Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение кариотипа сирийского хомячка Mesocricetus auratus в культуре клеток

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изменение кариотипа сирийского хомячка Mesocricetus auratus в культуре клеток"

всесоюзный научно-исследсвательскйи институт молекулярной биологии

На правах рукоплся

г

Урмаяова Мария Анатольевна

ИЗМЕКЕНИЕ КАРИОТИПА СИРИЙСКОГО ЖМЯЧКА ' Мезосг±се'Ь1а аига'Ьиз

в кулвтуре клеток

03.00.23-биотехналсгия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сслсканиа ученой степени кандидата биологических.наук

Новосибирск -1Э50

Раооть выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной околотки Министерства медицинской промышленности -СССР.

Научный руководитель;

кандидат биологических наук Царева A.A. '

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кикнадзе И-И.

кандидат биологических наук . Рябчикова E.V..

Ведущая организация:Институт цитологии АН СССР, г. Ленинград

Защита состоится '' Л/ gctcctiаээог. на заседании специализированного совета К.098.08.01 во Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии Мннмздпрома СССР по адресу: бззл.59 Кольцово Новосибирской области, ВНШ МБ, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке' ВНИИ МБ Шнмедпрома СССР

Автореферат разослан ■ " /¿¿»д^вуХ- 1ээог.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Клеточные лини;:, ведущие происхождение как от нормальны:-:, так и от опухолевых тканей, существуют ухе более тридцати лет. Кариотипичеекая структура клеточных линий отличаетля от набора хромосом исходного вида животного. 3 качестве основной причины эволюции клеток перевиваег.^ыхлиний рассматривается процесс адаптации к условиям существования in vitro. Поскольку условия культивирования из-за нестандартности питательных сред, сывороток, применения различны?: методов культивирования и т.п. своеобразны в каэдой лаборатории,одна и та ке клеточная линия мокет приобрести различные сзсйства и характеристик-/ , в том числе и измененную структуру кариоткпа.О целыэ получения адекватных результатов исследования целесообразно пользоваться хорошо охарактеризованными эталонными клеточным? линиями, хранящимися в специализированных коллекциях.

Многие из современных подходов к разработке иммунобиологических препаратов, при которых используются модификации традиционных методов или новые биологические приемы, включая методы генной инкенерии, связаны с применением перевиваемых клеточных линий. Использование клеточных линий для этих целей основано на системе посевных серий и банков рабочих клеток изготовителя, которые должны быть полностью аттестованы в соответствии с требованиями ВОЗ. Одним из основных требований, предъязляег-нх к клеткам субстратам , является стабильность Есех параметров, по которым они охарактеризованы,в том числе и цитогенетических, на протяжении всего периода использования клеток.

Культуры клеток сирийских ХОМЯЧКОВ ВНК-21 (с-13), НаК, CER относятся к наиболее часто применяемым в вирусологических исследованиях перевиваемым линиям клеток. Это объясняется их высокой чувствительностью к широкому спектру вирусов, а именно, к поксвирусам, герпесвирусам, аденовирусам, пара- и ортомиксо-вирусам, альфавирусам, пикорновкрусам, рабдовирусам и другим.

- 3 -

3 настоящее время за рубежом клеточная линия енк-21(с-13) имроко используется при производстве вакцин против вирусов ящура, японского энцефалита, бешенства, синего языка овец, везикулярного стоматита и аденовируса серотипа 2. Обсуждается возможность применения этой перевиваемой клеточной линии з качестве субстрата для производства субъединичных вакцин на основе вируса осповакцины. Однако, ни в отечественной, ни в зарубежной литературе нет полного патогенетического описания культур клеток сирийского хомячка, выполненного с применением методов дифференциальной окраски хромосом. Такав не изучено, каким образом монет изменяться каркотппическая структура клеточных линий в процессе их культивирования.

