Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение действия некоторых антагонистов на фитопатогенные микроорганизмы и развитие растений

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение действия некоторых антагонистов на фитопатогенные микроорганизмы и развитие растений"

УЗБЕКСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи УДК 615.33:632.937

МАННЛНОВ Рустам Нигматович

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ АНТАГОНИСТОВ НА ФИТОПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ

06. 01. 11. - защита растений от вредителей и болезней

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1998

С

Работа выполнена на кафедре фитопатологии и физиологии растений Ташкентского Государственного Аграрного Университета и в лаборатории Коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент САТГАРОВА Р. К.

Официальные оппоненты:

Академик АН РУз, доктор биологических наук МАВЛАНИ М. Э. доктор сельскохозяйственных наук, профессор ХАКИМОВ А. X.

Ведущая организация — Ташкентский Государственный Университет им. М.Улугбека, биолого—почвенный факультет.

на заседании Специализированного Совета Д.020.50.01 при Узбекском научно—исследовательском институте защиты растений по адресу: 700140, г. Ташкент 140, УзНИИЗР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Узбекского научно—исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан " 23" СМ^д^^Х 1998 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор сельскохозяйственных

Защита состоится

наук

Яхяев Х.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Бактериальные, грибные и вирусные заболевания сельскохозяйственных растений значительно снижают урожайность и наносят большой ущерб экономике сельского хозяйства нашей Республики. Поэтому вопросы разработки эффективных средств борьбы с фитопатогенными микроорганизмами постоянно находятся в центре внимания науки и производства.

В последнее время сильно возросла озабоченность по поводу чрезмерного наличия синтетических химических веществ в пищевых продуктах и в самой окружающей среде. Одним из источников накопления химикатов в почве является использование последних в качестве минеральных удобрений, а также в защите растений. Поэтому, в связи с опасностью отрицательного воздействия применяемых химикатов на здоровье человека и животных, в настоящее время внимание ученых направлено на поиск биологических средств борьбы с фитопатогенными микроорганизмами.

Оценка последних результатов по использованию биологических агентов для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами показывает, что биологический метод имеет большое будущее в сельском хозяйстве, как разумная с точки зрения охраны окружающей среды замена ядохимикатов, применяющихся в настоящее время для воздействия на сельскохозяйственные культуры.

Исследования в области использования микробов-антагонистов и продуктов их метаболизма в качестве биологической борьбы с фитопатогенными микроорганизмами свидетельствуют об актуальности и перспективности проведения поисков антагонистических микроорганизмов и изучения их действия на фитопатогенные микроорганизмы и продуктивность сельскохозяйственных культур.

Цель работы. Изучить действие некоторых наиболее активных бактерий - антагонистов на фитопатогены, вызывающие основные болезни хлопчатника для создания, в будущем, комплексного биопрепарата для защиты растений от болезней.

Задачи исследования.

1) Изучить антагонистический спектр действия бактерий -антагонистов к возбудителям основных болезней хлопчатника;

2) установить влияние различных концентраций культураль-ной жидкости бактерий - антагонистов на всхожесть и развитие семян некоторых сельскохозяйственных культур;

3) установить влияние клеточной суспензии бактерий - антагонистов на всхожесть, развитие семян некоторых сельскохозяйственных культур и их поражаемость фитопатогенами;

4.) определить биологическую эффективность использования антагонистов для предпосевной обработки семян хлопчатника;

5) определить влияние антагонистов на полезную почвенную микрофлору - представителей азотфиксирующих бактерий родов Azotobacter и Rhizobium;

6) выделить и изучить природу антибиотических веществ, продуцируемых В. subtiiis 23:

7) изучить характер действия антибиотических веществ, продуцируемых В. subUUs на клетки фитопатогенов Rhizoctonia solani и Fusarium oxysporm var.vasinfectum.

Научная новизна. Впервые изучена антагонистическая активность некоторых активных бактерий - антагонистов к фитопато-генным микроорганизмам, вызывающим основные болезни хлопчатника (Xanthomonas malvacearum. Rhizoctonia solani, Verticillium äahliae, Fusarium оxysporum var.vasinfectum). Выделены и очищены антибиотические вещества, продуцируемые штаммом В. subtiiis 23, установлены природа и характер их токсического действия. Составлена сравнительная характеристика почвенного и эн-дофитного штаммов антагонистов В. subtiiis. Показано стимулирующее действие метаболитов антагонистов на всхожесть семян хлопчатника и некоторых других сельскохозяйственных растений, их развитие, урожайность, а также снижение поражаемости фитопатогенами. Обоснована целесобразность использования штамма В. subtiiis 23 и продуктов метаболизма при разработке эффективных, экологически безвредных биопрепаратов для защиты растений.

Практическая ценность. Результаты лабораторных и мелко-деля-ночных опытов научно обосновывают целесобразность использования изученных антагонистов и продуктов их метаболизма при разработке эффективных средств защиты растений и могут служить основой для биотехнологии повышения урожайности хлопчатника и других сельскохозяйственных культур, что имеет существенное значение для дальнейшего развития сельскохозяйственной отрасли в Республике Узбекистан.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и опубликованы в виде тезисов на II Европ. конфер. "Молекулярная

биология клеточных взаимодействий" (Германия, 1995); Республиканской конфер. "Экологические проблемы приамударьинского региона Средней Азии" (Бухара, 1995); XIII Междунар. конгр. по защите растений (Нидерланды, 1995); научной конференции, посвященной 5-летию Независимости Республики Узбекистан и 660-летнему юбилею Амира Тимура (Ташкент, 1996); научно-практической конфер. "Экологические аспекты рационального использования почв" (Ташкент, 1997); 17-гом Междунар, конгр. по биохимии и молекулярной биологии (США, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 10 печатных работ, из которых 6 журнальных статей и 4 тезиса докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения результатов, выводов, рекомендаций науке и списка использованной литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 18 рисунков. Список литературы включает 139 источников, опубликованных в республиканских и зарубежных изданиях.

