Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биологических активностей мутантных форм белка р53

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пугачева, Елена Николаевна, Москва

/

и А /

......■ ' ' . /'

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ.В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.218

ПУГАЧЕВА Елена Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ АКТИВНОСТЕЙ МУТАНТНЫХ ФОРМ

БЕЛКА Р53

03.00.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

П.М.Чумаков.

МОСКВА -1999

СОДЕРЖАНИЕ

Содержание 1-4

Список сокращений 5

1. Обзор литературы. 6

Введение. 6-7

1.1 Общая характеристика антионкогена р53. 8

1.1.1. Молекулярная организация гена р53. 8

1.1.2. Мутации гена р53 в опухолях человека. 8-10

1.1.3. Доменная организация белка р53. 10-11

1.1.4. Рентгеноструктурный анализ р53. 11-13

1.2. Биологические активности белка р53. 12-14

1.2.1. Белок р53 транскрипционный активатор и репрессор. 14-18

1.2.2.Участие р53 в регуляции сверочных точек клеточного цикла. 18

1.2.2.1. Регуляция G1/S перехода клеточного цикла. Р53-зависимый Gl арест. 18-25

1.2.2.2. Р53-зависимый G2 арест. 25-26

1.2.3. Гены-мишени р53 и р53-зависимого апоптоза. 26-42

1.2.4. Гены-мишени р53, функция которых не выяснена. 42-43

1.3. Активация и ингибирование транскрипционного фактора - р53. 43

1.3.1. Взаимодействие с клеточными белками Mdm2, JNK, WT1 и ATM. 43-50

1.3.2. Коактиваторы р53. 50-52

1.3.3. Взаимодействие р53 с вирусными онкобелками. 52-54

1.3.4. Пострансляционные модификации р53. 54 1.3.4.1. Фосфорилирование. 54-56

1.3.4.2. Ацетилирование р53. 56-57

1.4. Системы деградации р53. 57-58

1.5. Биологические активности мутантных форм белка р53. 58

1.5.1. Кооперация мутантного белка р53 с онкогенами. 58-60

1.5.2. Участие мутантного р53 в иммортализации клеток. 60

1.5.3. Позитивная регуляция синтеза ДНК мутантным белком р53. 60-61

1.5.4. Взаимодействие мутантного р53 с белками теплового шока. 61-62

1.5.5. Специфическое связывание мутантного р53 с рядом клеточных белков. 62-63

1.5.6. Взаимодействие мутантных форм белка р53 с ДНК. 63-64

1.5.7. Характеристика трансактивирующих активностей мутантных форм р53. 64-68

1.6. Конформации мутантных форм белка р53. 68-70

1.7. Мутантный р53-доминантный или рецессивный онкоген. 70-72

1.8. Стабилизация мутантного белка р53. 72-73

1.9. Субклеточная локализация белка р53. 73-74 2. Материалы и методы 75

2.1. Культивирование клеточных линий. 75

2.2. Получение панелей линий клеток человека и мыши, экспрессирующих р53 дикой и мутантных форм под контролем гормон-зависимого или

тетрациклин-регулируемого промотора. 75-76

2.3. Иммунопреципитация. 76-77

2.4. Фракционирование белков в полиакриламидном геле. 77-78

2.5. Перенос белков из гелей на нитроцеллюлозные фильтры и

иммунодетекция р53. 78

2.6. Бактериальные штаммы, плазмиды, ретровирусные вектора. 78-79

2.7. Получение компетентных клеток DH5. 79

2.8. Выделение плазмидной ДНК. 79

2.8.1. Препаративное выделение плазмидной ДНК 79-80

2.8.2. Аналитическое выделениеплазмидной ДНК. 80-81

2.9. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами. 81

2.10. Фракционирование ДНК в агарозных гелях. 81-82

2.11. Извлечение ДНК из агарозных гелей. 82

2.12.Субклонирование фрагментов ДНК в вектора pPS-neo, pSIT-neo, pMMTV. 82

2.12.1. Получение векторной ДНК. 82

2.12.2.Реакция лигирования. 82-83

2.13. Трансформация компетентных клеток E.Coli плазмидной ДНК. 83

2.14. Трансфекция ретровирусных и плазмидных конструктов методом кальций-фосфатной преципитации. 83-84

2.15. Определение эффективности трансфекции и инфекции

по флюорисценции зеленого белка. 84

2.16. Инфекция клеток рекомбинантными ретровирусами. 84-85

2.17. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 85

2.18. Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера. 86 2.19 Экстракция РНК и Nothern-блоттинг. £6-87 2.20. Метод субтрактивной гибридизации. 87-89

2.21 Выделение высокомолекулярной ДНК. 89

2.22 Гибридизация по Саузерну 89

2.23. Анализ активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (САТ-реакция). 89-90

2.24. Просчет радиоактивности в пробах. 90

2.25 Авторадиография. 90

2.26. Компьютерный анализ. 91

3. Результаты и их обсуждение 92

1. Р53 с мутацией в кодоне 273 увеличивает вероятность амплификации

гена с1Мг. 92-94

2. Исследование трансактивационных свойств мутантов р53. 94-98

3. Идентификация генов, активируемых мутантными формами р.53. 98-101

4. Получение полноразмерных кДНК генов дУТФазы, N038 и 21Ша мыши. 101-102

5. Анализ экспрессии генов дУТФазы, N038, 21Ша и NAP1 в перевиваемых

линиях клеток мыши и человека, содержащих различные формы белка р53. 103-106

6. Получение клеток 10(3), содержащих дексаметозон-индуцибельный

р53-Й8175, и анализ экспрессии генов дУТФазы и NAP1 в данной системе. 106-108

7. Конструирование линий 10(1), МОА-041, Н1299, БС-ОУ-З экспрессирующих тетрациклин-регулируемый 53 и анализ экспрессии генов

дУТФазы и 21Ша в данной системе. 108-112

8. Влияние экспресии мутантного р53И$175 на устойчивость клеток

10(1) к 5-фтор-уридину. 113-117

4. Выводы 118

5. Список литературы. 119-148

Список сокращений

А.о. - аминокислотный остаток

БСА - бычий сывороточный альбумин

БФС - бромфеноловый синий

ДТТ - дитиотрейтол

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS - додецилсульфат натрия

Hepes - 1<Г-2-гидроксиэтиленпиперазин-М-2-этансульфоновая кислота

ТВР - ТАТА-связывающий белок

NLS - сигнал ядерной локализации

PBS - фосфатно-солевой буфер

PMSF - фенилметилсульфанилфторид

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток

Wt р53 - белок р53 дикого типа

CAT - хлорамфениколтрансфераза

ИО - ионизирующее облучение

УФ - ультафиолетовое облучение

1. ВВЕДЕНИЕ

Опухолевый супрессор р53 играет важную охранную роль, предотвращая размножение и накопление в организме аномальных клеток. В основе такой функции р53 лежит его способность активироваться при самых разных внутриклеточных нарушениях и вызывать в ответ на них либо экстренную остановку клеточного цикла в G1 и G2 фазах, либо апоптоз. Активация р53 наблюдается при различных ДНК-повреждающих воздействиях (УФ- и у-облучение, химические мутагены); понижении внутриклеточного пула нуклеотидов; ингибировании ДНК- и РНК-полимераз и других стрессов. Являясь специфическим транскрипционным фактором р53 выполняет часть своих супрессорных функций за счет трансактивации генов-мишеней, содержащих специфические р53 респонсивные элементы. Наиболее значительную роль в задержке клеточного цикла играет р53-респонсивный ген p21/WAF, продукт которого является универсальным ингибитором циклин-зависимых киназ. Повышение экспрессии p21/WAF вызывает остановку клеточного цикла в G1 и G2 фазах клеточного цикла. Блокирование поврежденных клеток в G2 связано, вероятно, также с активацией и другого р53-респонсивного гена - gadd45. Индукция р53-зависимого апоптоза обусловливается, по-видимому, активацией гена проапоптотического белка В ах, а также ряда других генов, продукты которых стимулируют апоптоз - Fas, KILLER/DR5, группа генов PIG и т.д.

Нарушения функции гена р53 приводят к инактивации «сверочных точек» (checkpoints) в G1 и G2 фазах клеточного цикла, увеличению жизнеспособности поврежденных клеток и, как следствие, значительному увеличению скорости накопления в организме клеток с различными изменениями генома, в том числе и онкогенными. В результате отбора из таких клеток образуются опухоли. О ключевой роли нарушений функции р53 в процессах канцерогенеза свидетельствует тот факт, что примерно в половине

всех опухолей человека обнаруживаются мутации гена р53. При этом, в отличие от других опухолевых супрессоров, для которых характерны мутации, прекращающие синтез белка (делеции, образование стоп-кодонов, сдвиг кодирующей рамки, нарушения сплайсинга мРНК), подавляющее большинство мутаций р53 представляет собой миссенс-мутации, приводящие к замене одной из аминокислот на другую. Примечательно также, что опухоли в которых экспрессируется мутантный р53 более агрессивны и труднее поддаются лечению, чем те, в которых ген р53 полностью делегирован. Более того, было обнаружено, что трансдукция некоторых мутантных р53 в клетки, не продуцирующие эндогенный р53, увеличивает выраженность в них признаков трансформированного фенотипа in vitro и онкогенный потенциал in vivo. Все эти наблюдения позволили предположить, что по крайней мере некоторые из наблюдающихся в опухолевых клетках мутаций вызывают не только инактивацию супрессорных активностей р53, но и придают ему ряд новых активностей, несвойственных белку дикого типа.

Предполагается, что новые активности мутантных р53 заключаются, прежде всего, в приобретении способности увеличивать экспрессию генов, не являющихся транскрипционными мишенями белка дикого типа. Так, было продемонстрировано, что мутантные р53 с заменами в ко донах 175, 273 и 282 способны, в отличие от p53-wt, активировать промоторы генов MDR1, PCNA, c-myc, hEGFR, VEGF, hIL-6, BFGF и hHSP70. Однако, этот список не исчерпывает, очевидно, спектр генов, активность которых модифицируется мутантными р53. Идентификация неизвестных ранее мишеней их транскрипционных активностей может оказаться весьма важной для более полного понимания роли мутаций р53 в процессах канцерогенеза.

1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИОНКОГЕНА Р53 1.1.1. Молекулярная организация гена р53.

Ген р53 человека имеет размер 16-20kb и расположен на коротком плече 17 хромосомы в позиции 17р13.1 (142). Он состоит из 11 экзонов. Первый экзон не несет белок кодирующей информации. Трансляция начинается со второго экзона, расположенного на расстоянии 8-10kb от первого. Сплайсированный транскрипт р53 представляет собой мРНК длиной 2.2-2.5kb, которая синтезируется в клетках всех тканей организма. Ген р53 эволюционно консервативен. Например, р53 мыши и человека гомологичны на 80% (236). 100% гомология наблюдается по пяти консервативным областям. Основные мутации р53, обнаруженные в опухолях человека, локализуются именно в этой зоне. Ген р53 называют геном опухолевой супрессии, основываясь на следующих фактах : 1. В 50% опухолей человека ген р53 мутирован (91), 2. Мыши без р53, полученные посредством технологии knock-out, развиваются нормально, но предрасположены к образованию опухолей, в основном лимфом, в возрасте 6-9 месяцев (56).

1.1.2. Мутации гена р53 в опухолях человека.

Ген р53 локализован на коротком плече 17 хромосомы в положени 17р3.1. Делеция этого участка часто встречаетса в опухолях человека (33), составляя 60% всех опухолей толстой кишки, рака молочной железы, легких, надпочечников, крови и, по крайней мере 30% опухолей мозга (189). Сиквенирование гена р53 млекопитающих, земноводных, птиц и рыб показало существование пяти высококонсервативных зон, четыре из которых локализованны внутри экзонов 5-8. Первая область включает кодоы 117-142, вторая 171181, третья 234-258 и четвертая 270-286. My тации, входящие в зоны 2-4, приводят к нарушению связывания с большим Т антигеном вируса SV-40 (102), а мутации в районе

кодонов 66-228 делают мутантный белок р53 способным специфически связываться с белком Hsc70 (100). 98% известных мутаций р53 (102) кластаризуются внутри кодонов 110307. Мутации лежащие вне этой зоны этой встречаются крайне редко. В большинстве случаев, это точечные мутации сопровождающиеся заменой аминокислоты. Более 98% мутаций являются соматическими и возникают в процессе развития опухоли, однако, существуют и наследуемые мутации р53, обнаруженные у пациентов с синдромом Li-Fraumeni (240).

Опухоли толстой кишки и молочной железы.

Мутации встречающиеся в этих типах рака характерезуются транзициями типа G/C и А/Т, они составляют 79% всех мутаций опухолей данного типа. Большинство из них возникают в области CpG динуклеотидов, причем половина клостаризуется в трех горячих точках, локализованных в кодонах 175, 248, 273. Только 13% всех транзиций типа G/C, А/Т локализованы в данных горячих точках при раке молочной железы. Всего около 40% пациентов с раком молочной железы имеют мутации в гене р53 (43). Мутации р53 в лимфомах и лейкемиях.

Распределение мутаций в данном типе рака сходен с таковым при раке толстой кишки. В основном это опять транзиции в CpG островках, равномерно распределенных по всей кодирующей области р53, причем мутации происходят в одном аллеле. Преобладают транзиции типа А:Т на G:C спектр которых одинаков в лимфомах Беркета, В-клеточных опухолях и Т-клеточных злокачественных образованиях (37).

Мутации в гене р53. обнаруженные в раках легкого и печени. ^

Ген р53 мутирован минимум в 45% немелкоклеточного рака легкого (38), в состав которого входит 75% всех раков легкого. Среди них такие злокачественные новообразования как аденокарцинома, бронхиоальвиолярная карцинома, крупноклеточная

карцинома и другие (181). Мутации обнаруживаются на всех стадиях первичных опухолей, являются соматическими и локализуются в области 132-283 кодонов с горячей точкой в 273 кодоне (189). 14-ть из 23-х мутаций локализуются в области консервативной в эволюции, причем 65% из них укладываются вобласть связывания с большим Т-антигеном вируса SV-40 (237). Наиболее яркое отличие мутаций р53 в опухолях легкого от мутаций р53 в других опухолей заключается в типе нуклеотидных замен. В основном, это замены G на Т. Как известно, тип мутаций отражает тип мутагена, вызывающего эти мутации. Например, в некоторых случаях, бензприен вызывает трансверсии типа G на Т, что совпадает со сторгой корелляцией между курением и возникновением рака легкого. При исследовании частоты и паттерна мутаций гена р53 у пациентов с мелкоклеточным раком легкого было обнаружено, что мутации встречаются в 73% случаев и тип замен отличен. Здесь это, в о сновном, трансверсии А/Т или G/C с горячей точкой в кодоне 242. Замены типа G на Т также часто встречаются, как и при немелкокллеточном раке легкого и составляют 57% (249). Возникновение гипатоцелюллярной карциномы строго кореллирует с определенными географическими зонами. Районами повышенного риска являются: провинция Квидонг в Китае, Южная Африка и Япония. Около 18-ти различных типов мутаций было обнаружено у больных из этих трех районов. Горячей точкой в данном случае является кодон 249, для которого характерны трансверсии типа G на Т. Столь характерное распределение мутаций при раке печени связано с орпеделенным тиопм мутагена, а именно, афлотоксином В1 и вирусом гепатита В, который часто встречается в этих регионах (105).

1.1.3. Доменная организация белка р53.

Белок р53 был впервые обнаружен в 1979 году (143) как белок, коиммунопреципитирующийся с Т-антигеном вируса SV40. Р53-ядерный фосфобелок с молекулярной массой 53 kDa, состоящий из 393 аминокислот, с периодом полужизни около

ч»

20-30 минут. Доменная организация белка р53 может быть представлена следующим образом : 1)75 N-концевых аминокислотных остатков составляют довольно кислую зону, которая способна образовывать а-спираль, далее следует гидрофобная область (75-150 а.к.) богатая пролином. Этот домен является трансактивационным в том случае, если белок р53 связывается с ДНК. 2)Область между 120-290 кодонами может функционировать в качестве ДНК-специфического связывающего домена, узнающего определенный консенсус на ДНК (129). Для р53 этот консенсус представляет собой последовательность из 20 нуклеотидов (н. к.), состоящей из двух копий блока типа -5'-Pu-Pu-Pu-C-A/T-A/TG-Py-Py-Py-3' (76), разделенных 0-13 н. к.. 3)С-концевой домен (290-393 амк.) основной. Он содержит набор сигналов ядерной локализации р53, сайты фосфорилирования для циклин зависимых киназ (cdk) (172). Этот домен важен для сборки тетрамерных и олигомерных структур белка р53 в растворе (243). На основе выше изложенного можно сделать вывод, что р53 - это транскрипционный фактор (TF), способный усиливать транскрипцию гена, имеющего р53 консенсус, что и было доказано экспериментально in vitro и in vivo (63). Транскрипция многих генов без р53 консенсуса ингибируется или негативно регулируется белком р53 (164).

2.1.4. Рентгеноструктурный анализ р53.

Недавно доктором Cho и его коллегами был проведен рентгеноструктурный анализ ДНК-связывающего домена белка р53, закристализованного с олигонуклеотидом, содержащим консенсусную последовательность, узнаваемую р53 (41). ДНК-связывающий домен локализуется между 100-300 аминокислотами и способен связыватся с консенсусом% (Ри-Ри-Ри-C-A/T-A/T-G-Py-Py-Py) . ДНК-связывающий домен фланкирован С-концевым доменом участвующим в олигомеризации и N-концевым доменом, участвующим в трансактивации. В работе было показано, что р53 содержит характерные для других ДНК-

связывающих белков элементы (например helix-loop-helix мотив, цинковый палец и др. ) и имеет уникальную структуру, названную b-сэндвичем. b-сэндвич играет роль «строительных лесов» для трех петель, обозначенных на рисунке 1 как LSH (Loop-Sheet-Helix), LH (Loop-Helix), и L (Loop). Сам b-сэндвич сложен из двух антипараллельных b-слоев, содержащих 4 и 5 b-цепей соответственно, b-сэндвич закрепляет петли и принимает участие в димеризации р53. Первая петля LSH связывается с ДНК по большому желобку. Вторая петля LH расположена напротив L и стабилизирует ее. Петля L взаимодействует с ДНК по малому желобку. L и LH держатся вместе, частично за счет тетрагональной координации атомом цинка. Установленная таким образом структура коррелирует с данными по обнаруженным мутациям гена р53 в опухолях человека. Большинство миссенс мутаций р53 локализовано в области непосредственного ко