Цель саботы. Целью настоящей оаботы являлось псоведение

паспортизации клеточных линий сирийского' хомячка нак, сгк, знк-21(с-13) и ее клонов, имеющихся в коллекции ВНИИ МБ; выявление касиотипических особенностей различных сублиний зн:<-21(с-1Э), имевшихся в коллекции ВНИИ ?ЛБ; определение закономерностей изменения кариотипа клеточных линий сирийского хомячка в культуре; изучение устойчивости кариологических характеристик производственного штамма клеточной линии внк-21(с-13) при длительном культивировании в различных условиях с целью дать рекомендации к ее использованию в Сиотехкологических разработках.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе впервые проведено полнее онтогенетическое исследование клеточных линий сирийского хсмячка, выполненное с применением различных методов дифференциальной окраски хромосом. Выявлены различия в структуре кариотипа семи сублиний внк-21(с-13) и была обоснована необходимость проведения полного карислогического контроля клеток производственного штамма внк-21(с-13) на этапе изготовления эталонных заморозок клеток культуры. Выявлены за- 4 -

кономерности з исменеклях кариоткпа клеток культуры внк-21(с-13) Изучение устойчивости кариологлческих характеристик суспензионного производственного этажа внк-21(с-13) при длительном культивировании в различных условиях показало, что структура кариотипа данной культуры остается стабильной лишь при условии, что культивирование прозодится при строго регламентированных условиях в ферментерах.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликована статья, этот материал представлен также в " Каталоге перевиваемых культур клеток " т.2 (деп. ВИНИТИ, i9S8). Результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции " Генетика соматических клеток" (Звенигород, 198эг.) и з-м Всесоюзном совещании 11 Культивирование клеток животных и человека" (Пущи-

ho, х990г.).

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 'So страницах машинописного текста, включая 47 рисунков и з таблицы.

Данная работа проводилась в рамках НИР ВНИИ МБ и выполнялась совместно с сотрудниками ВНИИ молекулярной биологии. Автор выражает глубокую признательность Исаенко A.A., Максутову О.И., Хромых Т.И., Серпинскому 0-И.

1. Онтогенетическая характеристика культур клеток сирийского хомячка, имеющихся в коллекции ВНИИ МБ.

1.1 Цитогенетическая характеристика клеток суолиний

внк-21(с-13).

1.1.1 внк-21 (с-13) now. В клетках данной сублинии число хромосом варьирует незначительно, количество клеток, имеющих от ■42 до 44 хромосом, составляет 79%, число полиплоидных клеток

-12,7%. Для культуры характерны 4 маркерные хромосомы ( рис.1 ):

Ml - t<2;Y) (2pter—cen—2qcl::Yga3—Yqter),

K2 - del(X)(pter—cen—aa3:),

КЗ - del(Y)(pter—cen—qal:).

», ä

íj PI

л £

и ^ 1

о

V 2

О

Г'

• ts

u y У

4» "J Vi 1 Ú «A 4 л В ti g U <( î-d p '1 © î»

О 7 S *9 10

Ï1 s? «Э

Ï5 -

f S3 <E>

1 1 1 2

a -a Si %

il

г> s?

г;

13

о и 4

17

i? «» M ïi

14

Г» «> О

19

Ö 15

С fe

20

21

Ml

ä

SA A

easff^ M2

Û I

из

« ô

5

1

г'.^се^еггг'исльг.ал октмсуа хромосок.

Маркеры т и мз образовались в результате нереципрокной тракс-локаиии хромосом г и у.

Маркеры М1, М2, мз хорошо выявляются при С-окрашивании.

1.1.2 внк-21(с—13) ВКК. Размах изменчивости по числу хромосом незначителен, количество клеток, имеющих от 49 до 50-ти хромосом, составляет 75%, число полиплоидных клеток - 5,1%. Для клеток данной культуры характерно наличие шести маркерных хромосом:

М1 - ае1(X)(рйег—сеп—даЗ:), М2 - <3е1(1)^ег—сеп—дЬЗ:),

МЗ - t(9;?) (9pteг—сеп—9дЫ::?), — "

М4 - inv йир(15) (pter—сеп—дЬЗ::дЬЗ—дЫ::дЬЗ—дЬег), М5 - 1:(1б:?) (?: :сеп—lбqter) , Мб - ?.

При С- окрашивании в клетках линии выявляется только маркер М1. При Ад+-окрашивании в клетках культуры обнаруживается 7-8 яд-рышкообразующих хромосом. С помощью Ад —б- переокрашивания хромосом было подтверждено происхождение маркеров мз и М5.

1.1.3 внк-21 (с—13) Л и три ее крупноклеточных клона с-9, с-24, с-зб. В клетках линии внк-21(с-13) Л число хромосом варьирует незначительно, количество клеток, имеющих от 43 до 45 хромосом, составляет 86%, число полиплоидных клеток - 5,2%.

