Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение транскриптомного паттерна на ранних стадиях болезни Паркинсона

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение транскриптомного паттерна на ранних стадиях болезни Паркинсона"

На правах рукописи

$4'

АЛИЕВА АНЕЛЯ ХАНЛАРОВНА

ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПТОМНОГО ПАТТЕРНА НА РАННИХ СТАДИЯХ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

03.01.03 — молекулярная биология

1 6 СЕН 2015

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2015

005562220

005562220

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики наследственных болезней Отдела молекулярных основ генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Шадрина Мария Игоревна,

ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярной генетики наследственных болезней Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Валерий Вячеславович Носиков,

заведующий Лабораторией постгеномных молекулярно-генетических исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

кандидат биологических наук Виктор Александрович Аниол,

старший научный сотрудник Лаборатории функциональной биохимии нервной системы Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биологии гена Российской академии наук

Защита состоится 15 октября 2015 г. в 12 часов 30 минут на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Эигельгардта Российской академии наук по адресу: ГСП-1, 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Эигельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32. и на сайте ИМБ РАН www.eimb.ru.

Автореферат разослан « (Я» 2015г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Анатолий Михайлович Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время большое внимание уделяется изучению механизмов функционирования центральной нервной системы человека на всех уровнях организации - от молекулярного до всего организма в целом. При этом крайне важным является изучение нервной системы при развитии патологических процессов, так как подобный анализ позволит получить наиболее полную информацию о функционировании нервной системы в различных условиях и стать основой для формирования новых подходов к терапии наиболее распространенных неврологических заболеваний. К числу таких нейродегенеративных заболеваний относится болезнь Паркинсона. В среднем, частота встречаемости болезни Паркинсона составляет 1% в популяции лиц старше 60 лет, а в группе лиц старше 85 лет составляет не менее 4-5% населения. При этом в последнее время отмечается рост числа больных, страдающих данной патологией, а также снижение возраста начала заболевания.

Болезнь Паркинсона является сложным системным заболеванием и обусловлена нарушением функционирования различных нейромедиаторных систем с выраженным преобладанием недостаточности дофаминергической системы. Подобные нарушения приводят к дисбалансу медиаторов и дезорганизации деятельности мозга в целом. Нейродегенеративным процессам подвержен не только центральный, но и периферический отдел нервной системы. Таким образом, болезнь Паркинсона затрагивает практически все отделы нервной системы, что обуславливает сложную и клинически гетерогенную картину проявлений данного заболевания.

В настоящее время не вызывает сомнений, что важную роль в развитии болезни Паркинсона играют генетические факторы. На это, в первую очередь, указывает наличие семейных форм. Считается, что семейная форма заболевания составляет (по разным данным) от 10 до 20% от всех случаев болезни Паркинсона. У большинства больных развитие заболевания носит спорадический характер и определяется сложным взаимодействием между генетической конституцией организма и факторами внешней среды.

В настоящее время в геноме человека выявлено большое количество генов, так или иначе вовлеченных в патогенез данной патологии. Однако только для семи генов (SNCA, PARK2, PINK1, PARK7, LRRK2, АТР13А2, VSP35) точно определен характер наследования и выявлены мутации, приводящие к развитию моногенных форм болезни Паркинсона.

Также до сих пор остается не решенным окончательно вопрос о том, где начинаются процессы нейродегенерации — в соме нейрона или на его периферии, а также остается неизвестным, какие именно процессы запускают развитие патологического процесса.

Одним из подходов к поиску механизмов, связанных с развитием патологии, является изучение изменения транскриптома на самых ранних стадиях патогенеза. Известно, что характерной особенностью патогенеза болезни Паркинсона является хроническое и медленно прогрессирующее течение заболевания.

Одним из возможных путей для решения этой проблемы является изучение моделей, воспроизводящих самые ранние стадии болезни Паркинсона. Однако при этом необходимо учитывать, что ни одна из существующих моделей не является совершенной и не воспроизводит полностью все закономерности патогенеза болезни Паркинсона. Таким образом, наиболее оптимальным представляется параллельное изучение как моделей самых ранних стадий болезни Паркинсона, так и пациентов, находящихся на ранних клинических стадиях заболевания. Такой комплексный подход позволит выявить механизмы, инициирующие процессы нейродегенерации при болезни Паркинсона.

Цель и задачи исследования:

Целью данной работы является изучение изменения экспрессии генов в процессе развития болезни Паркинсона и выявление новых транскриптомных маркеров заболевания.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Полнотранскриптомный анализ тканей черной субстанции и стриатума мышей с МФТП-индуцированными моделями досимптомной и ранней симптомной стадий БП. Отбор генов для дальнейшего анализа.

2. Детальный анализ изменения экспрессии отобранных генов в различных тканях мышей с МФТП-индуцированными моделями досимптомной и ранней симптомной стадий БП.

3. Анализ изменения экспрессии генов, отобранных при изучении МФТП-индуцированных моделей БП, в периферической крови пациентов с БП, находящихся на самых ранних клинических стадиях развития заболевания.

4. Анализ изменения экспрессии генов, отобранных на основе литературных данных, в периферической крови пациентов с БП, находящихся на самых ранних клинических стадиях развития заболевания.

5. Анализ уровней различных микроРНК в периферической крови пациентов с БП, находящихся на самых ранних клинических стадиях развития заболевания.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе работы впервые был проведен полнотранскриптомный анализ тканей стриатума и черной субстанции мышей с МФТП-индуцированными моделями досимптомной и ранней симптомной стадий болезни Паркинсона. При этом было выявлено четыре кластера генов, непосредственно связанных с везикулярным транспортом. Эти данные свидетельствуют о важной роли нарушений везикулярного транспорта на ранних этапах нейродегенерации при болезни Паркинсона.

При анализе экспрессии отобранных по результатам полнотранскриптомного анализа генов Ср!х2, Огс/2, Ерп2, Ехос4, Мгк2 и Бпса было показано развитие компенсаторных процессов в теле нейрона на досимптомной стадии заболевания.

Сравнительный анализ профилей экспрессии генов Ср1х2, Огс{2, Ерп2, Ехос4, Шгк2 и Бпса в черной субстанции и периферической крови выявил

сходные изменения в уровнях мРНК данных генов у мышей с МФТП-индуцированными моделями болезни Паркинсона. Это подтверждает, что периферическая кровь может быть использована в диагностике ранних стадий болезни Паркинсона, а уровни мРНК генов в периферической крови могут, рассматриваться в качестве биомаркеров нейродегенерации при болезни Паркинсона.

Проведен анализ изменения экспрессии генов ALDH1A1,ATP13A2, CPLX2, DRD2, EPN2, ЕХОС4, NTRK2, LRRK2, PARK2, PARK7, PDHB, PINK/, PPARGC1A, SNCA, WFS1 и ZNF746 в периферической крови пациентов, находящихся на ранних стадиях БП (I и 2 стадии по шкале Хен и Яра). При этом впервые было выявлено резкое снижение уровня экспрессии гена PINK] более чем в 4 раза в группе неврологического контроля и статистически значимое, специфическое для болезни Паркинсона и независимое от проводимой терапии увеличение экспрессии генов АТР13А2, PARK7 и ZNF746. Данные гены могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров ранних стадий болезни Паркинсона.

При анализе уровней микроРНК впервые было установлено, что микроРНК MIR7, MIR9-5p, MIR9-3p, MIR129 и MIR132 высоко чувствительны к проводимой терапии у пациентов с болезнью Паркинсона и могут быть использованы в будущем в качестве биомаркеров эффективности проводимой терапии у пациентов с болезнью Паркинсона.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 6 статей и 10 материалов симпозиумов и конференций.