Автор выражает глубокую благодарность проф. Ж. С. Сафиязову за руководство и помощь при выполнении микробиологических исследований.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе приведен анализ современного состояния проблемы по разработке биологических методов защиты растений с использованием природных микроорганизмов-антагонистов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили наиболее активные бактерии • - антагонисты Pseudomonas fluorescens 41, Bacillus subtilis 23, В. megaterium 26, ранее изученные к 7 видам фитопатогенных бактерий аспирантом кафедры Фитопатологии ТашГАУ Шукри Мохамедом Эль Греми (1990). В. subtilis N была выделена из биопрепарата Хлопкоспорин (Менликиев и др.. 1992).

Фитопатогенные микроорганизмы Xanthomonas malvacearum, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum var. vasinfectum. Ver-ticUUum dahliae были любезно предоставлены лабораторией Кол-

лекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз и кафедрой Фитопатологии ТашГАУ. Клубеньковые бактерии: Rhizobium Japon! cum 966, й. japonicum 1141, R. trifolii 329, R. meliloti Д и свободноживущие азотфиксирующие бактерии: Azotobacter chroo-coccum 19, A. chroococcum 17, A. chroococcum 514, A. agita 7, были таете любезно предоставлены лабораторией Коллекции микроорганизмов Института микробиологии АН РУз.

Бактерии-антагонисты в зависимости от эксперимента культивировали на пептонном бульоне или на пептонном агаре. Возбу-детель гоммоза хлопчатника X. malvacearum культивировали • на картофельном агаре, а грибные фитопатогены культивировали на среде Чапека. Азотфиксирующие клубеньковые и свободноживущие бактерии культивировались на среде Эшби.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности микроорганизмов изучали по общепринятым методам, описанным в руководствах по микробиологии (Егоров, 1976; Скворцова, 1984; Bergey's manual of det. bacteriology, 1974).

Антагонистическое действие бактерий-антагонистов изучали методом агаровых блочков, описанным Cooksey D.А. и Moore L.W. (1980). Для изучения влияния культуральной жидкости бактерий-антагонистов на всхожесть, развитие и продуктивность сельскохозяйственных культур использовали семена средневолокнистых сортов 108 - Ф и Киргизский - 3 со средней массой каждого 100-120 мг, а также семена фасоли, кукурузы, пшеницы и огурца. Статистическую обработку данных проводили по Доспехову В. А. (1985). С целью изучения культуральной жидкости антагонистов на всхожесть, и урожайность хлопчатника, а также его поражае-мость фитопатогенными микроорганизмами был заложен мелко-деля-ночный опыт (междурядье - 60 см) на опытном участке кафедры Фитопатологии и физиологии растений ТашГАУ. Посев обработанных в зависимости от варианта опыта семян хлопчатника производили в первой декаде мая, а сбор урожая в третьей декаде сентября. Полив производили 6 раз. Подсчет процента пораженности корневой гнилью хлопчатника проводили по количеству пораженных всходов, а пораженность растений гоммозом производили по Schi-hata Z.А. (1974). Биологическую эффективность определяли по методике, описанной Дементьевой М.И. (1997).

С целью изучения сравнительных физиолого-биохимических

особенностей В. subtilis. штаммы культивировались в 2-х литровых колбах Эрленмейера. содержащих 1 л пептонного бульона на круговой качалке (170 об/мин) при 27°С. Для экстракции антибиотических веществ из 2х-литровой колбы брали 400 мл культу-ральной жидкости через каждые 5 ч. замеряли ее значение рН. затем измеряли оптическую плотность"(0П-550 нм) культуральной жидкости на спектрометре (UNICAM 8625 UV/VIS spectrometer, England), проводили экстракцию антибиотических веществ из надосадочной жидкости хлороформом, который упаривали под вакуумом на роторном испарителе (BUCHÍ 011 RE 111, с водяной баней BUCHI 461, Swltzerland). Антибиотические вещества элюи-ровали из полученного осадка 80%-ным этаном, фракционировали методом ТСХ на 20 X 20см силика гелевых пластинках (Silica gel 60 F-254 tfluoresclng indicator] Curtin-Matheson Scientiflc. Inc., Houston, TX). и использовали для проведения масс-спект-рометрического анализа на масс-спектрометре МХ-1310.

Фазово-контрастное микроскопирование и микрофотографирование проводили с использованием микроскопов МБИ-3, МБИ-6, Nikon UFX-DX с флюорецентным фильтром И-2А. фотонасадки МФН-15.

Единицы биологической активности выделенных антибиотических веществ определяли по Егорову Н.С. (1986). Построение графиков и статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ CA-Cricket Gragh III и Excel V.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Антагонистические свойства исследуемых бактерий

Настоящая работа является продолжением исследований, начатых Шукри М. Эль-Греми (1990), который изучил антагонистическую активность более 40 штаммов спороносных и неспороност-ных бактерий к семи видам фитопатогенных бактерий - Xanthomo-nas malvacearum, X. campesiris. X. phaseoli, X. vesicatoria, Ervinia carotovora, Agrobacteríum tumefaciens, Pseuáomonas lachrymans. и отметил высокую антибактериальную активность штаммов Р.fluorescens, В. subtilis 23 и В. megaterium 26.

Нам было интересно изучить влияние этих наиболее активных бактерий - антагонистов к возбудителям основных болезней хлопчатника (Xanthomorias malvacearum, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum var. vasinfectum, Verticillium dahliae). В качестве

контроля мы использовали бактерию В. зиЫШБ, которая была выделена нами из биопрепарата Хлопкоспорин и поименована как штамм N.

Изучение антимикробного действия исследуемых микроорганизмов показало, что наиболее активными антагонистами по отношению к возбудителям болезней хлопчатника оказались штаммы В. вимтв (табл.3.1.1.).

