Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ у больных хроническими лейкозами в динамике заболевания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ у больных хроническими лейкозами в динамике заболевания"

ТВ oR

i a VAKP

ШКСТЕРСТЕО ЗДРЛВООХР,'и-ЕЖШ и медицинской ПГОМЫШЛЕННОСТИ РФ

РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ 'МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА II. П. ПАВЛОВА

На правах рукописи УДК: 577.1г":616.155.302- 036.12-008.9

БОРИСКИНА Марта Алексеевна

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЯЙОСОМАЛЬНЫХ ЦИСТЕИН0ЕЫХ ПРОТЕИНАЗ У БОЛЬШК ХГОШ'ЛЕСКМЖ ЛЕЙКОЗАМИ В ДИНАМИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

С'3.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на ссгасканда ученой степени кандидата медицинских наук

Рязань - 1996

Работа выполнена на кафедре биологической и биоарганическсй химии с курсом клинической лабораторной диагностики Рязанского государственного медицинского университета им. акад.

И. П. Павлова

Научный руководитель - академик РАН Е. А. Строев

Официальные оппоненты - д.и.н., профессор Б.Г.Читай

к.и.в. А.В.Дактркев

Ее дуемая организация

- Институт питания РАМН

Защита состоится " " 1996 года в " и часов

на заседании Диссертационного совета Д 084.67.02. при Рязанском государственной медицинском университете имени академика И.П.Паадова. (391000, РФ, г.Рязань, ул.Высоковольтная, д.9)

Автореферат разослан "1 " (М^7^ 1996 года.

С диссертацией межно ознакомиться в библиотеке Рязанского государственного медицинского университета

Ученый сег-^етарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.А.РязаноЕа

СЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность текц. К числу фундаментальных достаггеЕкй молекулярной биология последних 15-18 лет относится осознание про-теолйза как особой форш биологической регуляции {Л.А.!окшкна, 1994).

Особенный интерес в атом аспекте представляет изучение системы лизосомагьных щетеиясашс прстеяназ (ЛЦ1Т), так как именно им в настоящее время приписывается участие в заключительных этапах синтеза и активация обширного ряда функционально важных белков через иеханкзш ограниченного протеолига (К.Н.Веремеенко, 1985; В.А.Тутелыгн, 1S90; Л.А.Локшина, 1391 и другие).

На сегодняшни дега> имеются доказательства участия система ЛЦД в осуществлении таких фундаментальных физиологических и патологических процессов, кпк перестройка тканей (Н.М.Ыаякскзя, 1990; ХА.Локякна, 1934), воспаление (K.itunlmatsu, 19SQ; W.îiachleldt, 1932; A.Saflna, 1982),.атеросклероз (В.Д.Тутельян, Î9Q7; А.В.Васильев, 1990; С.Н.Табагара, 1990) сахаркш диабет (й.В.Иатвзега, 1992), иязазнз а иэтэстагщювшше гяогеггественныг опухшей (Е.А. Козырева, 19S4; Т.А.Отлоблшш, 19S4; S.Krepela, 1989; R.l.toson, 1990).

Последние годы знздзнуются ловьззенкем интереса к изучению состояния лизосошлыюгоЧщстеинового протеешиза в разнообразных сферах биологии и медицины, обусловленным, в частности, появлением сведений о его вкладе в функциошфовение системы иммунитета (А.В.Васильев, 1937 - 1991; ß.Gradenhadt, 1S9Î; C.Rey-Mlilet, 1993; Р.Morton, 1995), а такта в процессы возникновения и развк-' тик опухолей (Э.А.Дияакян, 1SS4; Cj.Sim, 1989). Полная характеристика роли ЛЦП в этих процессах пека не получена.

В связи с вышеизложенным перспективнпм представляется изучение состояния ' лизссомалышх цистешювых протеиназ при хронических лейкозах, характерными признаками которых являются избы-

- о _

точная клепальная пролиферация клеток лимфсидиого или шелоидно-го ряда, сопровождающаяся выраженным вторичный шыунадефицитаы.

В последние годы в этом направлении опубликовано несколько работ (В.С.Былкнкина, 1991; 7.А.Гуреева, 1993; Л.А.Локшина, 1393), однако их результаты все еще носят фрагментарный и несколько противоречивый характер, в связи с чей нами к было предпринято настоящее исследование.

Цель работы состояла в выявлении состояния активности лизо-сомалькых цистеиновых протеин аз в лейкоцитах и плазме крови при хронических лейкозах и юс лечении.

Экспериментальна1! часть включала решение следующих задач;

1) Провести сравнительный анализ распределения суммарной активности дизссомальных цистеиновых катепсшов В, С и I. между двумя основными фракциями лейкоцитов периферической крови в норме.