Апробация диссертации

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на Третьем всемирном конгрессе по болезни Паркинсона (3rd World Parkinson Congress, Монреаль, Канада), 2013 г., VI Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированных генетических симпозиумах (Ростов-на-Дону), 2014 г., Всероссийской конференции «Фундаментальные проблемы нейронаук: функциональная асимметрия, нейропластичность и нейродегенерация» (Москва), 2014 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 20 апреля 2015 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает введение; обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 280-ти источников, среди которых 4 источника отечественной и 276 источников зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста, содержат 12 таблиц, 13 рисунков и 2 приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для проведения работ по моделированию паркинсонизма были сформированы 4 группы мышей самцов линии C57BL/6 из 10 животных в каждой группе, эксперимент был повторен трижды. Эксперименты с лабораторными животными проводились в соответствии «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Мыши содержались в виварии со свободным доступом к пище и воде и естественной сменой освещения. Для моделирования досимптомной стадии (ДС-стадии) нейротоксин вводили подкожно с концентрацией 12мг/кг дважды с интервалом в два часа. Для моделирования ранней симптомной стадии (PC-стадии) нейротоксин вводили подкожно с концентрацией 12мг/кг четыре раза с интервалом в два часа. Животным из контрольных групп вводился 0,9% раствор хлорида натрия (Ugrumov et al. 2011). Через две недели после введения нейротоксина проводили декапитацию животных. Для дальнейшего исследования отбирались ткани коры больших полушарий, стриатума, черной субстанции и периферической крови.

В настоящей работе было проанализировано 47 пациентов с недавно поставленным диагнозом БП (1-2 стадия БП по шкале Хен и Яра), подвергавшихся и не подвергавшихся лечению.

Все больные являлись русскими по происхождению. Для постановки диагноза БП пациенты были исследованы по международной унифицированной оценочной шкале БП (Unified Parkinson's Disease Rating Scale, UPDRS) (Fahn et al. 1987) и шкале Hoehn Yahr (Hoehn and Yahr scores) (Goetz et al. 2004) в Научном центре неврологии, г. Москва.

В качестве групп сравнения в настоящей работе исследовались следующие выборки:

- 23 пациента с различными неврологическими заболеваниями (боковой амиотрофический склероз, болезнь Мари-Шарко, болезнь Вильсона-Коновалова, мозжечковая атаксия и др.)

- 44 неврологически здоровых добровольца

В группы больных с различными неврологическими патологиями и группы контроля отбирались лица русского происхождения обоих полов в возрасте от 30 до 70 лет. Все больные и неврологически здоровые добровольцы были отобраны в Научном центре неврологии, г. Москва. Все образцы крови были взяты с информированного согласия исследуемых лиц.

Полнотранскриптомный анализ проводился в пулах тканей мозга мышей с МФТП-индуцированными ДС-стадией и PC-стадией БП. Для этого отбирали по 5мг ткани мозга от каждого из 10 животных в каждой группе. Выделение тотальной РНК из мозга мышей для проведения экспрессионного анализа отдельных генов проводилось у каждого индивидуального животного. Для этого отбирали 20 мг ткани мозга от каждого животного. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора RNAeasy Mini Kit («Qiagen», Германия) согласно рекомендациям производителя.

Для выделения тотальной РНК и микроРНК из цельной крови человека кровь забирали в 8 часов утра натощак, затем хранили перед выделением нуклеиновых кислот не больше 2 часов при +4°С.

Выделение тотальной РНК из цельной крови человека и периферической крови мышей проводили с использованием набора ZR Whole-Blood Total RNA Kit™ («Zymo Research Corp.», США) согласно рекомендациям производителя. Для выделения отбиралось 250 мкл крови каждого образца.

Выделение микроРНК из цельной крови человека проводили с использованием набора для выделения микроРНК mirVana™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Technologies, США) согласно рекомендациям производителя. Для выделения отбиралось 250-750 мкл крови каждого образца.

Концентрацию выделенной тотальной РНК и микроРНК измеряли с помощью набора Quant-iT RNA BR Assay Kit и флуориметра Qubit («Invitrogen», США).

Полнотранскриптомный анализ пулов РЖ из тканей черной субстанции и стриатума мозга мышей проводился на микрочипах MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChip Kit («Illumina», США), позволяющих оценивать 25600 аннотированных транскриптов. Для каждого образца проводилось шесть независимых гибридизаций и определялся уровень экспрессии всех генов относительно панели генов домашнего хозяйства. Сравнение профилей экспрессии генов в контроле и опыте проводилось с использованием пакета программ «Genome Studio» V. 1.8 («Illumina», США).

Анализ экспрессии генов проводили с использованием реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов.

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора RevertAid™ H Minus Reverse Transcriptase kit («Fermentas», Литва) и соответствующего обратного праймера (Табл.1) согласно рекомендациям производителя.

Праймеры и зонды для проведения реакции ПЦР в реальном времени подбирали с помощью программы Beacon designer 7.0 и нуклеотидных последовательностей генов Cplx2, Drd2, Ерп2, Ехос4, Ntrk2, Snca, ZNF746, ALDH1A1, P/NK1, PARK7, PD1IB, ATP13A2 и LRRK2, а также генов «домашнего хозяйства» Bcat2, Psmd7, POLR2F и PSMA5. Последовательности ген-специфичных праймеров и зондов представлены таблице 1.

При проведении ПЦР в реальном времени в качестве матрицы использовали кДНК, полученные в ходе реакции обратной транскрипции. Перед внесением в реакционную смесь кДНК разводили в растворе тРНК E.coli (100 нг/мкл) (Suslov et al. 2005) до концентрации кДНК 0,02 нг/мкл. ПЦР в реальном времени проводили на приборах StepOnePlus™ System (Applied Biosystems, США) и АНК-32 (Институт аналитического оборудования, Россия). В состав 30 мкл реакционной смеси входило: 5 мкл кДНК (0,02 нг/мкл); 3 мкл ПЦР буфер (10х) («Синтол», Россия); 1,5 мкл 25 мМ MgCl2; 10 пМ праймеров («Синтол», Россия); 2,5 пМ зонда («Синтол», Россия); 200 мкМ каждого дНТФ; 1 единица активности Hot-Rescue Taq ДНК-полимеразы («Синтол», Россия).

Ген Нуклеотндные последовательности

Са1Ъ2 ЫМ_007586.1* Зонд: 5'-ЯОХ-АССТСААСССАТТССТОТСТСАССТССТ-ВН02-3' Прямой праймер: 5'-АОАСАОААОТСОСТАСАТССААО-3' Обратный праймер: 5'-ОТАСТССТСОАОСТТАССТТСАТС-3'

Ср1х2 ЫМ_009946.2 Зонд: 5'-ЯОХ-АОСССАТАСТТОТСТССОАТСТССТСС-ВНд2-3' Прямой праймер: 5'-САААСАСССССССАТССААС-3' Обратный праймер: 5'-ТССТСТОССТСТТТСТСТТССТТС-3'

ОгсП ЫМ_010077.2 Зонд: 5'-!ЮХ-САОССАОСАОАТОАТОААСАСАССААОА-ВН<32-3' Прямой праймер: 5'-ТСССАОСАОААСОАОААОАААО-3' Обратный праймер: 5'-ТСТАТАТТСАССАТСТСССТСАТС-3'

Ерп2 ЫМ_001252188.1 Зонд: 5'-1ЮХ-СТААОСССАСТТСТСССТСАССОТССТТ-ВН02-3' Прямой праймер: 5'-ОСТСОАААОАСААСАСАТССС-3' Обратный праймер: 5'-ААСТТССААССТТОТСАААТТСАС-3'

Ехос4 ЫМ_009148.3 Зонд: 5'-ЯОХ-АСОТСТТССАООТТСАТСТСССТСАСАС-ВНд2-3' Прямой праймер: 5'-СТАСТССАСССАААТТССТТСАТО-3' Обратный праймер: 5'-ТССТСТССОТСАСАСТССААа-3'

Мгк2 ЫМ_001025074.2 Зонд: 5'-1ЮХ-ТОТОААССТСАСТСТССАТТТТССССС-ВН<32-3' Прямой праймер: 5'-ОССАСААААССГГСТАООАСААО-3' Обратный праймер: 5'-СТТССССТТСССТСТСАСАО-3'

Бпса ЫМ_001042451.2 Зонд: 5'-аОХ-ССТССТСАСССТТССССАТСТООТСС-ВН02-3' Прямой праймер: 5'-АОТСОАСССАССТССОААТАТАС-3' Обратный праймер: 5'-ССАТСТСТТССАССАТТССТТСС-3'

ВсШ2 КМ_001243053.1 Зонд: 5'-РАМ-СООАТАСАСТССААСАССТССТССТТОТ-ВН01-3' Прямой праймер: 5'-ТСААСАТССАСАОСАТССТАСО-3' Обратный праймер: 5-ССАОТСТТТСТСТАСТТСААТСАСС-З'