Таблица 3.1.1.

Влияние бактерий-антагонистов на фитопатогенные микроорганизмы

Бактерии - Диаметры зон угнетения фитопатогенов, мм

антагонисты-------

Х.тпаЬрасеагт V. йаНПае ¥. Уаз1п1ес1ит К.эоШШ

P.fluor es-

cens 41 26.25 + 2.8 20.25 + 1.4 23.25 + 2.8 22.0 + 4.1

В. subtilis 23 35.0 + 2. 4 32.5 + 1.4 19. 25 + 2. 8 31. 25 + 2. Э

В. subtilts N 34.8 + 2.1 18.7 + 4.26 28.4 + 2.7 28.5 + 7.3 В. megaterium

26 23.0 + 2.4 24.25 + 2."8 15.25 + 2.7 18.75 + 2.8

3.2. Сравнительное изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов Bacillus subtilis

Нам было интересно выяснишь, имеются ли существенные культурально - морфологические и физиолого - биохимические различия между относящимися к одному виду В. subtilis штаммами 23 и N, которые могут влиять на антимикробную активность.

В результате исследований установлены незначительные различия по морфологии микроорганизмов, скорости клеточного деления и антибиотикообразования, интенсивности гидролиза крахмала и желатины, пептонизации молока, каталазной и уреазной активностях. Данные процессы протекали более интенсивно у штамма В. subtilis N, по сравнению со штаммом 23.

В целом, сравнительное изучение культурально - морфологических и физиолого - биохимических свойств штаммов ß.subtilis не выявило существенных различий.

3.3. Влияние метаболитов микробов - антагонистов на всхожесть семян хлопчатника и других сельскохозяйственных культур, их рост и развитие

Следующим этапом наших исследований было изучение влияния различных концентраций культуральной жидкости взятых в опыт антагонистов на всхожесть семян хлопчатника и развитие проростков. Полученные результаты показали, что по мере увеличения концентрации культуральной жидкости процент всхожести семян снижается, что находится в соответствии с данными Шукри М. (1990) и других исследователей, отмечавших, что эффект стимуляции обычно проявляется при низких концентрациях метаболитов антагонистов и исчезает по мере их увеличения.

Из полученных результатов видно, что культуральная жидкость испытанных нами микробов - антагонистов в 10%-ной концентрации оказывала стимулирующее действие на всхожесть семян, длину и массу проростков хлопчатника, а с увеличением концентрации культуральной жидкости наблюдалось ее ингибирукщее действие (табл. 3.3.1.).

Результаты наших исследований показали, что культуральные жидкости антагонистов в 10%-ной концентрации оказывали стимулирующий эффект на всхожесть семян хлопчатника сортов 108-Ф и Киргиский-3. Причем, наибольшим стимулирующим действием обладала 10%-ная культуральная жидкость антагониста В. втлЫгИз 23.

В связи с тем, что в культуральной жидкости антагонистов, кроме клеток микроорганизма и продуктов' его метаболизма, содержатся также элементы питательной среды, которые могут стимулировать всхожесть и развитие растений мы изучали влияние питательной среды на выше указанные параметры.

Установлено, что питательная среда оказывает стимулирующий эффект на всхожесть семян хлопчатника, длину и массу проростка (табл. 3.3.2.). Однако, в вариантах с использованием культуральных жидкостей антагонистов данные параметры были выше, что указывает на положительный эффект метаболитов бактерий-антагонистов. Аналогичные результаты были получены нами также при использовании семян фасоли, кукурузы, пшеницы, огур-

Таблица 3.3.1. Влияние различных концентраций культуральной жидкости антагонистов на всхожесть, рост и развитие хлопчатника

Разведение 10 % 25 % 50 % 100 %

Сорт хлопчатника 108-Ф Всхожесть (%)

Контроль (вода) 68+16.4 P.fLuorescens 41 83.3+16.4

B.subtilis 23 B.megaterim 26

Контроль (вода) P. fluoresceins 41 В.subtilis 23 B.megaterium 26

Контроль (вода) P.fluorescens 41 В.subtilis 23 B.megaterium 26

86.6+16.4 63.3+16.4

4.7+0.9 3. 06+0. 3 6. 2+0. 6 5. 9+0. 5

516+59 588+71 651+79 704+71

60. 0+27.8 51.6+16.5 43.6+16.4

45.0+27.8 45.0+16.6 26.6+16.5

Длина проростка (см)

4.8+0. 8 3.5+0.8 4.9+0.8 3.8+0.9 4.7+0.5 3.2+0.4 Масса проростка (мг)

471+59 500+57 481+79

311+43

375+111

311+59

Сорт хлопчатника Киргизский-3

Всхожесть (.%)

Контроль (вода) 82.0+16.5 P.fluorescens 41 91.6+16.5 B.subtilis 23 98.3+16.5 B.megaterium 26 91.6+16.4

81.6+1Б.5 88. 3+16.4 80.0+16.5

53. 3+16.5 58.3+16.4 63.3+16.4

Контроль (вода) 6.5+0.5

P. fluorescens 41 7.7+1.0

В.subît Its 23 8.2+0.4

B.megaterium 26 7.4+0.3

Контроль (вода) 655+79

P. fluorescens 41 765+168

B.subtilis 23 790+57

B.megaterium 26 704+71

Длина проростка (см)

5.6+0.4 3.9+0.7 5.9+0.3 4.2+0.6 5.2+0.5 3.7+0.7 Масса проростка (мг)

541+79 571+71 524+170

423+93 465+69 422+96

21.6+16.5 18.3+16.5 13.3+16.4

2.3+1.0 2.6+0.4 2.2+0.3

176+86 194+71 166+139

36.6+16.5 33.3+16.4 21.6+16.5

2.3+0.3 2.4+0. 6 1.9+0.7

242+71 245+79 213+69

Влияние 10 %-ной культуральной жидкости антагонистов на всхожесть семян различных сельскохозяйственных культур, их рост и развитие

Варианты Сельскохозяйственные культуры

опыта хлопчатник фасоль кукуруза пшеница огурец

Контроль(вода) 80.0+16.5 100 Пит. среда (ПБ) 81.0+16.4 100,

Всхожесть (%) 68. 0±16. 4 73. 3+16. 5

98.3+16.5 68.0+16.4

100

73.3+16.4

В. subtilis 23 83.3+16.4 100 86.6+16.4 100 82.3+16.:

В. subtilis N 83. 3+16. 4 100 83.3+16.4 100 86. 6+16..