Клетки клонов характеризовались широким размахом каристи-пической изменчивости при отсутсвии четко выраженного модального класса клеток, причем наблюдалось значительное увеличение общего количества хромосом в клетках клонов.Для данной культуры клеток характерны 9 маркерных хромосом:

М1 - Ь(3;1) (Зд1ег—сеп—^ег),

М2 - 1:(Х;2;15) (Хр<:сг—Хра1::2да2—сеп—2ра4::2да2—2чс1:

:15дЬ1—15д±ег),

МЗ - £{У;15) (¥р1.ег—сеп—УдаЗ:;15даЗ—15с[Ъег) ,

М4 - (Зе1 (6) (:ссп—gter),

М5 - 11(16??) С?—сеп—16gter),

Мб - йе1(5)(:ра1—сеп—дЬег),

М7 - сЗе1(2)(:да1—сеп—pter),

М8 - ^6; 17) (6pter— сеп—17<^ег) ,

Маркерные хромосомы мг и мз выявляются также и при С-окрашива-нии. Кроме того, кариотипы клеток линии внк-21(с-хз) Л и клонов этой линии были сопоставлены по частоте встречаемости гомологов различных нормальных и маркерных хромосом. Сделан вывод о том, что клон с-9 был получен от тетраплоидной клетки, клон с-24 -от триплоадной клетки, а клон с-з& - от гексаплоидной.

В клетках культуры внк-21(с-13) JI выявляется 7-8 ядрышко-образующих хромосом. Интересно, что все ЯО-хрсмосомы сохраняют свою активноять и в крупнохлеточных клонах. Так, в клетках клона с-9 было выявлено 18-20 ЯО-хромосом, а в клетках клона с-зб - 24-30 ЯО-хромосом.

1.1.4 внк-2i(с-13) ИП. 3 клетках данной линии число хромосом варьирует незначительно, количество клеток, имеющих от 40 ДО 44 Хромосом составляет 77%, число полиплоидных клеток -з,5%. Культуру характеризуют 9 маркерных хромосом, шесть из которых идентичны маркерам культуры внк-21(с-13) Л:

Ml - t(5;17)(5pter—cen—17q) ,

M2 - t(X;2;15)( Xter—Xpal::2qa2—cen—2pa4::2qa2—2qcl:

: 15qbl—15qter) , ИЗ - t(Y;15)(Ypter—cen—Yqa3::15qal—15qter), M4 - del(6)(:cen—qter), MS - t(16:?)(?—cen—16qter), Мб - del(5)(:pal—cen—qter), M7 - t(9;?)(9pter—cen—9qbl:: ?), M3 - ?

M9 - t(1;?){lqter—cen—lpter::?).

Маркеры H2, из и мэ хорошо идентифицируются при С-окрашвании. 3 клетках культуры постоянно выявляются 7-е ЯО-хромосом

1.1.5 внк—21(с-13) ЧС. Размах изменчивости по числу хромосом в клетках культуры незначителен, количество клеток имеющих CT 42 до 44 хромосом, СССТЭВЛЯеТ 86%, число полиплоидных кле-тсх-э*. Культуру характеризует десять маркерных хромосом:

Ml - t<6;2)(6pter—car—2qter),

K2 - t(6,-ll) (6pter—cer—llqter),

КЗ - t{5;8) (Sqter—cen—5рЫ: :8qa2—В qter) ,

М4 - inv dup(pter—cen—qb3::qb3—qbl::qb3—qter), M5 - del(4)(:qa2—cen—pb2), Мб - del(4)(:pa2—cen—pter), M7 - del(X)(pter—cen—qa30, M8 - ?

M9 - dir dup (6)(pter—pa2::ptqr—cen—qter), MIO - ?.

Маркер M7 хорошо выявляется при С-окрашивании.

