Изучение биодеструкции и биосовместимости полимерных систем на основе полиоксиалканоатов

Босхомджиев, Араша Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение биодеструкции и биосовместимости полимерных систем на основе полиоксиалканоатов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение биодеструкции и биосовместимости полимерных систем на основе полиоксиалканоатов"

004600099

На правах рукописи

Босхомджиев Араша Петрович

ИЗУЧЕНИЕ БИОДЕСТРУКЦИИ И БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИОКСИАЛКАНОАТОВ

03.01.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 2010

Москва - 2010

004600099

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Г.А. Бонарцевя

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

А.Б. Шехтер

доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова

Ведущая организация: Биологический факультет Московского

государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 2010 г. в ^ часов на заседании

диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 1 19 071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан ¿¿^Я^С-иЯ-

2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук / А.Ф. Орловский

Л*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в России необходимость изучения и создания новых биоразлагаемых полимерных материалов для медицины стоит очень остро в связи с тем, что на рынке биоразлагаемых медицинских изделий превалируют изделия импортного производства из химически синтезируемых полимеров (полилактиды (ПЛА) и полигликолиды), которые являются быстро деструктируемыми биоматериалами и по своим характеристикам часто не удовлетворяют требованиям медицинских изделий с контролируемым процессом деструкции.

В последние годы в мире ведутся активные исследования полиоксиалканоатов (ПОА) -нового класса природных полиэфиров, обладающих биосовместимостыо с живой тканью и не подверженных быстрой гидролитической деградации. Возможность получать полимеры и сополимеры ПОА с заданными свойствами, такими как мономерный состав, молекулярная масса, кристалличность и т.д., позволяет прогнозировать широкую сферу применения данных материалов для медицины применительно к ортопедии, сердечно-сосудистой хирургии, урологии, герниопластике и фармакологии. Однако результаты, полученные к настоящему времени разными исследователями, фрагментарны и часто весьма противоречивы, что связано как с технологическими методами получения этих биополимеров (вид микроорганизма продуцента, условия биосинтеза, состав, метод экстракции, чистота), так и с методами исследования полимеров in vitro и in vivo, поэтому комплексное детальное изучение ПОА с учетом вышеперечисленных существенных факторов и свойств является весьма актуальным.

В нашем институте в течение многих лет ведутся работы по изучению биосинтеза и физико-химических свойств ПОА с целью их возможного использования в медицине. Данная работа является их логическим продолжением и посвящена комплексному изучению процессов биодеструкции и биосовместимости поли-3-оксибутирата (ПОБ) и сополимера поли-3-оксибутирата с 3-оксивалератом (ПОБВ) в условиях, приближенных к физиологическим in vitro и в опытах на животных in vivo.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является комплексное изучение биодеградации и биосовместимости полимерных систем на основе поли-3-оксибутирата разной молекулярной массы и его сополимера с 3-оксивалератом in vitro и in vivo. В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать пленочные системы из ПОБ и ПОБВ разной молекулярной массы.

2. Изучить гидролитическую и ферментативную деструкцию пленочных систем из ПОБ и ПОБВ разной молекулярной массы в сравнении с полилактидами в модельных системах in vitro.

3. Исследовать биодеградацию и биосовместимость полимеров из ПОБ и ПОБВ при их подкожной имплантации крысам линии Вистар в сравнении с ПЛА.

4. Оценить возможность использования ПОБ в качестве покрытия сеток «Линтекс-Эсфил» - медицинского изделия, применяемого в герниопластике.

Научная новизна работы. Впервые проведен комплексный анализ особенностей течения процессов деструкции полиоксиалканоатов широкого набора молекулярных масс (от 169 кДа до 1482 кДа) в условиях in vitro и in vivo. Исследован механизм деструкции пленочных систем из ПОА. Показано, что как гидролитическая, так и ферментативная деструкция пленок ПОБ и ПОБВ происходит одновременно и на поверхности и в объеме полимера и зависит от толщины полимерной пленки, молекулярной массы, химического состава и кристалличности полимера. Установлено влияние фермента липазы как неспецифической эстеразы на биодеградацию полиоксибутирата. Выявлено, что тканевая реакция на имплантацию пленочных систем из ПОА характеризуется умеренной воспалительной реакцией, которая достоверно ниже реакции на имплантацию ПЛА. Показано, что ПОА разной ММ не оказывают токсического действия и являются биосовместимыми.

Практическая ценность работы. Подкожная имплантация пленочных систем из ПОБ и ПОБВ разной ММ крысам линии Вистар на большом объеме операций (150 животных) позволила изучить тканевую реакцию на данные полимеры. Выявлено, что тканевая реакция на имплантацию пленок из полиоксиалканоатов характеризуется умеренной воспалительной реакцией, что позволило предложить использование ПОБ в качестве покрытия сеток «Линтекс-Эсфил». Новый сетчатый эндопротез с покрытием из ПОБ может быть предложен для использования в герниопластике для лечения брюшной грыжи, т.к. результаты исследований выявили лучшую тканевую реакцию, проявляемую в виде менее интенсивной и продолжительной воспалительной фазы, более коротких сроков образования и созревания соединительной ткани по сравнению с полипропиленовым аналогом.

Полученные в работе результаты необходимы для разработки широкого спектра изделий медицинского назначения на основе полиоксиалканоатов: хирургических нитей, шурупов и пластин для хрящевой и костной фиксации, мембран для лечения пародонтоза, раневых покрытий, заплаток для восстановления дефектов кишечника, перикарда и кости, чехлов для восстановления нервных каналов и т.д.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (273 источников). Работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 45 рисунков и 8 таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии на 7-ой

Рамочной Программе» (Санкт-Петербург, 2006), XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), третьей Санкт-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2007), 17-ом Европейском съезде по гипертонии (Милан, Италия, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, Украина, 2007), 23-ей ежегодной научной конференции Американского Общества Гипертензии на секции молодых ученых «Young lnvest¡gator-in-Training Abstract Competition» (Новый Орлеан, США, 2008), VI открытой международной конференции молодых ученых по высокомолекулярным соединениям ВМС-2008 (Киев, Украина, 2008).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 17 печатных работ (5 статей, из них 2 статьи в рецензируемых российских журналах и 12 тезисов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования н материалы. В работе были исследованы экспериментальные образцы ПОА, полученные нами в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Для синтеза полимеров использовали штамм-продуцент Azotobacter chroococcum 7Б, способный к сверхсинтезу ПОБ (до 80% ПОБ от сухого веса клеток). Штамм выделен из ризосферы пшеницы (дерново-подзолистая почва). Для достижения сверхсинтеза поли-3-оксибутирата в клетках культуру азотобактера выращивали при 30°С в течение 48 часов на среде Берка в условиях избыточного содержания источника углерода в среде (г/л): MgS04'7H20 - 0,4; FeS04 7Н20 - 0,01 ; Na2Mo04'2H20 - 0,006; цитрат Na -0,5; CaCI2 -0,1 ; K2HP04 3H20 - 1,05; KH2P04- 0,2; сахароза - 40. Для синтеза сополимера ПОБВ концентрация сахарозы была снижена до 30 г/л среды, спустя 10 часов после начала инкубации культуры в питательную среду было добавлено 20 мМ валериановой кислоты (в виде натриевой соли).

В работе были использованы следующие реактивы: полилактиды (Fluka, ММ=67, 152 и 400 кДа), натрий фосфорнокислый 1-замещенный (NaH2P04, ХИММЕД, ММ=121), трис (С4НцЖ)з, ММ=121,1, SERVA, Германия), азид натрия (NaN3, Sigma-Aldrich, США), липаза из поджелудочной железы свиньи (А = 20 U/mg, ММ = 50 кДа, KMF Laborchemie Handels Gmbh, Германия,), хлороформ (трихлорметан СНСЬ, ЗАО «ЭКОС-1», РФ), соляная кислота (HCl, «ОСЧ 20-4», ХИММЕД, РФ), натрий гидроокись (NaOH, ХЧ, ХИММЕД, РФ), тиопентал натрия (CuHnN202SNa, БИОХЕМИ Гмбх, Кундль, Австрия). При операциях на крысах линии Вистар использованы хирургические нити (шелковая плетеная нить 4/0, ВОЛОТЬ, РФ).

Выделение и очистка ПОА из биомассы. Выделение из биомассы и очистка полимера включали следующие стадии: получение очищенной сухой биомассы (центрифугирование, промывка биомассы изопропанолом, сушка при 60°С), получение раствора ПОА (экстракция полимера из сухой биомассы хлороформом при умеренном нагревании (35-40°С), фильтрация, упаривание раствора), получение очищенного ПОА (осаждение ПОА из раствора изопропанолом, фильтрация и промывка полученного геля изопропиловым спиртом, сушка при температуре 60°С).

Определение молекулярной массы ПОА. Молекулярную массу полимера определяли методом вискозиметрии. Измерения вязкости раствора ПОА в хлороформе проводили при 30°С. Молекулярную массу вычисляли по уравнению Марка - Хаувинка - Куна, используя коэффициент [п] = 7,7-10'5-М0,82, где г] - вязкость, M - молекулярная масса ПОБ (Akita et al., 1975).

Исследование состава полимера методом ядерно-магнитного резонанса. Спектры 'Н-ЯМР 1-2% растворов поли-3-гидроксибутирата и поли-З-гидроксибутирата-З-гидроксивалерата в дейтерированном хлороформе сняты на спектрометре MSL-300 "Bruker" (Германия). Рабочая частота - 300 МГц. Химические сдвиги отсчитывали от сигнала остаточных протонов CDCI3 -7,20 ррш. Количество накоплений NS = 40. Процентное содержание элементарных звеньев гидроксивалерата в сополимере ПОБ-ОВ рассчитывали по соотношению интегральной интенсивности сигнала метильной группы гидроксивалерата (0,89 ррт) к сумме интегральных интенсивностей сигналов метильной группы гидроксивалерата (0,89 ррш) и метильной группы гидроксибутирата (1,27 ppm) (Bloembergen et al., 1986).

Определение степени кристалличности образцов полимера методом рентгеноструктурного анализа. Методом рентгеноструктуриого анализа были определены химическая структура, тип кристаллической решетки и степень кристалличности полимера. Рентгеноструктурные исследования изотропных образцов проводили на установке на базе 12кВт генератора с вращающимся медным анодом «RU-200 Rotaflex» фирмы «Rigaku» (Япония) в режимах на прохождение (40 кВ, 140 мА). Использовалось излучение СиКа с длиной волны ?i = 0,1542 нм. Для получения двумерных картин дифракции в больших углах и построения дифрактограмм пользовались двухкоординатным позиционно-чувствительным детектором «GADDS» фирмы «Bruker AXS» (Германия) с плоским графитовым монохроматором, установленном на первичном пучке. Диаметр коллиматора составлял 0,5 мм (Ребров и др., 2002).

Изготовление пленок ПОА, ПЛА и их композитов, модифицирование пленок. Пленки получали методом полива растворов ПОА и ПЛА в хлороформе на обезжиренную поверхность стекла. Были получены серии пленок из ПОБ толщиной 40 мкм, диаметром 30 мм разной ММ: 169 кДа, 349 кДа, 510 кДа, 950 кДа, 1482 кДа и сополимера 3-оксибутирата с 3-оксивалератом с

MM 1056 кДа. Дополнительно были получены серии пленок из полилактидов (Fluka) толщиной 40 мкм, диаметром 30 мм разной ММ: 67 кДа, 152 кДа и 400 кДа. Кроме того, была получена смесевая композиция ПОБ с ПЛА. Высокомолекулярный ПОБ (ММ = 950 кДа) и низкомолекулярный ПЛА (ММ = 67 кДа) в соотношении полимеров 1:1 по массе были растворены совместно в хлороформе; после его испарения были получены пленки композита.

Исследование биодеградации пленок ПОА in vitro. Для измерения гидролитической деструкции пленок ПОБ, ПЛА, ПОБВ и смесевой композиции пленки инкубировали в 0,025 M фосфатном буферном растворе (pH = 7,4) при 37° и 70°С в течение S3 дней в пробирках с 15 мл буфера. Перед взвешиванием пленки промывали дистиллированной водой и высушивали при температуре 70°С в течение 1 часа, затем проводили взвешивание на весах (ошибка измерения d=0,l mg). Для изучения ферментативной деструкции ш vitro пленки ПОБ и ПОБВ инкубировали в 0,2 M трис буфере (рН = 7,7) при 37°С с добавлением 10 мг/мл липазы (из поджелудочной железы свиньи, А = 20 U/mg, ММ = 50 кДа KMF Laborchemie Handels GmbH) в течение 3 месяцев. В буферный раствор добавляли азид натрия (№N3) 2 г/л для ингибирования роста микроорганизмов и предотвращения их вклада в биодеструкцию. Замену буфера в пробирках производили через каждые 3 суток в экспериментах с фосфатным буфером и через 2 суток в экспериментах с липазой. Для измерения веса полимера, пленки через каждые 2-3 суток вынимали из буферного раствора и сушили в течение 4 часов при 40°С (Freier et al, 2002). Перед измерениями пленки обрабатывали 0,1% SDS в дистиллированной воде в течение 2 часов, отмывали детергент водой и затем высушивали.

Исследование биодеградации пленок ПОА in vivo. Для оценки биодеградации ПОБ и ПОБВ m vivo, пленки толщиной 10, 20 и 40 мкм размером 15x15 mai помещали подкожно на брюшину самцам крыс линии Wistar (1 крыса - 1 имплант) (Miller, Williams, 1987). Образцы пленок ПОБВ и ПЛА имели толщину 40 мкм. В эксперименте использовали ПОБ ММ: 510, 950, 1482 кДа, ПЛА ММ=152 кДа и ПОБВ ММ=1056 кДа. Предварительно пленки стерилизовали автоклавированием и дополнительно промывали спиртом и дистиллированной водой перед непосредственной имплантацией пленок. В экспериментах было использовано 150 животных. Перед операцией крысам вводили раствор тиопентала натрия и ожидали наступления наркоза. Фиксацию пленок к тканям не проводили. На 7, 14, 30, 90 и 180 сутки животных выводили из эксперимента. Животных вскрывали, извлекали соединительнотканные капсулы с имплантатами, полимерные пленки извлекали из капсул при помощи глазных ножниц и пинцета. Пленки обрабатывали 0,1% SDS в дистиллированной воде в течение 2 часов, отмывали детергент водой и высушивали. При постоперационном контроле состояния животных ни в одном случае не было отмечено отторжения имплантируемых образцов. Для всех полимеров исследование внутренних органов не выявило отличий между контрольной и опытными группами животных.

Нанесение покрытия из ПОБ на сетчатые эндопротезы из полипропилена и исследование их биосовместимости. В экспериментах на животных использовали сетчатые полипропиленовые эндопротезы фирмы «Линтекс Эсфил» (Россия) в качестве контроля и опытные образцы сеток, покрытых ПОБ. Для этого образец сетки 15x15 мм погружали в 1% раствор хлороформа с ПО Б ММ =510 кДа с последующим высушиванием на воздухе, досушиванием при 70°С в течение 2-х часов и стерилизации путем автоклавирования при 0,5 атм в течение 20 минут. При этом получали толщину покрытия сеток 5-7 мкм. Измерения проводили с помощью механического микрометра. Отличительной особенностью данного эксперимента является моделирование брюшной грыжи, создание дефекта брюшины. Производился продольный разрез брюшины длиной 1,5 см, подбрюшинно помещался образец эндопротеза, который закрывал созданный дефект, а затем эндопротез фиксировался к брюшине с помощью нити ВОЛОТЬ 4/0. Имплантация завершалась наложением швов на кожу. Мы оценивали тканевую реакцию и сроки образования соединительной ткани в зоне имплантации эндопротсзов. Сроки вывода животных из эксперимента и методика наркотизирования и стерилизации аналогична эксперименту, проводимому по изучению биодеградации пленок ПОБ in vivo.