В. megate-

rium 26 82. 3±16. 5 100 79.3+16.4 100 78. 0+16.;

Длина . проростка (см)

Контроль(вода) 4.6+0.6 4.2+1.2 2.1+0.6 1.0+0.3 0. 7+0. 2

Пит.среда (ПБ) 5. lfl.O 4.4+0. 6 2.1+0.7 1.2+0.3 0. 8+0. 2

В. subtilis 23 6.2+0.6 5.0+1.0 2. 2+0. 7 1.6+0.6 1.0+0.4

В. subtilis N о. 1+0.8 4.8+1.4 2. 2+0. 8 1.7+0.7 1.0+0.4

В. megate-

rium 26 5.6+1.2 4.6+1.1 2.1+0. 6 1.3+0.4 0. 8+0. 3

Масса проростка (мг)

Контроль(вода) 578+147 593+68 600+126 90+35 65+14

7ит.среда (ПБ) 599+162 605+79 740+200 105+35 71+21

3.subtilis 23 663+201 770+92 820+161 138±49 91+28

3. subti lis N 667+201 771+107 844+205 140+57 87+28

3. megate-

Чит 26 620+197 692+129 778+201 126+49 80+22

- и -

3.4. Влияние клеточной суспензии антагонистов на всхожесть семян хлопчатника, развитие всходов и их поражаемость корневой

гнилью и гоммозом

Чтобы определить действие бактерий антагонистов на всхожесть и развитие хлопчатника исключив влияние элементов питательной среды, мы изучали влияние клеточной суспензии бактерий.

Результаты наших исследований показали положительное действие клеточной суспензии антагонистов. Так, поражаемость всходов хлопчатника корневой гнилью снижалась с 80.0% до 40.0%, гоммозом - с 35.4% до 10.0%. Клеточные суспензии антагонистов также стимулировали всхожесть семян и высоту проростков. Наибольший положительный эффект показали культуры В. subtilis 23 и В. subtilis N. (табл. 3.4.1.)

Результаты опытов показали, что изучаемая нами культура В. subtilis 23 обладала высокой стимулирующей и биоконтролирую-щей активностями, и не уступала выделенному из биопрепарата Хлопкоспорин бактериальному штамму В. subtilis N.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований указывают на целесобразность использования культуры В. subtilis 23 как потенциального агента при разработки биопрепарата для предпосевной обработки семян в борьбе с фитопатогенными микроорганизмами.

3.5. Действие 10%-ной культуральной жидкости антагонистов

на урожайность хлопчатника и его поражаемость корневой гнилью и гоммозом

С целью изучения влияния продуктов метаболизма взятых в опыт антагонистов на всхожесть семян, урожайность хлопчатника а также его поражаемость наиболее вредоносными в условиях Узбекистана болезнями - возбудителями корневой гнили и гоммоза, мы закладывали мелко-деляночный опыт.

Результаты опыта подтвердили стимулирующее действие исследуемых бактерий-антагонистов на всхожесть семян, что совпадает с проведенными нами ранее лабораторными исследованиями.

Наибольший процент всхожести семян наблюдался при использовании 10 % - ной культуральной жидкости В. subtilis 23. Так, например, в 1995 году данный показатель составил сорта Кир-гизский-3 - 94.О %. а у сорта 108 - Ф 90.О % против 78.5 % И 75.4 % соответственно в контроле (3,5.1.).

Влияние клеточной суспензии антагонистов В. БиЬЬЩэ 23 и В. БиШНгв N на всхожесть семян хлопчатника (сорт Киргизский-3), длину проростка и его поражаемость гоммозом и корневой гнилью

Варианты опыта Всхожесть, Высота Поражаемость,

% проростка. см %

Контроль 100 8.0 -

В. subtilis 23 100 9.1 -

В. subtilis N 100 9.1 -

В. megaterium 26 100 8.9 -

X. malvacearum 60 6.5 35.4

X. malvacearum +

В. subtilis 23 100 7.2 10. 0

X. malvacearum +

В. sub Ellis N 100 7.1 10:25

X. malvacearum +

B. megaterium 26 80 6.9 30.3

R. solarii 20 3.2 80.0

■R. solani ■*■

B. subtilis 23 80 4.9 40.0

R. solani +

B. subtilis N 80 4.6 40.0

R. solani +

B. megaterium 26 60 3.4 60.0

HCP (0.05) 20.0 0. 64 13.5

Влияние 10 %-ной культуральной жидкости антагонистов на всхожесть семян хлопчатника сортов 108-Ф и Киргизсккй-3