2) Выявить изменения активности указанных ферментов в раз-ли- :шх типах лейкоцитов и плазме крови в дип&мике развития хро-

■ н шее кого лимфо- и миелолейкоэа.

3) Дать оценку влиянию традиционной химиотерапии хронических лейкозов на активность ЛЦЕ1 при данном типе патологии.

Научная новизна. В результате проведения исследований впервые было подробно охарактеризовано состояние активности катепси-нов В, С и I в различных фракциях лейкоцитов и плазме крови в норме и при хроническом лимфо- и шелодейкозе. В работе впервые продемонстрирована зависимость направленности и выраженности сдвигов активности катепсинов В, С и Ь от стадии развития хронического лимфолейкг-'а и описаны изменения активности указанных ¡ухзтеияаз при переходе развернутой клинической стадии хронического ыиедолойкоза в терминальную, охарактеризовано влияние широ-

- 3 - .

ко используемых традициояых методов химиотерапии хронического лнмфолейкоза (сочетания циклофосфава, винкристина и преднизаао-из) и хронического миелолейкоза (препаратов гидрокеимочешвш) на состояние лизосомального цистеанового протеализа в лейкоцитах.

Кроме того, в работе предложен метод сравнительного анализа степени протеелитической активации катеасина I в нормальных и лейкозноповрежденннх лейкоцитах и произведена оцэнка указанного параметра. ^

Практическая значимость. Предложенная в данной работе модификация метода фракционирования леикоцнгЪв при хроническом лим-фолейкозе легко осуществима и мозит быть применена в условиях клинических лабораторий для обследования данной категории больных. Выявленное достоверное различие активности ЛЦП мэлду двум;: основными фракциями лейкоцитоз периферической крови в норме указывает ка необходимость их ^акционирования при изучении состся-зля протэолкга в белых клетках крови пря различных заболеваниях.

Ояиегнноэ постепенное снягение зотивкоети катепышоз В, С и Ь в лейкоцитах пря прсгрессировании хронического лкмфолейкоза может быть использована в качестве дополнительного метода при определении стадии заболевания. Выявленное резкое возрастание активности катеясика В в лейкоцитах больных хроякческиы лимфо-лейкозш пря переходе заболевания в терминальную стадию может дагь основу кетаду дгаздаческаго наблвдезия для своевременного шкале нее озлокачествжещш процесса.

Ме-год определения степени протеолитической активации катеп-сина Ь, примененный в работе, мажет быть цепользоззн при проведении научных исследований по патохиыки протеализа.

Результату, полученные в настоящей работе, углубляют представления об участии системы Л1Щ в процессах опухолевого роста, а

также о возможных механизмах изменения их активности при изучаемой патологии.

Результаты работы внедрены в учебный процесс по курсам биохимии и гематологии, а метод определения степени протеолитичес-кои активации катепсина L - в научные исследования ЦНИЛ Рязанского государственного медицинского университета.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов" (Рязань, 1995), а также на заседании Рязанского отделения Всероссийского биохимического общества.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Об'ем и структура работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного тенета, состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 161 источник. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 17 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы результаты исследования активности лиаосомальных цистеиновых протеиназ в лейкоцитах и плазме крови у 25 здоровых людей (11 мужчин, 14 женщин, средний -возраст 50,1 ±2,1 года) и 98 больных хроническими лейкозами (50 мужчин и 48 женщин) в возрасте от 32 до 77 лет (73 бальных хроническим лим-фалейкоаом, из них 25 - во II стадии заболевания, 28 « 20 - в стадии III и IV соответственно; 25 бальных хроническим миелолей-козом, из них 4-е переходом заболевания в терминальную стадию). Диагноз устанавливался на основании комплекса клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования. Изучение

активности лиэосомальных ферментов осуществлялось двалян: на 1 -2 день после поступления и на фоне химиотерапии (больные хроническим лимфолейкозом обследовались на фоне полихимиотерапии по схеме СОР, бальные хроническим миелолейкозом - в процессе лечения препаратами гкдроксимочевины).

Вавесь лейкоцитов в плазме получали из гепариннаированиой периферической крови (10 мл) после осаждения эритроцитов декс-траном (А. Л. Лобашевский, 1982) и подвергали градиентному центрифугированию в среде верография - полкглвкия (Д.К.Новиков, 1979) для разделения плазмы, ыоноядерных лейкоцитов (№1) и полкморф-ноядерпых лейкоцитов (ПШ). Остаток эритроцитов удаляли путем осмотического гемолиза 0,92 раствором хлорида аммония, после чего клетки отмывали 0,15 Ы раствором хлорида натрия, пропускали через капроновый фильтр и подсчитывали в камере Горяева.

Чистоту разделения лейкоцитов проверяли эдкроскопией мазков из штефазы и осадка после соответствующего окраоивания (Е.А.Кост,* 1975). Для улучшения разделения лейкоцитов у больных хроническим лимфолейкозом (ХМ) нами применена собственная модификация метода градиентного центрифугирования с увеличением плотности среды верографин - политлюкин до 1,200. В связи со значительным преобладанием в периферической крови больных хроническим миелолейкозом (ХШ1) гранулоцитов на различных стадиях дилеренщ-гроЕКИ, полное фракционирование ¡соторых не представляется возможным, активность лигссшзльных. !?®р>,!энтов у тагога большие ИТ /Делили в суммарной фршщки лейкоцитов, полученных центрифуг ¡трог, анкем после осакдения эритроцитов декстраксм.

Окончательную суспензию клеток, содерзгащуто 105 - 10е лейкоцитов в 1 мл дистиллированной еоды обрабатывали тритоном Х-100 и подвергали трехкратному замораживанию - оттаиванию, после чего

- б -

полученные лизаты и плазму крови использовали для определения общей активности лизосомальных ферментов.

Активность катепсинов В и С определяли слектрофлуориметри-чески по методу Peters в модификации А.В.Васильева (1983), используя в качестве субстратов Н-а-бензоил-DL-аргинин- 8- иафтида-мид (BAÑA, "Serva") или глицил- L-фенилаланин- Û-нафтиламид ("Siena").

Активность катепсина L оценивали по скорости энаиматическо-го гидролига Н-карбобензскси-Ь-фенилаланин-аргинин-7-амидо-4-ме-тилкуыарина ("Sigma"), используя спектрофлуориметрический метод H.Klrshke (1932). Для определения степени протеолитической активации катепсина L реакционную смесь преинкубировали 15 минут при 37°С, после чего добавляли субстрат. Дальнейшую обработку проб и определение активности фермента осуществляли согласно вышеописанному методу, степень нарастания активности выражали в процентах по отношению к параллельно определяемым значениям, полученным без преинкубации. Белок в пробах определяли по методу М. Bradford ,1976).

Статистическая об]работка полученных результатов производилась с использованием критерия t Стьюдента с помощью пакета программ Quattro Fro for Windows на IBM PC.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ К ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительная характеристика активности лизосомальных цистеиновых протеиназ в крови здоровых лиц и бальных хроническими лейкозами.

Нами описано состояние показателей общей активности трех основных ЛЦП, обладающих разным-типом протеолитического действия и отличающихся .о степени чувствительности к регулирующим факторам: катепсина В (дипептидилкарбоксипептидаза), катепсина С (дй-пегггидилаыинопептидаза) и катепсина L (эндопептидаза) в лейкоци-

и отличающихся по степени чувствительности к регулирующим факторам: катепсина В (дипептидидкарбоксипептидаза), катепсина С (ди-пептидилашнопептвдаза) и катепсина L (эндопептидага) в лейкоцитах и плазме крови здоровых людей и больных ХЯЛ и ШЛ в динамике заболевания.

В ходе сравнительного анализа активности катепсинов В, Си L в двух оснсвнш: фракциях лейкоцитов периферической крови у здоровых ¿шдей обнаружилось, что ПМЯЛ характеризуются достоверно белее высокой активностью первых двук ферментов по сравнении с МЯЛ (рис. 1). Эта разница скорее всего обусловлена отличиями в функциях для указанных типов клеток, ведущая! к различной потребности в ЛЦГ1.

В связи с выявленным нами значительным снижением концентрации белка в обоих фракциях лейкоцитов периферической крова у больных ХЕЛ по сравнению с контролем (рис. 2), что соответствует данным Н.М.Геворкян (1986) удельнзя активность ферментов выражалась в расчете.на'.10® клеток во избежание неверней интерпретации результатов из-за различия содержания белка в нормальных и опухолевых ¡сгетках.

При проведегпи сравнительной характеристики, изменений активности лиэосомальшх цистеиновых катепсинов в трех клинических группах больных XJDI (И, III и IV стадия заболевания по Rai) по сравнении с контролем и в зависимости от стадии заболевания нами выявлены следующие тенденции (рис. 3, 4).

Б ЫЯЯ актотглость катапсика В у больных ХЯЛ II оказалась на 31,2% пже контрольных значений (р<0,05), проявляя далее тенденцию к постепенному снижению по мере прогрессирования заболевания ■■''л - рис. 3 А. Та?:, у больных УЛЧ III и. IV активность фермента оказалась ниже уровня копроля на 47,6% (р<0,01) и на 79,1% (р<0,001). Однако при анализе достоверности отличия указанного

>,2

И 0,3 К.

0.« 0,4 0,2

I- Г

д. к^тапскн в в.с-чтгпсини !

акт. лцп в мял

80 70

.5 » 1

I

3 40

.'О

= »Г-

Ч

VI-

.1.

, 1

С. Катспаш С

Г1 АКТ. дцп В пмял

Рис. 1. Соотношение активности . ЛДП в МЯЛ и ШЯЛ у ■ здоровых лиц.

Примечание: звездочкой обозначена достоверность значений активности (р < 0,05).

отличия

¡5 3.5

5 3

X «

I 2

й АЗ 1

* I

0 —

Г-

я

' т*

йм

I-

гмял

"Л

аКонтрош, Значаща у бэльнш

Рис.2. Содержание: белка в лейкоцитах ;в ворме и при ХЛЛ. Пришч^ие; звездочкой обозначена достоверность : отличия значений от контроля (р.< 0,05).

параметра в зависимости от стадии заболевания оказалось, что несмотря на вышеописанную тенденцию .. постепенного достоверного сшкепия активности фермгнта в Ш1 (представленных у таких больных лейкозно поврежденными лейкоцитами), только IV стадия забо-. левания характеризуется достоверным отличием активности, фермента от соответствующих значений, полученных для предыдущих стадий.

Активность катепсинз С з МЯЛ снижалась на 84,РХ, 88,9% и 93.8Х, а активность катепсняа Ь - на 84, ЭХ, 93,4Ж и 93,7% от уровня контроля, у больных 1М в С1ЭДИИ П, III и IV соответственно. Сравнительный анализ достЬвзр:госгга изменений активности катепсинов С' и I в зависимости.от стадии заболевания и от контрольных значений представлен' на рисунке 3 (С и В соответйтвенко).

. ВГ.ШШ больных укаж^-пыг -кш&ческях групп отмечалось пос-• тепекное достовернЬ» .еи^'ли.1 ср-ч-з.рвей 'активности катвпсина С на 52,27. <р<и,01) я СЗ,Г-1 (р<0,01), рис. 4 С, и

. катепсикаг на 7^,-Г; , (1*3,05) к 82,6Х (р<0Д15),

■.'рис. 4 Б, КО С?)ВШ:с ; с-'.,гт:'Л с^дгл II, III.и IV соот-в«мтвеш;а. Кат« .-с .¡к 3 » "'.'ЛД ;/ ~ЛЗ а стадге? II демонс-

трировав всйвгг.ж« с.-у.сшосгл .»а ЛУ.'л". яодозтоварнов из-га зна--чяеш'яогъ ■ гэяб}*!»? з: и:''', в Ш стод.с*. рзйолевания активность '^-ршета сте^лЕ^ цч0,05), а в IV стадии - на 52;2% (р<0,Ш) по с *гмг/Ч18*га (ряс. 4 А).

С&изшгвшс« трс^-гглпо^ долюв^'Псг е-ь'жеше активности •веех «¡т*- ГШ г 'ПЛ. ' т. .•• ./-V г'уииг;:вто-1 оиухола, у больных -мл п 1 3. С.Еклхнсшс • (1191), ".А.Гу-

реевой (Ю'У:-; и Я..- ..: . • ,:т " : г.Ссги.Еую сте-

пей сяплоая пшяжсст}« 1кп:::п;оп г „дач^еютэх при хроническом по орт :;яг.<?} с друтгя « лим|юпроли$е-ратшших. \'Т<.\н- ч работах данник

I а

0,8

14 0,7

<">

ь 0,6

я 0,5

X

§ ОН

■е 0,3

0,2

О

¡д. 0,1

0

к №

nid Ш

м

А. Катепсин В В. Катепсин L

60 50 40 J0 20 10 О

Л

1 ■

* * *

С. Катепсин С

Контроль

Ш II стад. Ш III стад. О Л/стад.

Рис. 3. Активность ЛЩ1 в ЫЯЛ больных ХЛЛ в зависимости от

стадии ааболевания по-Ral. Примечание: * - достоверность отличия от контроля (р<0,05), ** -достоверность отличия от стадии II (р<0,05). *** - достоверность отличия от стадии III (р<0,05).

~J Контроль

II стад:

ш стад. ЕЗ IV стая

Рис. 4. Активность ЛЦП в ШШ больных ХДЛ в зависимости от

стадии заболевания по Rai Примечание: * - достоверность отличия от контроля (р<0,05), ** - достоверность отличия от стадии II (р<0,05).

' - 11 -

сравнения изучаемого параметра с контрольнами значениями препятствует соотнесению с их результатами данных, полученных нами.

Значительное снижение активности лиаосомальных протеиназ в ШЯЛ у больных ХЛЛ является еще одним свидетельством функциональной недостаточности гранулоцитов при этом заболевании, отмечаемой ранее М.С.Мухадзе (1988), М.Д.Подилъчак (1989).

В целом, учитывая данные А. В.Васильева (1987 - 1991), а также G.Gradenhadt (1991), C.Rey-Mlllet (1993), P.Morton (1995) о необходимости участия системы ЛЦП в процессах формирования иммунного ответа, можно предполагать, что выявленное нами снижение активности ферментов этой- группы как в лимфоцит??, так и в гра-нулоцитах при ХЛЛ мажет оказаться одним из звеньев патогенеза гуморального и клеточного иммунодефицита, характеризующего это заболевание (Т.В.Голосова,1д80; Е.Р.Черных, 1991; S.Mulllgan, 1993; H.Xu, 1993).

При изучении состояния ЛЦП в лейкоцитах больных хроничс ским миелолейкозом в развернутой клинической стадии нами обнаружено • выраженное достоверное снижение активности кагепсинов В, С и L по сравнении с контролем на 85,42, 91,52 и 92,52 , р<0,001 для всех серий (рис. 5). Подученные результаты соотносятся со сведениями о функциональной неполноценности нейтрофидов у таких бальных. Возможно, что ЛЦП, важной ролью которых является активация различных белков путем реакций ограниченного протеолиза участвуют, например,, в биосинтезе Fo и СЗ-рецепторов, недостаточность которых на лейкозных нейтрофюгах (В.И.Шардаков, 1987) мсаит при- . водить к подобного рода нарушениям их функций (Г.В.Голосова, 1980).

В процессе обследования 4 бальных ЯШ, у которых на основании клинических и лабораторных методов исследования состояние расценивалось как переход заболевания в терминальную стадию,

У.1:.

•Д! '¡у

•л'д1?: с А- *

С. Катепсаи С

Контроль | р Значения у больных.

.Рис. 5. Активность ЛЦП в-лейкоцитах больных ХМЦ , Примечание: '* - Доставерность отличия от контроля (р<0,001).

нмаль ч**иа клеток

1.8.1-7- ". 1.0-^77/

имодь Фылы. Влеток

0.9-!: 0.50.4-03 0.20.Ц

• - •

м Ч» •

зо 2010-

е-.

♦ • • *

ВМОДЬ

Ч*млн- кдаоЕ

5.

13023.1'

В.

А. В. . А.- , В. -А.

А Катепсик В В. Кйтепсин С С. Катепсин Ь Рис. б.. Иаменшшэ активности ЛЦП в лейкоцитах у больных ХИЛ

прк переходе заболевания в терминальную стадию. Цркыечание: . . »- активность у больных в развернутой клишгческш стадии . & - активность при переходе заболевания в терминальную стадия егга - интервал нормальных значений ------ - сроднил уровень

сказалось» что этот переход сопряжен со значительным повышением активности катепсина В и, в ыеньией степени, I. и практически на отражается па активности катепсина С (рий. 6).

Поскольку терминальная стадий хронического миелолейкоза принципиально отличается от развернутой клинической и является, па-существу, зозюыоговениет^ острого миелобластного лейкоза на фоке предсудествуйЕ^гр Ш1 (А.И.Воробьев, 1976; К.(аа1е, 1991), наши, результаты хорошо дополняют данные П. В.Антипенко (1987) о повышении активности лигосомального катепсина 0 у больных острым миелобласгТЕым ленкоаоы по 'сравнению. а; кормой как при первом возникновения, так "я пря рецидивах заболевания.

ИСследовэн1й> активности катепсинов В, СЯЬ а пяззмз кроеи у больных хроническими лейкозами пе выявило достоверных изменений указанных параметров по сравнения с контролем ни для одной клинической труппы.

При попытке объяснения возможных механизмов оттаянного нами снижения акаавности ютепеннов - В, С и С в лейкоцитах при хронических кйкоэах необходимо помнить о многоуровневой -системе регуляции активности диаЬсоыаяьиьк 'цисгеиновых • вротеиназ.

Тот факт, что* аарйду с оодучеянш нами снижением активности ЛЦП а литерззуре. иаеатся даннда об' аналогичных изменениях зктив-ности целого ряда кшс лизоссмальшк, Так и вне лвзосомаяьных ферментов различных група (В,-С.Бьш1акщ1а,1991; ..Ы.Е.Преображенс-кая, 1991;" Т.А.Гурееаа» 1363; Л.А.Локдцша-,: 1993) позволяет предположить, что пря.даяюм гкпе патологии нарушен этап белкового синте&а и, возможно, " рранепорта фермгнтов в лизосомы. Однако, поскольку активность - катепеияа В снижалась в значительно меньшей степени по сравнению'со сходными с ним но принадлежности к семейству катепеинаыи С и ш считаем, что наряду , с вышеописан-

- и -

ными механизмами при данной патологии играет роль повышение концентрации в клетке белковых ингибиторов цистеиновых протеиназ. Ваше предположение основывается' на знании, что катепсин В в силу особенностей активного центра (D.Musil, 1991) слабо связывается с ингибиторами, в то время как -даже небольших концентраций последних оказывается достаточно для прочного угнетения катепсцнор С (А.В.Васильев, 1991) и L (W.Machlelût, 19Э2), и подтверждается данными К. В.Голубевой (199Q) и Г.А.Гуреевой (199-1), обнаруживших в лимфоцитах при XJ0I ингибиторы цистеиновых протеиназ.

Динамика снижения показателей активности ЛЦП в лейкоцитах по мере прогрессирогания хронического лимфолейкоза может быть вызвана либо повышением концеягращи в них ингибиторов, либо нарастанием доли лэйкоако поврежденных лейкоцитов в общем пуде,

Еарастание активности кагег.синов В и L, в лейкоцитах при яе-реходе 7Ш в терминальную фазу, может быть СЕязано со сверхэкспрессией генов этих ферментов, что уже описано для ряда других злокачественных новообразований (M.Murnane, 1991; L.Paulirra, 1991; Q.Gong, 1993;).

Наши данные укладываются в систему постепенно развкващихся в настоящее время представлений об учзетщ лигссомальных цистеи-вошх протеиназ не только s процесса}: щщадки и ыетастазироЕания ■ злокачественных опухолей, но и в на^аных этапах онко:-енной трансформации клетки (Э.А.Дмяакян, 1991. 1994; Л. А. Легаша, 1991), причем для этих зтадов важным/шляется именно ек:асв; se активности ЯЩ (Q.Sun, 1989; V.Turk, 1991).

2. Сравнительная оценка состозшия лизосомальных цистешювих протеиназ у больных хроническими лейкозами в процессе химиотерапии.

*

. Применение хкмиопрепаратов гидроксимочевины у больных ■ хро-

ническим миелолейкоаш, приводя к выраженной нормализации клеточного состава периферической крови и уменьшению размеров печени и селезенки, не вызывало достоверных изменений активности ка-тепсйнов В, С и Ьв лейкоцитах данной группы больных, несмотря н& некоторую тенденцию к повышению рассматриваемых показателей (таблица 1).

Таблица 1

Изменение активности ЛЦП в лейкоцитах больных ЯШ под влиянием препаратов гидроксимочевины

1—:-1-г

На фоне] |

*1-1

РЗ

Показатель|Контроль| До лечения

I I

I (п-25) | (п-21)

-1-1-^

Катепсин В| |

нмоль/ч* |0,999 |0,148 *10бклет<ж| * 0,103| ± 0,052

.1 • I

Катепсин С| I

нмоль/ч* |79,01 16,720

*10®клеток|4 7,60 |± 1,640-

I I

Катепсин Ц |

нмоль/ч* |0,910 |0,068 *10®клеток|4 0,130 |± 0,016

терапии (п-21)

Р1 I Р2

0,153 ± 0,078

12,96 ± 3,81

0,171 ± 0,052

< 0,00Ц< 0,01

> 0,05

< 0,001|< 0,01

I

< 0,0011< 0,01

> 0,05

> 0,05

Примечание: Р1 - больные до лечения в сравнении с контролем;

Р2 - больные после лечения в сравнении с контролем;

РЗ - больные после лечения по сравнению с состоянием до лечения.

Влияние псшшшиотерапии ХЛЛ сочетанием циклофосфана, винк-ристина и преднизалона на-активность диаосомалькых цистеиновых катепсинов в МЯЛ и ПМЯЛ таких больных продемонстрировано в таблице 2. Как видно иа таблицы, этот вид терапии вызывает дальнейшее снижение активности ферментов'в лейкоцитах, га исключением катепсинов В и L в III стадии, причем во II стадии заболевания эти изменения были достоверны в ШК по сравнению с состоянием до лечения.

Таким образом, несмотря на клинико-гематологическую эффективность химиотерапии- хронических лейкозов, это влияние оказалось не сопряжено с "исправляющим" действием на состояние системы ЛЦП.

В связи с выявленной в данной работе тенденцией к снижению • активности ЛЦП & лейкоцитах больных хроническими лейкозами, нами была сделана попытка проследить один из возможных механизмов та-, кого рода изменении.

Поскольку одним иа путей регуляции активности ЛЦП является -их существование в форме неактивных предшественников, активируемых ферментами собственного семейства (A.Rowan, 1992), нами проведен сравнительный анализ степени нарастания активности катеп-еина L в гомогенате лейкоцитов после преинкубацки в условиях, необходимых для действия ЛЦП (соответствующее ькаае^ле уА, присутствие доноров SH-групп). Катепсин L был избран в связи с наибольшей степенью снижения его активности во всех кашшчеекгс: группах.

Обнаруженная вами большая степень нарастания активности ферментов в леикозно поврежденных лейкоцитах как при ХЛЛ, так и при XMJI по сравнению с соответствующими значениями для здоровых лиц (рис. 7 В, Е) скорее всего свидетельствует о том, чт° при

Таблица 2

Влияние СОР- полихишотералии на активность лизосомальных цистеи-новых протеиназ у большое ХЩ в стадии II (1), III (2) и IV (3).

Показатель

МЯЛ

Кон - | До ле-троль | чения

После лечения

ТШЛ

-1-

Кон - | До де-троль | чения

После лечения

1.

Натепсин В

Катепсин С

Натепсик L

О.бСШ 10,419* * 0*071 |0,062

I

52,24±|7,880± * 5,90 |1,560

I

0,759±|0,117± * 0,120 |0,021

0,186± * 0,049 **

3,450± * 0,790 **

0,039± * 0,008 **

0,999±|1,905± 0,103 10,717 I

79,01±|37,79± * 7,60 | 7,75

I

0,910±|0,251± * 0,130 |0,500

0,В13± 0,228

21,53± * 3,99

0,176+ * 0,041

-Ч-

0,609±|0,319+ * 0,071 10,035 I

52,24+15.790+ * 5,90 1:1,870 . .1 О,75&±|0,0504 * 0,120 ¡0,014

+

Катепсин В

Катепсин С

Катепс-кн L

0,325t * 0,053

3,190+ * 0,720 .

0,068± * 0,017

О,999i10,700* 0,103 |0,164

I

79,01±|12,38± * 7,60 | 3,92

I

0,910±10,145± * 0,130 |0,025

0,769+ 0,190

5,937i * 1,119

О,163± * 0,054

3.

Катепсин В

Катепсин С

Катепсин L

0,609±|Q,127i.* 0,071 |0,028 .

i

52,24± 13,S4Q± 5,90 11.330

I

0,759±|0.039i * 0,120 10,011

Q;106± * 0.036

QiSZtt* 0.480

0,021± * 0,009

0,999±|0,475± * 0,103 10,075 I

79,01±|8,850± * 7,60 13.870

I

0,910±|0,158i * 0,130 |0,040

0,214+ * 0,143

3,440+ * 0.980

0,132± * 0,038

Примечание: * - достоверность изменений по сравнению с контролем? ** - достоверность изменений после лечения по сравнению с. состоянием до лечения. Активность ферментов выражена в нмоль/ч*10б клеток.

700-

Рис. 7. Сравнительный анализ степени возрастания активности катепсйна Ь в гомогецатах лейкоцитов здоровых лиц и боль них хроническими леикозами после 15 мин преинкубации (37 °С, рН 5,5).

Примечание: А - ШЕ здоровых лиц; В - МЯЛ больных ХШ1 при поступлении в стационар; С - МНЯ больных ХЛЛ на фоне химиотерапии; и - ШЯЛ здоровых лиц; Е - лейкоциты больных ЖИ при поступлении; Р - леикоциты больных ХШ1 на фоне лечения.

По оси ординат - активность катепсйна I. (и % о? уровня активности в соответствующем типе клеток бег ареш^убацик) * - достоверность отличия от контроля (р < 0,05) ** - достоверность отличия от состояния до гечеюк (р < 0,05).

изучаемых заболеваниях большая, чем в норме, доля катепсина L находится в форме профермента, нуждающегося в нротеолитической активации представителями семейства ЛЦП. Это дополняет данные Э.А.Дилакян (1991, 1994) и В.Тгоеп (1988), полученные для онко-генно трансформированных мышиных фибробластов.

Достоверное снижение степени нарастания протеолитической активности катепсина L в лейкозных клетках под влиянием химиотерапии (рис. 7, С и F) говорит, возможно, об угнетении цитостати-ческими средствами синтеза ферментов, из-за чего исчерпываются проферментные формы существования катепсина.

В целом определение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ лейкоцитов при хронических лейкозах дает информативные результаты и может быть использовано в качестве одного из диагностических и, возможно, прогностических критериев указанных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. МЯЛ и ГШ периферической крови в норме существенно раздаются с.чпченнямй суммарной активности катепсинов В и С, ito связано, по-пкдймому, с различной функцией этих клеток в ор-анизме. Наибольшая активность указанных ферментов наблюдается в МЯЛ.

2. Для хронического лиыфолейкоаа характерным является выра-энное угнетение суммарной активности лизосомальных цистеиновых ротеиназ как в МЯЛ, так и в.ПШШ. При этом активность катепси-)в С и L снижается гораздо значительнее, чем катепейна В.

3. Прогрессировать хронического лимфолейкоза сопровождает-[ постепенным снижением активности описываемых ферментов в за-сжлости от стадии заболевания по Ral. Темп снижения активности тепсинор. в МЯЛ оказался более высоким, чем в ПМЯЛ.

- 20 -

4. В лейкоцитах больных хроническим миелолейкозом в вывернутой клинической стадии отмечается выраженное и равномерное снижение активности катепсинов В, С в L по сравнению с крнтрагь-ными значениями.

5. Переход развернутой клинической стадии хронического мие-лолейкоза в терминальную знаменуется резким возрастанием суммарной активности катеасина В в лейкоцитах вплоть до контрольных значений и их превышения. Активность катепсина L приатом танке повышалась, хотя и не столь значительно, катепсина С - практически не менялась.

Б. При обоих типах хронических лейкозов достоверных изменений значений активности катепсинов В, С и L в плазме крови не обнаружено.

?. При сценке степени .протеодихичеекой активации катепсина L выявлено некоторое ее нарастание в лейкозных клетках по сравнению с соответствующим контролем, которое практически полностью снималось под влиянием химиотерапии.

8. Полихнмиотерапия КШ1 по схеме СОР приводила к дальнейшему снижению суммарной активности катепсинов В, С и L i МЯЛ во II. стадия заболевания, суцзегвепно не отражаясь на состоянии проте-олиза в лейкоцитах у больных в III и IV стадиях. Препараты гвд-роксимочевины, приводя к значительному кяинико-гематолс-гшеско^ улучшению состояния больных ШД, не даааьтгшг влияния на аиткв-кость ЛЦП в лейкоцитах.

. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЁКОЫЕВДАЦЙИ Рекомендуется учитывать различия в состоянии суммарной активности катепсинов В, С между фракциями ШЛ и 1ШЯЛ периферической крови при дальнейших исследованиях состояния ЛЦП в лейкоцитах.

2. Предложенная наш модификация метода разделения лейкоцитов при хроническом лимфолейкозе проста в исполнении и мояет вить рекомендована для широкого использования в клинических лабораториях.

3. Изменения активности лиэосомальных цистеиновых протеиназ в лейкоцитах могут быть испольаованы в качестве одного из критериев прогрессировали хронического лимфолейкоза.

4. Динамическое исследование активности гатепсина В в лейкоцитах больных хроническим ыиедолейксзом может быть предложено для прогнозирования и диагностики перехода заболевания а терминальную стадйв.

5. Использованный в работе метод определения степени проте-олитической активации катепсйна L модно рекомендовать к применений а научных исследованиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Борискина U. А. Активность лизосомавьных цистеиновых про- . ТеййаЗ в лейкоцитах и плазме крови доноров // Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов: Tea. дскл. Всерос. на-уч.'практ. конф.- Рязань, 1995.- С. 32

2. Бсфискина Ы.А. Изменение активности катепсйна С у больных хроническим лгафолейкозом //Современные аспекты экспериментальной и клинической фармакотерапии.- Рязань, 1998;- С. 3 - 6

3. Борискина Ы. А. Изменение активности катепсйна В в лейкоцитах больных хроническим ликфодейкозом а динамика . лечения // Гормональная регуляция метаболизма в норме я при патологий.- Рязань, 1996.- С. 45 - 47

4. БорискИна U.R., Строев Е.А. Сравнительный анализ активности

катепсйна L в различных, фракциях лейкоцитов у больных хроничеб-

КИМ лимфолейкогом И Вопросы диагностики и коррекции физического состояния организма.- Рязань, 1995.- С. 6 - 9 5. Строев Е.А., Борискша Ы.А. Наделение различных фракций лейкоцитов из периферической крови.у больных хроническим лимфслей-козок: Методические рекомендации.- Рязань: В.и., 1996.- 10 с.

Шмд М 08 Ш

Рхзкедкнстатут. Ротапринт. Ззпз т«р»ж$$ екз.