1.1.6 внк-21(с-13) ТА.' По числу хромосом клетки распределены следующим образом: 50% составляют клетки с числом хромосом ОТ 41 до 43, 18% клеток имеют окотриплоидное ( 60-70 ) число

хромосом и 18% клеток околотетраплоидные. Культуру характеризуют десять маркерных хромосом: MI - i(1) (qter—cen—qter), K2 - dirdup(2)(pter—cen—qter::qcl—qter), M3 - t(X;3)(Xpter—cen—3qter), M4 - t(3?ll)(3qter—3qal::llpter—cen—llqter), M5 - t(6;5)(6qter—6qa3t:5ptol—cen—5qter), M6 - t(9;?)(9pter—cen—9qbl::?), M7 - t(7;ll)(7pter—cen—7qbl: :llqa4—llqter), M8 - t(17,?)(cen—17qb2::?), M9 - t(Y;?)(Ypter—cen—Yqal::?),

MIO - inv dup (15)(pter—cen—qb3::qb3—qbl::ab3—qter).

Маркер M9 хорошо выявляется при С-окрашивании хромосом.

1.1.7 внк—21(с—13) ПШ. Для клеток модального класса характерен небольшой размах кариотипической измвнчтвости, количество клеток, содержащих от- 40 до 42 хромосом равно 75%, очень большое количество полиплоидных клеток - 21%. При анализе g- окрашенных хромосом клеток производственного штамма (рис.2), выявлено, что большое количество маркерных хромосом имеет сложное строение. Среди них маркер mi - представляет собой изохрсмоссму з с амплифицированкым коротким плечом (троекратный повтор), причем, сохраняется лись одна центромера, которая и выявляется

- 9 -

при окрашивании на конститутивный гетерохроматин. мз - маркер в состав которого входят хромосома 12 и длинный амгглифицированный фрагмент, в котором при g- окрашивании выявляется до пяти темных полос, а при С-окрашиванш до восьми блоков конститутивного гетерохроматина. В целом, маркеры ' клеток производственного штамма могут быть описаны :

ml - i ашр(з) (qter—сеп—р—р—р—qter) ,

М2 - del(X)(pter—сеп—qa3 : ) ,

мз - t(12;?)(12qter—сеп—12pter::?),

м4 - del (4 ) (pter—сеп—qbl:),'

m5 - t(17 ;5) (5pter—cen—17qter),

m6 - i(6)(6qter—cen—6qter),

m7 - t(14;?)(14pter—cen—14qter::?),

m8 - i(19) (19qter—19al: : 19al~19qter) ,

>19 - ?,

mio - del(18)(cen—qbl:),

mil - t(6;17)(6pter—cen—17qter),

m12 - ? возможно inv dup del(17)(cen—qbl::qbl—qal), m13 - i(18)(qb2—cen—qb2), ml 4 - ?, m15 - ?, m16 - ?

Mi4 - M16 - являются редковстречающимися маркерами. В клетках культуры выявляются 7-8 ядрышкообразующих хромосом, среди них одна - является маркером.'

Важно отметить, что в регламенте культивирования производственного штамма внк-21(с-13) уделено незаслуженно малое внимание онтогенетическому контролю клеток. Требования предъявляются только к числу хромосом в клетках модального класса. Этим требованиям удовлетворяют почти все сублинии внк-21(с-13) ( за исключением сублинии ВКК ), имеющиеся в коллекции ВШИ МБ. Результаты данного анализа говорят о необходимости проведения полного онтогенетического анализа клеток производственного штам.га линии внх-21(с-13), предназначенных для эталонных заморозок.

1.2 [1итогенетнческая характеристика клеток линии нак. Для клеток культуры характерен сравнительно небольшой размах'карио-

^ fi

IZ ir*

«fr. о «

t» -f. *

k

Y**

V *

г* S *

£ M

17

«■« в

fc. Я

lö IS

» «к

to ;

типической изменчивости. Количество клеток, содержащих от 55 до

57 хромосом равно 61%, количество полиплоидных клеток равно

12,8%. Выявлены 15 маркерных хромосом: Ml - t(2 ;?)(pter—cen—2qcl::?), M2 - i(17)(qter—cen—qter), M3 - dir dup(12)(pter—cen—qb2::qa4—qter), M4 - del(12) (:cen—qter) , M5 - dup(5)(pter—cen—qbl::qal—qtee), M6 - i(6)(qter—cen—qter), M7 - t(ll;16)(llqter—cen—16qter), M8 - t(16,•?)(?: :cen—16qter) , M9 - t(9;?)(9pter—cen—9qa2?), MIO - t(9;11)(9pter—cen—llqter), Mil - del(8)(:cen—8qter), M12 - ?,

M13 - t(13 ;?)(?: :13pter—13qter), M14 - ?, M15 - ?.

В клетках культуры содержится n-i2 активных ЯО-хромосом, некоторые из них имеют сложное строение и могут являться маркерами культуры.

1.3 Патогенетическая характеристика клеток линии сек. Для клеток культуры характерен широкий размах кариотипической изменчивости ( от во до 77 ' хромосом), модальный класс составляют клетки с 70-76-ю хромосомами, их количество достигает 65%, количество полиплоидных клеток равно э,з%. Культуру клеток cer характеризуют десять маркерных хромосом:

MI - del(1)(pter—cen—qa3), M2 - i(2)(qter—cen—qter),

M3 - del(ll) (:cen—qter) , ПреДСТЭЕЛеН ДЕУМЯ гомологэми, M4 - del(4)(pter—cen—qa4:), M5 - i(6)(qa5—cen—qa5),

M6 - t(6;2)(6pter—cen—6qb5::2qc2—2qter), M7 - dup(S)(pter—cen—qb3::qbl::qb3—qter), MS - t(ll;M7)(llqter—cen—H7qter), .49 - del (14) ( :pal—cen—qa2) , H10 - del(14)(pter—cen:).

2. Сравнительный анализ количества ядерной ДНК в культурах клеток сирийского хомячка, имеющихся в коллекции ВНИИ МБ. Измерения количества ядерной ДНК в клетках культур были проведены на проточном цлтсфлюориметре "fartccraph-fmp" фирмы "kpatel", согласно протоколу фирмы N2 8 с использованием красителя этидиу-ма бромида. Сублинии внк-21(с-13) различаются по количеству я характеру распределения ядерной ДНК в клетках. Эти данные хорошо согласуются с распределением клеток по числу хромосом в различных сублиниях. Ранее, на основании частоты встречаемости g-окрашенных нормальных и маркерных хромосом, был сделан вывод о тем, что клетки культуры нак имеют околотриплоидный набор хромосом, а клетки культуры cer - околотетраплсидный. Зтст вывод подтверждается данными, полученными на основе анализа кривых, описывающих распределения клеток по количеству ДНК для культур клеток вНК-21(с-13) Flow, как, сел. Подтверждено происхождение клеток крупноклетечккх клонов.

з. Анализ маркерных хромосом, образовавшихся з культурах клеток сирийского хомячка.

з.1 Участие ядрыикообразуюших хромосом в формировании маркерсв. В клетках сирийского хомячка все ЯОР локализованы либо з теломерных районах коротких- плеч субтелоцентрических хромосом ( 2,б,9,ю,1з ), либо в центромерных районах акреиентри-ческих хромосом ( 16,17 и 19). Если при Ад -скрашизанки хромосом клеток линий сирийского хомячка, выявляются хромосомы с иной локализацией ЯОР - эти хромосомы являются маркерами данной клеточной линии. В настоящей работе проведен дополнительный анализ трех клеточных линий сирийского хомячка, имеющих ЯСР-не-сущие маркерные хромосомы.

Метод Ag"—g -переокраски хромосом, который для анализа кариотипа клеточных линий был применен каш впервые, показал,

- 13 -

что б исследованных клеточных культурах сирийского хомячка яд-рыакоозразующими ЯВЛЯЮТСЯ хромосомы 6,9,16,17 и 19 -й пар. В составе маркеров выявляются хромосомы 6,9,16 и 17, причем, лишь хромосомы 16 и 17 вовлекаются в перестройки своими ядрышкообра-зуюшими районами. В линиях клеток нак, внк-21(с-13) ВКК и внк-21(с-13) 1Ш1 выявлены маркерные ЯО-хромосомы, что позволяет использовать Ад+-окрашивание в сочетании с анализом спектра изоферментов ГбФД и ЛГ для быстрой идентификации данных клеточных линий, минуя трудоемкую и длительную процедуру анализа в-окрашенных хромосом.

3.2 Типы хромосомных перестроек, встречающиеся при образовании маркеров в культурах клеток сирийского хомячка. При проведении анализа маркерных хромосом культур клеток сирийского хомячка было установлено, что в образовавшихся маркерах встречаются все типы хромосомных перестроек : транслокации, инверсии, делеции и дупликации. В культурах, где в процессе эволюции кариотипа произошли более значительные изменения исходного ка-риотипа сирийского хомячка ( внк-21 (с-13) ПШ, нак и с£1? ) большую роль играют транслокации и делеции, затрагивающие гетерохроматические области, нарастает роль дупликаций.

3.3 Локализация -"горячих точек" на хромосомах, участвующих в образовании маркеров в культурах клеток сирийского хомячка. Структурно-функциональная дифференциация хромосомы по ее длине, несомненно, сказывается на лредпочтительной локализации точек разрывов в одних участках хромосомы и отсутствии или меньшей их встречаемости в других. В общей сложноста во всех проанализированных клеточных линиях сирийского хомячка было идентифицировано 92 маркерных хромосомы, из них п - уникальной морфологии. Анализ данных о локализации точек разрывов на хромосомах ("горячих точек") при образовании маркеров в клеточных линиях сирийского хомячка позволил сделать вывод о неслучайном характере

14 -

вовлечения нормальных хромосом в перестройки, происходящие в клеточных линиях. Обнаружено, что образование маркерных хромосом в сублиниях культуры клеток внк-21(с-1з) чаще связано с повреждением центромерных районов 1, з и 6-й хромосом. Ча^то вовлекаются в перестройки половые хромосомы, разрывы локализуются как в области центромеры X'хромосомы, так и в гетерохроматических районах обеих половых хромосом. При этом чаще всего происходит делетирование больших участков хромосом, а в двух сублиниях хромосома у утрачена полностью. Аутоссмы 2,4,5,3,9,16,17,18 19 также часто участвуют в образовании маркеров, з то время как хромосомы 7,13,20 и 21-й пар преимущественно остаются "холодными" (рис.3).

Для других клеточных линий сирийского хомячка НаК И СЕН характерна иная локализация "горячих точек" на хромосомах. Так, в обеих клеточных линиях половые хромосомы и хромосома 15 вообще не вовлекаются в перестройки. В то же самое время область центромеры хромосомы и является весьма активным районом.

Ни в отечественной, ни в зарубежной литературе нет ни одного цитогенетического описания перевиваемых культур клеток сирийских хомячкоз внк-21(с-13), нак и сеи, выполненного с применением методов дифференциальной- окраски хромосом. Однако, проведено большое количество исследований по изучению изменений кариотипа, происходящих в процессе иммортализации и трансформации первичных культур клеток сирийского хомячка в результате воздействия химических, физических и биологических факторов. Сопоставление суммарных данных о "горячих точках" на хромосомах в клетках культур, трансформированных химически?® канцерогенам;! и различными ДНК содержащими вирусами, описанных рядом авторов, с данными о "горячих точках", полученными нами при анализе постоянных клеточных ЛИНИЙ сирийского хомячка ВНК-21(с-13) , НаК и сен, показывает что: 1.клеточная линия внк-21(с-13) характери-

- 15 -

■

-Б' •

и

г

"В л

15.

.16

А:

12

с

•У.

17

- о 13

I

1Е

I

а-.

14

•н

19

1)1.. •v «

15

4

20

1/г-

и

21

I У

Рис.3 Локализация точек разрывов на хромосомах при образовании маркеров з клетках сугшший ШК-21 (с-13) (* ), ВаХС-13 ), скн. ( л ), емгшнлшсизш целой хромосомы (1 ), цоносомяи (В 3-

зуется определенней локализацией "горячих точек" на хромосомах, для других клеточных линий сирийского хомячка нак и сен характерно иное расположение разрывов на нормальных хромосомах, воз- . пикающих при образовании маркеров: z. локализация "горячих точек" на хромосомах в клетках линии внк-21<с-13) и в первичных культурах клеток сирийского хомячка, трансформированных онко-геиными вирусами совпадает.

з.4 Маркерные хромосомы линии клеток внк-гке-гз; .3 данной работе проанализировано семь различных сублиний внк-21(с—13) и три крупноклеточные клона одной из них. Всего было выявлено 5з уникальных маркерных хромосы, характеризующие различные сублинии этой культуры, Однако, невозможно выделить "классические маркеры", наличие одного из которых позволяло бы идентифицировать каждую из исследованных сублиний как дериват

ВНК-21(с-13) .

В кариотипе клеток сублинии Flow в процессе его эволюции произошло небольшое количество нарушений хромосом. В клетках этой культуры выявлено всего четыре маркерные хромосомы, причем, если провести реконструкцию нормальных хромосом из маркеров, то получится почти нормальный диплоидный каристип сирийского хомячка. Исключение составляют лишь утрата небольшого участка гетерохроматического плеча X хромосомы и амплификация фрагмента длинного плеча хромосомы 15 (рис.1).

Наиболее значительные изменения кариотипа произошли в суб--линии ПШ (рис.2). В клетках этой культуры выявлено большее количество маркерных хромосом, возникших в результате транслска-ций, делеций и амплификаций. Не удалось достоверно установить происхождение многих маркерных хромосом этей сублинии из-за сложности их строения, несмотря на применение различных методов дифференциальной окраски хромосом. Кроме того, з клетках данной сублинии полностью утрачены оба нормальных гомолога хромосом

- I?-

3,4,6,10,15 и 19-й пар, а хромосомы 5,12,14,16 и и представлены одним нормальным гомологом.

Такие серьезные изменения в структуре кариотипа сублинии ПШ произошли, по-видимому, в результате жесткого отбора клеток данной сублинии в условиях суспензионного культивирования. Эта сублиния обладает несомненными технологическими преимуществами перед клетками других сублиний культуры внк-21(с-13).

4. Анализ структуры кариотипа производственного штамма линии клеток внк-21(с-13) при длительном культивировании различными способам;',. Проведен полный цитогенетический анализ производственного штамма внк-21(с-13) при длительном культивировании клеток в монослое ( статическим и роллерным способами ) и в суспензии.

При анализе кариотипа клеток культуры внк-21(с-13)ПШ после трех независимых культивирований в ферментере в течении 8, ю и 12 пассажей не было выявлено ни количественных, ни качественных изменений в структуре кариотипа клеток. Количество клеток, содержащих от 38 до 42 хромосом "во всех случаях составляло 69-76%, причем, преобладали клетки с 41-ой хромосомой, количество полиплоидных клеток было 21-23,2%.

После ю-ти пассажей культивирования в роллерах в кариоти-пе клеток культуры внк-21(с-13) ПШ произошли некоторые изменения. Так, число клеток, содержащих от 38 до 42-х хромосом по-прежнему составляло 76%, однако, большинство клеток имели ei хромосому, уменьшилось количество полиплоидных клеток < 18,7%). При анализе G-окрашенных хромосом этих клеток было установлено, что состав нормальных и маркерных - хромосом * сохранился. Изменения затронули лишь маркер кг, где выявлена делеция: del(X) (pter—ccn—qa3:)—del(X) (pter—ccn—qal:) , Т.е. произошла дальнейшая потеря.гетерохроматического материала X хромосомы.

Белее значительные изменения кариотипа з клетках культуры Знк-21(с-13) ПШ выязленк гтсслэ культивирования клеток в течение 29-ти пассажей в стационарном монсслое ( в культуральнкх матез-сазс). Изменения структуры кариотппа носили качественны;* и количественный характер. Увеличилось число клеток, ссдеряааих 40-41 хосмссому ( до 73% ), резко снизилось количество полиплоидны:-: клеток ( 5,2% ). Анализ G-скращенных хрсмсссм показал, ".то выявленные изменения затрагивают как нормальные, так и маркасные хсомсссмы. Наиболее типичны! m являются на руления, лреисоледши? s маркерах мз л не. Выявлена деления значительного участка длинного плеча маскера мз, новый маркер представляет собой .ме-тэцентрическуп хромосому средних размесов. Изменения в строен;;;: маскера мз легко выявляются при С-дисференниальнсм окрашивании хромосом клеток культуры. Другая ( интерстициальная ; деления выявлена В маркере Мб, НОВЫЙ маркер M6*-(qter—qa2::csn—чгаг; . Креме того, было обнаружено большое количество нарушений нсс-мальных и маркерных хромосом, каэдеэ из которых встречалось в 2-6-ти клетках из общего числа проанализированных- Маркер часто утрачивает'часть длинного плеча ( интерстипиальная деле-ция ), которая представляет собой материал 1-2 коротких плач хромосомы з. Маркер мг может быть представлен в виде г daifXi (pter—сап—cal:). Из перестроек нормальных хромосом чаше всего встречаются 3q+ и дицентрическая хромосома, образовавшаяся з результате тандемной транслокация t (ip г 2р ).

Изменение условий существования клеток in vitra ( состава питательней среды, режима или способа культивирования) приводит к нарушению стабильности цигогенетнческих параметров культуры. В проведенных нами ранее работах было показано, что при культивировании клеток епк—21 (с-13) ПШ з среде с пониженным содержанием глюкозы, уже через 2-3 пассата количество полиплоидных клеток з популяция составляло з%-. Наоборот, при !сультаз*лрсван:-га

- 19 -

¡слеток в среде ПСА ( источником аминокислот является аутолизат пекарских дрожжей ) уже к пятому пассажу происходило не только увеличение количества полиплоидных клеток, но и увеличение их плоидности.

В целом, можно констатировать, что поддержание постоянных условий культивирования на протяжении всего срока наблюдения обеспечивает клеточным линиям сохранение основных хромосомных характеристик. Вместе с тем, основные параметры набора хромосом клеток весьма лабильны и способны быстро реагировать на неблагоприятные воздействия или на нарушения регламентирующих параметров культивирования. Это дает возможность эффективно использовать кариологический метод исследования в качестве контроля стабильности клеточной культуры, используемой в научно-исследовательских работах и в биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. Проведена онтогенетическая паспортизация, выполненная с применением различных методов дифференциальной окраски хромосом, линий клеток сирийского хомячка, имеющихся в коллекции ВНИИ MB - ВНК-21(с-13), НаК И CER.

2. Проведено цитогенетическое изучение семи клеточных линий, поступивших в коллекцию ВНИИ МБ под одним и тем ке названием внк-21(с-13). Показано, что все они представляют собой различные сублинии культуры клеток внк-21 (с- 1з> и имеют индивидуальные морфологические и онтогенетические характеристики. Показана необходимость проведения полного кариологического анализа клеток производственного штамма культуры внк-21(с-13), предназначенных для эталонных заморозок.

3. Изучение закономерностей изменения кариоткпа клеточных линий сирийского хомячка в культуре показало неслучайный характер вовлечения нормальных хромосом в перестройки в ходе образо-

- 20 -

занля маркеров. Локализация "горячих течек" на хромосомах в клетках сублиний внк-21(с-13) характерна для клеток сирийского

рашивании выявлены ядсышкообразухте маркеры в линиях

БНК-21 (с —13) ГШ] ВНК-21 (с—13) ВКК И НаК, ПОЗЕОЛЯЮ12ИЗ бЫСТСО

идентифицировать эти линии.

4. Изучение устойчивости карислогических характеристик суспензионного производственного штамма бнк-21(с-13) при длительном культивировании з различных условиях показало, что структура кариотипа данной культуры остается стабильней'лишь при условии, что культивирование проводится при строго регламентированных условиях в ферментерах.

Семенные результаты диссертации изложены в следутших публикзци-

1. Урмансва М.А., Тихонов В.Я., Балзовская Е.Г., Кишенко Г.П. Нитогенетическая характеристика клеточной линии енх-2кс-13) и трех ее кленов. - Цитология, 1939, т.з1, N7, с. 79э-зоб.

2. Царева A.A., Исаенко A.A., Немцов D.S., Холскольцева Т.Д., Срченко D.A., Решетникова Г.Ф., Юрченко Н.Д., Махсва K.M., Рубцова Н.В., Урманова М.А., Машукоза С.З., Дмитриева Е.З., Гетма-нсва Т.Н., Чешэнко О.И., Киц И.В. - Каталог перевиваемых культур клеток, т.2. Деп. ВИНИТИ абб-Ззз, 29.01.1933.

3. Урмансва M.Â., Царева A.A. Сравнение структуры кариотипа клеток перевиваемых линий сирийского хомячка ehk-21(c-i3), нак, сен.— Тезисы докладов. Всесоюзная конференция по генетике соматических клеток в культуре, 12-15 октября 19ззг, стр. 117. £ве-нигерол, 1939г.

4. Урманова М.А., Пареза A.A. Сравнительный онтогенетический анализ суеллния внк-21(с-13). - Тезисы докладез. 3-е Всесоюзное совещание " Культивирование клеток зибст'~"г т» т^омаи 13-15

хомячка, трансформированных онкогеннкми вируса?.®, i-ри Ад - ск-

февраля 1939г., стр. эо. ГТушино, 1ээог.