Варианты Всхожесть. %

опыта 100 - Ф Киргизский - 3

1993 1994 1995 1993 1994 1995

Контроль 76.6 75.0 75. 4 80. 0 78. 5 78. 5

Р. Т1иогезсепв 41 89. 0 88.3 89. 1 94. 0 94.0 94. 8

В. БиЫШз 23 91. 0 90.0 90. 8 94. 3 93. 3 94. 0

В. mвgaterгum 26 86. 6 84.4 85. 9 89. 0 88. 6 89. 0

Хлопкоспорин 95. 3 90.3 93. 1 98. 0 98. 0 96. 3

Триходермин 86. 6 83.4 85. 2 90. 0 89. 3 88. 5

X. ш1уасеагшп 50. 0 50.0 49. 6 55. 0 56.0 56. 3

X. malva.cea.rum

+ Р.fluorescens 41 66. 6 64.0 65. 1 63.3 63. 0 62. 7

+ В. зиЪШгэ 23 75. 3 75.3 75. 6 78.0 76. 5 77. 1

+ В.теваЬегЛит 26 60.0 55.4 58. 9 65. 0 64. 9 65. 0

+ Хлопкоспорин 78. 4 76.6 76. 9 80. 4 80. 0 80. 7

+ Триходермин 63. 3 60.0 62. 7 65. 0 62. 0 64. 7

Я, йо 1ап1 00. 0 00.0 00. 0 1. 5 1. 5 1. 0

й. гоШпг . *

+ Р^Ыагезсепэ 41 50. 0 50.0 50. 0 56. 6 52. 9 54. 0

+ В.зиЫШз 23 55. 0 56.3 55. 4 61. 3 60. 3 61. 0

+ В. теяаЬеггшл 26 48. 3 47.3 50. 0 59. 0 57. 3 58. 1

+ Хлопкоспорин 57. 3 55.0 56. 7 60. 0 60. 0 61. 2

+ Триходермин 50. 0 50.5 50.0 55. 0 50. 9 49. 8

Изучение влияния 10%-ной культуральной жидкости антагонистов на поражаемость хлопчатника корневой гнилью и гоммозом показало положительный эффект на снижение поражаемости фитапа-тогенами. Так. штамм В. subti lis 23 оказывал наилучший эффект в вариантах с семенами, предварительно инфецированными возбудителем гоммоза хлопчатника, и на инфекционном фоне R. sotaní (3.5.2.).

Анализ 3-х летних полученных данных по пораженности растений хлопчатника семядольной и листовой формами гоммоза, указывает на то, что эффект от использования антагонистов для предпосевной обработки инфецированных семян особенно ярко проявляется в фазе семядолей.

Так. если пораженность гоммозом в варианте опыта с инфецированными и обработанными в культуральной жидкости B.subti-lis 23 семенами, пораженность семядольной формой составила 35.3 % и 31.7 % у сортов Ю8-Ф и Киргизский-3 соответственно, то пораженность листовой формой в этом же варианте была 77.9 % и 75.1 % соответственно.

Полученные результаты показали, что предварительная обработка семян хлопчатника оказывала положительный эффект на повышение урожайности растений по сравнению с соответствующими контрольными вариантами (3.5.3.).

Так. например, в 1995 году в контроле, где семена не подвергались обработке урожай составил 34.0 ц/га и 34.3 ц/га на сортах 108 -Фи Киргизский ~ 3 соответственно, тогда как в опыте с предпосевной обработкой семян 1Й %- ной культуральной жидкостью В. subtiUs 23, урожайность составила 39.8 и 40.0 ц/га соответственно. Урожайность обоих сортов хлопчатника в вариантах опыта с зараженными и обработанными в 10%-ной культуральной жидкости антагонистов была также выше, чем в контроле с инфецированными семенами. Так. в 1995 году в варианте опыта с предварительно инфецированными X. malvacearum и обработанными в культуральной жидкости В. subtilis 23 семенами, урожайность составила 30.0 ц/га и 30.6 ц/га у сортов 108-Ф и Киргизский-3 соответственно, а в варианте опыта без обработки культуральной жидкостью антагониста, этот показатель был 22.1 ц/га и 22.5 ц/га соответственно.

Таблица 3.5.2.

Влияние 10 %-ной культуральной жидкости антагонистов на поражаемоеть хлопчатника сортов 108-Ф и Киргизский-3 гоммозом и корневой гнилью

Варианты 108 - Ф Киргизский - 3

опыта 1993 1994 1995 1993 1994 1995

Процент поражаемости всходов гоммозом семядольной формы, й

Контроль 90. 8 88. .6 89. 0 75. 9 74. 3 74. 7

Р.ТШогезсепв 41 40. 0 42. . 1 41. 8 33. 3 34. 8 32. о

В.зиЫШз 23 35. 1 36. 6 34. 3 31. 0 32. 2 31. 8

В.теяаЕетЧит 26 55. 4 57. .0 54. 9 53. 3 55. 3 56. 0

Хлопкоспорин 34. 9 37. 6 34. 9 31. 9 31. 7 32. 0

Триходерммн 50. 8 51. 0 50. 1 57. 0 56. 6 58. 9

Процент поражаемое™ всходов корневой гнилью, %

Контроль 92. 1 90. .0 90. 5 85. 0 90. 0 86. 7

Р.Т1иогеБсепз 41 31. 6 31. 8 30. 9 30. 1 31. 9 27. 0

В.быЫШЗ 23 30. 6 30. 8 30. 3 30. 5 30. 0 25. 0

В.теёаЬеПит 26 50. 9 51. 4 51. 9 49. 4 50. 4 50. 0

Хлопкоспорин 30. 6 32. 0 29. 2 29. 9 27. 0 27. 0

Триходермин 31. 2 31. 9 33. 3 31. 0 30. 3 29. 8

Таблица 3.5.3.

Урожай хлопка - сырца в пересчете на га в центнерах по мелко - деляночному опыту на опытном участке ТашГАУ

Варианты Урожайность, ц/га

опыта 108 - Ф Киргизский - 3

1993 1994 1995 1993 1994 1995

Контроль 35. .2 33. .7 34. 0 35. .7 33. .8 34. . 3

Р.. fluorescens 41 38. .7 36. . 7 37 .6 38. 3 36. .9 37. 9

В. subtiUs 23 40. . 1 39. . 0 39. .8 40. 4 39. .4 40. 0

В. megateríum 26 37. .2 35. ,3 36. .4 37. 8 35. . 7 36. .9

Хлопкоспорин 39. 9 38. . 1 38. .8 40. 2 38. .6 39. 1

Триходермин 36. 4 34. . 1 37. .8 36. 7 34. .5 38. 3

X. malvacearum 23. .0 20. 6 22. 1 23. 9 20. 9 22. 5

X. malvacearum

+ Р.fluorescens 41 28. 3 27. 1 27. 2 28. 5 27. 6 27. 5

+ В.subti lis 23 30. 7 27. 9 30. 0 30. 9 28. 2 30. 6

+ В.megateriwn 26 24. 8 22. 1 23. 1 25. 0 22. 4 23. 5

+ Хлопкоспорин 28. 2 26. 3 27. 2 28. 8 26. 7 27. 6

+ Триходермин 24. 0 21. 9 23. 0 24. 7 22. 4 23. 3

•R. solani 16. 4 13. 8 15. 7 16. 9 14. 1 16. 1

R, so lani

+• P. fluorescens 41 24. 0 22. 3 23. 9 " 24. 7 22. 7 24. 1

+ B.subtilis 23 27. 1 25. 4 26. 2 27. 6 25. 8 26. 8

+ B.megaterium 26 19. 9 17. 6 18. 3 20. 3 17. 9 18. 8

+ Хлопкоспорин 26. 8 24. 7 25. 5 27. 1 25. 0 25. 9

+ Триходермин 27. 9 24. 8 26. 3 28. 2 25.3 26. 8

Таким образом, результаты мелко-деляночного опыта показали, что 10%-ная культуральная жидкость В. виЬЬИгз 23 оказывала наилучший эффект на всхожесть семян хлопчатника сортов 108~ф и Киргизский-3, их урожайность, а также на снижение по-ражаемости растений возбудителями гоммоза хлопчатника и корневой гнили.

3.6. Биологическая эффективность предпосевной обработки семян хлопчатника 10%-ной культуральной жидкостью бактерий - антагонистов

При определении биологической эффективности.использования ■ 10%-ной культуральной жидкости взятых в опыт антагонистов для предпосевной обработки семян хлопчатника сортов 108-Ф и Кир-гизский-3 установлено, что самая высокая биологическая эффективность проявлялась при использовании штамма В. зиМгиэ 23 (табл. 3. 6.1.).

Таблица 3.6.1.

Биологическая эффективность предпосевной обработки семян хлопчатника 10 %-ной культуральной жидкостью антагонистов Среднее за 1993-1995 гг.

Варианты опыта Пораженность Биологическая

% эффективность, %

сорт 1С8-Ф

Контроль (X. malvacearum) 89.5

X.malvacearum + P.fluorescens 41 41.3 53. .8

X. malvacearum + B.subtilis 23 35.3 60. 5

X. malvacearum + B.megaterium 26 55.8 37. 6

X.malvacearum + Хлопкоспорин 35.8 60. 0

X. malvacearum + Триходермин 50.6 43. 4

Контроль (tf.solani) 90.9

R.solani + P.fluorescens 41 31. 4 65. 4

.R.solani + B.subtilts 23 30.5 66. 5

R.solani + B.megaterium 26 51.4 43. 4

R.solani + Хлопкоспорин 30.6 66. 3

R.solani + Триходермин 32. 1 64. 6

сорт Киргизский-3

Контроль {X.malvacearum) 75.0 :

X. malvacearum + P.fluorescens 41 33.7 55. 1

X. malvacearum +• B.sub tilis 23 31.7 57. 7

X. malvacearum + B.megaterium 26 54.9 26. 8

X. malvacearum *■ Хлопкоспорин 31.9 57. 4

X.malvacearum + Триходермин 57.5 23. 3

Контроль (R.solani) 87.2

fi.solani + P.fluorescens 41 29.6 66. 0

R.solani + B.subtilis 23 28.5 67. 3

R.solani + B.megaterium 26 49.. 9 42. 7

R.solani + Хлопкоспорин 28.0 67. 8

R. solani + Триходермин 30.3 65. 2

3.7. Влияние бактерий - антагонистов на представителей полезной почвенной микрофлоры

В связи с тем, что после предпосевной обработки семян бактерии - антагонисты попадают вместе с семенами в почву, нам было интерестно узнать, какое влияние они могут оказывать на представителей полезной почвенной микрофлоры, в частности, на азотфиксирующне микроорганизмы.

В результате исследований установлено, что антагонисты лишь в некоторых вариантах оказывают слабый ингибирующий эффект и, следовательно, не предсталяют опасности для фзотфиксирующих клубеньковых и свободноживущих микроорганизмов (табл. З.7.1.).

Таблица 3. 7.1.

Влияние бактерий - антагонистов на азотфиксирующне бактерии

Азотфиксирующие Диаметры зон угнетения, мм

бактерии -------------

Р.flúores- В. subti- B.subti- B.mega-cens 41 lis 23 lis N terium 26

Клубеньковые бактерп;:: Rhizobium japonicum 966 R. japonicum 1141 R. trifolii 329

R. meliloti Д 11 ± 3.1

8 + 1.3

9 + 4. 2 8 ± 2. 1

12 + 4.2

Свободноживушие азотфиксирующие бактерии: Azotobacter

chroococcum 19 8 ± 2.5 A. chroococcum 17 -

A. chroococcum 514 A. agila 7 -

3.8. Природа антибиотических веществ, продуцируемых штаммами В. subtHis

Для выяснения механизма антагонистической активности изучаемых штаммов В. subtг lis мы выделяли биологически активные

вещества из культуральных жидкостей антагонистов.

Выделенные нами нингидрин-позитивные биологически активные вещества штаммов 23 и N обладали расстворимостью в этаноле, изопропаноле, и не расстворялись в этил ацетате, ацетоне и воде, а полученный спиртовой экстракт, хранившийся при температуре +4°С, не терял антибиотической активности в течении одного года. В экспериментах по выделению антибиотических веществ, было получено около 850 мг биологически активных веществ на литр 3 - суточных культуральных жидкостей штаммов 23 и N.