Световая микроскопия. Животных забивали методом растяжения позвонков. Материал, предназначенный для исследования (кожа - пленка - окружающие ткани, сетка - брюшина -окружающие ткани), бережно иссекали ножницами с острыми браншами, превышая во всех направлениях необходимый размер на 1-2 мм. Далее полученный материал помещали в фиксатор - 4% формалин и заливали в парафин по стандартной методике. Исследовали 100 макропрепаратов, из которых сделали 300 серийных срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашивали гематоксилином-эозином и изучали их с помощью светооптического микроскопа «Leica»

Атомно-еиловая микроскопия. Микрофотографии поверхности пленок ПОБ получены методом атомно-силовой микроскопии. Для исследования пленок ПОБ использовали атомно-силовой микроскоп «Solver PRO-M» (Россия, Зеленоград). Исследуемый кусочек пленки размером ~2х2 мм2 закрепляли на держателе двухсторонним скотчем. Сканирование проводили в полуконтактном режиме с использованием кантилеверов NSG01 (типичная жесткость 5,1 Н/м), частота сканирования составляла 1-3 Гц, размер кадров от 3x3 до 20x20 мкм2. Для описания поверхности образцов вычисляли два параметра шероховатости - среднюю

Rü = —У>„|

- дг ¿—)\ "I

шероховатость: и среднеквадратичную шероховатость:

Эти параметры вычисляли по трем кадрам 20x20 мкм2, в каждом кадре 512x512 точек.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование гидролитической деструкции пленок ПОА lit vitro 1.1. Кинетика гидролитической деструкции ПОБ и его производных

В работе гидролитическая деструкция была исследована в двух различных водных средах: в фосфатном буфере рН=7,4 и в трис буфере рН=7,7 при 37°С в течение 3-х месяцев. Анализ кинетических кривых показывает, что максимальная скорость потери веса отмечается у наиболее чувствительного к деградации низкомолекулярного ПЛА (ММ 67 кДа) и у ПОБ с относительно низкой ММ 169 кДа; кроме того, у этих полимеров гидролитическая деструкция заметно отличается в разных средах: в фосфатном буфере этот процесс происходит быстрее (рис. 1).

- 67 кДа ПЛА (Трис) 169 кДа ПОБ (Трис) 510 кДа ПОБ (ФБ)

- композит (ФБ)

40 50 60 Время (сутки)

- 67 кДа ПЛА (ФБ) • 169 кДа ПОБ (ФБ) 950 кДаПОБ (ФБ)

100

-й-ПОБВ(ФБ) ■ о-349 кДа ПОБ (ФБ) -*—400 кДаПЛА(ФБ)

Рис. 1. Деградация полимеров ПОБ, ПОБВ, ПЛА разной ММ и композита в фосфатном буфере (ФБ) рН=7,4 и трис буфере (трис) рН=7,7 in vitro при t° 37°С.

Важно отметить, что устойчивость к гидролитической деструкции в тех же условиях возрастает с увеличением ММ образцов ПОБ, что отражено на рис. 1. Действительно, потеря веса у низкомолекулярного ПОБ (ММ 169 кДа) происходит быстрее, и остаточный вес образца составляет 87,4% от начального веса к 84 суткам инкубации. У высокомолекулярных образцов ПОБ 349, 510 и 950 кДа значение остаточного веса выше и составляет 94-98%.

Сопоставление кривых потери веса для пленок с близкими ММ биополимеров: ПЛА и ПОБ (ММ = 400 и 510 кДа соответственно) показало, что полилактиды теряют вес быстрее, чем аналогичные образцы ПОБ. Этот факт подтверждают литературные данные о более высокой скорости деструкции ПЛА по сравнению с ПОБ (Qu et al, 2006; Kunze et al, 2006).

40 ■ ■ .

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Время (сутки)

—♦—169 кДа ПО Б --»-- 349 кДаПОБ л.....5ЮкДаПОБ -•□■- 67 кДа ПЛА

д— 400 кДа ПЛА —о— композит --950 кДа ПОБ х ПОБВ

Рис. 2. Деградация пленок из ПОБ, ПЛА, ПОБВ и композита в фосфатном буфере при 1° 70°С рН=7,4.

Деградация ПОБВ идет достаточно медленно: в течение 60 суток потери веса почти не происходит, в этот период пленка теряет всего 1% от своего веса, а после 70 суток начинается заметное постепенное падение веса. На рис. 1 также видно, что композит ПОБ и ПЛА деградирует приблизительно с той же скоростью, что и высокомолекулярный ПОБ, входящий в его состав, тогда как низкомолекулярный ПЛА гидролизуется с более высокой скоростью.

Чтобы выяснить влияние температуры на степень гидролиза ПОБ и интенсифицировать процесс, была выбрана более высокая температура - 70°С и использован фосфатный буфер с рН=7,4. Как и следовало ожидать, ускорение гидролиза в этих условиях было весьма заметным, что представлено на рис. 2.

К 45 суткам инкубации пленки из ПЛА превращались в мелко дисперсный порошок, потеря их веса для образца с ММ=67 кДа составляла 50,1% и с ММ=400 кДа - 39,5%. ПОБ с небольшой ММ=169 кДа после 83 дней инкубации в буфере терял 38,5% от первоначального веса пленки и был сильно фрагментирован. Через 83 дня инкубации пленки ПОБ с большей молекулярной массой (349, 510 и 950 кДа) теряли меньший процент веса: 20,2%, 10% и 15,4% соответственно. Интересно, что для композитных пленок потеря веса к 83 суткам составляла 50,8%, тогда как пленки из ПОБВ при возрастании температуры были весьма устойчивы и к концу 95 суток теряли лишь 4,1% от исходного веса полимера. Здесь следует отметить, что при биосинтезе введение в макромолекулу ПОБ звеньев 3-оксивалерата приводит к двум противоположно влияющим на сорбцию воды процессов. С одной стороны, происходит увеличение гидрофобности цепи, т.е. отношение числа сложноэфирных групп к

углеводородным группам (метальным, этильным и метиленовым) уменьшается, тогда как степень кристалличности в таком полимере падает с 70 примерно до 30 вес.%. Каждый из этих процессов противоположным образом влияет на сорбционную емкость воды сополимером. В целом, с одной стороны гидрофобизация снижает содержание воды, но с другой стороны, падение степени кристалличности - его повышает (Iordanskii et al, 1984). Поэтому более высокая устойчивость сополимера к гидролизу, по видимому, связана с преобладанием влияния гидрофобизации полимерной цепи ПОБВ.

1.2. Изменение молекулярной массы ПОБ и ПОБВ

При изучении гидролитической деструкции in vitro мы оценивали не только потерю веса пленок, но и изменение молекулярной массы ПОБ и ПОБВ. Максимальное снижение молекулярной массы у всех изучаемых образцов полимеров наблюдается при их инкубации в фосфатном буфере при 70°С (рис. 3).

1200 1000 2 800

0 45 83

Время.сутки

Рис. 3. Изменение ММ образцов ПОБ и ПОБВ в фосфатном буфере рН=7,4 при С5 70°С.

Обозначения: 1 - 169 кДа ПОБ, 2 - 349 кДа ПОБ, 3 - 510 кДа ПОБ, 4-950 кДа ПОБ,

5 - 1056 кДа ПОБВ.

Так, после 83 дней инкубации снижение ММ у полимерных пленок ПОБ достигало 81,65% для образца с ММ 169 кДа и составляло 31 кДа и достигало 91% для образца с ММ 510 кДа и составляло 46 кДа. Значительное уменьшение ММ у всех исследованных образцов было отмечено уже к 45 суткам инкубации, потом падение ММ замедлялось. Например, ПОБ с исходной ММ = 349 кДа к 45 суткам имел ММ = 39 кДа, при дальнейшей инкубации к 83 суткам ММ снижалась незначительно - до 35 кДа. Для сравнения укажем, что у того же полимера с ММ 349 кДа в других температурных условиях при 37°С в том же фосфатном буфере снижение ММ было в 7 раз меньше: а именно, к 45 суткам инкубации - 286 кДа, к 83 дням - 266 кДа. В экспериментах на трис буфере при 37°С мы наблюдали такое же снижение молекулярной массы ПОБ 349 кДа к концу эксперимента (265 кДа), как и на фосфатном буфере (табл. 1).

Таблица 1. Изменение ММ пленок из ПОБ и ПОБВ в фосфатном буфере при t° 37 и 70°С и в трис буфере при t° 37°С in vitro

Пленка/срок (сутки) [ 37°С Фосфатный буфер \ 37°С трис ] 70°С Фосфатный буфер

169 кДа ПОБ

0 169±9

45 130±4 37±2

83 116±5 132±4 31±1

349 кДя ПОБ

0 349±12

45 83 286±8 266±10 265±11 39±2 35±2

510 кДа ПОБ

0 510±15

45 328±8 113±4

83 306±12 306±15 46±2

950 кДа ПОБ

0 950±25

45 670±22 143±8

83 482±19 - 86±4

ПОБВ

0 1056±39

45 775±25 1!6±4

83 591±1б 551±13 50±3

Наибольшая потеря ММ бьиа у сополимера ПОБВ и составляла 95,26% от начального значения в эксперименте при инкубации пленок в фосфатном буфере при 70°С. Полимер ПОБ, имеющий ММ 950 кДа на 83 сутки того же эксперимента терял 90,94% от начальной ММ полимера. Большая скорость деструкции ПОБВ по сравнению с деструкцией ПОБ, вероятно, связана с тем, что введение в полимерную цепь ПОБ звеньев оксивалерата вызывает появление большего количества аморфных областей, которые играют решающую роль в деструкции полимера.

1.3. Анализ поверхности пленок ПОБ методом атомно-силовой микроскопии

Морфология, структура и шероховатость поверхностей пленок ПОБ, подвергнутых воздействию различных коррозионных сред (фосфатный буфер, раствор NaOH) исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). На рис. 4 представлен в качестве контрольного образец ПОБ с ММ=169 кДа, полученный методом полива его раствора в хлороформе на стеклянную подложку.

Анализ шероховатости различных поверхностей одной и той же пленки показал, что средняя и среднеквадратичная шероховатость плоскостей, обращенных к воздуху и стеклу, отличаются приблизительно в десять раз. Подобные различия связаны с условиями десорбции растворителя (хлороформа) из формируемых пленочных образцов ПОБ. В случае испарения хлороформа с поверхности в окружающую воздушную среду поток растворителя формирует

дополнительные каналы - поры, которые фиксируются по мере затвердевания и кристаллизации образца. В то же время, морфология ПОБ на противоположной поверхности менее подвержена воздействию транспорта растворителя и обусловлена поверхностной энергетикой (поверхностным натяжением) на границе стекло-ПОБ.

10 12 1-1 16 18 ,

Рис. 4. Шероховатая поверхность пленки полиоксибутирата 169 кДа, контрольная пленка(А) и шероховатая поверхность пленки, выдержанной в фосфатном буфере в течение 83 суток при температуре 70°С (Б) (ув. хЗОО).

Инкубация образца ПОБ в буферном растворе (трис и фосфатный буфер) в течение длительного времени (83 суток) приводит к троекратному возрастанию шероховатости на поверхности, ранее обращенной к стеклу, и практически не влияет на шероховатость и морфологию противоположной поверхности (табл. 3, рис. 4).

1.4. Исследование кристалличности ПОБ и ПОБВ

В наших экспериментах у всех исследованных полимеров было отмечено возрастание кристалличности в начальный период и затем её постепенное снижение на последнем сроке, когда некоторые образцы были уже сильно фрагментированы, а в случае композита и ПЛА представляли практически порошок.

На рис. 5 приведены сравнительные дифрактограммы исходной пленки 950 кДа, не подвергавшейся деградации, и пленок, выдержанных в фосфатном буфере при 37°С на сроках 45 и 83 суток. Рассчитанные на основе полученных дифрактограмм значения степени кристалличности составляли 74,8%, 76,5% и 77,9% для исходной пленки и пленок на сроках 45 и 83 суток соответственно. Так как структура полимера предполагает наличие аморфных и кристаллических областей, а аморфные области подвергаются гидролизу в первую очередь (Зругоэ е1 а1, 1997), очевидно, что при последовательном разрушении аморфных областей снижается молекулярная масса полимера и повышается степень его кристалличности.

1000 -

о eoo -

600 -

200-

10 15 20 25 30 35

20. град.

Рис. 5. Дифрактограммы пленок ПОБ ММ 950 кДа в процессе деструкции во времени (Б).

В таблице 2 приведены данные по определению кристалличности изучаемых полимеров. Из данных таблицы видно, что максимальная кристалличность отмечена у пленки из ПОБ 950 кДа - 74,8%, а наименьшее у пленки из ПОБВ - 61,2%. Известно, что присутствие оксивалерата в ПОА существенно влияет на характеристики полимера, снижая кристалличность материала, делая его по сравнению с полиоксибутиратом более эластичным, упругим и удобным для переработки (Luizier et al, 1992), что хорошо согласуется с полученными нами данными по определению кристалличности ПОБ и его сополимера.

Также из таблицы видно, что начальные значения кристалличности прямо пропорциональны ММ; чем выше ММ, тем выше значение кристалличности. Это не относится к сополимеру из ПОБВ, кристалличность которого имеет значение 61,2%, тогда как у пленок ПОБ, имеющих минимальную ММ 169 кДа, значение кристалличности равняется 71,2%. Исследования изменения кристалличности в процессе деградации in vitro показали, что изменение кристалличности полимеров ПОБ и ПОБВ имеет волнообразную природу: сначала значение кристалличности возрастает за счет вымывания аморфных областей полимера, затем постепенно снижается за счет появления амофных областей из кристаллических. Наблюдаются и обратные тенденции превращения кристаллических областей в аморфные (табл. 2).

По-видимому, процессы вымывания аморфных областей и образования аморфных областей из кристаллических происходят одновременно и независимо, благодаря чему общая кристалличность полимера в процессе его деструкции изменяется волнообразно и разнонаправленно в зависимости от условий эксперимента.

Таблица 2. Изменения кристалличности ПОБ и ПОБВ в процессе деградации

in vitro в фосс >атном буфере

Пленки Условия Степень кристалличности Сх в % Вес пленки, в %

ПОБ 169 кДа контроль 71,2±1,7 100

37°С 45 сут. 72,1±1,5 88,9±0,9

37°С 83 сут. 7 0°С 45 сут. 70,7±1,2 68,0±|,6 87,5±1,5 82,3±0,8

70°С 83 сут. разрушается 61.5±2,1

ПОБ 349 кДа контроль 71,1±1,9 100

37°С 45 сут. 80,7±1,7 97,2±0,7

37°С 83 сут. 72,8±1,4 97,1±1,8

70°С 45 суг. 69,0±2,3 91,¡±0,6

70°С 83 сут. 80,3±2,2 79,8±|,8

ПОБ 510 кДа контроль 74,7±1,7 100

37°С 45 сут. 73,8±1,3 97,8±0,6

37°С 83 сут. 79,1±2,2 97.8±1,5

70°С 45 сут. 63,5±2,5 96,6±0,5

70°С 83 сут. 75,7±2,0 89,9±1,7

ПОБ 950 кДа контроль 74,8±1,6 100

37°С 45 сут. 76,5±1,8 94,7±0,8

37°С 83 сут. 70°С 45 сут. 77,9±1,2 65,5±2,3 94,2±1,8 94,5±1,2

70°С 83 сут. 72,1±2,1 84,б±2,2

ПОБВ контроль 61,2±1,4 100

37°С 45 сут. 65,8±1,5 99,2±0,5

37°С 83 сут. 58,1±1,3 95,7±2.3

70°С 45 сут. 67,0±|,4 99,8±0,8

70°С 83 сут. 70,1±1,7 95,8±1,8

Таким образом, на основании полученных результатов по изучению гидролитической деструкции ПОА многоэтапная картина этого процесса выглядит следующим образом: в первый период (несколько недель) происходит растворение «вымывание» аморфной фазы, в результате чего кристалличность полимера может несколько возрасти, далее происходит разрыв полимерных цепей и образование тетра-, димеров и мономеров и снижение молекулярной массы, затем развиваются процессы эрозии материала и происходит собственно снижение массы полимера (образца или изделия). Этот процесс длителен и в зависимости от условий среды и физико-химических свойств ПОА может продолжаться многие месяцы. Изменение соотношения мономеров в ПОА сопровождается существенными изменениями физико-химических свойств материала.