РБМСП ЫМ_010817.2 Зонд: 5'-РАМ-АСТССТАСОТССТТТОССТТСАСОТСОА-ВНС>1-3' Прямой праймер: 5'-СТОСАСААОААТОАТАТССССАТС-3' Обратный праймер: Г-СТССАСТСАСАТОТАСССТТСС-З'

1ЫГ746 ЫМ_001163474.1 Зонд: 5'-1ЮХ-АССССАСТССАСОСТСОО-ВНСг2-3' Прямой праймер: 5'-ССТССССССААСАТТССАО-3' Обратный праймер: 5,-СТС,СГГ(МГСТС,САТСААС,АС,С,ТС,-3'

АЮН1А1 ЫМ 000689.4 Зонд: 5'-ЯОХ-САСТТАССАССССАТАОСААТТСАСС-ВН(32-3' Прямой праймер: 5'-ТАААОССАТААСААТСТССТСТО-3' Обратный праймер: 5'-АСАТСПГ,ААТССАССАААС,С,-3'

Р1ЫК1 ЫМ_032409.2 Зонд: 5'-1ЮХ-АСССАТСТТСААСАСААТОАСССАСС-ВНр2-3' Прямой праймер: 5'-ААСАТСТССССАСОТТСС-3' Обратный праймер: З'-СПСОА ГПТС7С,ТААС,ТС,АСТС,-3'

РА ЯК 7 ЫМ_007262.4 Зонд: 5'-1ЮХ-ТССТАСТССТСТОТТСССТСАТОАА-ВНС>2-3' Прямой праймер: 5'-ТСАТАССССССАТСТОТС-3' Обратный пример: 5'-СТПАС,СААС,АС,С,аТС,ТС,Т1С-У

РОНВ ЫМ_000925.3 Зонд: 5'-КОХ-АСАТСААТТСАТТСТСТАССАССАССАСТО-ВНд2-3' Прямой праймер: 5'-ТССААТТСАСАССАТССТАААОС-3' Обратный праймер: 5'-С.С,С,АС,С,ААА1ТСААААС,С,ААСС-3'

АТР13А2 ЫМ_022089.2 Зонд: 5'-КОХ-АОТССАСССАСТСТТССТСТСССС-ВНд2-3' Прямой праймер: 5,-ТСТААСССАСАТССТСААСТТО-3' Обратный праймер: 5'-САОТСТСС(Х;С,СА(ТАС,С-3'

ытю ЫМ_198578.3 Зонд: 5'-КОХ-ААССААСАСТТСССТОСАТАТААТСССА-ВНд2-3' Прямой праймер: 5'-ТСССТСТААААТССТАААТСАТС-3' Обратный праймер: 5ЧХПТГСАТААСТС,ТГАС,ТАГПТС,С,-3'

СРЬХ2 ЫМ_006650.3 Зонд: 5'-ЯОХ-САТОТССТТТОТССССССТСС-ВНр2-3' Прямой праймер: 5--АТССАСТТСОТСАТСААССАСО-3' Обратный праймер: У-ТГПТСТГ,СССС,ТСС,С,С,С,-3'

0Я02 ЫМ_000795.3 Зонд: 5'-1ЮХ-ТСССАТСАОСАТСОАСАСОТАСАСАССТ-ВН02-3' Прямой праймер: 5'-САСССССАССАТССГСААС-3' Обратны й праймер: 5 '-А ОСА СССА СА СО А ТОГ,А С,А ТС-3'

ерш Л'Л/ 014964.4 Зонд: 5'-ШХ-АСССОААТСТОТОАССТСТСТСССАТСС-ВН(32-3' Прямой праймер: 5'-СТСААТТТСАСААССТТССОАСТТС-3' Обратный праймер: 5'-С,(Х}ТСАС,С,С,СТСХ1ГАС,ТТСС-3'

EXOC4 NM021807.3 Зонд: 5'-ЯОХ-ТСААТССАСАСТТТСССААССТСАТСССОТ-ВНд2-3' Прямой праймер: 5'-ТСАСТААСТССССАААТААААТАААСС-3' Обратный праймер: 5'-АСАА(УПСА(;С,АСА'1С,СПАТаС-3'

NTRK2 NM 006180.3 Зонд: З'-КОХ-ССАССАООАТСАСТТСАОАСААСТСАА-ВНдг-З' Прямой праймер: 5'-ТТТАССССАААСАААСТСАСОАС-3' Обратный праймер: 5'-ТААТ(ПХ.'А('А(!аАССАТС!ТАААТ(!(!-3'

POLR2F NM 021974.3 Зонд: 5'-РАМ-СТТСАТССТССТССАСАТСАТСАААСТССТСС-ВН(31-3' Прямой праймер: З'-АТОТСАСАСААСОАССАСААТТТТС-З' Обратный праймер: З'-ГПГСОаСАП'СТССААОГСАК-З'

PS MA 5 NM001199772.1 Зонд: 5'-РАМ-АСССАТСААСТСТТСАСТСАТСАТССТС-ВНд1-3' Прямой праймер: 5'-АОААСТТТАССАСААОТСТАТОАС-3' Обратный праймер: З'-СА'ПСАССГГСТСС'ГССАПАС-З'

* инвентарные номера в базе данных GenBank (Accession numbers). Курсивом выделены праймеры, использованные для проведения реакции обратной транскрипции.

Для проведения амплификации использовали следующий температурный режим: 50°С - 60 сек., 95°С - 600 сек., далее 45 циклов 95°С - 20 сек. и 60°С -50 сек.

Каждый образец был проанализирован трижды для коррекции различий в качестве образцов и эффективности реакции обратной транскрипции.

Анализ уровней микроРНК проводили с использованием реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов.

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора TaqMan* MicroRNA Reverse Transcription Kit («Applied Biosystems», США) и соответствующего обратного праймера согласно рекомендациям производителя.

Анализ экспрессии генов MIR7, MIR9-5p, MIR9-3p, MIR129, MIR132, MIR 133b, MIR153, MIR191, M1R346, M1R433, MIR598 и генов «сравнения» мяРНК U6, мяРНК U44 и мяРНК U47 проводили с использованием набора Custom TaqManK Gene Expression Assay (Applied Biosystems, США) и реагента TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя. ПЦР в реальном времени проводилась в соответствии с инструкциями производителя, используя StepOnePlus ™ System (Applied Biosystems, США). Каждый образец крови анализировали в трех независимых повторах для коррекции различий в качестве образца и эффективности обратной транскрипции.

Статистический анализ данных полнотранскриптомного исследования мозга мышей проводили с использованием пакета программ «Genome Studio» («Illumina», США). Во внимание принимались значения с разницей экспрессии по сравнению с контролем более чем в 1,5 раза и р <0.01. Анализ функциональной кластеризации отобранных генов проводили с использованием биоинформатического ресурса DA VID 6.7.

Последовательности праймеров и зондов были подобраны с помощью программы Beacon designer 7.0 «Premier Biosoft International» (Palo Alto, USA).

Расчет относительных уровней экспрессии проводился с использованием метода сравнения пороговых уровней амплификации AACt (Applied Biosystems 2001). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ "Statistica for Windows 8.0" (StatSoft, Inc.

(2007). STATISTICA (data analysis software system), version 8.0. www.statsoft.com) и программного обеспечения MS Excel 2010 (Microsoft). Для оценки относительных уровней экспрессии генов применяли непараметрический U-тест Манна-Уитни.

Результаты исследований

Полиотранскрнптомныи анализ тканей мозга мышей с МФТП-индуцированнои моделью досимнтомной и ранней симнтомной стадии болезни Паркинсона

Нами был проведен полнотранскриптомный анализ тканей черной субстанции и стриатума мышей с МФТП-индуцированной моделями досимптомной стадии (ДС-стадии) и ранней симптомной стадии (PC-стадии) БП. Было проанализировано 25697 транскриптов генов. На первом этапе была проведена нормализация первичных данных и последующее попарное сравнение нормализованных данных, полученных от модельной и контрольной групп мышей с использованием программы Genome Studio V.l.8. Это позволило выявить транскрипты, изменившие свою представленность относительно контроля в 1,5 раза и более со статистической достоверностью р <0,01. Как видно из таблицы 2, количество транскриптов в тканях не сильно варьирует. При этом обращает на себя внимание, что большее количество транскриптов, изменивших свою представленность по сравнению с контрольной группой, было выявлено в тканях стриатума мозга мышей как с ДС-стадией, так и с РС-стадией.

Таблица 2. Количество транскриптов генов, изменивших свою представленность более чем в 1,5 раза и р <0,01 в тканях черной субстанции и _стриатума при моделировании ДС-стадии и РС-стадии БП.

Ткань Моделируемая стадия Количество транскриптов генов

Черная субстанция ДС-стадия 1208

РС-стадия 853

Стриатум ДС-стадия 1497

РС-стадия 1315

Далее каждая группа транскриптов была проанализирована по отдельности с использованием биоинформатического ресурса DAVID V.6.7. Результаты биоинформатического анализа представлены в таблице 3. В таблицу 3 вошли только самые значимые кластеры с высокой достоверностью (E.S. >1,5,/? <0,001). Высокая статистическая значимость выявленных кластеров может указывать на то, что данные кластеры, а также метаболические пути и гены, вошедшие в них, могут быть вовлечены в нейродегенеративные процессы при БП.

Черная субстанция Стриатум

ДС-стадия PC-стадия ДС-стадия PC-стадия

pVal E.S.1 pVal E.S. pVal E.S. pVal E.S.

Аппарат Гольджи 1.2Е-5 4.46 - - 5.3Е-4 3.12 1.3Е-3 2.42

Везикулярный транспорт 5.1Е-4 2.79 - - 8.2Е-6 3.52 4.9Е-11 4.77

Эпдоцитоз I.5E-3 2.79 - - 1.6Е-3 3.52 I.6E-4 4.77

Структура мембраны 2.2Е-3 2.79 - - 4.3Е-4 3.52 - -

Конъюгация убиквитина 9.5Е-4 2.58 1.6Е-3 2.02 2.9Е-6 4.05 1.0Е-6 5.25

Внутриклеточные оргапеллы, не связанные с мембраной 3.2Е-3 2.10 - - 6.1Е-7 4.75 1.2E-4 2.68

Функционирование митохондрий 2.3Е-4 2.07 3.04Е-4 2.21 1.9Е-6 4.00 7.6E-9 5.87

Мембраны органелл 2.3Е-4 2.07 - - - - 5.4E-9 4.84

Связывание ДТФ - - 6.7Е-4 2.13 - - 6.0E-6 4.12

Передача нервного импульса - - 2.IE-4 2.08 5.8Е-7 4.30 - -

Цитоскелет - - 4.7Е-3 1.76 1.3 Е-4 4.75 4.8E-3 2.68

Регуляция синаптической пластичности - - 5.0Е-3 1.56 - - - -

Апоптоз - - - - - - 9.6E-4 1.80

Функционирование синапса - - 8.9Е-3 1.47 5.7Е-6 4.30 2.4E-6 2.44

Сплайсинг РНК - - - - 1.4Е-4 2.72 1.7E-4 1.82

Гомеостаз ионов клетки - - - - 9.1Е-5 2.72 - -

Постсинаптичсская мембрана - - - - 9.4Е-3 2.50 - -

Связывание кальмодулина - - - - 9.6Е-3 1.97 - -

Дифференцировка нейронов - - - - - - 3.5E-4 1.76

Экзоцитоз - - - - - - 2.0E-3 1.68

'E.S.- enrichment score

Как видно из таблицы 3, наименьшее количество кластеров выявлено в черной субстанции на обеих стадиях, особенно на РС-стадии (7 кластеров из 20) по сравнению со стриатумом, где на ДС-стадии выявляется наибольшее количество кластеров (14 кластеров из 20). Эти данные согласуются с результатами, представленными в таблице 2. Такие различия могут говорить о том, что на ранних этапах развития нейродегенерации больше задействованы терминали дофаминергических (ДА-ергических) нейронов, которые расположены в стриатуме.

Однако полученные нами данные могут также указывать на сложный характер изменений в стриатуме, который обусловлен тем, что в структуре этого отдела мозга помимо отростков ДА-ергических нейронов расположены другие виды нейронов, такие как ГАМК-ергические и глутаматергические. Это, в свою очередь, может говорить о том, что на ранних этапах развития БП вовлечены не только ДА-ергические нейроны, но и другие типы нейронов. В целом, полученные данные указывают на сложность всех происходящих нейродегенеративных изменений при изучаемом нами заболевании.

В результате биоинформатического анализа было отобрано 8 кластеров, выделенных цветом (табл. 3), которые выявлялись сразу в трех образцах (ДС-стадия и/или PC-стадия, черная субстанция и/или стриатум). Для кластера «конъюгация убиквитина», непосредственно связанного с убиквитин-зависимым протеолизом, и кластера «функционирование митохондрий» ранее уже было достоверно подтверждено участие в патогенезе БП (Antony et al. 2013). Наличие этих кластеров указывает на специфичность и адекватность исследуемых моделей БП. Четыре кластера непосредственно связаны с везикулярным транспортом: «аппарат Гольджи», «везикулярный транспорт» «эндоцитоз» и «функционирование синапса».

Эти кластеры представляют большой интерес, так как обладают наиболее высокой статистической значимостью и в настоящее время есть данные о том, что нарушения везикулярного транспорта могут играть существенную роль в развитии БП (Hunn et al. 2015). В связи с этим, мы обратили особое внимание на них при отборе генов для дальнейшего экспрессионного анализа.

На основе выявленных кластеров был отобран 51 ген, изменивший свою экспрессию, как минимум, в двух образцах (ДС-стадия и/или PC-стадия, черная субстанция и/или стриатум) для дальнейшего анализа (табл. 4).

Таблица 4. Список генов-кандидатов для дальнейшего экспрессионного ___анализа.

Ген Белок

A bat 4-aminobutyrate aminotransferase

Copq coatomer protein complex, subunit gamma

Drd2 dopamine receptor 2

Gabrbl gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, subunit beta 1

Cabrd gamma-aminobutvric acid (GABA) A receptor, subunit delta

Gabbrl gamma-aminobutyric acid (GABA) В receptor, 1

Gabrg2 gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, subunit gamma 2

Gipcl G1PC PDZ domain containing family, member 1

Grial glutamate receptor, ionotropic, AMPA1 (alpha 1); similar to Glutamate receptor,ionotropic, AMPA1 (alpha 1)

Gria2 glutamate receptor, ionotropic, AMPA2 (alpha 2)

Homerl homer homolog 1 (Drosophila)

Nln neurolysin (metallopeptidase M3 family)

Cacnb4 calcium channel, voltage-dependent, beta 4 subunit

Crbn Cereblon

Kcna2 potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, member 2

Calb2 calbindin 2

Cplx2 complexin 2

Exoc4 exocyst complex component 4

ScampS secretory carrier membrane protein 5

Sv2b synaptic vesicle glycoprotein 2 b

Stxl2 syntaxin 12

Stxbpl syntaxin binding protein 1

Rab5a RAB5A, member RAS oncogene family; similar to small GTP-binding protein rab5

Nsf N-ethylmaleimide sensitive fusion protein

Sytll synaptotagmin XI; similar to synaptotagmin XI

Snca synuclein, alpha

Lin7b lin-7 homolog B (C. elegans)

Klk8 kallikrein related-peptidase 8

Epn2 epsin 2

Aplsl adaptor protein complex AP-1, sigma 1

Ap2al adaptor protein complex AP-2, alpha 1 subunit

Necapl NECAP endocytosis associated 1

Aflph aftiphilin

Rab8b RAB8B, member RAS oncogene family

Rabepl rabaptin, RAB GTPase binding effector protein 1

SIc27al solute carrier family 27 (fatty acid transporter), member 1

SnxI8 sorting nexin 18

Kiflb kinesin family member IB

Cyld cylindromatosis (turban tumor syndrome)

Trim9 tripartite motif-containing 9

Uchl3 ubiquitin carboxyl-terminal esterase L3 (ubiquitin thiolesterase)

Ubr7 ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 7 (putative)

Ube3c ubiquitin protein ligase E3C

Uspl9 ubiquitin specific peptidase 19

Usp39 ubiquitin specific peptidase 39

Ube2gl ubiquitin-conjugating enzyme E2G 1 (UBC7 homolog, C. elegans)

Ube2k ubiquitin-conjugating enzyme E2K (UBC1 homolog, yeast)

Ube2m ubiquitin-conjugating enzyme E2M (UBC12 homolog, yeast)

Ufcl ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1

Ntrk2 neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2

Pex5 peroxisomal biogenesis factor 5

Анализ изменения экспрессии отдельных генов в тканях мышей с МФТП-индуцированной моделью досимптомной и ранней симптомной стадий болезни Паркинсона

Было выделено шесть генов (табл. 4), которые показали выраженные изменения экспрессии как минимум в двух образцах (ткань/стадия) и функции которых позволяют предполагать их важную роль в формировании патологических процессов при БП: ОЫ2, Ср1х2, Ехос4, Бпса, Ерп2 и Шгк2. В этот список вошли гены, связанные с транспортом веществ и выживаемостью нейронов.

Анализ изменения экспрессии отдельных генов проводился в тканях мозга (кора полушарий, стриатум и черная субстанция) и в периферической крови животных с МФТП-индуцированными моделями ДС-стадии и РС-стадии. Результаты экспрессионного анализа представлены в таблице. 5.

Таблица 5. Экспрессия генов-кандидатов в тканях мышей с МФТП-__индуцированной ДС-стадией и РС-стадией.

Ген Кора полушарий Стриатум Черная субстанция Периферическая кровь

ДСС1 РСС2 Дес РСС ДСС РСС ДСС РСС

Cplx2 1,463 1,24-1,734 0,96 0,30-1,55 3,065 030-430 2,37 146-2,89 1,66 0,52-1,73 0,61 0,17-0,68 1,81 0,82-3,75 0,25 0,22-0,33

Drd2 4,16 3,86-8,38 0,79 0,57-5,09 0,90 0,17-1,09 0,42 0,33-0,86 3,55 3,14-5,80 0,27 0,13-0,59 0,90 0,75-1,52 0,38 0,27-0,44

Ерп2 3,16 2,98-6,74 0,24 0,20-0,40 1,42 1,22-2,77 0,82 0,72-1,33 1,53 0,82-2,36 0,73 0,33-0,78 1,29 1,05-1,84 0,67 0,61-0,72

Ехос4 2,59 2,26-3,06 0,30 0,19-0,91 0,81 0,17-1,09 0,72 0,59-0,85 1,34 0,41-1,78 0,26 0,10-0,40 2,50 0,31-2,74 0,56 0,40-1,10

Ntrk2 9,97 8,92-11,35 0,61 0,51-2,48 1,20 0,24-1,83 2,23 0,93-2,45 3,42 1,01-4,03 0,19 0,15-0,51 1,50 0,72-2,92 0,36 0,26-0,56

Sitca 10,66 10,18-11,06 0,30 0,25-0,36 0,93 0,12-1,00 0,73 0,61-1,30 7,52 6,42-8,36 0,17 0,16-0,36 0,69 0,21-1,82 0,20 0,14-0,36

'ДСС - досимптомная стадия БП; 2РСС - ранняя симптомная стадия БП; 3Ме, медиана; 425%-75%, 25-75 ироцентили; 'Данные, выделенные жирным, являются статистически значимыми (р<0.05). Уровень экспрессии в контроле принят за единицу.

Как видно из представленных данных, для каждого гена было выявлено, как минимум, три статистически значимых результата, а для генов Бгё2 и Бпса было выявлено максимальное количество достоверных данных в исследуемых тканях. Достоверно доказано, что ген БЫСА может принимать участие в развитии как семейной, так и спорадической формы БП (Огапвоу е1 а1. 2013). Таким образом, выявленные изменения экспрессии Бпса в разных тканях мозга мышей на обеих стадиях БП в очередной раз подтверждают важную роль данного гена в патогенезе БП и указывают на то, что функционирование этого гена может иметь важное значение на самых ранних стадиях развития данного заболевания. Для гена 01Ю2 ранее были получены противоречивые данные о его вовлеченности в патогенез БП. В отличие от генетических исследований наши данные указывают

на то, что этот ген может играть важную роль на ранних этапах нейродегенерации при БГТ, также, как и БИС А.

Как видно из таблицы 5, в черной субстанции и периферической крови на РС-стадии практически все выявленные изменения экспрессии являются достоверными. Большое количество достоверных данных позволяет провести анализ изменения экспрессии в целом по всем полученным данным. Для двух тканей, коры полушарий и черной субстанции, наблюдается идентичный спектр изменений уровней мРНК для все проанализированный генов (рис.1).

Так на ДС-стадии наблюдается рост уровней мРНК в этих тканях по сравнению с контролем. В то же время на РС-стадии наблюдается выраженное снижение относительной экспрессии анализируемых генов как в черной субстанции, так и в коре головного мозга. Причем выявленное снижение экспрессии генов в черной субстанции вряд ли связано с уменьшением количества нейронов из-за их гибели, так как подобные изменения наблюдаются и для нейронов коры полушарий, гибели которых на данных стадиях еще нет. И наблюдаемые нами изменения экспрессии в черной субстанции — либо непосредственно задействованы в процессах нейродегенерации, либо являются их следствием.

Наличие выраженного повышения экспрессии исследуемых генов на ДС-стадии в черной субстанции может указывать на развитие компенсаторных эффектов в теле нейрона. Это предположение подтверждает тот факт, что на ДС-стадии содержание ДА, как основного показателя развития специфической нейродегенерации для БП, в пересчете на один нейрон в стриатуме остается на уровне контроля, а в теле нейрона количество ДА даже возрастает. Однако на РС-стадии наблюдается резкое снижение экспрессии генов, что может говорить о том, что возможности выживших клеток для компенсации иссякают.

В то же время в стриатуме не наблюдалось профиля экспрессии исследуемых генов, сходного с черной субстанцией у мышей с моделированием ДС-стадии и РС-стадии (рис. 2). С одной стороны, это может говорить о том, что при БП происходит изменение транспорта веществ. На это указывает наличие больших различий в уровнях экспрессии данных генов в стриатуме и черной субстанции, которые могут быть обусловлены нарушением доставки мРНК из тел нейронов, находящихся в черной субстанции, к их окончаниям, расположенным в стриатуме. С другой стороны, данные различия могут указывать на сложный характер заболевания и вовлеченность различных типов нейронов в развитие нейродегенеративных процессов, как уже говорилось выше.

В то же время, сравнительный анализ профилей экспрессии генов в черной субстанции и периферической крови выявил сходные изменения в уровнях мРНК данных генов при моделировании БП у мышей (рис. 3). При этом на РС-стадии наблюдалось статистически достоверное снижение экспрессии генов как в черной субстанции, так и в периферической крови.

ДСС, К'П

дсс. чс

Рисунок 1. Относительные уровни мРНК генов-кандидатов в тканях мышей с МФТП-индуцированными моделями БП. КП - кора полушарий; ЧС — черная субстанция.

I.

ii s I

г ■

шСр1х2 mDrd2

■ Ерп2 а Ехос4 *Ntrk2

■ Snca

ДСС. CT

ДСС, ЧС

Рисунок 2. Относительные уровни мРНК исследуемых генов в стриатуме и черной субстанции с МФТП-индуцированными моделями БП. ДСС, CT -стриатум, ДСС - досимптомная стадия БП, ЧС - черная субстанция, РСС- ранняя симптомная стадия БП.

I Ля

* Ср1х2

■ Drd2

■ Ерп2 л Ехос4 *Ntrk2

■ Snca

ДСС. ЧС

ДСС. ПК

Рисунок 3. Относительные уровни мРНК исследуемых генов в разных тканях мышей с МФТП-индуцированными моделями БП. ЧС - черная субстанция, ПК - периферическая кровь.

По всей видимости, лимфоциты периферической крови могут отражать процессы, происходящие в мозге. Данное предположение подтверждается тем фактом, что лимфоциты имеют ряд особенностей, характерных для ДА-ергических нейронов. Эти данные в совокупности позволяют предположить, что в дальнейшем лимфоциты периферической крови могут быть использованы в диагностике ранних стадий БП, а уровни мРНК генов в периферической крови могут рассматриваться в качестве биомаркеров нейродегенерации при БП.

Анализ периферической крови пациентов с БП

Наиболее информативным для выявления процессов, инициирующих нейродегенерацию при БП, является изучение пациентов, находящихся на самых ранних стадиях, сразу после постановки диагноза и до начала лечения. При этом самой доступной тканью для исследования является кровь, в лимфоцитах которой экспрессируется ряд характерных для ДА-ергических нейронов ферментов.

Анализ изменения экспрессии отдельных генов в периферической крови пациентов с болезнью Паркннсона, находящихся на ранних стадиях заболевания

Для экспрессионного анализа были отобраны гены EPN2, ЕХОС4, CPLX2, DRD2 и NTRK2, которые показали статистически значимое изменение экспрессии при моделировании БП на мышах с использованием МФТП (табл.5). Кроме того, был проведен анализ изменения уровней мРНК генов, которые были выбраны, исходя из анализа литературных данных. Сюда относятся гены, вовлеченные в развитие моногенных форм БП (АТР13А2, LRRK2, PARK2, PARK7, P1NK1, SNCA), и гены, изменение экспрессии которых может быть связано с патогенезом БП (ALDH1A1, PDHB, PPARGC1A, WFS1, ZNF746). Результаты представлены в таблице 6.

В результате экспрессионного анализа для двух генов было выявлено неспецифическое изменение их уровней транскриптов. Так, было обнаружено существенное снижение уровня SNCA, как в группах пациентов с БП, так и в неврологическом контроле. Кроме того, для гена SNCA было показано сходное изменение экспрессии как в периферической крови и мозге мышей при моделировании БП, так и в периферической крови пациентов с БП (табл. 5 и табл.6). Это может указывать на идентичные процессы, приводящие к развитию БП при ее моделировании с использованием МФТП и у пациентов с БП. Кроме того, наблюдаемое изменение уровня мРНК гена SNCA также и в группе неврологического контроля, возможно, связано с наличием общих закономерностей патогенетических процессов при различных нейродегенеративных заболеваниях.

Таблица 6. Экспрессионный анализ генов-кандидатов в периферической крови

пациентов с БП.

Ген БП нелеч1 БП леч2 Неврол.к.3

ALDH1A1 1,084 (0,71-1,53)5 1,60 (0,94-2,08) 0,95 (0,33-1,64)

АТР13Л2 1,94 (1,43-3,03)6 2,14 (1,29-4,86) 0,86 (0,46-1,62)

LRRK2 0,44 (0,31-1,26) 0,56 (0,41-1,42) 0,83 (0,37-1,35)

EPN2 0,93 (0,49-1,19) 0,65 (0,29-1,33) 0,65 (0,34-1,05)

ЕХОС4 0,67 (0,35-2,33) 0,93 (0,72-1,17) 0,77 (0,67-1,02)

PARK7 1,68 (0,96-2,51) 1,60 (1,32-2,20) 1,00 (0,64-1,50)

PINK1 0,75 (0,25-1,40) 1,29 (0,28-3,37) 0,26 (0,12-0,56)

PDHB 1,46 (0,65-2,16) 2,10(0,58-2,36) 1,32 (1,01-1,55)

SNCA 0,24 (0,06-1,16) 0,16(0,04-0,24) 0,14 (0,02-0,99)

WFS1 0,89 (0,42-2,10) 0,48 (0,38-0,88) 1,07 (0,44-2,19)

ZNF746 2,33 (0,96-4,60) 2,46 (0,66-5,01) 1,07 (0,33-1,64)

БП нелеч, пациенты с БП, не подвергавшиеся лечению; 2БП леч, пациенты с БП, подвергавшиеся лечению; 3Неврол.к., группа неврологического контроля; ""Ме, медиана, 325%-75%, 25-75 процентили, ''Данные, выделенные жирным, являются статистически значимыми (р<0.05). Уровень экспрессии в контроле принят за единицу.

Интересными также представляются результаты по гену PINK1. В нашем исследовании для этого гена не было выявлено достоверных изменений в группах пациентов с БП, но в то же время наблюдалось резкое снижение уровня экспрессии гена PINK1 более чем в 4 раза в группе неврологического контроля. По всей видимости, изменение экспрессии этого гена не задействовано на ранних симптомных стадиях спорадической формы БП. Резкое снижение уровня мРНК в группе неврологического контроля может быть связано с особенностями патогенеза заболеваний, вошедших в эту группу сравнения.

Наиболее значимыми являются данные, полученные в результате анализа изменения уровня транскриптов генов АТР13А2, PARK7 и ZNF746. Было выявлено статистически значимое повышение экспрессии генов АТР13А2, PARK7 и ZNF746 более чем в 1,5 раза у пациентов с БП. Эти изменения являются специфическими для БП, так как в группе неврологического контроля уровни экспрессии данных генов не отличаются от уровней экспрессии в здоровом контроле. Изменения уровней транскриптов наблюдались как в группе пациентов с БП, не подвергавшихся лечению, так и в группе пациентов, подвергавшихся лечению. Необходимо отметить, что для ZNF746 у пациентов, подвергавшихся лечению, изменения уровня мРНК транскриптов не являются статистически значимыми, однако, динамика изменений сходна с теми, что наблюдаются в группе пациентов с БП, не подвергавшихся лечению.

Гены PARK7 ИАТР13А2 являются генами моногенных форм БП и связаны с развитием семейных форм БП, однако, нет литературных данных об изменении их экспрессии у пациентов с БП. Повышение экспрессии гена PARK7 может указывать, на компенсаторные явления, развивающиеся в ответ на окислительный стресс в клетках, так как показано, что продукт данного гена,

белок DJ-1, способен защищать клетку путем самоокисления (Clements et al. 2006). Ген ATPI3A2 кодирует лизосомальную АТФазу, и изменение его экспрессии может свидетельствовать о нарушениях в процессах, связанных с удалением вредных компонентов из клетки (Dehay et al. 2013).

Однако наибольшие изменения наблюдались для гена ZNF746 в группе пациентов, не подвергавшихся лечению. Роль этого гена в патогенезе БП не ясна, при этом есть данные о высоком уровне экспрессии его белка PARIS в стриатуме и черной субстанции (Shin et al. 2011).

Повышение уровней транскриптов этих трех генов не связано с проводимой терапией, поскольку наблюдаемые изменения у пациентов, подвергавшихся лечению, сходны с изменениями у пациентов, не подвергавшихся лечению. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что повышение уровней транскриптов генов АТР13А2, PARK7 и ZNF746, выявленное на самых ранних клинических стадиях у пациентов, не подвергавшихся лечению, может также наблюдаться и на досимптомных стадиях БП, а эти гены могут быть вовлечены в развитие нейродегенерации или принимать участие в ее инициации. Кроме того, гены A TPI3A2, PARK7, ZNF746, а также SNCA могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров для включения в диагностичекую панель доклинических стадий БП. Однако для проверки данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования и, в первую очередь, на больных, находящихся на доклинической стадии БП.

Анализ нзменення экспрессии микроРНК в периферической крови пациентов с болезнью Паркипсопа, находящихся на ранних стадиях заболевания

Нами был проведен анализ микроРНК в периферической крови пациентов, находящихся на ранних стадиях БП. Отбор микроРНК для исследования осуществлялся на основе литературных данных. Было выбрано 11 микроРНК (M1R7, MIR9-5p, M/R9-3p, MIR129, MIR132, M1RI33Ö, MIR153, MIR191, MIR346, MIR433 и MIR598), которые хорошо представлены в мозге, а для некоторых из них показано возможное участие в патогенезе БП (MIR7, MIR133b, MIR153 и MIR433). Нами был проведен анализ изменения уровней этих микроРНК в лимфоцитах периферической крови пациентов с БП по сравнению с контролем.

На первом этапе нами был проведено исследование изменения уровней микроРНК в группах пациентов с БП и группе здоровых добровольцев. Для микроРНК, со статистически значимой разницей в уровнях между исследуемыми группами, был проведен дополнительный анализ в группе неврологического контроля для оценки специфичности наблюдаемых изменений при БП (табл. 7).

Таблица 7. Экспрессионньтй анализ микроРНК в лимфоцитах _ периферической крови пациентов с БП.

МикроРНК БП нелеч1 БП лечен2 Неврол.к.3

MIR7 1,754 (0,66-5,61)5 32,39 (8,91-44,84)" 0,91 (0,05-3,42)

MlR9-5p 1,19(0,90-5,11) 6,57(1,04-19,72) 1,21 (0,73-1,49)

M1R9-3p 0,86 (0,50-9,52) 3,27 (0,53-7,90) 0,61 (0,42-0,95)

M1R129 1,36 (0,83-2,64) 3,93 (1,28-18,43) 1,01 (0,54-2,73)

MIR132 1,65 (0,59-5,43) 3,63 (0,67-11,84) 1,10(0,43-2,07)

MIR133b 1,03 (0,63-2,47) 1,65 (0,24-5,73) —

MIR 153 0,76 (0,33-3,1 1) 3,12 (0,72-10,48) —

MIR191 2,30(1,26-4,90) 2,64(1,19-12,64) —

M1R346 2,31 (0,40-3,91) 1,59 (0,38-8,76) _

M1R433 0,98 (1,42-4,40) 2,76 (0,34-1,50) —

MIR598 2,79 (0,54-9,15) 1,76 (0,92-7,14) —

'БП нелеч, пациенты с БП, не подвергавшиеся лечению; 2БП леч, пациенты с БП, подвергавшиеся лечению; 3Неврол.к., группа неврологического контроля; ■'Ме, медиана; 525%-75%, 25-75 процентили; ''Данные, выделенные жирным, являются статистически значимыми

(£><0.05).

Необходимо отметить, что для микроРНК MIR7 было выявлено самое существенное изменение экспрессии среди всех исследуемых микроРНК. Еще для четырех микроРНК было показано статистически значимое изменение экспрессии в периферической крови пациентов с БП, подвергавшихся лечению. Так, уровни микроРНК MIR9-3p, MIR129 и MIRI32 возрастают более чем в три раза, MIR9-5p - в шесть раз (табл.7). При этом различий в уровнях микроРНК между неврологическим контролем и группой здоровых добровольцев не наблюдалось. Возможно, повышение уровней этих микроРНК связано с проводимой терапией, так как статистически значимые изменения наблюдались только в группе пациентов с БП, подвергавшихся лечению. Можно предположить, что применение препаратов способно активировать экспрессию данных микроРНК. Вероятно, микроРНК весьма чувствительны к проводимой терапии и введению препаратов, а наблюдаемые эффекты от терапии могут быть связаны с изменением уровней данных микроРНК и их генов-мишеней у пациентов с БП. Возможно, микроРНК MIR9-3p, MIR 129, MIRI32, MIR9-5p и MIR7 могут быть использованы в будущем в качестве биомаркеров эффективности проводимой терапии у пациентов с БП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время уже доказано, что развитие БП обусловлено гибелью разных типов нейронов. При этом ведущую роль играет дегенерация именно ДА-ергических нейронов черной субстанции. При БП происходит не столько поражение конкретной нейромедиаторной системы, сколько дисбаланс нейромедиаторов в целом, приводящий к дезорганизации мозга и последующему развитию клинической симптоматики данного заболевания.

Однако несмотря на очевидный прогресс, достигнутый в изучении вовлеченных в развитие БП молекулярно-генетических факторов, до сих пор не выявлены все метаболические процессы, нарушение которых связано с патогенезом БП. Остается неизвестным, какие механизмы инициируют развитие нейродегенерации при данном заболевании.

Для выявления новых молекулярно-генетических закономерностей патогенеза БП было проведено изучение экспрессионного профиля на ранних стадиях заболевания. Были изучены различные ткани мышей с МФТП-индуцированными моделями ранних стадий БП, а также периферическая кровь пациентов с БП, находящихся на ранних стадиях данной патологии (1-2 стадия по шкале Хен и Яра).

На первом этапе нами был проведен полнотранскриптомный анализ тканей стриатума и черной субстанции мышей с МФТП-индуцированными моделями БП. Этот анализ показал, что как на ДС-стадии, так и на РС-стадии большее число генов изменили свою экспрессию в стриатуме по сравнению с черной субстанцией. Эти данные позволяют предположить, что, возможно, на ранних этапах патогенеза БП в первую очередь вовлекаются терминали ДА-ергических нейронов, расположенные в стриатуме. В результате полнотранскриптомного анализа был выявлен ряд кластеров, связанных с различными метаболическими процессами. Для двух из них, функционирование митохондрий и убиквитин-зависимый протеолиз, уже давно получены доказательства их роли патогенезе БП. Также были получены данные, подтверждающие важную роль везикулярного транспорта в развитии нейродегенеративных процессов при данной патологии.

Анализ отдельных генов (Ср1х2, Огс12, Ерп2, Ехос4, Ии-к2 и Япса), отобранных по результатам полнотранскриптомного анализа, показал рост их экспрессии на ДС-стадии и последующее снижение экспрессии на РС-стадии в черной субстанции мышей с МФТП-индуцированными моделями БП. Наличие таких изменений в черной субстанции может указывать на развитие компенсаторных механизмов в теле нейрона на ДС-стадии. При этом было установлено, что что профиль изменения экспрессии данных генов в стриатуме на обеих стадиях БП не совпадает с изменениями, наблюдаемыми в черной субстанции. Выявленные различия могут говорить о том, что при БП происходит изменение транспорта веществ, которое, в свою очередь, может приводить к нарушению доставки мРНК из тел нейронов, находящихся в черной субстанции, к их окончаниям, расположенным в стриатуме.

Сравнительный анализ профилей экспрессии генов в черной субстанции и периферической крови выявил сходные изменения в уровнях мРНК данных

генов при моделировании БП у мышей. Мы подтверждаем имеющиеся данные о том, что лимфоциты периферической крови могут отражать процессы, происходящие в мозге. Эти данные позволяют предположить, что в дальнейшем периферическая кровь может быть использована в диагностике ранних стадий БП, а уровни мРНК генов в периферической крови могут рассматриваться в качестве биомаркеров нейродегенерации при БП.

Экспрессионный анализ ряда кандидатных генов в периферической крови пациентов с БП, находящихся на ранних симптомных стадиях заболевания, выявил статистически значимое изменение экспрессии генов АТР13А2, PARK7, SNCA и ZNF746 у пациентов с БП. Для гена SNCA было выявлено существенное снижение уровня экспрессии у пациентов с БП. Однако подобные изменения также наблюдались в группе неврологического контроля, которое, возможно, связано с наличием общих закономерностей патогенетических процессов при различных нейродегенеративных заболеваниях. Для генов ATPI3A2, PARK7 и ZNF746 было выявлено достоверное повышение их уровней экспрессии более чем в 1,5 раза. Эти изменения являются специфическими для БП, так как в группе неврологического контроля уровни экспрессии данных генов не отличаются от уровней экспрессии в здоровом контроле. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что выявленные изменения экспрессии этих трех генов на самых ранних клинических стадиях у пациентов, не подвергавшихся лечению, могут также наблюдаться и на досимптомных стадиях БП, а данные гены могут быть вовлечены в развитие нейродегенерации или принимать участие в ее инициации. Кроме того, гены АТР13А2, PARK7, ZNF746, а также SNCA могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров для включения в диагностичекую панель доклинических стадий БП. Однако для проверки данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования и, в первую очередь, на больных, находящихся на доклинической стадии БП.

Кроме того, было выявлено статистически значимое повышение уровней пяти микроРНК (M/R9-3p, MIR/29, MIR!32, MIR9-5p и MIR7) в периферической крови пациентов с БП, подвергавшихся лечению. Вероятно, микроРНК весьма чувствительны к проводимой терапии и введению препаратов, а наблюдаемые эффекты от терапии могут быть связаны с изменением уровней данных микроРНК и их генов-мишеней у пациентов с БП. При этом данные микроРНК могут быть использованы в будущем в качестве биомаркеров эффективности проводимой терапии у пациентов с БП.

Таким образом, хотелось бы еще раз отметить, что полученные нами данные расширяют представления о процессах, происходящих при БП, и указывают на важную роль терминалей ДА-ергических нейронов и процессов, связанных с транспортом веществ, на начальных этапах развития нейродегенеративных процессов при БП.

выводы

1. Полнотранскриптомное исследование тканей черной субстанции и стритуама мозга мышей с МФТП-индуцированными досимптомной и ранней симптомной стадиями болезни Паркинсона выявил 8 кластеров генов, вовлеченных в формирование паркинсон-подобного фенотипа у мышей. Анализ этих кластеров подтвердил специфичность и адекватность исследуемых моделей болезни Паркинсона и установил важную роль нарушений везикулярного транспорта в развитии патологического процесса на ранних этапах нейродегенерации.

2. Анализ экспрессии отобранных по результатам полнотранскриптомного анализа генов Ср!х2, Drd2, Ерп2, Ехос4, Ntrk2 и Snca на досимптомной стадии выявил рост экспрессии, а на ранней симптомной стадии - снижение экспрессии всех генов в черной субстанции мышей с МФТП-индуцированными моделями БП. Наличие таких изменений в черной субстанции указывает на развитие компенсаторных механизмов в теле нейрона на досимптомной стадии заболевания.

3. Сравнительный анализ профилей экспрессии генов Cplx2, Drd2, Ерп2, Ехос4, Ntrk2 и Snca в черной субстанции и периферической крови выявил сходные изменения в уровнях мРНК данных генов у мышей с МФТП-индуцированными моделями болезни Паркинсона. Это подтверждает, что периферическая кровь может быть использована в диагностике ранних стадий болезни Паркинсона, а уровни мРНК генов в периферической крови могут рассматриваться в качестве биомаркеров нейродегенерации при болезни Паркинсона.

4. Проведен анализ изменения экспрессии генов 16 генов в периферической крови пациентов, находящихся на ранних стадиях БП (1 и 2 стадии по шкале Хен и Яра), и выявлено статистически значимое, специфическое для болезни Паркинсона и независимое от проводимой терапии увеличение экспрессии генов АТР13А2, PARK7 и ZNF746.

5. Определены уровни 11 микроРНК в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона, находящихся на ранних клинических стадиях заболевания. Показано, что до начала лечения уровни изученных микро РНК в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона не отличаются от таковых в контрольной группе. Для пяти микроРНК (MIR7, MIR9-5p, MIR9-3p, MIR129 и MIR132) выявлено статистически значимое увеличение их уровней в группе больных, подвергавшихся лечению. Это указывает на высокую чувствительность соответствующих микроРНК к проводимой терапии при БП.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в рецензируемых журналах

1. Anelya Kh. Alieva, Elena V. Filatova, Aleksey V. Karabanov, Sergey N. Illarioshkin, Svetlana A. Limborska, Maria I. Shadrina, Petr A. Slominsky, «miRNA expression is highly sensitive to a drug therapy in Parkinson's disease». Parkinsonism and Related Disorders, 2014, 10.1016/j.parkreIdis.2014.10.018

2. E.B. Филатова, М.И. Шадрина, A.X. Алиева. А.А. Колачева, П.А. Сломинекий, M.B. Угрюмов, «Анализ экспрессии генов системы убиквитин-протеасомной деградации белков при моделировании ранних стадий МФТП-индуцированной болезни Паркинсона у мышей». Доклады академии наук, 2014, 456 (6), с.728-730.

3. Alieva A.Kh.. Shadrina М.1., Filatova E.V., Karabanov A.V., Illarioshkin S.N., Limborska S.A., Slominsky P.A., «Involvement of endocytosis and alternative splicing in the formation of the pathological process in the early stages of Parkinson's disease». Biomed Res Int., 2014, 2014:718732.

4. Филатова E.B., Алиева A.X., Шадрина М.И., Шульская М.В., Федотова Е.Ю., Иллариошкин С.Н., Лимборская С.А., Сломинекий П.А., «Анализ мутаций у пациентов с предполагаемой аутосомно-доминантной формой болезни Паркинсона». Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2014, 1, с. 3-4.

5. Anelya Kh. Alieva. Maria I. Shadrina, Elena V. Filatova, Vera V. Ustinova, Ekaterina Yu. Fedotova, Alexey V. Karabanov, Sergey N. Illarioshkin, Petr A. Slominsky, «Polymorphisms in the SNCA gene: association with the risk of development of the sporadic form of Parkinson's disease and the level of SNCA gene expression in peripheral blood of patients from Russia». Neuroscience & Medicine, 2013,4, pp. 208-214.

6. E.B. Филатова, A.X. Алиева. М.И. Шадрина, П.А. Сломинекий, «Микро-РНК: возможная роль в патогенезе болезни Паркинсона». Биохимия, 2012, 77 (8), с. 981-989.

Тезисы устных докладов

7. Алиева А.Х.. Филатова Е.В., Карабанов А.В., Иллариошкин С.Н., Сломинекий П.А., Шадрина М.И., «Анализ изменения транскриптома на ранних симптоматических стадиях болезни Паркинсона». Всероссийская конференция «Фундаментальные проблемы нейронаук: функциональная асимметрия, нейропластичность и нейродегенерация» (18-19 декабря 2014 г., г. Москва). Тезисы докладов, с. 922.

8. Алиева А.Х.. Филатова Е.В., Шадрина М.И., Карабанов А.В., Иллариошкин С.Н., Сломинекий П.А., «Экспрессионные маркеры при болезни Паркинсона». VI Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы (15-20 июня 2014 г., г. Ростов-на-Дону). Тезисы докладов, с. 111.

9. Anelya Alieva. Elena Filatova, Maria Shadrina, Aleksey Karabanov, Sergey Illarioshkin, Petr Slominsky, «Analysis of gene expression in peripheral blood of

patients with Parkinson's disease». 3rd World Parkinson Congress (October 1-4, Montreal, Canada). Journal of Parkinson's Disease, 2013, 3, suppl. 1, P.44.

Тезисы стендовых сообщений

10. Алиева А.Х.. Филатова Е.В., Карабанов А.В., Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А., Шадрина М.И., «Анализ изменения экспрессии генов в периферической крови пациентов на ранних симптомных стадиях болезни Паркинсона». Сборник материалов VII Съезда Российского общества медицинских генетиков, с. 7, г. Санкт-Петербург, 19-23 мая 2015 г.

11. Elena Filatova, Anelja Alieva. Maria Shadrina, Elena Kozina, Gulnara Khakimova, Petr Slominsky, Michael Ugrumov, «Transcriptome analysis in MPTP mouse models of early stages of Parkinson's disease».3rd World Parkinson Congress (October 1-4, Montreal, Canada). Journal of Parkinson's Disease, 2013, 3, suppl. 1, P.46.

12. Шадрина М.И., Филатова E.B., Алиева A.X., Волкова А.П., Сломинский П.А., «Транскриптомные исследования в изучении болезни Паркинсона». XXII съезд физиологического сообщества имени И.П. Павлова (16-20 сентября 2013 г., Волгоград), тезисы докладов, с.587.

13. A.Kh. Alieva. E.V. Filatova, M.I. Shadrina, P.A. Slominsky, «Expression analysis of microRNA in peripheral blood in Russian patients with Parkinson's disease». International Summer School: "Neurogenetics. Unraveling behavior and brain mechanisms using modern technologies"(August 20th to August 25th 2012, Zvenigorod, Russia). Abstracts, P.5.

14. A.X. Алиева. E.B. Филатова, М.И. Шадрина, П.А. Сломинский, «Анализ экспрессии микро-РНК в периферической крови». XXIV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (7-9 февраля 2012 г, Москва). Тезисы докладов, с. 45.

15. Сломинский П.А., Филатова Е.В., Алиева А.Х., Карабанов А.В., Лимборская С.А., Иллариошкин С.Н. «Поиск экспрессионных маркеров ранних стадий болезни Паркинсона». Болезнь Паркинсона и расстройства движений. Руководство для врачей. По материалам II Национального конгресса по болезни Паркинсона и расстройствам движений (с международным участием) (21-23 сентября 2011 г., Москва), аннотированные доклады, с.63.

16. Шадрина М.И., Филатова Е.В., Алиева А.Х., Карабанов А.В, Иллариошкин С.Н. «Анализ транскриптома при болезни Паркинсона». Седьмой Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (3-13 июня 2011 г., Судак, Крым, Украина), тезисы докладов, с.457.

Алиева Анеля Ханларовна

ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПТОМНОГО ПАТТЕРНА НА РАННИХ СТАДИЯХ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 26.08.2015. Заказ № 308 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86