Результаты ТСХ показали, что обе культуры являются продуцентами идентичных антибиотических веществ, так как фракция содержавшая биологически активное вещество у обоих штаммов имело одно и то же значение Rr 0.72.

Полученный масс-спектр выделенных и разделенных методом ТСХ биологически активных веществ, продуцируемых штаммом 23 позволил нам предположить, что изучаемая нами культура В. subtills 23 является продуцентом сурфактин - подобного полипептидного антибиотика.

3.9. Характер биологического действия антибиотических веществ, продуцируемых штаммами В. subtilis на клетки фигопатогенов

Последним этапом нашей работы было изучение характера антибиотической активности выделенных биологически активных веществ из штаммов Б. subtilis. Установлено, что продуцируемые антибиотические вещества оказывают литическое действие на клетки фитопатогена. вызывая дезорганизацию клеточных стенок R. so laut. В частности, клеточные стенки R. solani в зоне действия антибиотика имели многочисленные повреждения и разрывы. приведшие к потере внутреннего содержимого клетки и, в конечном счете, ее гибели.

В связи с тем, что конидиальное спороношение у фитопатогена R. solani встречается очень редко (Шаабдурахманова, Сафия-зов, 1976; Hillocks, 1992), данный факт затрудняет детальное изучение характера действия антибиотических веществ на индивидуальные клетки фитопатогена. В связи с этим, нами было решено для дальнейших исследований использовать клетки возбудителя фузариозного вилта хлопчатника, гриб F. oxysporum var. vasin-

/есЬит.

Использование метода фазово-контрастной микроскопии позволило установить, что микроконидии в зоне действия антибиотических веществ, в зависимости от степени диффузии антибиотика в питательный агар в направлении от лунки к краям чашки Петри, через одни сутки были не жизнеспособными, не прорастали, либо прорастали и погибали.

Для более детального анализа характера антимикробного эффекта мы изучали сравнительное действие различных разведений полученных экстрактов 23 и N штаммов В. зиЫг Ив, обладавших биологической активностью.

Результаты исследований позволили нам установить, что клетки фитопатогена по характеру антимикробного действия антибиотическими веществами 23 и N штаммов В. зиЫгИз разделяются на 4 условные группы жизнеспособности. Показан идентичный характер биологического действия антибиотических веществ, продуцируемых штаммами 23 и N. а также установлено, что единица антибиотической активности (по Егорову. 1996) биологически активных экстрактов штаммов 23 и N эквивалентна 85 мкг выделенных антибиотических веществ, а 1 мл экстракта содержал-11.8 единиц антибиотической активности.

ВЫВОДЫ

1. Штаммы В. subtilis обладают высокой антагонистической активности) по отношению к возбудителям основных болезней хлопчатника - фитопатогенным микроорганизмам Rhizoctonia solani, Verticillium äahliae. Fusarium oxysporum var. vasinfectum и Xanthomonas malvacearum.

2. Культуральные жидкости антагонистов в 10%-ной концентрации оказывают стимулирующий эффект на всхожесть семян хлопчатника, их рост и развитие.

3. Метаболиты антагониста В. subtilis 23 обладют наилучшим стимулирующим действием на всхожесть семян, рост, развитие хлопчатника и других сельскохозяйственных растений, урожайность хлопчатника, а также снижает поражаемость хлопчатника наиболее вредоносными в условиях Узбекистана возбудителями болезней - Rhizoctonia solani и Xanthomonas rnalvacearm.

4. Самая высокая биологическая эффективность установлена при использовании штамма Б. subtilis 23 и составляет: против гоммоза хлопчатника - 60.5% и 57.7% на сортах 108-Ф и Киргизский - 3 соответственно; против корневой гнили 66.5% и 67.3% на сортах 108-Ф и Киргизский - 3 соответственно.

5. Установлено, что почвенный антагонист В. subtilis 23 и эн-дофит В. subtilis N не различаются существенно по культураль-но-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам.

6. Штаммы В. subtilis не оказывают существенного ингибирующего эффекта на представителей полезной почвенной микрофлоры.

7. Штаммы В. subtilis 23 и N являются продуцентами идентичных rio природе сурфактин-подобных антибиотических веществ. Единица антибиотической активности биологически активных экстрактов штаммов 23 и N. эквивалентна 85 мкг выделенных антибиотических веществ, а 1 мл экстракта содержит 11.8 единиц антибиотической активности.

8. По характеру ингибирования антибиотические вещества штаммов В. subtilis вызывают дезорганизацию клеток фитопатогенов R. sotaní и F.oxysporwn vor. vasinfectum. Характер биологического действия антибиотических веществ, продуцируемых штаммами 23 и N В. subtilis идентичен.

9. Полученные результаты обосновывают перспективность использования изученной культуры В. subtilis 23 и ее метаболитов при разработке комплексного биопрепарата для предпосевной обработки семян хлопчатника против фитопатогенных микроорганизмов.

Рекомендации науке

Для эффективной защиты хлопчатника от возбудителей корневой гнили и гоммоза рекомендуем начать производственные испытания 10%-ной культуральной жидкости штамма Bacillus sub tills 23 в качестве предпосевной обработки семян.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сафиязов Ж.С., Маннанов Р.Н.. Саттарова Р.К. Влияние бактерий - антагонистов на фитопатогенные микроорганизмы и рост хлопчатника. // Узбекский биологический журнал. Ташкент, "ФАН", 1993,- N 1. с. 79-81.

2. Саттарова Р.К., Маннанов Р.Н., Сафиязов Ж.С. Влияние бак-

терий - антагонистов на урожайность хлопчатника и поражаемость корневой гнилью и гоммозом. // Узбекский биологический журнал. Ташкент. "ФАН", 1994,- N 2. с. 67-68.

3. R.N. Mannanov, J.S. Safiyazov, R.К. Sattarova, D.U. Akh-medova. Morphological, physiological and biochemical study of Bacillus subtilis - an agent of biological control of plants. // European J. of Plant Pathology, XIII International Plant Protection Congress, The Hague. 2-7 July, 1995, - Abstracts, -p. 599.

4. J.S. Safiyazov, R.N. Mannanov, R.K. Sattarova. The use of bacterial antagonists for the control of cotton diseases. // Field Crops Research, Elsevier Science, Amsterdam, 1995,- v.43, pp.51-54.

5. Сафиязов Ж. С., Ахмедова Д. У., Маннанов Р.Н. Сравнительное изучение антагонистических и стимулирующих свойств эндофитных микроорганизмов. // Респ. конфер. "Экологические проблемы при-амударьинского региона Средней Азии". Бухара, 26-28 октября, 1995, сб. тезисов. - с. 16-17.

6. Сафиязов Ж.С., Маннанов Р.Н., Ахмедова Д.У. Морфологические и антагонистические особенности эндофитных бактерий. // ДАН РУз. Ташкент. 1995,- N9-10, с. 62-64.

7. Саттарова Р.К., Маннанов Р.Н., Сафиязов Ж.С. Тупрок анта-гонистларини кишлок хужалик экинларининг уругини унувчанлигига таъсири. // Усимлик зараркунандалари, касалликлар ва бегона утларга карши кураш. ГошДАУ, Тошкент, 1995,- 6.47-51.

8. Mannanov R.N.. Safiyazov J.S. Antibiotic substances produced by endophytic and soilborne strains of Bacillus subtilis. // Karadeniz Journal of Medical Sciences, Turkey, 1996,-v. 9, N4, pp. 132-134.

9. Саттарова P. К.. ХакимоваН., Сафиязов Ж. С., Маннанов Р.Н. Отбор почвенных антагонистов с целью создания экологически безвредных биопрепаратов для сельсадго хозяйства. // На-учно-прак. конфер."Экологические аспекты рационального использования почв", ТашГАУ, Ташкент. 18-20 июня, 1997, сб. тезисов, -с. 185-186.

10. Safiyazov J.S., Mannanov R.N. Biochemical analysis of antibiotic production by endophytic and soilborne strains of Bacillus subtilis. // The FASEB Journal. 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, San-Francisco, August 24-29, 1997,- Abstracts,- 2101.

Машшнов Рустам Нмгматович

АЙРИМ АНТАГОНИСТЛАРИНИНГ ФИТОПАТОГЕН МИКРООРГАНИЗМЛАРГА ВА УСИМЛИКЛАРНИ РИВОЖЛАНИНШГА ТАЪСИРШШ УРГАНИШ

1<;ИСЦАЧА МАЗМУНИ

Антагонистларнинг антимикроб з^усусиятларини урганиш натижасида Б. subtilis штаммлари гузанинг асосий касалликларини ^узгатувчи фитопатогенлар - Rhizoctonia solani, Verticilîium dahliae, Fusarium oxysporum var. vasinfectum ва Xanthomonas malvacearum кабиларга нисбатан говори антагонистик фаолликка эгалиги ашщланди.

Уругликка экишдан олдин ишлов бериш борасида ^илинган лаборатория ва кичик булмали тажрибалар B.subtilis 23 антагонист -бактериясининг 10%-ли культурал суюкдпт ва ^ужайра суспензияси чигит Da баъзи бир бош^а ¡ушшок, хужалик экинларининг урури униб чикиши, ривожланиши ва ^оеилдорлигига ижобий таъсир ципиб, уларнинг фитопатоген микроорганизмлар билан зарарланиш даржаси камайишини курсатди.

Б. subtilis 23 ва В. subtilis N штаммлар баъзи бир морфологик -культурал хусусиятлари ва ^ужайра булиниши тезлиги билан бир -биридан фар?; ^илиши аншутанди, лекин бу икки штамм ^ам табиатан бир хил сурфактин-каби антибиотик моддалар ишлаб чицаради. R. solani ва F. oxysporum var. vasinfectum хужайралари В. subtilis-нинг 23 ва N штаммлари антибиотик моддалари билан ингибирланиши характери кусатилди.

Олинган натижалар илмий асосланган равишда урганилган B.subtilis 23 штаммни гуза ва бошка «ишлов; хужалик экинларини касаллик келтириб чикарувчиларга 1;арши экишдан олдин уругга ишлов бериладиган комплекс биопрепаратларни яратилишида фойдалилигини билдиради.

Rustam Nigmatovich Mannanov

STUDY OF THE ACTION OF SOME ANTAGONISTS ON PIIYTOPATHOGENIC MICROORGANISMS AND GROWTH OF PLANTS

SUMMARY

Analysis of anti-microbial properties of some bacterial antagonists allowed to reveal high inhibitory activity of Bacillus subtilis strains against phytopathogens of cotton plants: Xanthomonas malvacearum, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum var. vasinfectum, Vcrticillium dahliae.

Laboratory and small-plot trials using antagonists as means of pre-sowing seed treatment had shown highest biological efficacy in case application of with 10% cultural liquid of antagonist B. subtilis 23 by improving seed germination, growth and productivity of cotton plants, as well as decreasing affection by major cotton phytopathogens.

Comparative cultural-morphological and physiological-biochemical studies of 23 and N strains of B. subtilis had discovered certain non-significant differences. However, further investigation of anti-microbial properties of extracted from both strains surfactin-like biologically active substances on cells of phytopathogens R. solarti and F. oxysporum var.vasinfectum had shown identical features of antibiotic action.

Obtained results prove scientifically the prospective from the use of strain B. subtilis 23 for working out complex, ecologically non - hazardous products for biological control of cotton and other agricultural plants.

Заказ № 264 Подписано в печать 22.09.98 г. Печатный лист 1,5 Тираж 80

Отпечатано в типографии ГФНТИ