2. Исследование биодеструкции пленок ПОБ и ПОБВ в модельных опытах с липазой in vitro и в опытах in vivo 2.1. Кинетика биодеструкции ПОБ и ПОБВ в модельных экспериментах с липазой in vitro и в опытах с крысами линии Wistar in vivo

Нами были проведены две серии экспериментов: in vitro (пленки инкубировались в трис буфере с добавлением липазы) и in vivo (пленки имплантировались подкожно крысам). В эксперименте in vitro были исследованы полимеры ПЛА 67 кДа, ПОБ с ММ 169, 349 и 510 кДа, а также ПОБВ (рис. 6).

-о- 67 кДа ПЛА+Lip -й-510 кДа ПОБ х 169 кДа ПОБ+ Lip -о- 349 кДа ПОБ

Время(сутки)

67 кДа ПЛА > ■ ПОБВ+Lip а 169 кДа ПОБ

100

120

-510 кДа ПОБ+Lip ПОБ В

- 349 кДа ПОБ+ Lip

Рис. 6. Деградация пленок из ПОБ, ПЛА, ПОБВ в Трис буфере с липазой (+Lip) in vitro при t° 37°С, рН=7,7.

Из данных, представленных на рисунке следует, что после 95 дней инкубации влияние липазы на потерю веса пленок из ПОБ и ПОБВ практически отсутствует. Достоверного снижения массы пленок из ПОБ и ПОБВ в течение всего наблюдаемого периода не зафиксировано. В то же время, образцы пленок из ПЛА после 75 суток под действием липазы теряли 54% от первоначального веса, тогда как в контроле без липазы потеря веса пленок из ПЛА составляла всего 15%.

Исследования биодеградации полимеров in vivo показали, что после внедрения имплантата ПОБ в организм животного наблюдаются вослалительно-репаративные изменения, которые приводят к образованию капсулы, которая формируется новой соединительной тканью (рис. 7).

Рис. 7. Фотография частично деструктировавшей пленки 510 кДа ПОБ, имплантированной подкожно - /и vivo в крысе через 2 недели (А), через 3 месяца (Б).

Поэтому особенностью биодеградацни полимера in vivo является то, что распад ПОБ происходит внутри капсулы. Известно, что основными клеточными элементами, участвующими в деструкции инкапсулированного полимера, являются макрофаги и гигантские клетки инородных тел (ГКИТ) (Zhao et al, 1992; Као et al, 1994; Tang et al, 1999). В эксперименте in vivo наблюдалось почти полное рассасывание полимера через 6 месяцев после имплантации пленок из ПОБ ММ 510 кДа (рисунок 8). К этому времени начальный всс пленки у полимеров 950 и 1482 кДа уменьшался на 93% и 83% соответственно.

100 ...... • ■ - — - -•;

о 60 i

140 ^^xnN.

0 12 3 4 5 6

Время(месяцы)

—♦— 510 кДа in vivo -о— 950 кДа in vivo 1482 кДа in vivo

-■»■ 510 кДа in vitro 37C •■•■ 950 кДа in vitro 37C -о— 510 кДа ПОБ 70С ФБ -+- 950 кДа ПОБ 70С ФБ

Рис. 8. Сравнительная деградация пленок из ПОБ in vitro в фосфатном буфере при Io 37 и 70°С рН=7.4 и in vivo при подкожной имплантации крысам линии Wistar.

Эти эксперименты наглядно показали, что разрушение ПОБ происходит значительно быстрее в организме животного, чем в условиях in vitro, что объясняется наличием в организме большого числа неспецифических эстераз, способных расщеплять полимер. Вклад неспецифических эстераз, макрофагов и ГКИТ в бнодеградацию ПОА был продемонстрирован ранее в ряде работ (Lobler et al, 2002; Hoshino et al, 2002; Shishatskaya et al, 2005).

2.2. Изменение молекулярной массы ПОБ и ПОБВ

В эксперименте по изучению ферментативной деструкции in vitro, пленки инкубировали в трис буфере рН=7,7 при 37°С (контроль) и в тех же условиях с добавлением липазы в течение 83 суток. Из данных представленных на рисунке 9 видно, что добавление липазы существенно снижает ММ у всех исследованных образцов ПОБ и ПОБВ по сравнению с контролем без липазы.

1200 1000 I 800 600 400 200 о

О 83

Время, сутки

Рис. 9. Изменение ММ пленок из ПОБ и ПОБВ в Трис буфере in vitro с липазой (+Lip) и контроль (к) при t° 37°С рН=7,7. Обозначения: 1-169 кДа ПОБ к., 2-169 кДа ПОБ +Lip, 3 - 349 кДа ПОБ к, 4 - 349 кДа ПОБ +Lip, 5 - 510 кДа ПОБ к, 6 - 510 кДа ПОБ +Lip, 7 - 1056 кДа ПОБВ к, 8 - 1056 кДа ПОБВ +Lip.

В этом эксперименте ММ у ПОБ 169 кДа снижалась на 21,9% до 132 кДа в контроле и на 38,5%) до 104 кДа с добавлением липазы, у ПОБ 349 кДа на 24,1% до 265 кДа в контроле и на 56,2% до 153 кДа с липазой, у ПОБ 510 кДа на 40% до 306 кДа в контроле и на 73,1% до 137 кДа с липазой; у ПОБВ 1056 кДа на 47,8% до 551 кДа в контроле и на 75,1% до 263 кДа с липазой. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что ферментативная деструкция ПОБ и ПОБВ протекает гораздо быстрее (примерно в 2 раза), чем гидролитическая, если судить о ней по падению ММ. Из сопоставления этих результатов с результатами предыдущих разделов можно заключить, что уменьшение ММ не вызывает снижения общей массы пленок. Этот эффект можно объяснить тем, что липаза, имея достаточно малый размер, способна проникать в объем полимерной матрицы ПОБ и ПОБВ, тем самым, увеличивая площадь ферментативной атаки. Поэтому общая скорость реакции между субстратом и ферментом также растет, но продукты реакции, вследствие их высокой ММ, низкой растворимости в воде и стерических затруднений не могут десорбироваться из объема полимерных образцов.

Кроме того, в экспериментах in vivo на крысах линии Вистар нами было определено изменение ММ у образцов ПОБ -510, 950 и 1482 кДа через 1 месяц после имплантации. Как и в экспериментах in vitro здесь также наблюдалось снижение ММ образцов. В организме животного снижение ММ у образца ПОБ 510 кДа достигало 57,8% и составляло 215 кДа, у образца ПОБ 950 кДа достигало 54,1% и составляло 436 кДа, т.е. было заметно выше, чем в условиях in vitro в фосфатном буфере, где снижение ММ было 35,7% для образца 510 кДа (до 328 кДа) и 29,5% для образца 950 кДа (до 670 кДа). Однако при 70°С в фосфатном буфере рН=7,4 через 45 суток инкубации мы наблюдали еще большее падение ММ у исследованных образцов у ПОБ 510 кДа - 77,8% (до 113 кДа) и у ПОБ 950 кДа - 84,8% (до 144 кДа), что заметно резче, чем снижение ММ у этих образцов in vivo. В эксперименте с липазой к 83 суткам

снижение ММ для образца 510 кДа составляло 72,9% (+L¡p до 138 кДа) и 40% (контроль до 306 кДа), т.е. за временной промежуток почти в 3 раза больший, чем в вышеприведенном 1 мес. эксперименте на животных. Образец ПОБ 1482 кДа показал самое высокое падение ММ в экспериментах на животных: через 1 месяц после имплантации образца крысам падение ММ достигало 62% от начальной величины и составило 566 кДа. К сожалению, определить значения ММ исследованных образцов на следующих сроках было невозможно в связи с тем, что они не имели достаточной массы для вискозиметрии. Таким образом, можно сказать, что падение ММ ПОБ и ПОБВ in vivo происходит гораздо быстрее, чем в условиях гидролитической и даже ферментативной деструкции биополимера с липазой in vitro, что связано со значительным вкладом в биодеструкцию этих полимеров клеточных элементов ткани, макрофагов и ГКИТ.

2.3. Анализ поверхности пленок ПОБ методом атомио-силовой микроскопии

Для выявления действия липазы на поверхность пленок были исследованы образцы ПОБ ММ 169 кДа, обработанные липазой в трис буфере в течение 83 суток при t° 37°С. Из таблицы 3 видно, что значения параметров шероховатости пленок после контакта с раствором липазы и буферным раствором близки. Отсюда можно сделать предварительный вывод, что начальная стадия гидролиза ПОБ как в присутствии, так и в отсутствии фермента развивается преимущественно в объемной области полимера. Причем, менее пористая структура поверхности полимера, обращенная к стеклу, подвергается большим изменениям, т.к. представляет диффузионный барьер для проникновения фермента в объем ПОБ. Здесь наряду с объемными процессами протекает и поверхностный гидролиз. Напротив, поверхность, обращенная к воздуху с высокопористой морфологией, такого барьера не имеет, и мы имеем дело с односторонней диффузией молекул липазы в объем полимерного образца.

Таблица 3. Параметры шероховатости пленок ПОБ ММ 169 кДа

Образец Поверхность контакта R„ им R,,, им

исходный воздух 130±10 165±10

исходный стекло 15±2 20±1

после контакта с буфером, 37"С воздух 135±5 166±7

после контакта с буфером, 37"С стекло 46±2 59±1

после контакта с липазой, 37"С воздух 127±7 16Ш1

после контакта с липазой, 37"С стекло 48±2 60±2

2.4. Исследование кристалличности ПОБ и ПОБВ in vitro

Для изучения изменения кристалличности в процессе ферментативной деструкции была исследована серия пленок ПОБ и ПОБВ, инкубировавшихся в трис буфере с липазой в течение 83 суток. Были получены дифрактограммы и определена степень кристалличности исследованных образцов полимеров (табл. 4). Из таблицы видно, что степень кристалличности возрастает у всех образцов из ПОБ и ПОБВ, но большие значения соответствуют образцам,

обработанным липазой. Это связано с действием фермента на аморфные области полимера, как на поверхности, так и внутри полимерной матрицы. За счет малого размера, фермент способен проникать в поры на поверхности пленки и дополнительно действовать изнутри.

К сожалению, измерить значения кристалличности образцов в экспериментах in vivo, после их извлечения из животных, было невозможно из-за прорастающей соединительнотканной капсулы, которая препятствует измерению.

Таблица 4. Изменение ММ, степени кристалличности и веса пленок из ПОБ и ПОБВ под действием липазы in vitro (продолжительность эксперимента 83 сут.)

Пленки Условия ММ Степень кристалличности Сх в % Вес пленки, в %

ПОГ» 169 кДа контроль 169±9 71,2±1,7 100

трис без Lip 83 сутки 132±4 72,4±1,4 96,4±2,3

трис + Lip 83 сутки 104±5,5 75,8±1,5 96,3±2,2

ПОГ. 349 кДа ПОБ 510 кДа контроль 349±12 71,1±1,9 100

трис без Lip 83 сутки 265±11 74,3±1,5 97,4±2,1

трис + Lip 83 сутки контроль 153±7 510±15 76,6±1,4 74,7±1,7 97,6±2,4 100

трис без Lip 83 сутки 306±15 73,1±1,6 99,0±1,5

трис + Lip 83 сутки 137±8 71,3±1,2 97,5±1,6

ПОБВ контроль 1056±39 61,2±1,4 100

трис без Lip 83 сутки 551±13 61,1±1,3 99,3±1,3

трис + Lip 83 сутки 2бЗ±14 67,3±1,4 98,6±1,8

Механизм биодеградации ПОБ может включать совместное сочетание ферментативного и неферментативного разложения. Однако, этот факт совсем не означает, что биодеградация в этом случае представляет простую комбинацию (сложение) этих двух процессов. Более того, биодеградация ПОБ in vivo, проявляющаяся в снижении молекулярной массы и общей массы образца, остается объектом пристальных исследований, не имеющих однозначной интерпретации. Как уже отмечалось выше, при исследовании процесса гидролиза биополимера в условиях in vitro основной причиной расхождения в описании механизма гидролитической деструкции является использование в разных литературных источниках нестандартных и заметно отличающихся технологических условий получения полимера и модельных условий имитации живого организма (инкубационная среда, t°C, рН и т.д.).

Таким образом, в наших экспериментах in vitro достоверно установлено, что добавление липазы в буферный раствор почти в 2 раза увеличивает падение ММ и вызывает возрастание кристалличности образцов, но не влияет на уменьшение веса пленки. В экспериментах на животных показано, что процессы снижения ММ, потери веса и роста степени кристалличности образцов полимеров из ПОА протекают быстрее, чем в модельных экспериментах биодеструкции с липазой in vitro.

3. Изучение биосовместимости пленок и сетчатых эндопротезов /и vivo 3.1. Гистологическое изучение тканевой реакции и внутренних органов крыс при подкожной имплантации пленок из ПОБ, ПОБВ н ПЛЛ

Общая картина тканевой реакции на имплантацию пленок из ПОБ, ПОБВ и ПЛА разной ММ и толщины выглядит следующим образом: на 7 сутки вокруг имплантата формируется тонкая соединительная капсула с большим количеством клеток воспаления (макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов), структура пленки остается без видимых повреждений; на 14 сутки соединительно-тканная капсула утолщается. Внутренний слой капсулы относительно плотный, наружный рыхлый. Внутренняя поверхность капсулы выстлана макрофагами и единичными гигантскими клетками. Ткань капсулы состоит из коллагеновых волокон и фибробластов и в умеренной степени инфильтрирована лимфоцитами и макрофагами, пленка остается прозрачной без явных признаков деградации; через 1 месяц имплантации пленки на поверхности имеют сильную шероховатость (признаки «изъеденности»), появляются глубокие трещины в толще пленки вследствие биодеградации полимера, на поверхности видны отдельные макрофаги. Соединительно-тканная капсула в среднем несколько толще, чем капсула после 14 дней, хотя толщина её варьирует у разных животных. Капсула состоит из относительно зрелой соединительной ткани, содержащей коллагеновые волокна и фибробласты, а также немногочисленные лимфоциты и макрофаги. Нейтрофильные лейкоциты практически отсутствуют. На внутренней поверхности капсулы виден слой макрофагов и единичных гигантских многоядерных клеток; после 3 месяцев капсула вокруг имплантата тонкая, зрелая, состоит из относительно рыхлой соединительной ткани. По сравнению со сроком в 1 месяц в ней значительно уменьшается лимфо-макрофагальная инфильтрация, общее количество фибробластов, а также количество макрофагов и гигантских клеток на внутренней поверхности. По сравнению с контрольной группой капсула более зрелая и в меньшей степени инфильтрирована клетками. Полимерная пленка истончается. Через 6 месяцев после имплантации капсулы внутри были пустыми, пленки всех толщин были полностью резорбированы. Соединительно-тканная капсула в основном сохраняет свою толщину и структуру по сравнению с 3-х месячным сроком. В торцевой части она тонкая, в плоской части она несколько толще. Отличие от 3-х месячного срока заключается в разрыхлении коллагеновых волокон, уменьшении макрофагов и гигантских клеток на внутренней поверхности капсулы и в ещё большем уменьшении лимфо-макрофагальной инфильтрации (рис. 10, 11).

Гистологическое изучение внутренних органов (печень, почка, селезёнка) во всех опытных группах не выявило каких-либо различий на всех сроках имплантации.

Сопоставление реакции тканей на ПОБ, ПОБВ и полиэфиров типа ПЛА показывает значительно лучшую реакцию тканей и организма на полимеры из ПОА в сравнении с ПЛА, где реакцию тканей можно охарактеризовать как хроническое воспаление в связи с тем, что в результате быстрого гидролиза полилактидов и их сополимеров продукты гидролиза (молочная и др. кислоты) не успевают утилизироваться в организме и вблизи имплантата резко снижается рН окружающей среды (рис. 12А, Б). Хроническое раздражение ткани в результате снижения рН

является серьезной проблемой применения полимерных имплантатов на основе сополимеров полилактидов и полигликолидов (Ignatius et al, 1996; Agrawal etal, 1997).

5" - ■.• v.-г■.},.лш^ж^а™

¡j

ч" ..74» V 41 V. •

ТА ^ ->• >-' : ■ •„ ' ■

Рис. 10. Морфология тканей вокруг пленок ПОБ 510 кДа толщиной 40 мкм через 7 (А), 14 (В), 30 (С), 90 (О) и 180 (Е) суток после операции (краситель - гематоксилин эозин).

Jm- " - >

щ Щт

чЖ® т-ш

Рис. I 1. Морфология тканей вокруг пленок ПЛА толщиной 40 мкм через 7 (А), 14 (В), 30 (С), 90 (D) и 180 (Е) суток после операции (краситель - гематоксилин эозин).

Ы_1. . м L MLL

7 суток 14 суток 30 суток 90 суток 180 суток Время {сутки}

■ Кол-во макрофагов п Кол-во лимфоцитов □ Кол-во фибробластов а Кол-во нейтрофилов А

О ш 40

С 20

А к

iü к

ЙШ

7 суток

14 суток 30 суток 90 суток 180 суток Время (сутки)

■ Кол-во макрофагов Ш Кол-во лимфоцитов □ Кол-во фибробластов И Кол-во нейтрофилов Б

Рис. 12. Динамика изменения клеточного состава соединительнотканной капсулы вокруг пленок ПОБ 510 кДа толщиной 40 мкм (А) и пленок из ПЛА ММ 152 кДа толщиной 40 мкм (Б) через 7, 14, 30, 90 и 180 суток после операции.

Аналогичные результаты были получены и другими исследователями. В работах Фрейра с сотрудниками наблюдалось существенное снижение количества лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов после 6 месяцев имплантации пленок ПОБ одновременно со снижением толщины капсулы примерно до 80-100 мкм. Капсула состояла, главным образом, из коллагеновых волокон, наблюдалось значительное снижение числа клеток соединительной ткани. Небольшое количество экссудата макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов отмечено в тканях, непосредственно примыкающих (адгезированных) к имплантату на сроках 3-6 месяцев после имплантации ПОБ (Freier et al, 2002).

Таким образом, установлено, что воспалительная тканевая реакция на имплантацию пленок на основе ПОБ разной молекулярной массы и толщины на протяжении всего

эксперимента независимо от химического состава полимера и толщины пленок была одинаковой. Присутствие оксивалерата в полимере не изменяло длительности и интенсивности фазы воспаления, а также характера фиброзной капсулы вокруг пленок. Однако по сравнению с ПЛА воспалительная реакция была менее выраженной, у ПЛА наблюдалась более острая фаза воспаления на начальном этапе и сохранялась до срока в 1 месяц. Отсутствие каких-либо патологических изменений во внутренних органах свидетельствует о том, что пленки на основе ПОБ не оказывают токсического воздействия. В пользу бпосовместимости говорит и тот факт, что промежуточный продукт биодеградации ПОБ - D-3-окснмасляная кислота в норме содержится в крови и тканях всех животных в концентрациях 0,3 - 1,3 мМ (Wiggam et al, 1997; Larsen et al, 2005).

3.2. Гистологическое изучение тканевой реакции и внутренних органов крыс на сетчатые эндопротезы

Прорастание протезирующего материала схоже с первичным заживлением раны. Пролиферация фибробластов, кровеносных сосудов, синтез коллагена - все это этапы одного процесса. Процессы, происходящие при этом, характерны для реакции воспаления. Во всех случаях имплантации эндопротезов на 7 сутки с момента операции развивалась тканевая реакция в виде острого неспецифического воспаления с отёком. Степень выраженности воспалительной реакции на 7 сутки проведения эксперимента в зоне имплантации эндопротеза в зависимости от материала была следующей: сильно выражена - при имплантации эндопротезов «Линтекс-Эсфил», умеренно выражена - в зонах имплантации эндопротеза «Линтекс-Эсфил» с покрытием ПОБ (рис. 13А, НА). На 14 сутки во всех случаях было обнаружено формирование вокруг элементов эндопротеза рыхлой соединительной ткани без признаков «зрелости», с разнонаправленной ориентацией образующих её коллагеновых волокон(рис. 13В, 14В).

К 30 суткам с момента имплантации эндопротезов отмечено созревание рыхлой соединительной ткани вокруг эндопротеза (рис. 13С, 14С). Через 3 месяца наблюдается созревание плотной соединительнотканной капсулы с упорядочиванием волокон и циркулярной их ориентацией вокруг филаментов эндопротеза, прорастанием кровеносных сосудов в структуру сетчатого эндопротеза (рис. 13D, 14D). К 6 месяцам с момента имплантации эти процессы становятся более отчетливыми (рис. 13Е, 14Е). Оценка репаративных изменений (включающих смену клеточных ассоциаций с лимфо-макрофагальной на фибробластические образования, время и скорость формирования коллагеновых волокон вокруг филаментов эндопротеза, созревание новообразованной соединительной ткани) в зоне имплантации не показала каких-либо значимых различий, зависящих от вида имплантируемой сетки (рис. 15А, Б). Однако, если учитывать, что после изготовления срезов (микропрепаратов) из материала на 7, 14, 30 сутки сами филаменты наиболее часто сохранялись в срезах с сеткой покрытой ПОБ ММ 510 кДа, то можно сделать предположение о сравнительно более тесном контакте

филаментов этих эндопротезов с элементами соединительной ткани, а значит более быстром сокращении воспалительной фазы и более качественном развитии репаративных процессов.

Рис. 13. Морфология тканей вокруг сеток «Линтекс Эсфил» через 7 (А), 14 (В), 30 (С), 90 (D) и 180 (Е) суток после операции (краситель - гематоксилин эозин).

Рис. 14. Морфология тканей вокруг сеток «Линтекс Эсфил» с покрытием ПОБ ММ 510 кДа через 7 (А), 14 (В), 30 (С), 90 (D) и 180 (Е) суток после операции (краситель - гематоксилин эозин).

|75

"50

О bd

fell

isLL iL

125 J00

| 75

J 50

*25 0

7 суток 14 суток 30 суток 90 суток 180 суток Время (сутки!

■ Кол-во макрофагов Ш Кол-во лимфоцитов □ Кол-во фибробластов Н Кол-во нейтрофилов А

ИИ

7 суток

90 суток

14 суток 30 сушк Время (сутки)

■ Кол-во макрофагов Ш Кол-во лимфоцитов □ Кол-во фибробластов В Кол-во нейтрофилов Б

Рис. 15. Динамика изменения клеточного состава соединительнотканной капсулы вокруг сеток «Линтекс-Эсфил» (А) и сеток «Линтекс-Эсфил», покрытых ПОБ ММ 510 кДа через 7, 14, 30, 90 и 180 суток после операции.

О биологической совместимости материалов, используемых для изготовления эндопротезов, свидетельствует отсутствие послеоперационных осложнений и отсутствие миграции имплантированных эндопротезов, а также образование соединительнотканной капсулы, прорастающей в элементы эндопротеза и вызывающей его «сморщивание» (редукцию). Необходимо отметить меньшую степень выраженности тканевой реакции на имплантацию эндопротезов «Линтекс-Эсфил» с покрытием ПОБ по сравнению с полипропиленовым аналогом, проявляемую в виде менее интенсивной и продолжительной воспалительной фазы, более коротких сроков образования и созревания соединительной ткани.

Выводы:

1 Впервые проведены комплексные исследования биосовместимости и биодеградации пленочных систем на основе синтезированных полиоксибутирата разной молекулярной массы и его сополимера с оксивалератом in vitro и in vivo.

2 Изучен механизм и кинетика деструкции полиокспалканоатов in vitro. Показано, что гидролитическая деструкция пленок полиоксибутирата и его сополимера с оксивалератом происходит одновременно как на поверхности, так и в объеме полимера. Ферментативная деструкция происходит преимущественно в объеме полимера. Полученные результаты позволяют прогнозировать время деструкции этих полимеров в условиях in vivo.

3 Показано, что скорость гидролитической деструкции in vitro пленочных систем из полиоксиалканоатов значительно ниже, чем из полилактидов и обратно пропорциональна молекулярной массе биополимеров.

4 Впервые разработан метод оценки ферментативной биодеструкции полиоксиалканоатов in vitro в присутствии липазы. Показано, что действие липазы как неспецифической эстеразы полиоксиалканоатов приводит к уменьшению молекулярной массы и увеличению кристалличности полимеров in vitro, моделируя процесс их биодеструкции in vivo.

5 Показано, что биодеградация полиоксиалканоатов in vivo происходит преимущественно за счет энзиматической деструкции с незначительным вкладом гидролитической. В процессе биодеструкции имплантаты полностью резорбируются через 6 месяцев после их имплантации.

6 Выявлено, что тканевая реакция на имплантацию пленочных систем из полиоксиалканоатов характеризуется умеренной воспалительной реакцией, которая достоверно ниже реакции на имплантацию полилактидов. Полимеры из полиоксиалканоатов не оказывают токсического действия и являются биосовместимыми.

7 Выявлена лучшая тканевая реакция на полипропиленовый сетчатый эндопротез с покрытием из полиоксибутирата по сравнению с полипропиленовым аналогом. Разработанный нами эндопротез не оказывает токсического действия и является биосовместимым, что позволяет рекомендовать его для медико-биологических испытаний с целью использования в хирургической практике.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Бонарцев А.П., Бонарцева Г.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Лучинина Е.С., Лившиц В.А., Босхомджиев А.П., Маркин B.C., Иорданский А.Л. Новые полимерные системы для контролируемого высвобождения дипиридамола и индометацина. Прикладная биохимия и микробиология. 2006 г., Т.42, №6, стр. 710-715. (Applied biochemistry and microbiology, 2006, Vol. 42, No. 6, p. 625-630).

2. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Иванов Е.А., Багров Д.В., Филатова Е.В., Иорданский А.Л., Бонарцева Г.А. Сравнительное изучение кинетики биодеградации биополимерных систем на основе поли-3-оксибутирата. Биомедицинская химия. 2009 г., Т.55, вып.6, стр. 702-712.

Статьи:

1. Bonartsev А.P., Myshkina V.L., Nikolaeva D.A., Furina Е.К., Makhina T.A., Livshits V.A., Hoskhomdzhiev A.P., Ivanov E.A., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Biosynthesis, biodégradation, and application of poly(3-hydroxybutyrate) and its copolymers - natural polyesters produced by diazotrophic bacteria. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, Ed: A. Méndez-Vilas, Formatex, Spain, 2007, Vol.1, p. 295-307.

2. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Иванов Е.А., Багров Д.В., Филатова Е.В., Бонарцева Г.А., Иорданский А.Л. Гидролитическая деструкция биополимерных систем на основе поли-3-оксибутирата. Кинетический и структурный аспекты. Пластические массы. 2009 г., вып. №8, стр. 13-18.

3. Бонарцев А. П., Иорданский А. Л., Бонарцева Г. А., Босхомджиев А. П., Заиков Г. Е. Биодеградация и биомедицинское применение бактериального поли(З-оксибутирата). Все материалы. Энциклопедический справочник. 2009 г., №11, стр. 31-41.

Тезисы докладов:

1. Bonartsev А.P., Postnikov А.В., Mahina Т.К., Myshkina V.L., Voinova V.V., Boskhomdzhiev А.P., Livshits V.A., Bonartseva G. A., Iorganskii A.L. A new in vivo model of prolonged local nitric oxide action on arteries on basis of biocompatible polymer. The Journal of Clinical Hypertension, 2007, Suppl. A., V. 9, N. 5, p. A152.

2. Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Босхомджиев А.П., Лившиц В.А., Иванов Е.А., Постников А.Б., Николаева Д.А., Воинова В.В., Иорданский А.Л., Бонарцева Г.А., Медведева Н.А. "Создание модельных и лекарственных полимерных систем на основе поли-3-оксибутирата". Материалы докладов XIV Международной конференции

студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 11-14 апреля 2007, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Т. 1, стр. 19-20.

3. Bonartsev А.P., Livshits V.A., Ivanov Е.А., Makhina Т.А., Myshkina V.L., Boskhomdzhiev A.P., Voinova V.V., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Nanospheres and nanocapsules loaded with drugs and proteins on the base of biocompatible and biodegradable polymer, poly(3-hydroxybutyrate). Book of reports of K1ST-MSU Joint Workshop on Nanotechnology, Seoul, Korea, November 13-14, 2007, p. 77-87.

4. Bonartsev A., Postnikov A., Mahina Т., Myshkina V., Boskhomdzhiev A., Livshits V., Ivanov E., Voinova V., Nikolaeva D., Medvedeva N., Bonartseva G., lorganskii A. A new model of prolonged local nitric oxide action on different blood vessels in vivo on basis of poly(3-hydroxybutyrate. Book of abstracts of 17th European Meeting of Hypertension, June 15-19,

2007, Milan, Italy, p. 138.

5. Livshits V.A., Ivanov E.A., Bonartsev A.P., Boskhomdzhiev A.P., Mahina Т.К., Myshkina V.L., Voinova V.V., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Microspheres, nanospheres and membranes on the base of biocompatible and biodegradable polymer, po!y(3-hydroxybutyrate), loaded with antiproliferative and antihypertensive drugs. The 23rd Annual Scientific Meeting of the American Society of Hypertension, May 14-17, 2008. The Journal of Clinical Hypertension,

2008, Suppl. A, Vol. 10, Iss. 5, p. A2.

6. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Бонарцева Г.А. "Исследование биодеградапни биополимера микробного происхождения - полн-р-оксибутирата". Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 11-14 апреля 2007, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, Т.1, стр. 71-72.

7. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Бонарцева Г.А. "Изучение биосовместимости и биодеструкции бактериального биопластика - поли-(3-оксибутирата разной молекулярной массы". Тезисы докладов Третьей Санкт-Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах", 17-19 апреля 2007, Санкт-Петербург, с. 328.

8. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л. "Изучение биодеградации парадонтологических мембран на основе поли-(3-оксибутирата". Тезисы докладов XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», 25-26 апреля 2007, Казань: Отечество, с. 310.

9. Bonartsev А.P., Voinova V.V., Postnikov А.В., Makhina Т.А., Myshkina V.L., Livshits V.A., Boskhomdzhiev A.P., Ivanov E.A., Nikolaeva D.A., Bonartseva G.A., Iordanskii A.L. Book of abstracts of the XVI International Conference " Physiological model of sustained nitric oxide action onvascular tissues with using biocompatible polymer, poly(3-hydroxybutirate)", "New

Information Technologies in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology". May 31 - June 9, 2008. Gurzuf, Ukraine., p. 107-108.

10. Бонарцева Г.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Николаева Д.А., Фурина Е.К., Босхомджиев А.П., Иванов Е.А., Лившиц В.А., Бонарцев А.П., Иорданский А.Л. Разработка новых медицинских изделий с пролонгированным высвобождением инкапсулированных лекарственных препаратов на основе биосовместимых и биоразлагаемых полимеров. Материалы симпозиума "Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств", 9-11 июня 2008 г., Москва, стр. 28.

11. Бонарцева Г.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Николаева Д.А., Фурина Е.К., Лившиц В.А., Иванов Е.А., Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Иорданский А.Л. Разработка новых инъекционных форм лекарственных препаратов пролонгированного действия на основе микросфер из биосовместимых и биоразлагаемых полимеров. Материалы симпозиума "Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств", 9-11 июня 2008 г., Москва, стр. 26-27.

12. Bonartsev А.P., Livshits V.A., Ivanov Е.А., Makhina Т.А., Myshkina V.L., Boskhomdzhiev A.P., lordanskii A.L., Bonartseva G.A. Micro- and nanoparticles loaded with various drugs on the base of biocompatible and biodegradable polymer, poly(3-hydroxybutyrate). Book of abstracts of the 11th MipTec Conference - The Leading European Event for Drug Discovery. Oct 14-16, 2008, Basel, Switzerland, p. 113.

Заказ № 32-а/03/10 Подписано в печать 09.03.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Босхомджиев, Араша Петрович

Список сокращений

Введение

ЧАСТЬ 1. Литературный обзор

Глава 1.История изучения полиоксиалканоатов

Глава 2. Физико-химические свойства ПОБ

Глава 3. Пути синтеза и распада ПОБ. Биосинтез ПО А

Глава 4. Биодеградация ПО А на примере ПОБ

4.1. Неферментативный гидролиз ПОБ in vitro

4.2. Ферментативная деградации ПОБ in vitro

4.3. Биодеградащш ПОБ in vivo в тканях животных

Глава 5. Исследование биосовместимости ПОА

5.1. Биосовместимость ПОА в экспериментах in vitro на клеточных культурах. Сравнение с другими полимерами

5.2. Гемосовместимсоть ПОА. Сравнение с другими полимерами

5.3. Биосовместимость ПОА in vivo. Реакция тканей на имплантацию

ПОА. Тканевая реакция на ПОА в сравнении с другими полимерами

Глава 6. Применение ПОА в медицине

6.1. Медицинские изделия из ПОА

6.2. Методы модификации поверхности медицинских изделий

6.3. Сетчатые эндопротезы и герниопластика. Сетчатые эндопротезы на основе биополимеров. Методы модификации поверхности сетчатых эндопротезов

ЧАСТЬ 2. Материалы и методы исследований

1. Объекты исследования

2. Выделение и очистка ПОА из биомассы

3. Определение содержания поли-3-гидроксибутирата в бактериальных клетках по Зевенхаузену

4. Определение молекулярной массы полимера

5. Исследование состава полимера методом ядерно-магнитного резонанса

6. Определение степени кристалличности образцов полимера методом рентгеноструктурного анализа

7. Изготовление пленок ПО А, ПЛА и их композитов, модифицирование пленок

8. Покрытие сеток ПОБ

9. Исследование биодеградации пленок ПОА in vitro

10. Исследование биодеградации пленок ПОА in vivo

11. Исследование биосовместимости пленок, покрытых ПОБ

12. Световая микроскопия

13. Атомно-силовая микроскопия

ЧАСТЬ 3. Результаты и их обсуждение

Глава 1. Исследование деградации пленок ПОА in vitro 1.1. Кинетика гидролитической деструкции ПОБ и его производных

1.2. Изменение молекулярной массы ПОБ и ПОБВ

1.3. Анализ поверхности пленок ПОБ методом атомно-силовой микроскопии

1.4. Исследование кристалличности ПОБ и ПОБВ '

Глава 2. Исследование биодеградации пленок ПОБ и ПОБВ

2.1. Кинетика биодеструкции ПОБ и его производных

2.2. Изменение молекулярной массы ПОБ и ПОБВ

2.3. Анализ поверхности пленок ПОБ методом атомно-силовой микроскопии

2.4. Исследование кристалличности ПОБ И ПОБВ

Глава 3. Изучение биосовместимости пленок и сетчатых эндопротезов in vivo

3.1. Гистологическое изучение тканевой реакции и внутренних органов крыс при подкожной имплантации пленок из ПОБ, ПОБВ и ПЛА

3.2. Гистологическое изучение тканевой реакции и внутренних органов крыс на сетчатые эндопротезы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение биодеструкции и биосовместимости полимерных систем на основе полиоксиалканоатов"

В настоящее время в России необходимость изучения и создания новых биоразлагаемых полимерных материалов для медицины стоит очень остро. Это связано с тем, что на рынке биоразлагаемых медицинских изделий превалируют изделия импортного производства из химически синтезируемых полимеров (полилактиды (ПЛА) и полигликолиды (ПГА)), которые являются быстро деструктируемыми биоматериалами и по своим характеристикам часто не удовлетворяют требованиям медицинских изделий с контролируемым процессом деструкции.

В последние годы в мире ведутся активные исследования полиоксиалканоатов (ПОА) — нового класса природных полиэфиров, обладающих биосовместимостью с живой тканью и не подверженных быстрой гидролитической деградации. Возможность получать полимеры и сополимеры ПОА с заданными свойствами, такими как мономерный состав, молекулярная масса, кристалличность и т.д., позволяет прогнозировать широкую сферу применения данных материалов для медицины применительно к ортопедии, сердечно-сосудистой хирургии, урологии, герниопластике и фармакологии. Однако результаты, полученные к настоящему времени разными исследователями, фрагментарны и часто весьма противоречивы, что связано как с технологическими методами получения этих биополимеров (вид микроорганизма-продуцента, условия биосинтеза, состав, метод экстракции, чистота), так и с методами исследования полимеров in vitro и in vivo, поэтому комплексное, детальное изучение ПОА с учетом вышеперечисленных существенных факторов и свойств является весьма актуальным.

В нашем институте в течение многих лет ведутся работы по изучению биосинтеза и физико-химических свойств ПОА с целью их возможного использования в медицине. Данная работа является их логическим продолжением и посвящена комплексному изучению процессов биодеструкции и биосовместимости поли-3-оксибутирата (ПОБ) и сополимера поли-3-оксибутирата с 3-оксивалератом (ПОБВ), в условиях, приближенных к физиологическим in vitro и в опытах на животных in vivo.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Босхомджиев, Араша Петрович

выводы

На основании проведенных исследований и полученных результатов можно сделать следующие выводы:

2 Изучен механизм и кинетика деструкции полиоксиалканоатов in vitro. Показано, что гидролитическая деструкция пленок полиоксибутирата и его сополимера с оксивалератом происходит одновременно как на поверхности, так и в объеме полимера. Ферментативная деструкция происходит преимущественно в объеме полимера. Полученные результаты позволяют прогнозировать время деструкции этих полимеров в условиях in vivo.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена исследованию деградации и биосовместимости полиоксиалканоатов разной молекулярной массы в сравнении с полилактидами.

Полиоксиалканоаты являются перспективными материалами для различных сфер применения, таких как медицина, фармакология, пищевая промышленность и т.д. Это связано с тем, что представители класса ПОА обладают уникальными свойствами, такими как биосовместимость и биодеградируемость. Кроме того, биосинтез широкого спектра ПОА и создание композитов на их основе дает возможность получения широкого ассортимента биоразлагаемых термопластиков с заданными физико-химическими характеристиками, что значительно расширяет сферы их применения. В лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН разработан эффективный способ получения этого биополимера, синтезируемого штаммом-продуцентом Azotobacter chroococcum.

Методом полива растворов ПОА и ПЛА в хлороформе на обезжиренную поверхность стекол были получены серии пленок разной молекулярной массы из полиоксибутирата, его сополимера с оксивалератом (12-13% включения ММ= 1056 кДа), полилактидов и смесевой композиции ПОБ с ПЛА. В экспериментах in vitro проведен анализ и сопоставление долгосрочных кинетических кривых . гидролитической деструкции полученных пленок. В качестве контроля степени гидролитической деструкции использовали суммарную потерю массы образца, степень кристалличности и изменение средневязкостной молекулярной массы (ММ). Для контроля состояния поверхности пленок ПОБ использовался метод атомно-силовой микроскопии. Было показано, что скорость гидролитической деструкции зависит от среды инкубации (природы буфера), температуры, химического состава биополимера и его молекулярной массы. Сопоставление кривых потери веса для пленок с близкими ММ биополимеров ПЛА и ПОБ (ММ = 400 и 510 кДа соответственно) в одинаковых условиях показало, что полилактиды теряют массу быстрее, чем аналогичные образцы ПОБ. Важно заметить, что композитная пленка показала приблизительно среднее значения 50% потери веса, тогда как для полилактидов это значение равно

100% и 14% для ПОБ. Было показано, что наряду с объемными процессами гидролиза ПОБ протекает и поверхностный гидролиз полимера. Было отмечено падение ММ и возрастание степени кристалличности всех исследуемых образцов.

Следующим шагом нашей работы стало изучение биодеградации in vitro и in vivo. Для этого в экспериментах in vitro исследовано влияние липазы, как неспецифической эстеразы. В эксперименте in vivo пленки подкожно имплантировались в брюшную область самцам крыс линии Wistar. Сопоставление кривых потери веса для пленок ПОБ и ПОБВ не показало достоверного снижения массы пленок, оценка ММ показало ее значительное снижение в группе с липазой по сравнению с контрольной группой; также отмечался рост степени кристалличности. В экспериментах на животных наблюдалось постепенное снижение веса пленок в течении 3-х месяцев до рос полной биодеградации за 6 месяцев, одновременно наблюдали падение ММ пленок. I

Далее были проведены исследования тканевой реакции на подкожную имплантацию пленок из ПОБ, ПОБВ и ПЛА. Установлено, что воспалительная тканевая реакция на имплантацию пленок на основе ПОБ разной молекулярной массы и толщины на всем протяжении эксперимента независимо от химического состава полимера и толщины была одинаковой. Присутствие оксивалерата в полимере не изменяло длительности и интенсивности фазы воспаления, а также характера фиброзной капсулы вокруг пленок. Однако по сравнению с ПЛА воспалительная реакция на ПОБ была менее выраженной, у ПЛА наблюдалась более острая фаза воспаления на начальном этапе и держалась до срока 1 месяц. Отсутствие каких-либо ~ патологических изменении во внутренних органах свидетельствует о том, что мембраны на основе ПОБ не оказывают токсического воздействия.

На основе результатов экспериментальных исследований биосовместимости и биодеградации пленок ПОБ in vivo изучена тканевая реакция на сетчатые эндопротезы «Линтекс-Эсфил» покрытых ПОБ с целью улучшения биосовместимых свойств полипропиленовой сетки. О биологической совместимости данных материалов свидетельствует отсутствие послеоперационных осложнений и миграции эндопротезов, а также образование соединительнотканной капсулы, прорастающей элементы эндопротеза и вызывающей его «сморщивание» (редукцию). Необходимо отметить меньшую степень выраженности тканевой реакции на имплантацию эндопротезов «Линтекс-Эсфил» с покрытием ПОБ по сравнению с полипропиленовым аналогом, проявляемую в виде менее интенсивной и продолжительной воспалительной фазы, более коротких сроков образования и созревания соединительной ткани. Исследования гидролитической и ферментативной деградации, а также тканевой реакции на ПОБ и ПОБВ позволяют рекомендовать использование покрытия из ПОБ сетчатых эндопротезов «Линтекс-Эсфил» для лечения грыж в герниопластике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Босхомджиев, Араша Петрович, Москва

1. Abe Н. and Doi Y. Enzymatic and environmental degradation of racemic poly(3-hydroxybutyric acid)s with different stereoregularities // Macromol. 1996. - V. 29. - P. 8683-8688.

2. Abe H. and Doi Y. Structural effects on enzymatic degradabilities for poly(R)-3-hydroxybutyric acid. and its copolymers: mini rewiew // Int. J. Biol.

3. Macromol. 1999. - V. 25, № 1-3. - P. 185-192.i

4. Abe H., Doi Y., Aoki H., Akehata T. Solid state structures and enzymatic degradability for melt-crystallized films of copolymers of (R)-3-hydroxybutyric acid with different hydroxyalkanoic acids // Macromol. 1998. - V. 31. -P. 1791-1797.

5. Abe H., Kikkawa Y., Iwata Т., Aoki H., Akehata Т., Doi Y. Microscopic visualization on crystalline morphologies of films for poly(R)-3-hydroxybutyric acid. and its copolymer // Polymer. 2000. - V. 41. - P. 867-874.

6. Abe H., Marsubara I., Doi Y. Physical properties and enzymatic degradability of polymer blends of bacterial poly(R)-3-hydroxybutyrate. stereoisomers // Macromol. 1995. - V. 28. - P. 844-853.

7. Agrawal C.M., Athanasiou K.A. Technique to control pH in vicinity of biodegrading PLA-PGA implants. J. Biomed. Mater. Res., 1997, 38(2), 105-114.

8. Akita S., Einada Y., Miyaki Y., Fugita H. Properties of poly((3-hydroxybutyrate) as a solution// Macromol., 1976, v. 9, pp. 774-780.

9. Akutsu T. Artifical heart. Total replacement and partial support. Tokyo, 1975, 1064 p.

10. Alper R., Lundgren D.G. Properties of poly-р -hydroxybutyrate. I. General considerations concerning the naturally occuring polymer// Biopolymers, 1963, v. 1, pp. 545-556.

11. Anderson A. J., Dawes E. A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates // Microbiol. Rev. 1990. - V. 54.-P. 450^172.

12. Ashraf A. M., Gamal. S. S., Amany. H. H. II. Dielectric investigation of cold crystallization of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) // Polymer. 1999. - V. 40. - P. 5377-5391.

13. Avella M., Martuscelli E. Poly(D-(-)-(3-hydroxybutyrate)/polyIethylenen oxide) blends: phase diagram, thermal and crystallization behavior// Polymer. -1998.-V. 29.-P. 1731-1737.

14. Avella M., Martuscelli E., Greco P. Crystallization behavior of poly(ethylenen oxide) from poly-D-(-)-(3-hydroxybutyrate)/poly(ethylenen oxide): phase structuring, morphology and thermal behavior // Polymer. 1991. - V. 32. -P. 1647-1653.

15. Avelle M., Martuscelli E., Raimo M. Review Properties of blends and composites based on poly(3-hydroxy)butyrate (PHB) and poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) (PHBV) copolymers // J. Materials Science. 2000 a. - V. 35. -P. 523-545.

16. Baptist J. N., Ziegler J. B. Method of making absorbable surgical sutures from poly beta hydroxy acid // US Patent № 3 229 766. 1965.

17. Barnard G.N., Sanders J.K., The poly- P-hy droxybutyrate granule in vivo. A new insight based on NMR spectroscopy of whole cells// J. Biol. Chem., 1989, v. 264(6), pp. 3286-91.

18. Birk D.E., Mayne R. Localization of collagen types I, III and V during tendon development. Changes in collagen types I and III are correlated with changes in fibril diameter. Evr. J. Cell Biol. 1997; 72, 352-361.

19. Bloembergen S., D. A. Holden, G. K. Hamer, T. L. Bluhm, and R. H. Marchessault, "Studies of Composition and Crystallinity of Bacterial Poly(P~ Hydroxybutyrate-co-P-Hydroxyvalerate)", Macromolecules, 19 (11), 2865, (1986).

20. Blixmm E., Owen A. J. Miscibillity, crystallization and melting of poly(3-hydroxybutyrate)/poly(L-lactide) blends// Polymer. 1995. - V. 36. - P. 40774081.

21. Boatman E.S. Observation on the fine structure of spheroplasts of Rhodospirillum rubrum// J. Cell Biol., 1964, v. 20, pp. 297-311.

22. Bonartsev A.P., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. and Zaikov G.E. Polymers Research Journal. Volume 2 Issue 2 pp. 127-160- YB (2008) Biodegradation and Medical Application of Microbial Poly (3-Hydroxybutyrate)

23. Borkenhagen M., Stoll R. C., Suter U. W., Aebischer P. In vivo performance of a new biodegradable polyester system used as a nerve guidance channel // Biomaterials. 1998. - V. 19, № 23. - P. 2155-2165.

24. Bostman O., Pihlajamaki H. Clinical biocompatibility of biodegradable orthopaedic implants for internal fixation: a review. Biomaterials, 2000, 21(24), 2615-2621.

25. Bowald S. F., Johansson E. G. A novel surgical material // Europen Patent Application № 0 349 505 A2. 1990.

26. Bowers K.T., Keller J.C., Randolph B.A., Wick D.G., Michaels C.M. Optimization of surface micromorphology for enhanced osteoblasts responses in vitro. Int. J. Oral. Max. Irnpl., 1992, 7, 302-310.

27. Boyan B.D., Hummert T.W., Dean D.D., Schwartz Z. Role of material surfaces in regulating bone and cartilage cell response. Biomaterials 1996, 17, 137-146.

28. Brandl H., Gross R. A., Lenz R. W., Fuller C. W. Pseudomonas oleovorans as a source of Poly(P-hydroxyalkanoates) for potential application as biodegradable polyesters // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54. - P. 1977-1982.

29. Brandl H., Gross R., Lenz R., Fuller R. Plastics from bacteria and for bacteria: poly(-hydroxyalkanoates) as natural, biocompatible, and biodegradable polyesters // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1990. - V. 41. - P. 77-93.

30. Braunegg G., Lefebvre G., Genzer K. F. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects (rewiew article) // J. of Biotechnol. -1998. V. 65. - P. 127-161.

31. Byron D. Production of poly-P-hydroxybutyrate: polyhydroxyvalerate copolymers // FEMS Microbiol. Rev. 1992. - V. 103. - P. 247-250.

32. Cameron A. E., Taylor D.E. Carbon-fibre versus marlex mesh in the repair of experimental abdominal wall defects in rats. Br. J. Surg. 1985; 72, 648-654.

33. Cao W., Wang A., Jing D., Gong Y., Zhao N., Zhang X. Novel biodegradable films and scaffolds of chitosan blended with poly(3-hydroxybutyrate). J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2005, 16(11), 1379-1394.

34. Catchpole B.N., Curran R.C. A new type of arterial prosthesis. // Surgery, 1958, 44, №6, 992-1007.

35. Ceonzo K., Gaynor A., Shaffer L., Kojima K., Vacanti C.A., Stahl G.L. Polyglycolic acid-induced inflammation: role of hydrolysis and resulting complement activation. Tissue Eng. 2006, 12(2), 301-308.

36. Cha Y., Pitt C.G. The biodegradability of polyester blends. Biomaterials 1990, 11(2): 108-112.

37. Chanvel-Lesrat D.J., Pellen-Mussi P., Auroy P., Bonnaure-Mallet M. Evaluation of the in vitro biocompatibility of various elastomers. Biomaterials 1999, 20, 291-299.

38. Chaput C., Des Rosiers E. A., Assad M., Brochu M., Yahia L., Selmani A., Rivard C. Processing biodegradable natural polyesters for porous soft materials // NATO ASI Ser. 1995a. - V. 294. - P. 229-245.

39. Chaput C., Yahia L., Selmani A., Rivard C., Mater C. Natural Poly(hydroxybutyrate-hydroxyvalerate) polymers as degradable biomaterials // Res. Soc. Symp. Proc. 1995b. - V. 394. - P. 111-116.

40. Chen G.Q., Wu Q. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials. Biomaterials, 2005, 26(33):6565-6578.

41. Chun Y. S., Kim W. N. Thermal properties of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) and poly(ecaprolactone) blends. Polymer. - 2000. - V. 41. -P. 2305-2308.

42. Cochran D., Simpson J., Weber H., Buser D. Attachment and growth of periodontal cells on smooth and rough titanium. Int. J. Oral. Max. Impl., 1994, 9, 289-297.

43. Condon R.E., Carili S. The biology and anatomy of inguinofemoral hernia. Semin. Laparosc. Surg. 1994; 1, 75-85.

44. Cornibert J., Marchessault R.H. Physical properties of poly-P-hydroxybutyrate. IV. Conformational analysis and crystalline structure// J. Mol. Biol., 1972, v. 71, pp. 735-756.

45. Coskun S., Korkusuz F. and Hasirci V. Hydroxy apatite reinforced poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) based degradable composite bone plate. J. Biomater. Sci. Polymer Edn, 2005, Vol. 16, No. 12, pp. 1485-1502.

46. Сох М. К. Properties and applications of polyhydroxyalkanoates// In:

47. Biodegradable Plastics and Polymers.(Y. Doi and K. Fukuda, eds.). Amsterdam:

48. Elsevier. 1994. - P. 120-135.

49. Cronenwett J.L., Zelenock G.B. In: Biomaterials in Reconstructive Surgery./Ed.L.R.Rubin.- Mosby: St.Louis, MO, 1982, 595-620.

50. Dang M. H., Birchler F., Ruffieux K., Wintermantel E. Toxocity screening of biodegradable polymers I. Section and evaluation of cell culture test methods // J. Environ. Poly. Degrad. - 1996. - V. 4. - P. 197-203.

51. Davies S., Tighe B. Cell attachment to gel-spun polyhydroxybutyrate fibers// Polym. Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem.) 1995. - V. 36. -P. 103-104.

52. Dawes E. A (Ed.) Novel biodegradable microbial polymers // Kluwer Academic, Dordrecht, the Netherlands. 1990. - 287 p.

53. Dawes E.A., Senior P.J. The role and regulation of energy reserve polymers in microorganisms//Adv. Microb. Physiol., 1973, v. 10, pp. 135-266.

54. De Smet M. J., Egink G., Witholt В., Kingma J., Wynberg H. Characterization of intracellular inclusions formed by Pseudomonas oleovorans during growth on octane // J. Bacterid. 1983. - V. 154. - P. 870-878.

55. Delafield F. P., Doudoroff M., Palleroni N.J., Lusty C.J., Contopoulos R. Decomposition of poly-P-hydroxybutyrate by Pseudomonas// J. Bacterid., 1965, v. 90, pp. 1455-1466.

56. Deng Y., Lin X.S., Zheng Z., Deng J.G., Chen J.C., Ma H., Chen G.-Q. Poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyhexanoate) promoted production of extracellular matrix of articular cartilage chondrocytes in vitro. Biomaterials, 2003, 24(23), 4273-4281.

57. Doi Y. Microbial synthesis, physical properties, and biodegradability of polyhydroxyalkanoates.-1995.

58. Doi Y., Abe H. Structural effects on biodegradation of aliphatic polyesters // Macromol. Symp. 1997. - V. 118. - P. 725-731.

59. Doi Y., Kanesawa Y, Kawaguchi Y, Kunioka M. Hydrolytic degradation of microbial poly(hydroxyalkanoates). Makrom. Chem. Rapid. Commun. 1989; 10:227-230.

60. Doi Y., Kanesawa Y., Kunioka M., Saito T. Biodegradation of microbial copolyesters: poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-4- hydroxybutyrate). Macromolecules, 1990 a, 23:26-31.

61. Doi Y., Kawaguchi Y., Nakamura S., Hiramitsu M., Yoshida Y., Kimura H. Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates // FEMS Microbiol. Rev. -1992 b.-V. 1-3.-P. 103-108.

62. Doi Y., Microbial Polyesters// VCH, New York, 1990, pp. 89-98.

63. Doudoroff M., Stanier R.Y. Role of poly-p-hydroxybutyric acid in the assimilation of organic carbon by bacteria//Nature, 1959, v. 183, pp. 1440-1442.

64. Doyle C., Tanner E.T. and Bonfleld W. In vitro and in vivo evaluation of polyhydroxybutyrate and of polyhydroxybutyrate reinforced with hydroxy apatite. Biomaterials 1991, 12:841-847.

65. Dubost C. // Acta Chir. Belg., 1955, 55, № 4, 285-294.

66. Duvernoy O, Malm T, Ramstrom J, Bowald S. A biodegradable patch used as a pericardial substitute after cardiac surgery: 6- and 24-month evaluation with CT. Thorac Cardiovasc Surg. 1995 Oct;43(5):271-274

67. Edwards w!s., Rich A., Peter E. // Surg.Gynec. Obstet., 1957, 105, № 2, ^ 177-178. '

68. Fedorov M., Vikhoreva G., Kildeeva N., Maslikova A., Bonartseva G., Galbraikh L. Modeling of surface modification process of surgical suture.У

69. Chimicheskie volokna 2005, (6), 22-28. Article in Russian.

70. Fischer D., Li Y., Ahlemeyer В., Kriglstein J., Kissel T. In vitro cytotoxicity testing of polycations: influence of polymer structure on cell viability and hemolysis. Biomaterials 2003, 24(7), 1121-1131.

71. Freier Т., Kunze C., Nischan C., Kramer S., Sternberg K., Sass M., Hopt U.T., Schmitz K.P. In vitro and in vivo degradation studies for development of abiodegradable patch based on poly(3-hydroxybutyrate). Biomaterials. 2002, 23(13):2649-2657.

72. Galgut P., Pitrola R., Waite I., Doyle C., Smith R. Histological evaluation of biodegradable and non-degradable membranes placed in rat // J. Clin. Periodental. 1991.-V. 18.-P. 581-586.

73. Gavard R., Dahinger A., Hauttecoeur В., Reynaud C. Degradation du lipide P-hydroxybutyrique par un extrait enzymatique de Bacillus megaterium I. depolymerase A.// C.R. Acad. Sci. Paris, 1966, v. 263, pp. 1273-1275.

74. Gibsoti I.D., Stafford C.E. Synthetic mesh repair of abdominal wall defects. Am. Surg. 1964; 30, 481-488.

75. Greca F. H., de Paola J,, Biondo- Simoes M. L., da Costa F. D. et all. The influence of differing pore sizes on biocompatibility of two polypropylene meshes in the repair of abdominal defects experimental study in dogs. Hernia 2001; 59-64.

76. Griebel R., Merrick J.M. Metabolism of poly-|3-hydroxybutyrate, effect of mild alkaline extraction on native poly-P-hydroxybutyrate granules// J. Bacterid., 1971, v. 108, pp. 782-789.

77. Griebel R., Smith Z., Merrick J.M. Metabolism of poly-P-hydroxybutyrate. I. Purification, composition and properties of native poly-P-hydroxybutyrate granules from Bacillus megaterium// Biochemistry, 1968, v. 7, pp. 3676-3681.

78. Gursel I., Balcik C.,Arica Y., Akkus O., Akkas № , Hasirci V. Synthesis and mechanical propertied of interpentrating network of polyhydroxybutyrate co-hydroxyvalerate and polyhydroxyethyl methacrylate // Biomaterials. - 1998. -V. 19. -P. 1137-1143.

79. Hao J., Deng X. Semi-interpenetrating networks of bacterial poly(3-hydroxybutyrate) with net-poly(ethylene glycol) // Polymer. 2001. - V. 42. -P. 4091-4091.

80. Harrison J.H. // Am. J. Surg., 1958, 95, № 1, 3-15.

81. Harrison S.T., Chase H.A., Amor S.R., Bonthrone K.M., Sanders J.K.

82. Plasticization of poly(hydroxybutyrate) in vivo// Int. J. Biol. Macromol., 1992, v. 14(1), pp. 50-56.

83. Haywood G.W., Anderson A.J., Dawes E.A. The importance of PHB-synthase substrate specificity in PHA synthesis by Alcaligenes eutrophus// FEMS Microbiol. Lett., 1989, v. 57, pp. 1-6.

84. Hazari A., Johanson-Ruden G., Junemo-Bostron K., Ljungberg C., Terenghi G., Green C., Wiberg M. A new resorbable wraparound implant as an alternative nerve repair technique // J. Hand. Surg. 1999 a. - V. 24B. - P. 291295.

85. Hazari A., Wiberg M., Johansson-Ruden G., Green C., Terenghi G. A resorbable nerve conduit as an alternative to nerve autograft in nerve gap repair // Br. J. Plast. Surg. 1999 b. - V. 52, № 8. - P. 653-657.

86. Henkel W., Glanville R.W. Covalent crosslinking between molecules of type I and type III collagen. Evr. J. Biochem. 1982; 122, 205-213.

87. Hesselink V. J., Luijendijk R.W., de Wilt J.H., Heide R. An evaluation of risk factors in incisional hernia reccurence. Surg. Gynecol. Obstet 1993; 176, 228-234.

88. Hirt Т. D., Neuenschwander P., Suter U. W. Telechelic diols from poly(R)-3rhydroxybutyric acid. and poly{R)-3hydroxybutyric acid]-co-[(R)-3-hydroxyvaleric acid]} // Macromol. Chem. Phys. 1996. - V. 197. - P. 1609-1614.

89. Hocking P. J., Marchessault, R. H. Biopolyeaters // in: Chemistry and technology of biodegradable polymers (Griffin G. J, ed.). Glasgow: Blackie. -1994. P. 48-96.

90. Holland S.J., Jolly A.M., Yasin M., Tighe B.J. Polymers for biodegradable medical devices. II. Hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers: hydrolytic degradation studies. Biomaterials, 1987, 8(4):289-295.

91. Holmes P. Biologically produced (R)-3-hydroxy-alkanoate polymers and copolymers. In: Bassett DC (Ed.) Developments in crystalline polymers. London, Elsevier, 1988, Vol. 2: 1-65.

92. Huang R., Reusch R.N. Poly(3-hydroxybutyrate) is associated with specific proteins in the cytoplasm and membranes of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1996, 271, 22196-22201.

93. Hyon S.-H., Jamshidi K., Ikada Y., et al. // Кобунси ромбунсю, 1985, 42, №11, 771-776; РЖХимия., 1986, 14 T 394.

94. Ignatius А.А., Claes L.E. In vitro biocompatibility of bioresorbable polymers: poly(l, dl-lactide) and poly(1-lactide-co-glycolide). 1996, 17:8, 831-839.

95. Iordanskii A.L., Rudakova Т.Е., Zaikov G.E. (1984) Interaction of polymers with corrosive and bioactive media. 1984 VSP New York -Tokyo

96. Ishikawa K. Flexible triempler for use as a medical bag // US Patent № 5 480 394. 1996.

97. Jackson F.A., Dawes E.A. Regulation of the tricarboxylic acid cycle and poly-P -hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinkii// J. Gen. Microbiol., 1976, v. 97, pp. 303-312.

98. Jendrossek D. Microbial degradation of polyesters// Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. 2001. - V. 71. - P. 293-325.

99. Jendrossek D., Handrick R. Microbial degradation of polyhydroxyalkanoates // Annu. Rev. Microbiol. 2002. - V. 56. - P. 403-432.

100. Jendrossek D., Schirmer A., Schlegel H.G. Biodegradation of polyhydroxyalkanoic acids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996; 46:451-463.

101. Jensen Т.Е., Sicko L.M. Fine structure of poly-J3 -hydroxybutyric acid granules in a blue-green alga Chlorogloea fritschii// J. Bacteriol., 1971, v. 106, pp. 683-686.

102. Junge K., Klinge U., Rosch R., Klosterhalfen В., Schumpelick V.V

103. Funnctional and morphologic properties of a modified mesh for inguinal hernia repair. World J. Surg 2002; 26, 1472-1480.

104. Junge K., Klinge U., Rosch R., Klosterhalfen В., Schumpelick V., Mertens P. Decreased collagen type I/III ratio in patients with reccurring hernia after implantation of alloplastic prostheses. Arch. Surg. 2004; 389, 17-22.

105. Kadouri D, Jurkevitch E, Okon Y, Castro-Sowinski S. Ecological and agricultural significance of bacterial polyhydroxyalkanoates. Crit Rev Microbiol. 2005; 31(2):55-67.

106. Khouw I.M., van Wachem P.B., de Leij L.F., van Luyn M.J. Inhibition of the tissue reaction to a biodegradable biomaterial by monoclonal antibodies to IFN-gamma. J. Biomed. Mater. Res., 1998, 41, 202-210.

107. Kil'deevaN.R., Vikhoreva G.A., Gal'braikh L.S., Mironov A.V., Bonartseva G.A., Perminov P. A., Romashova A.N. Preparation of biodegradable porous films for use as wound coverings. Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 2006, 42(6): 716-720. [Article in Russian].

108. Kim D. Y., Kim Y. В., Rhee Yha. Bacterial poly(3-hydroxyalkanoates) bearing carbon-carbon triple bonds // Macromol. 1998. - V. 32. - P. 4760-4763.

109. Kiraly R.J., Hillegas D.V. In: Synthetic biomaterial polymer: concept and applications.- Technomic. Publishing Co.,Inc.: Westport, 1980.

110. Klinge U., Klosterhalfen В., Conze J. Modified mesh for hernia repair that is adapted to the physiology of the abdominal wall. Evr. J. Surg. 1998; 164, 951-960.

111. Klosterhalfen В., Klinge U., Hermans B. Patology of traditional surgical nets for hernia repair after long-term implantation in humans. Chirurg 2000; 71, 43-51.

112. Kominek L.A., Halvorson H.O. Metabolism of poly-P -hydroxybutyrate and acetoin in Bacillus cereus// J. Bacterid., 1965, v. 90, pp. 1251-1259.

113. Kostopoulos I., Karring T. Guided bone regeneration in mandibular defects in rats using a bioresorbable polymer // Clin. Oral Impl. Res. 1994 - V. 5. -P. 66-74.

114. Koyama N. and Doi Y. Morphology and biodegradability of a binary blend of poly((R)-3-hydroxybutyric acid) and poly((R,S)-lactic acid). Can. J. Microbiol., 1995 a,41(Suppl. 1): 316-322.

115. Koyama N., Doi Y. Continuous production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Alcaligenes eutrophus // Biotechnol. Lett. 1995 b. - V. 17. — P. 281-284.

116. Koyama N., Doi Y. Miscibillity of binary blends of poly(R)-3-hydroxybutyric acid). // Polymer. 1997. - V. 38. - P. 1589-1593.

117. Kuijer R., Bouwmeester S.J.M., Drees M.M.W.E., et al. // J.Mater.Sci. Mater. Med., 1998, 9, № 8, 449-455.

118. Kumagai Y., Doi Y. Physical properties and biodegradbillity of blends of isotactic and atactic poly(3-hydroxybutyrate) // Macromol. Chem. Rapid. Commun. 1992. - V. 13. - P. 179-183.

119. Kurcok P., Kowalczuk M., Adamus G., Jedlinrski Z., Lenz R.W. Degradability of poly (b-hydroxybutyrate) s. Correlation with chemical microstucture. JMS-Pure Appl. Chem. 1995, A32:875-880.

120. Larsen Т., Nielsen N.I. Fluorometric detennination of beta-hydroxybutyrate in milk and blood plasma. J. Daily Sci., 2005, 88(6), 2004-2009.

121. Law J. H., Slepecky R.A. Assay of poly-(3-hydroxybutyric acid// J. Bacterid., 1961, v. 82, pp. 33-36.

122. Lee S. Y., Choi Ji., Han K., Song J. Y. Removal of endotoxin during purification of poly(3-hydroxybutyrate) from gram-negative bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65, № 6. - P. 2762-2764.

123. Leenstra T. S., Maltha J. C., Kuijpers-Lagtman A. Biodegration of non-porous films after submucoperiostead implantation on the palate of Heagle dogs // J. Mater. Sci. Mater. Med. 1995. - V. 6. - P. 445^150.

124. Lemoigne M. Produit de deshydratation et de polymerisation de l'acide J3-oxybutyrique//Bull. Soc. Chhn. Biol., 1926, v. 8, pp. 770-82.

125. Lenz R.W., Marchessault R.H. Bacterial Polyesters: Biosynthesis, Biodegradable Plastics and Biotechnology. Biomacromolecules, 2005, 6(1): 1-8

126. Li S.-T.- In: Polym.Mater.Sci. and Eng.Proc. ACS Div.Polym.Mater.: Sci.and Eng, Vol.53: Fall Meet., Chicago, ILL, 1985.- Washington, DC, 1985, 3036.

127. Lickorish D., Chan J., Song J., Davies J.E. An in-vivo model to interrogate the transition from acute to chronic inflammation. Eur. Cell. Mater., 2004, 8, 1219.

128. Lobler M., Sass M., Kunze C., Schmitz K.P., Hopt U.T. Biomaterial patches sutured onto the rat stomach induce a set of genes encoding pancreatic enzymes. Biomaterials, 2002, 23:577-583.

129. Lobler M., Sass M., Schmitz K.P., Hopt U.T. Biomaterial implants induce the inflammation marker CRP at the site of implantation. J. Biomed. Mater. Res., 2003, 61, 165-167.

130. Luizier W. D. Materials derived from biomass/biodegradable materials // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. - V. 89. - P. 839-842.

131. Luklinska ZB, Bonfield W., Morphology and ultrastructure of the interface between hydroxyapatite-polyhydroxybutyrate composite implant and bone. J Mater Sci Mater Med. 1997 Jun;8(6):379-83.

132. Lundgren D.G., Alper R., Schnaitman C., Marchessault R. M. Characterization of poly-р -hydroxybutyrate extracted from different bacteria// J. Bacterid., 1965, v. 89, pp. 245-251.

133. Lundgren D.G., Pfister R.M., Merrick J.M. Structure of poly-P -hydroxybutyric acid granules// J. Gen. Microbiol., 1964, v. 34, pp. 441-446.

134. Lusty C.J., Doudoroff M. Poly-P -hydroxybutyrate depolymerase of Pseudomonas lemoignei// Biochemistry, 1966, v. 56, pp. 960-965.

135. Macrae R. M., Wilkinson J. F. The influence of cultural conditions on poly-hydroxybutyrate synthesis in Bacillus megaterium // Proc. R. Phys. Edin. 1958. -V. 27. - P. 73-78.

136. Maekawa M., Pearce. R., Marchessault R. H., Manley R. S. J. Miscibility and tensile of poly(P-hydroxybutyrate) cellulose propionate blends // Polymer. -1999. -V. 40. -P. 1501 -1505.

137. Malm T, Bowald S, Bylock A and Busch C. Prevention of postoperative pericardial adhesions by closure of the pericardium with absorbable polymer patches. An experimental study. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 1992, 104: 600-607. (c)

138. Malm T, Bowald S, Bylock A, Busch C, Saldeen T (1994). Enlargement of the right ventricular outflow tract and the pulmonary artery with a new biodegradable patch in transannular position. European Surgical Research, 26: 298-308.

139. Malm T, Bowald S, Karacagil S, Bylock A, Busch C. A new biodegradable patch for closure of atrial septal defect. An experimental study. Scand J Thorac Cardiovasc Surg. 1992; 26(1): 9-14 (a).

140. Marois Y., Chakfe N., Guidoin R., et al. // Biomaterials, 1996, 17, № 1, 3-14.

141. Marois Y., Zhang Z., Vert M., Deng X., Lenz R., Guidoin R. Effect os sterilization on the physical and structural characteristics of polyhydroxyoctanoate (PHO) // J. Biomater. Sci. Polymer. Edn. 1999a. - V. 10. - P. 469-482.

142. Marois Y., Zhang Z., Vert M., Deng X., Lenz R., Guidoin R. Hydrolytic and enzymatic incubation of polyhydroxyoctanoate (PHO): a short-term in vitro study of a degradable bacterial polyester. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1999, 10, 483499.

143. Marois Y., Zhang Z., Vert M., Lenz R., Guidoin R. In vivo biocompatibility and degradation studies of polyhydroxyoctanoate in the rat: A new sealant for the polyeatere arterial prothesis // Tissue Eng. 1999b. - V. 5. - P. 369-386.

144. Marois Y., Zhang Z., Vert M., Lenz R., Guidoin R. In vivo biocompatibilityIand degradation studies of polyhydroxyoctanoate in the rat: A new sealant for the polyeatere arterial prothesis // Tissue Eng. 1999b. - V. 5. - P. 369-386.

145. Meng W„ Kim S.Y., Yuan J., Kim J.C., KwonO.H., Kawazoe N., Chenг

146. G., Ito Y. and Kang I.K. Electrospun PHBV/collagen composite nanofibrous scaffolds for tissue engineering // . Biomater 2007. -V. 18-№ 1-P. 81-94.

147. Mergaert J., Webb A., Anderson C., Wouters A., Swings J. Microbial degradation of poly (3 -hy droxy butyrate) and poly(3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxyvalerate) in soils // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 3233-3238.

148. Merrick J.M., Doudoroff M. Depolymerization of poly-P-hydroxybutyrate by an intracellular enzyme system// J. Bacteriql., 1964, v. 88, pp. 60-71.

149. Merrick J.M., Doudoroff M. Enzymatic synthesis of poly-P-hydroxybutyric ' acid in bacteria//Nature, 1961, v. 189, pp. 890-892.

150. Merrick J.M., Lundgren D.G., Pfister R.M. Morphological changes in poly-P-hydroxybutyrate granules associated with decreased susceptibility to enzymatic hydrolysis// J. Bacterid., 1965, v. 89, pp. 234-239.

151. Merrick J.M., Yu C.J. Purification and properties of a D(-)-P-hy droxy butyric acid dimer hydrolase from Rhodospirillum rubrum// Biochemistry, 1966, v. 5, pp. 3563-3568.

152. Meyer A. Praktikum der botanischen bakterienkunde// Jena, 1903.

153. Miller N.D, Williams D.F. On the biodegradation of poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) homopolymer and poly-beta-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers. Biomaterials. 1987 Mar: 8(2): 129-137.

154. Mohapatra C.R. // Colourage, 1985, 32, № 12, 19-23.

155. More G. S., Sauders S. M. Advances in biodegradable polymer // UK, Kapra. Shiropshire. 1998. - 1000 p.

156. Muhamad 1.1., Joon L.K., Noor M.A.M. Comparing the degradation of poly-p-(hydroxybutyrate), poly-p-(hydroxybutyrate-co-valerate)(PHBV) and PHBY / Cellulose triacetate blend. Malaysian Polymer Journal, 2006, 1:39-46.

157. Miiller H.M., Seebach D. Polyhydroxyalkanoates: a fifth class of physiologically important organic biopolymers? Angew Chemie, 1994, 32, 477502.

158. Nagata M, Machida T, Sakai W., Tsutsumi N. Synthesis, characterization, and enzymatic degradation studies on novel network aliphatic polyester // Macromol. -1998. V. 32. - P. 6450-6454.

159. Nebe В., Forster C., Pommerenke H., Fulda G., Behrend D., Bernewski U., Schmitz K.P., Rychly J. Structural alterations of adhesion mediating components in cells cultured on poly-beta-liydroxy butyric acid. Biomaterials 2001, 22(17): 2425-2434.

160. Nitschke M., Schmack G., Janke A., Simon F., Pleul D., Werner C. Low pressure plasma treatment of poly(3-hydroxybutyrate): toward tailored polymer surfaces for tissue engineering scaffolds. J. Biomed. Mater. Res., 2002, 59(4), 632638.

161. Noisshiki Y., Komatsuzaki S. Medical materials for soft tissue use // Japanese Patent Application. № JP 7275344 A2. 1995.

162. Norris K.P., Greenstreet J.E.S. On the infrared absorption spectrum of Bacillus megaterium// J. Gen. Microbiol., 1958, v. 19, pp. 198-209.

163. Novikov L.N., Novikova L.N., Mosahebi A., Wiberg M., Terenghi G., Kellerth J.O. A novel biodegradable implant for neuronal rescue and regeneration after spinal cord injury. Biomaterials, 2002, 23, 3369-3376.

164. Oeding V., Schlegel H. G. (3-ketothiolase from Hydrogenomonas eutropha H16 and its significance in the regulation of poly-(3-hydroxybutyrate metabolism// Biochem. J., 1973, v. 134, pp. 239-248.

165. Olsen D., Unger F., Oster H., et al. // J.Thorac. Cardiovasc.Surg., 1975, 70, 248-257

166. Ostwald J., Dommerich S., Nischan C., Kramp B. In vitro culture of cells from respiratory mucosa on foils of collagen, poly-L-lactide (PLLA) and poly-3-hydroxy-butyrate (PHB). Laryngorhinootologie, 2003, 82(10), 693-699 [Article in German],

167. Pavlov E., Zakharian E., Bladen C., Diao С. Т. M., Grimbly C., Reusch R.N., French R. J. A large, voltage-dependent channel, isolated from mitochondria by water-free chloroform extraction. Biophysical Journal, 2005, 88, 2614-2625.

168. Pazur R. J., Hocking P. J., Raymond S., Marchessault R. H. Crystal structure of syndiotactic poly(-hydroxybutyrate) from X-ray fiber and powder diffraction analyses and molecular modeling // Macromol. 1998. - V. 32. -P. 6485-6492.

169. Poirier Y., Nawrath C., Somerville C. Production of polyhydroxyalkanoates, a family of biodegrabable plastics and elastomers, in bacteria and plants // Bio-Technol. 1995. -V. 13. - P. 142-150.

170. Pompe Т., Keller K., Mothes G., Nitschke M., Teese M., Zimmermann R., Werner C. Surface modification of poly(hydroxybutyrate) films to control cell-matrix adhesion. Biomaterials. 2007, 28(1), 28-37.

171. Qu X.-H., Wu Q., Chen G.-Q. In vitro study on hemocompatibility and cytocompatibility of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2006, 17(10), 1107-1121 (a).

172. Qu X.-H., Wu Q., Liang J., Zou В., Chen G.-Q. Effect of 3-hydroxyhexanoate content in poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) on in vitro growth and differentiation of smooth muscle cells. Biomaterials. 2006 May; 27(15):2944-2950 (b).

173. Qu X.H., Wu Q., Zhang K.Y., Chen G.Q. In vivo studies of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) based polymers: biodegradation and tissue reactions. Biomaterials, 2006, 27(19):3540-3548 (c).

174. Rebrov A.V., Dubinskii V.A., Nekrasov Y.P., Bonartseva G.A., Shtamm M., Antipov E.M. Structure phenomena at elastic deformation of highly oriented polyhydroxybutyrate. Vysokomol. Soedin. (Russian) 2002, 44, 347-351 [Article in Russian].

175. Reusch R.N. Biological complexes of poly-P-hydroxybutyrate. FEMS Microbiol. Rev., 1992, 103, 119-130.

176. Reusch R.N. Low molecular weight complexed poly(3-hydroxybutyrate): a dynamic and versatile molecule in vivo. Can. J. Microbiol., 1995, 41(Suppl. 1), 50-54.

177. Reusch R.N. Poly-p-hydroxybutryate/calcium polyphosphate complexes in eukaryotic membranes. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1989, 191, 377-381.

178. Reusch R.N., Bryant E.M., Henry D.N. Increased poly-(R)-3-hydroxybutyrate concentrations in streptozotocin (STZ) diabetic rats. Acta Diabetol., 2003, 40(2), 91-94.

179. Reusch R.N., Huang R., Kosk-Kosicka D. Novel components and enzymatic activities of the human erythrocyte plasma membrane calcium pump. FEBS Lett., 1997, 412(3), 592-596.

180. Rihova B. Biocompatibility of biomaterials: hemocompatibility, immunocompatibility and biocompatibility of solid polymeric materials and soluble targetable polymeric carriers. Adv Drug. Delivery Rev., 1996, 21, 157176.

181. Rivard С. H., Chaput С., DesRosiers Е. A., Yahia L. Н., Selmani А. Fibroblast seeding' and culture in biodegradable porous substrates // J. Appl. Biomater.1995. V. 6, № l.-P. 65-68.

182. Rivard С. H., Chaput C., Rhalmi S., Selmani A. Bio resorbable synthetic polyesters and tissue regeneration. A study of three-dimensional proliferation of ovine chondrocytes and osteoblasts // Ann. Chir. -1996. - V. 50, № 8. - P. 651658.

183. Rizzi S.C., Heath D.J., Coombes A.G.A., et al. // J.Biomed. Mater. Res., 2001, 55, №5, 475-486.

184. Rubin L.R.- In: Biomaterials in Reconstructive Surgery./ Ed.L.R.Rubin.-St.Louis: Mostly, 1982, 474-493.

185. Saad В., Hirt T. D., Welti M., Uhlschmid G. K., Neuenschwander P., Suter U. W. Development of degradable polyesterurerethans for medical applications: in vitro and in vivo evaluations // J. Biomed. Mater. Res. 1997b. - V. 36, № 1. -P. 65-74.

186. Saad В., Keiser О. M., Welti M., Uhlschmid G. K., Neuenschwander P., Suter U. W. Multiblock copolymers as biomaterials in vitro biocompatibility testing // J. Materials. Sci.: Materials in Medicine. 1997a. -V. 8, № 4. - P. 497-505.

187. Saito Т., Nakamura S., Hiramitsu M., Doi Y. Microbial synthesis and properties of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) // Polym. Int. 1996. -V. 39, №3.-P. 169-174.

188. Saito Т., Takizava K., Saegusa H. Intracellular of poly(3-hydroxybutyrate) depolymerase in Alcaligenes eutrophus // Can. J. Microbiol. -1995. V. 41 (Suppl. 1).-P. 187-191.

189. Saito Т., Tomita K., Juni K., Ooba K. In vivo and in vitro degradation of poly( 3-hydroxybutyrate) in rat. Biomaterials. 1991, 12(3):309-312.

190. Schlegel H.G. Die Speicherstoffe von Chromatium okenii// Arch. Mikrobiol., 1962, v. 42, pp. 110-116.

191. Schlegel H.G., Gottschalk G., Bartha R. Formation and utilization of poly-P-hydroxybutyric acid by knallgas bacteria (Hydrogenomonas)// Nature, 1961, v. 191, pp. 463-465.

192. Schliecker G., Schmidt C., Fuchs S., Wombacher R., Kissel T. Hydrolytic degradation of poly(Iactide-co-glycolide) films: effect of oligomers on degradation rate and crystallinity. Int. J. Pharm. 2003, 266(1-2): 39-49.

193. Schumpelick V., Conze J., Klinge U. Preperitoneal mesh-plasty in incisional hernia repair: a comparative retrospective study of 272 operated incisional hernias. Chirurg 1996 ; 67, 1028-1035.

194. Schuster R. F. A new method for the staged repair of large omphaloceles. Surg. Gynecol. Obstet. 1967; 125, 837-841.

195. Senior P.J., Beech G.A., Ritchie G.A.F., Dawes E.A. The role of oxygen limitation in the formation of poly-P-hydroxybutyrate during batch and continuous culture of Azotobacter beijerinkii// Biochem. J., 1972, v. 128, pp. 1193-1201.

196. Senior P.J., Dawes E.A. Poly-P-hydroxybutyrate biosynthesis and the regulation of glucose metabolism in Azotobacter beijerinkii// Biochem. J., 1971, v. 125, pp. 55-66.

197. Senior P.J., Dawes E.A. The regulation of poly-p-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinkii// Biochem. J., 1973, v. 134, pp. 225-238.

198. Sevastianov V.I., Perova N.V., Shishatskaya E.I., Kalacheva G.S., Volova T.G. Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2003, 14, 1029-1042.

199. Shahin M. M., Olley R. H. Novel etching phenomena in poly(3-hydroxy butyrate) and poly(oxymethylene) spherulites // J. Polymer Science: Polymer Physics. 2002. - V. 40. - P. 124-133.

200. Shishatskaya E.I., Volova T.G. A comparative investigation of biodegradable polyhydroxyalkanoate films as matrices for in vitro cell cultures. J. Mater. Sci-Mater. M., 2004, 15, 915-923.

201. Shishatskaya E.I., Volova T.G., Gordeev S.A., Puzyr A.P. Degradation of P(3HB) and P(3HB-co-3HV) in biological media. J Biomater Sci Polym Ed. 2005;16(5):643-657.

202. Shishatskaya EI, Khlusov I A, Volova TG. A hybrid PHB-hydroxyapatite composite for biomedical application: production, in vitro and in vivo investigation. // J Biomater 2006 -V. 17 (5)-P. 481-498.

203. Shumway N.E., Gliedman M.D., Lewis F.J. // Surg. Gynec. Obstet., 1955, 100, №6, 703-706.

204. Solheim E., Sudmann В., Bang G., Sudmann E. Biocompatibility and effect on osteogenesis of poly(ortho ester) compared to poly(DL-lactic acid). J. Biomed. Mater. Res. 2000, 49(2), 257-263.

205. Spyros A., Kimmich R., Briese В., Jendrossek D. NMR imaging study of enzymatic degradation in poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate). Evidence for preferential degradation of amorphous phase by

206. PHB depolymerase В from Pseudomonas lemoignei // Macromol. — 1997. V. 30. -P. 8218-82 25.

207. Stapp C. Uber die reserveinhaltstoffe und den schlein von Azotobacter chroococcum//Zentbl Bakteriol II, 1924, v. 61, pp. 276-92.

208. Steel M. L., Norton-Berry P. Non-wowen fibrous materials // US Patent № 4 603 070. 1986.

209. Steinbuchel A., Valentin H. E. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 128. - P. 219-228.

210. Steinbuchel A. and Lutke-Eversloh, T. Metabolic engineering and pathway construction for biotechnological production of relevant polyhydroxyalkanoates in microorganisms. Biochem. Eng. J. 2003, 16, 81-96.

211. Stockdale H., Ribbons D.W., Dawes E.A. Occurence of poly-P-hydroxybutyrate in the Azotobacteriaceae// J. Bacterid., 1968, v. 95, pp. 17981803.

212. Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters // Prog. Polym. Sci. 2000. - V. 25. -P. 1503-1555.

213. Tang S., Ai Y., Dong Z., Yang Q. Tissue response to subcultaneous implanting poly-3-hydroxybutyrate in rats // Disi fienyi daxue Xuebuo. -1999. -V. 20. P. 87-89.

214. Taylor M. S., Daniels A. U., Andriano K. P., Heller J. Six bioabsorbable polymers: in vitro acute toxicity of accumulated degradation products // J. Appl. Biomater. 1994. - V. 5, № 2. - P. 151-157.

215. Timm A., Steinbuchel A. Formation of polyesters consisting of medium-chain-length 3-hydroxyalkanoic acids from gluconate by Pseudomonas aeruginosa and other fluorescent pseudomonads// Appl. Environ. Microbiol., 1990, v. 56, pp. 3360-3367.

216. Tokiwa Y, Suzuki T, Takeda K. Hydrolysis of polyesters by Rhizopus arrhizus lipase. Agric. Biol. Chem.1986; 50:1323-1325.

217. Turner R.G., Hofman H.L., Weinberg S.L.- In: Biological and Synthetic vascular prostheses./ Ed. Stanley J.C. Grune and Stratton: New York, NY. 1982, 509-522.

218. Usher F.C., Coganj E., Lowry T.I. A new technique for ,the repair of inguinal and incisional hernias. Arch Surg. 1960; 81, 847-854.

219. Usher F.C., Ochsner J., Tuttle L.L. Use of marlex mesh in the repair of incisional hernias. Am Surg. 1958; 24, 969-974.

220. Velitchkov N. C., Losanoff J. E., Kjosses K. The Lichtenstein open tension-free inguinal hernia repair using a new prosthetic mesh Bulgarian Irresorhahle Ampoxen. Int. Surg. 1996; 81, 205-217.

221. Vogel C, Wessel E, Siesler HW. FT-IR imaging spectroscopy of phase separation in blends of poly(3-hydroxybutyrate) with poly(L-lactic acid) and poly(epsilon-caprolactone). // Biomacromolecules 2008. -V. 9 (2)-P. 523-527.

222. Vrijland W.W., Bonthuis F., Steyerberg E.W., Marquet R.L., Jeekel J., Bonjer H.J. Peritoneal adhesions to prosthetic materials: choice of mesh for incisional hernia repair. Surg Endosc. 2000; 14, 960-962.

223. Waddington D. S. Polyhydroxyalkanoates and film formation thereform // US Patent № WO 94/16000. 1994.

224. Wallen L. L., Rohwedder W. K. Poly-j-hydroxyalkanoate from activated sluge // Environ. Sci. Technol. 1974. - V. 8. - P. 576-579.

225. Wang H.T., Palmer H., Linhardt R.J., Flanagan D.R., Schmitt E. Degradation of poly(ester) microspheres. Biomaterials. 1990; ll(9):679-685.

226. Wang Y.-W, Wu Q., Chen G.Q. Attachment, proliferation and differentiation of osteoblasts on random biopolyester poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) scaffolds. Biomaterials, 2004, 25(4), 669-675.

227. Wang Y.-W., Wu Q., Chen J., Chen G.-Q. Evaluation of three-dimensional scaffolds made of blends of hydroxyapatite and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) for bone reconstruction Biomaterials. 2005, 26(8), 899-904 (a).

228. Wang Y.-W., Yang F., Wu Q., Cheng Y.C., Yu P.H., Chen J., Chen G.-Q. Effect of composition of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) on growth of fibroblast and osteoblast. Biomaterials. 2005, 26(7), 755-761 (b).

229. Webb A., Adsetts J. R. Wound dressings // UK Patent Appplication №2 166 354,- 1986.

230. Williams S. F., Martin D. P., Horowitz D. M., Peoples О. P. PHA applications: addressing the price performance issue. I. Tissue engineering // Int. J. Biol. Macromol. 1999. -V. 25, № 1-3. - P. 11-121.

231. Williams S.F., Martin D.P. Applications of PHAs in medicine and farmacy// in Series of Biopolymers in 10 vol. Ed. A. Steinbuchel, Wiley-VCY Verlag GmbH, 2002, v. 4, pp. 91-121.

232. Williamson D.H., Wilkinson J.F. The isolation and estimation of poly-P-hydroxybutyrate inclusions of Bacillus species// J. Gen. Microbiol., 1958, v. 19, pp. 198-209.

233. Winet H., Bao J.Y. // J. Biomater.Sci., Polym. Ed., 1997, 8, №7, 517532.

234. Winkler F.K., D'Arcy A., Hunziker W. Structure of human pancreatic lipase. Nature 1990; 343: 771-774.

235. Yang X., Zhao K., Chen G.Q. Effect of surface treatment on the biocompatibility of microbial polyhydroxyalkanoates. Biomaterials. 2002; 23(5):1391-1397.

236. Yoon J. S, Lee W. S., Jin H.-J., Chin I-J., Kim M.-N., Go Jin-H. Toughening of poly(3-hydroxybutyrate with poly(cis-l,4-isporen) // Europ. Polymer J. 1999. - V. 35. - P. 781-788.

237. Yoon J. S., Lee W. S., Kim K., Chin In. Kim M., Kim C. Effect of poly(ethyleneglycol)-block-poly(L-lactide) on the poly(R)-3-hydroxybutyrate./ poly(L-lactid) blends // Eur. Polymer J. 2000. - V. 36. - P. 435^142.

238. Yoon J. S., Oh S. H., Kim M. N. Compatibility of poly(3-hydroxybutyrate)/ poly (ethylene-co-vinyl acetate) blends // Polymer. 1998. - V. 39. - P. 2479 -2487.

239. Yoshie N., Goto Y.,Inoe Y., Chujo R. Biosynthesis and NMR studies of poly(3-hydroxybutyrate) produced by Alcaligenes eutrophus H16 // Int. J. Biol. Macromol. 1992. - V. 14. - P. 118-121.

240. Yu Ga-er., Marchessault R. H. Characterization of low molecular weight poly(poly-hydroxybutyrate)s from alkaline and acid hydrolis // 2000. - V. 41. -P. 1087-1098.t

241. Yuan. Y., Ruckenstein. E. Miscibility and transesterification of phenoxy with biodegradable poly(3-hydroxybutyrate) // Polymer. 1997. - V. 39. -P. 1893-1897.

242. Zhao K., Yang X., Chen G.Q., Chen J.C. Effect of lipase treatment on the biocompatibility of microbial polyhydroxyalkanoates. J. material science: materials in medicine. 2002; 13:849-854.

243. Zevenhuisen L.P. Cellular glycogen, P-l,2-glucan, poly-P-hydroxybutyric acid and extracellular polysaccharides in fast-growing species of Rhisobium// Antonie van Leeuwenhoek, J. Microbiol, and Serol., 1981, v. 47, pp. 481-497.

244. Zheng Z., Bei F.-F., Tian H.-L., Chen G.-Q. Effects of crystallization of polyhydroxyalkanoate blend on surface physicochemical properties and interactions with rabbit articular cartilage chondrocytes, Biomaterials, 2005, 26, 3537-3548. „

245. Лебедев Л.В., Плоткин Л.Л., Смирнов А.Д. Протезы кровеносного сосуда,- М.: Медицина, Л.О.- 1981.- 192 с.

246. Севастьянов В. И., Лаксина О. В., Новикова С. П. и др. Современные гемосовместимые материалы для сердечно-сосудистой хирургии. Под ред. В. И. Шумакова. // М.:ВНИИМИ. Медицина и здравоохранение, серия хирургия. 1987. - выпуск 2.

247. Севастьянов В. И., Перова Н. В.,. Довжик И. А, Титушкин И. А.,

248. Немец Е. А, Беломестная 3. М., Шишацкая Е. И, Волова Т. Г. Медико/биологические свойства полиокси-алканоатов — биодеградируемыхIбактериальных полимеров// Перспективные материалы 2001 - №.5. -С. 47-55.

249. Севастьянов В.И. Биосовместимость. // М.: ИЦ ВНИИгеосистем. — 1999.-368 с.

250. Троценко Ю.А., Белова Л.Л. Организация и регуляция биосинтеза полигидроксибутирата/валерата у бактерий// Микробиология, 2000, т. 69(6), с. 753-763.

251. Фрешни 3. Культура животных клеток // М.: Мир. 1989. - 322 с.

252. Шехтер А.Б., Розанова И.Б. Тканевая реакция на имплантат //1

253. Биосовместимость./Ред. В.И.Севастьянов. М., 1999., 174-211.

254. Штильман М. И.: Полимеры медико-биологического назначения // Изд-во: Академкнига, 2006.

255. Шумаков В.И., Зимин Н.К. В: Искусственные органы. / Ред. В.И.Шумаков.- М.: Медицина, 1990, 9-36.

Информация о работе

Босхомджиев, Араша Петрович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Изучение биодеструкции и биосовместимости полимерных систем на основе полиоксиалканоатов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы