 1986. A priori delineation of peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol Immunol 149: 3903-3913.

52. Glaser F., Steinberg D.M., Vakser I.A., Ben-Tal N. 2001. Residue frequencies and pairing preferences at protein- protein interfaces. Proteins: Struct. Fund. Genet. 43: 89-102.

53. Glucksman M.J., Bhattacharjee S., Makowsky L. 1992. Three-dimensional structure of a cloning vector: X-ray diffraction studies of filamentous bacteriophage M13 at 7 A resolution. J. Mol Biol 226:455-470.

54. Greenwood J., Willis A., Perham R. 1991. Multiple display of foreign peptides on a filamentous bacteriophage: Peptides from Plasmodium falciparum circumsporozoite protein as antigens. J. Mol Biol 220: 821-827.

55. Grihalde N.D., Chen Y.C., Golden A., Gubbins E., Mandecki W. 1995. Epitope mapping of anti-HIV and anti-HCV monoclonal antibodies and characterization of epitope mimics using a filamentous phage peptide library. Gene 166: 187-195.

56. Guesdon J.L., Ternynck Т., Avrameas S. 1979. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139.

57. Habeeb A.F. and Atassi M.Z., 1971. Enzymic and immunochemical properties of lysozyme:

58. V. Derivatives modified at lysine residues by guanidination, acetylation, succinylation ormaleylation. Immunochemistry 8:1047.

59. Hanes J. and Pluckhun A. 1997. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-4942.

60. Healy J., Murayama O., Maeda Т., Yoshino K., Sekiguchi K., Kikuchi M. 1995. Peptide ligands for integrin alpha v beta 3 selected" from random phage display libraries. Biochemistry 34: 3948-3955.

61. Ho J., MacDonald K.S., Barber B.H. 2002. Construction of recombinant targeting immunogens incorporating an HIV-1 neutralizing epitope into sites of differing conformational constraint. Vaccine 20:1169-1180.

62. Ishikawa D., Taki T. 1999. Biocombinatorial chemistry, a novel approach using phage-displayed libraries in glycobiology. Sppesial reference to glyco-replica peptides. Trends in Glycoscience and Glycotechnology 11: 277-285.

63. Jelinek R., Terry T.D., Gesell J.J., Malik P., Perham R.N., Opella S.J. 1997. NMR sructure of the principal neutralizing determinant of HIV-1 displayed in filamentous bacteriophage coat protein. J. Mol. Biol 266: 649-655.

64. Jellis C.L., Cradick T.G., Rennet P., Salinas P., Boyd J., Amirault Т., Gray G.S. 1993. Defining critical residues in the epitope for a HIV-neutralizing monoclonal antibody using phage display and peptide array technologies. Gene 137: 63-68.

65. Jones S. and Thornton J.M. 1997. Analysis of protein-protein interaction sites using surface patches. J. Mol Biol. 272: 121-132.

66. Karlsson G.B., Gao F., Robinson J., Hahn В., Sodroski J. 1996. Increased envelope spike density and stability are not required for the neutralization resistance of primary human immunodeficiency viruses. J. Virol 70: 6136-6142.

67. Kay B.K., Adey N.B., He Y.-S., Manfredi J.P., Mataragnon A.H. Fowlkes D.M. 1993. An M13 library displaying 38-amino-acid peptides as a source of novel sequences with affinity to selected targets. Gene 128: 59-65.

68. Keiber-Emmons Т., Luo P., Qiu J., Agadjanyan M., Carey L., Hutchins W., Westerink M.A., Steplewski Z. 1997. Peptide mimicry of adenocarcinoma-assosiated carbohydrate antigens. Hybridoma 16: 3-10.

69. Kishchenko G., Batliwala H., Makowski L. 1994. Structure of a foreign peptide displayed on the surface of bacteriophage M13. J. Mol. Biol. 241: 208-213.

70. Klasse P.J. and Moore J.P. 1996. Quantitative model of antibody- and soluble CD4-mediated neutralization of primary isolates and T-cell line-adapted strains of human immunodeficiency virus type I. J. Virol. 70: 3668-3677.

71. Koivunen E., Gay D.A., Ruoslahti E. 1994. Selection of peptides binding to the alpha 5 beta 1 integrin from phage display library. J. Biol. Chem. 268: 20205-20210.

72. Kozak S.L., Piatt E.J., Madani N., Ferro F.E. J., Peden K., Kabat D. 1997. CD4, CXCR-4, and CCR-5 dependencies for infections by primaiy patient and laboratoiy-adapted isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 71: 873-882.

73. Kretz K., Callen W., Hedden V. 1994. Cycle sequencing. PCR Methods Appl. 3: 107-112.

74. Krook M., Mosbach K., Lindbladth C. 1994. Selection of peptides with affinity for single-stranded DNA using a phage display library. Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 849854.

75. Ku J. and Schultz P.G. 1995. Alternate protein frameworks for molecular recognition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552-6556.

76. Kwong P.D., Wyatt R., Majeed S., Robinson J., Sweet R.W., Sodroski J., Hendrickson W.A. 2000. Structures of HIV-1 gpl20 envelope glycoproteins from laboratory-adapted and primary isolates. Structure 8: 1329-1339.

77. Kwong P.D., Wyatt R., Robinson J., Sweet R.W., Sodroski J., Hendrickson W.A. 1998. Structure of an HIV gpl20 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature 393: 648-659.

78. Lener D., Benarous R., Calogero R.A. 1995. Use of a constraind phage displayed-peptide library for the isolation of peptides binding to HIV-1 nucleocapsid protein (NCp7). FEBS Lett. 361: 85-88.

79. Lerner R.A. 1982. Tapping the immunological repertoire to produce antibodies ofpredetermined specificity. Nature 299: 593-596.

80. Levitan B. 1998. Stochastic modeling and optimizaion of phage display. J. Mol. Biol. 277: 893-916.

81. Li H., Liu Z.Q., Ding J., Chen Y.H. 2002. Recombinant multi-epitope vaccine induce predefined epitope-specific antibodies against HIV-1. Immunol Lett. 84: 153-157.

82. Liao M., Lu Y., Xiao Y., Ding J., Dierich M.P., Chen Y.H. 2000. Induction of high level of specific antibody response to the neutralizing epitope ELDKWA on HIV-1 gp41 by peptide-vaccine. Peptides 21: 463-468.

83. Lu Y., Ding J., Chen Y.H. 2001. Immunogenicity and specificity of the candidate multi-epitope-vaccines against HIV-1. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 23: 487-94.

84. Luzzago A., Felici F., Tramontano A., Pessi A., Cortese R. 1993. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides. I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides. Gene 128: 51-57.

85. Mattheakis L.C., Bhatt R.R., Dower W.J. 1994. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 90229026.

86. Matthews D.J. and Wells J.A. 1993. Substrate phage: Selection of protease substrates by monovalent phage display. Science 260: 1113-1117.

87. Matthews D.J., Goodman L.J., Gorman C.M., Wells J.A. 1994. A survey of furin substrate specificity using substrate phage display. Protein Sci. 3: 1197-1205.

88. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. 1990. Phage antibodies: Filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature 348: 552-554.

89. McConnel S.J. and Hoess R.H. 1995. Tendamistat as a scaffold for conformationally constrained phage peptide libraries. J. Mol. Biol. 250: 460-470.

90. McDougal J.S., Kennedy M.S., Orloff S.L., Nicholson J.K., Spira T.J. 1996. Mechanisms of human immunodeficiency virus tipel (HIV-1) neutralization: irreversible inactivation of infectivity by anti-HIV-1 antibody. J. Virol. 70: 5236-5245.

91. McLafferty M.A., Kent R.B., Ladner R.C., Markland W. 1993. M13 bacteriophage displaing disulfide- constrained microproteins. Gene 128: 29-36.

92. McLain L. and Dimmock N.J. 1994. Single- and multi-hit kinetics of immunoglobulin G neutralization of human immunodeficiency virus type 1 by monoclonal antibodies. J. Gen. Virol 75: 1475-1460.

93. McMichael A.J. and Rowland-Jones S.L. 2001. Cellular immune responses to HIV. Nature 410: 980-987.

94. Means R.E., Greenough Т., Desrosiers R.C. 1997. Neutralization sensitivity of cell culture-passaged simian immunodeficiency virus. J. Virol. 71: 7895-7902.

95. Mennuni C., Santini C., Dotta F., Farilla L., Di Mario U., Fierabracchi A., Bottazzo G., Cortese R., Luzzago A. 1996. Selection of phage-displayed peptides mimicking type 1 diabetes-specific epitopes. J. Autoimmun. 9: 431-436.

96. Minnenkova O.O., Ilyichev A.A., Kishchenko G.P., Petrenko V.A. 1993. Design of specific immunogens using filamentous phage as the carrier. Gene 128: 85-88.

97. Mo H., Stamatatos L., Ip J.E., Barbas C.F., Parren P.W., Burton D.R., Moore J.P., Ho D. D. 1997. Human immunodeficiency virus type 1 mutants that escape neutralization by human monoclonal antibody IgGlbl2. J. Virol 71:6869-6874.

98. Montefiori D.C. and Evans T.G. 1999. Toward an HIV type 1 vaccine that generates potent, broadly cross-reactive neutralizing antibodies. AIDS Res. Hum. Retrovir. 15: 689698.

99. Moore J.P. and Ho D.D. 1993. Antibodies to discontinuous or conformationally sensitive epitopes on the gpl20 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 are highly prevalent in sera of infected humans. J. Virol. 61: 863-875.

100. Moore J.P. and Ho D.D. 1995. HIV-1 neutralization: the consequences of viral adaptation to growth on transformed T cells. AIDS Suppl A: SI 17-S136.

101. Moore J.P. and Montefiori D.C. 1997. Neutralization assays using the BZ167 strain of human immunodeficiency virus type I. J. Infect. Dis. 176: 1410-1412.

102. Moore J.P. and Sodroski J. 1996. Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gpl20 exterior envelope glycoprotein. J. Virol. 70: 18631872.

103. Motti C., Nuzzo M., Meola A., Galfre G., Felici F., Cortese R., Nicosia A., Monaci P. 1994. Recognition by human sera and immunogenicity of HBsAg mimotopes selected from an M13 phage display library. Gene 146: 191-198.

104. Muster Т., Guinea R., Trkola A., Purtscher M., Klima A., Steindl F., Palese P., Katinger H. 1994. Cross-neutralizing activity against divergent human immunodeficiency virus type 1 isolates induced by the gp41 sequence ELDKWAS. J. Virol. 68: 4031-4034.

105. Muster Т., Steindl F., Purtscher M., Trkola A., Klima A., Himmler G., Ruker F., Katinger H. 1993a. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type \.J. Virol 67: 6642-6647.

106. Nabel G.J. 2001. Challenges and opportunities for development of an AIDS vaccine. Nature 410: 1002-1007.

107. Nakai M. and Goto T. 1996. Ultrastructure and morphogenesis of human immunodeficiency virus. J. Electron Microsc. (Tokyo): 45:247-257.

108. Nord K., Gunneriusson E., Ringdahl J., Stahl S., Uhlen M., Nygren P.A. 1997. Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain. Nat. Biotechnol. 15: 772-777.

109. Ohkubo S., Miyadera K., Sugimoto Y., Matsuo K., Wierzba K. Yamada Y. 1999. Identification of substrate sequences for membrane type-1 matrix metalloproteinase using bacteriophage peptide display library. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266: 308-313.

110. Oldenburg K.R., Loganathan D., Goldstein I.J., Schultz P.G., Gallop M.A. 1992. Peptide ligands for a sugar-binding protein isolated from a random peptide library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5393-5397.

111. Olofsson S. and Hansen J. E. 1998. Host cell glycosylation of viral glycoproteins—a battlefield for host defence and viral resistance. Scand. J. Infect. Dis. 30: 435-440.

112. О'Neil K.T., Hoess R.H., Jackson S.A., Ramachandran N.S., Mousa S.A., DeGrado W.F. 1992. Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage peptide library. Proteins 14: 509-515.

113. Pai E.F., Klein M.H., Chong P., Pedyczak A. 2000. World Intellectual Property Organization Patent WO-OO/61618.

114. Pantaleo G., Demarest J.F., Vaccarezza M., Graziosi C., Bansal G.P., Koeing S., Fauci A.S. 1995. Effect of anti-V3 antibodies on cell-free and cell-to-cell human immunodeficiency virus transmission. Eur. J.Immunol. 25: 226-231.

115. Parmley S.F. and Smith G.P. 1988. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: Affinity purification of target genes. Gene 73: 305-318.

116. Parren P.W.H.I., Gauduin M.C., Koup R.A., Poignard P., Sattentau Q.J., Fisicaro P., Burton, D.R. 1997. Relevance of the antibody response against human immunodeficiency virus type 1 envelope to vaccine design. Immunol. Lett. 58: 125-132.

117. Parren P.W.H.I., Moore J.P., Burton D.R., Sattentau Q.J. 1999. The neutralizing antibody response to HIV-1: viral evasion and escape from humoral immunity. AIDS Suppl A: SI 37-S162.

118. Parren P.W.H.I., Wang M., Trkola A., Binley J.M., Purtscher M., Katinger H., Moore J.P., Burton D.R 1998b. Antibody neutralization-resistant primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 72: 10270-10274.

119. Pessi A., Bianchi E., Crameri A., Venturini S., Tramontano A., Sollaso M. 1993. A designed metal-binding protein with a novel fold. Nature 362: 367-369.

120. Petit M.A., Jolivet-Reynaud C., Peronnet E., Michal Y., Trepo C. 2003. Mapping of a conformational epitope shared between El and E2 on the serum-derived human hepatitis С virus envelope. J. Biol Chem. 278: 44385-44392.

121. Phalipon A., Folgori A., Arondel J., Sgaramella G., Fortungo P., Cortese R., Sansonetti P.J., Felici F. 1997. Induction of anti-carbohydrate antibodies by phage library-selected peptide mimics. Eur. J. Immunol 27: 2620-2625.

122. Pinter A., Honnen W.J., Kayman S.C., Trochev O., Wu Z. 1998. Potent neutralization of primary HIV-1 isolates by antibodies directed against epitopes present in the V1/V2 domain of HIV-1 gpl20. Vaccine 16: 1803-1811.

123. Pohlmann S., Baribaud F., Doms R.W. 2001. DC-SIGN and DC-SIGNR: helping hands for HIV. Trends Immunol. 22: 643-646.

124. Poignard P., Fouts Т., Naniche D., Moore J. P., Sattentau Q.J. 1996a. Neutralizing antibodies to human immunodeficiency virus type-1 gpl20 induce envelope glycoprotein subunit dissociation. J. Exp. Med. 183: 473-484.

125. Poignard P., Klasse P.J., Sattentau Q.J. 1996b. Antibody neutralization of HIV-1. Immunol. Today 17: 239-246.

126. Poignard P., Olmann Saphire E., Parren P.W.H.I., Burton D.R. 2001. GP120: Biologic Aspects of Structural Features. Annu. Rev. Immunol. 19: 253-274.

127. Poignard P., Sabbe R., Picchio G.R., Wang M., Gulizia R.J., Katinger H., Parren P.W.H.I., Mosier D.E., Burton D.R. 1999. Neutralizing antibodies have limited effects on the control of established HIV-1 infection in vivo. Immunity 10: 431-438.

128. Purtscher M., Trkola A., Grassauer A.P.M., Schuiz, Klima A., Dopper S., Gruber G., Buchacher A., Muster Т., Katinger H. 1996. Restricted antigenic variability of the epitope recognized by the neutralizing gp41 antibody 2F5. AIDS 10: 587-593.

129. Rizzuto C.D., Wyatt R., Hernandez-Ramos N., Sun Y., Kwong P.D., Hendrickson W.A., Sodroski J. 1998. A conserved HIV gpl20 glycoprotein structure involved in chemokine receptor binding. Science 280: 1949-1953.

130. Robertson G.A., Kostek B.M., Schleif W.A., Lewis J.A., Eminl E.A. 1988. A microtiter cell-culture assay for the determination of anti-human immunodeficiency virus neutralizing antibody activity. J. Virol. Methods. 20: 195-202.

131. Salzwedel K., West J.T., Hunter E. 1999. A conserved tryptophan-rich motif in the membrane-proximal region of the human immunodeficiency virus type 1 gp41 ectodomain is important for Env-mediated fusion and virus infectivity. J. Virol. 73: 2469-2480.

132. Sattentau Q.J., Zolla-Pazner S., Poignard P. 1995. Epitope exposure on functional, oligomeric HIV-1 gp41 molecules. Virology 206: 713-717.

133. Sattentau Q.J. 1998. HIV gpl20: double lock strategy foils host defences. Structure 6: 945-949.

134. Schonning K., Lund O., Segaard L.O., Stig H.J. 1999. Stoichiometry of monoclonal antibody neutralization of T-cell line-adapted human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 73: 8364-8370.

135. Scott J.K. 1992. Discovering peptide ligands using epitope library. Trends Biochem. Sci., 17, 241-245.

136. Scott J.K., Loganathan D., Easley R, Gong X., Goldstein I., 1992. A family of concanavalin A-binding peptides from a hexapeptide epitope library. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 5398-5402.

137. Scott J.K. and Smith G.P. 1990. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science 249: 386-390

138. Sibille P., Ternynck Т., Nato F., Buttin G., Strossberg D., Avrameas A. 1997. Mimotopes of polyreactive anti-DNA antibodies identified using phage-display peptide libraries. Eur. J. Immunol. 27: 1221-1228.

139. Smith G.P. Cloning in fuse vector: A laboratory manual. Division of Biological Sciences, University of Missoury, Columbia. 1992.

140. Smith G.P. and Petrenko V.A. 1997. Phage display. Chem. Rev. 97: 391-410.

141. Smith G.P., Patel S.U., Windass J.D., Thornton J.M., Winter G., Griffiths A.D. 1998. Small binding proteins selected from a combinatorial repertoire of knottins displayed on phage. J. Mol. Biol. 277: 317-332.

142. Smith G.P., 1985. Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the surface of the virion. Science 228: 1315-1317.

143. Smith G.P. and Scott J. 1993. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. Meth. Enzymol. 217: 228-257.

144. Sparks A.B., Adey N.B., Cwirla S., Kay B. 1996. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. / Eds Kay B.A, Winter J., McCafferty J. Acad. Press., pp. 227-253.

145. Taki Т., Ishikawa D., hamasaki H., Handa S. 1997. Preparation of peptides which mimic glycosphingolipids by using phage peptide library and their modulation on beta-galactosidase activity. FEBS Lett. 418: 219-223.

146. Thali M., Moore J.P., Furman C., Charles M., Ho D.D., Robinson J., Sodroski J. 1993. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gpl20 neutralization epitopes exposed upon gpl20-CD4 binding. J. Virol 61: 3978-3988.

147. Trkola A., Dragic Т., Arthos J., Binley J.M., Olson W.C., Allaway G.P., Cheng-Mayer C., Robinson J., Maddon P.J., Moore J.P. 1996a. CD4-dependent, antibody-sensitive interactions between HIV-1 and its со- receptor CCR-5. Nature 384: 184-187.

148. Tsunetsugu-Yokota Y., Tatsumi M., Robert V., Devaus C., Sprite В., Chermann J.-C., Hirsch I., 1991. Expression of an immunogenic region of HIV by a filamentous bacteriophage vector. Gene 99: 323-326.

149. Ugolini S., Mondor I., Sattentau Q.J. 1999. HIV-1 attachment: another look. Trends in Microbiology 7: 144-149.

150. Ugolini S., Mondor I., Parren P.W.H. I., Burton D.R., Tilley S.A., Klasse P.J., Sattentau Q.J. 1997. Inhibition of virus attachment to CD4+ target cells is a major mechanism of T cell line-adapted HIV-1 neutralization./. Exp. Med. 186: 1287-1298.

151. Valadon P., Nussbaum G., Boyd L.F., Margulies D.H., Scharff M.D. 1996. Peptide libraries define the fine specificity of anti-polysaccharide antibodies to Cryptococcus neoformans. J. Mol. Biol. 261: 11-22.

152. Van Regenmortel M.H.V. 1996. Mapping epitope structure and activity: from one-dimensional prediction to four-dimensional description of antigenic specificity. Methods 9: 465-472.

153. Veronese F.D.M., Willis A.E., Boyer-Thompsom C., Apella E., Perham R.N. 1994. Structural mimicry and enhanced immunogenecity of peptide epitopes displayed on filamentous bacteriophage. J. Mol. Biol. 243: 167-172.

154. Wang L.-F., Du Plessis D.H., White J.R., Hyatt A.D., Eaton B.T. 1995. Use of a gene-targeted phage display random epitope library to map an antigenic determinant on the blue-tongue virus outer capsid protein VP5. J. Immunol. Methods 178: 1-12.

155. Wang N., Zhu Т., Ho D.D. 1995. Sequence diversity of VI and V2 domains of gpl20 from human immunodeficiency virus type 1: lack of correlation with viral phenotype. J. Virol. 69:2708-2715.

156. Willis A.E., Perham R.N., Wraith D. 1993. Immunological properties of foreign peptides in multiple display on a filamentous bacteriophage. Gene 128: 79-83.

157. Wyatt R. and J. Sodroski. 1998. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science 280: 1884-1888.

158. Wyatt R., Kwong P.D., Desjardins E., Sweet R.W., Robinson J., Hendrickson W.A., Sodroski J.G. 1998. The antigenic structure of the HIV gpl20 envelope glycoprotein. Nature 393:705-711.

159. Wyatt R., Kwong P.D., Hendrickson W.A., Sodroski. J.G. 2001. Structure of the Core of the HIV-1 gpl20 Exterior Envelope Glycoprotein. HIV Sequence Database.

160. Wyatt R., Moore J., Accola M., Desjardin E., Robinson J., Sodroski J. 1995. Involvement of the V1/V2 variable loop structure in the exposure of human immunodeficiency virus type 1 gpl20 epitopes induced by receptor binding. J. Virol. 69: 5723-5733.

161. Xiao Y., Dong X.N., Chen Y.H. 2000a. Induction of monoclonal antibody with predefined ELNKWA epitope specificity by epitope vaccine. Hybridoma 19: 347-50.

162. Xiao Y., Dong X.N., Chen Y.H. 2000b. Induction of high levels of antibodies recognizing the neutralizing epitope ELDKWA and the D- or K-position-mutated epitopes by candidate epitope vaccines against HIV-1. Int. Arch. Allergy Immunol. 122: 287-92.

163. Xiao Y., Zhao Y., Lu Y., Chen Y.H. 2000. Epitope-vaccine induces high levels of ELDKWA-epitope-specific neutralizing antibody. Immunol. Invest. 29: 41-50.

164. Xu D., Tsai C.J., Nussiniv R. 1997. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces. Protein Eng. 10: 999-1012.

165. Yu M.W., Scott J.K., Fournier A., Talbot P.J. 2000. Characterization of murine coronavirus neutralization epitopes with phage-displayed peptides. Virology 271: 182-196.

166. Zhang H., Zhong Z., Pirofski L.A. 1997. Peptide epitopes recognized by a human anti-cryptococcal glucoronoxylomannan antibody. Infect. Immun. 65: 1158-1164.

167. Zwick M.B., Wang M., Poignard P., Stiegler G, Katinger H., Burton D.R., Parren P.W.H.I. 2001b. Neutralization Synergy of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Primary Isolates by Cocktails of Broadly Neutralizing Antibodies. J. Virology 75: 12198-12208.

168. Zwick M.B., Shen J., Scott J.K. 1998. Phage-displayed peptide libraries. Current Opinion in Biotechnology 9: 427-436.

Информация о работе

Туманова, Ольга Юрьевна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изучение эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, с помощью пептидных фаговых библиотек - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 моноклональными антителами 2F5 и 2G12, с помощью пептидных фаговых библиотек - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы