Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их агрегационной и адгезионной активностью

Дуплякин, Евгений Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их агрегационной и адгезионной активностью
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их агрегационной и адгезионной активностью"

УДК 612.111.7:^535.321:57.087.27] 612.111.7:57.033

Дуплякин Евгений Олегович

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ ОПТИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ИХ АГРЕГАЦИОННОЙ И АДГЕЗИОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

03.00.02-Биофизика 14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов Росздрава и кафедре Физики живых систем Московского физико-технического института (государственного университета)

Научные руководители:

доктор биологических наук (03.00.02), профессор Севастьянов Виктор Иванович доктор биологических наук (14.00.41) Розанова Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат физико-математических наук

Иткин Георгий Пинкусович Василец Виктор Николаевич

Ведущая организация:

Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева РАМН

Защита диссертации состоится « » ^ _2005 г. в часов

на заседании Диссертационного совета К 212.156.03. при Московском физико-техническом институте (ГУ) (141700, г Долгопрудный, Институтский пер, д. 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института (ГУ).

Автореферат разослан « /У»

2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 212.156.03, кандидат физ.-мат. наук

Братин В. Е.

/Г/*/

Актуальность темы

Гемосовместимость материалов и изделий медицинского назначения во многом определяется реакцией тромбоцитов на чужеродную поверхность, т.к. именно эти клетки играют важную роль в поддержании гемостаза и сохранении агрегатного состояния крови. Традиционно функциональное состояние тромбоцитов связывают с протекающими при изменении окружающей среды процессами адгезии, агрегации и высвобождения внутриклеточных биологически активных компонентов. Так, например, адгезия клеток на поверхность имплантата провоцирует реакцию высвобождения тромбоцитарных факторов во внеклеточное пространство, в том числе индукторов агрегации. Это приводит к активации не адгезированных тромбоцитов, что сопровождается интенсификацией процессов адгезии клеток, а также их агрегацией на поверхности и в объеме.

Несмотря на прогресс в изучении механизмов активации тромбоцитов, процессы, протекающие при контакте этих клеток с чужеродным материалом до конца не изучены. В значительной степени это связано с ограниченностью, трудоемкостью и иногда недостаточной информативностью имеющихся методологических подходов к изучению свойств и реакций тромбоцитов. В связи с тем, что регистрация активации тромбоцитов в реальном масштабе времени трудно осуществима, функциональное состояние тромбоцитов обычно исследуется до и после того или иного воздействия.

Одним из наиболее информативных методов является исследование характера адгезии клеток с помощью сканирующего электронного микроскопа, что дает возможность одновременно изучать количество и морфологию адгезированных тромбоцитов. Однако эти два параметра не всегда дают полную информацию об изменениях функционального состояния тромбоцитов. Так, например, в потоке, при наличии напряжения сдвига, на поверхности материала не всегда удается найти адгезированные тромбоциты. При этом активированные поверхностью тромбоциты могут накапливаться в циркулирующей крови и состояние клеток, таким образом, будет отличным от исходного. Помимо этого, активированные контактом клетки могут иметь большую адгезионную активность, что может реализоваться в образовании тромбов в застойных зонах.

Широко распространенным методом анализа свойств тромбоцитов, проявляемых в объёме жидкой фазы, является изучение их агрегационной активности. В основе метода лежит регистрация увеличения светопропускания суспензии тромбоцитов под действием физических или химических индукторов. Эффект увеличения светопропускания объясняют уменьшением количества рассеивающих объектов с одновременным увеличением их размеров вследствие агрегации тромбоцитов. Однако изменение светопропускания может быть связано не только с изменением количества рассеивающих объектов, а и с изменением оптических свойств (среднего объема и коэффициента преломления) единичных клеток.

Методика, разработанная в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава, позволила привлечь метод лазерного дифраки среднего

3 СЯе

О»

3=£й

объёма и коэффициента преломления тромбоцитов в суспензии клеток с известной концентрацией Полноценное использование оптических характеристик тромбоцитов в качестве параметров оценки их функционального состояния невозможно без понимания их взаимосвязи с такими хорошо изученными свойствами клеток, как агрегация и адгезия, что и обусловливает актуальность данной работы.

Необходимость проведения подобного исследования объясняется еще и тем, что в дальнейшем это, позволит сопоставить степень активации клеток с изменением их оптических характеристик, и, таким образом, появится возможность использования оптических характеристик, как дополнительных параметров активации тромбоцитов.

Целью работы является исследование взаимосвязи между адгезионными, агрегационными свойствами тромбоцитов и их оптическими характеристиками в условиях in vitro. Задачи исследования

Исходя из поставленной цели, основные задачи работы сводились к следующему:

1. Найти оптимальные экспериментальные условия активации тромбоцитов, позволяющие регистрировать изменения их среднего объёма и/или коэффициента преломления;

2. Исследовать в условиях in vitro влияние поверхности синтетических полимерных материалов и индуктора агрегации тромбоцитов аденозиндифосфата (АДФ) на оптические характеристики тромбоцитов;

3. Исследовать взаимосвязь между оптическими характеристиками активированных тромбоцитов, их агрегационной и адгезионной активностью;

4. Продемонстрировать возможность использования оптических характеристик тромбоцитов как параметров, отражающих активацию клеток.

Научная новизна

1. Определены экспериментальные условия активации тромбоцитов чужеродной поверхностью или добавками АДФ, не приводящие к уменьшению концентрации клеток за счет процессов их агрегации и позволяющие по картине светорассеяния вычислять оптические характеристики тромбоцитов.

2. В условиях in vitro доказано влияние поверхности полимерных материалов в условиях потока и медленного перемешивания на коэффициент преломления тромбоцитов человека.

3. Обнаружено, что добавки АДФ в малых концентрациях приводят не только к первичной агрегации тромбоцитов в суспензии, но и изменяют оптические характеристики клеток.

4. Установлена взаимосвязь между оптическими параметрами активированных чужеродной поверхностью или добавками АДФ тромбоцитов и изменением их адгезионных и агрегационных свойств.

5. Показана возможность использования коэффициента преломления тромбоцитов в качестве параметра, прогнозирующего изменения их адгезионных и агрегационных свойств.

Практическая значимость

Разработана методика, позволяющая регистрировать изменение оптических характеристик тромбоцитов в режиме реального времени при контакте с поверхностью материала в условиях потока. Показано, что методика обладает достаточной чувствительностью для того, чтобы определять разницу в степени активации тромбоцитов при контакте с различными полимерами.

Исследовано влияние времени контакта с поверхностью материала на средний объём и коэффициент преломления тромбоцитов человека.

Исследована и установлена взаимосвязь между оптическими характеристиками тромбоцитов и их агрегационной и адгезионной активностью в различных модельных системах: малые добавки АДФ, контакт с поверхностью полимерного материала в условиях перемешивания и в условиях потока.

Проведена апробация возможности оценки активации тромбоцитов пациентов по степени изменения коэффициента преломления тромбоцитов до и после использования аппарата искусственного кровообращения (АИК) при операциях на открытом сердце.

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы были представлены на следующих семинарах и конференциях:

межинститутские семинары Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИ

Трансплантологии и искусственных органов Росздрава (2002 г., 2003 г., 2004 г.),

XLVI Научная конференция МФТИ, 2003,

XI научно-техническая конференция с участием зарубежных специалистов «Вакуумная наука

и техника» (сентябрь 2004 г., Судак, Украина),

XXXth Annual Congress of the European Society for Artificial Organs (ESAO) (September 3-6

2003, Aachen, Germany),

XXXIth Annual Congress of the European Society for Artificial Organs (ESAO) (September 8-11

2004, Warsaw, Poland),

Публикации

Результаты проведённых исследований отражены в 8 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом.

Структур» и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, трёх глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключения и выводов. Диссертация изложена на 90 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 17 таблиц, список литературы из 84 наименований, из них 13 российских и 71 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы в методы Материалы

- полиэтилен низков плотности (ПЭНП) в виде плёнок, ГОСТ 10354-82, партия 65, толщина 60 мкм, ЗАО Синпласт, Россия;

- трубки силиконовые (CP) медицинские марки ТСМ, ТУ 9436-004-18037666-94, с внутренними диаметрами 2 и 5 мм;

- трубки из поливинилхлорида (ПВХ) медицинские марки ПМ - 1/42, ТУ 64-2-286-79, с внутренними диаметрами 2 и 5 мм;

- пластиковые (ПВХ) трёхкомпонентные контейнеры для сбора и хранения компонент крови PL-146 (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, США) объёмом 500 мл содержащие 50 мл (3.8 % цитрата натрия) в качестве антикоагулянта;

- физиологический раствор для инфузий - натрия хлорид 0.9%.

- 155 цМ раствор АДФ в физиологическом растворе (Adenosine 5'-Diphosphate, чистота 98%, М=427.2, SIGMA CHEMICAL CO., США);

- силиконизирующий раствор хлорированного органосилаксана в гептане - SIGMACOTE® (SIGMA CHEMICAL CO., США);

- 2.5% раствор глутарового альдегида в физиологическом растворе для фиксации адгезированных на поверхности ПЭНП тромбоцитов.

Методы исследования

Измерение концентрации тромбоцитов

Концентрацию тромбоцитов (Nabx)> определяли с помощью автоматического 18-параметрического гематологического анализатора "АВХ Micros 60" (HORIBA АВХ - France, Франция), производящего подсчёт клеток на основе импедансного метода. Для одного измерения требуется около 20 мкл образца При определении концентрации тромбоцитов в одной пробе производили не менее трёх измерений.

Определение среднего объёма и коэффициента преломления тромбоцитов Средний объём и коэффициент преломления тромбоцитов определяли на лазерном дифракционном анализаторе дисперсионного состава суспензий "Mastersizer Micro" ("Malvern Instruments Ltd", Великобритания) по следующей схеме:

1. Приготовление суспензии клеток с концентрацией (1-5)104 кл./мкл путём разведения плазмы обогащенной тромбоцитами (ПОТ) физиологическим раствором в силиконизированном стеклянном бюксе объёмом не менее 10 мл. Оптимальное разведение - 1 мл плазмы ПОТ и 9 мл физиологического раствора. Забор исследуемого образца в шприц объёмом не менее 10 мл.

2 Медленное заполнение измерительной ячейки лазерного дифракционного анализатора измеряемым образцом из шприца. Не менее 3-х повторных измерений углового распределения рассеянного на тромбоцитах света с последующим сохранением результатов.

3. Восстановление распределений тромбоцитов по размерам из картины светорассеяния для набора презентаций. Условия- мультимодальная модель анализа, коэффициент преломления среды ПсР = 1.33, индекс поглощения х = 0, коэффициенты преломления тромбоцитов п = 1.357; 1.370; 1.390; 1.417; 1.456.

4. Вычисление среднего объёма и концентрации тромбоцитов из полученных распределений тромбоцитов по размерам для выбранных коэффициентов преломления. СОТ и концентрацию тромбоцитов при ПсР = 1.33, х = 0, и = 1.357; 1.370; 1.390; 1.417; 1.456 вычисляли с помощью программ описанных выше.

5. Построение графиков в координатах [концентрация тромбоцитов - и] и [я - СОТ]. Определение коэффициента преломления тромбоцитов (пц) по точке пересечения расчётной кривой [п - концентрация тромбоцитов], построенной для набора презентаций, с горизонтальной прямой концентрация=Кдвх - экспериментально полученным значением концентрации тромбоцитов. Определение среднего объёма тромбоцитов по точке пересечения расчётной кривой [и - СОТ], построенной для набора презентаций, с вертикальной прямой п = щ.

Исследование агрегации тромбоцитов

Исследования агрегационной активности тромбоцитов производились при помощи лазерного агрегометра "Aggregation analyzer 220LA" (Biola Ltd, Москва). Для исследования агрегационной активности клеток исследуемый образец в силиконизированной стеклянной кювете помещали в измерительную ячейку агрегометра. Непосредственно после начала регистрации сигнала светопропускания в объём исследуемой пробы добавляли АДФ в необходимой концентрации. Используемые в работе концентрации АДФ составляли 5.0 и 0.5 цМ соответственно. Для количественного описания процесса активации под действием АДФ концентрацией в работе использовали значение светопропускания при выходе на стационарное значение - плато, называемой степенью агрегации и выражаемой в %. Исследование адгезии тромбоцитов

Образцы ПЭНП инкубировали с тромбоцитарной плазмой в статических условиях 15 минут, фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида и обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающих концентраций. Визуализацию адгезироваяных клеток проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM Т-ЗЗО (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 5 кВ и увеличениях до х2000 - 3500.

На поверхности каждого образца произвольным образом выбирали 30 полей размером 28x28 мкм при увеличении х3500 с общей площадью 24000 мкм2 (30 полей размером 49x49 мкм2 при х2000 с общей площадью 72000 м км2) и подсчитывали количество объектов в каждой из двух выделенных морфологических групп (рисунок 1): одиночные неактивированные клетки (1) и

клетки с псевдоподиями (2), которые классифицировали как слабо

активированные формы, полностью распластанные тромбоциты (3) и агрегаты (4), которые классифицировали как сильно активированные формы.

Рисунок 1. Разделение адгезированных тромбоцитов по морфологическим признакам: 1, 2 - слабо активированные клетки, 3, 4 - сильно активированные клетки.

Для каждого образца суммировали по всем полям общее количество объектов (Н*щ), а также количество сильно (Ыс„) и слабо (Ысл) активированных форм. Для количественной оценки адгезионной активности клеток вычисляли относительный показатель адгезии тромбоцитов ОПАТ = м"кг/н""прол' как для общего количества клеток, так и для сильно и слабо активированных форм.

Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их адгезионной и агрегационной активностью

Схему исследования взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их адгезионной и агрегационной активностью в упрощённом виде можно представить следующим образом:

1. Исследование адгезионных, агрегационных свойств тромбоцитов человека, их концентрации и оптических характеристик непосредственно после выделения тромбоцитов (контроль).

2. Активация тромбоцитов: добавки 0.5 цМ АДФ, контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров (1 ч.), контакт ПОТ с поверхностью ПВХ и СР трубок в условиях медленного перемешивания (2 часа), контакт суспензии тромбоцитов с малой концентрацией с поверхностью ПВХ и СР трубок в условиях потока (до 3 ч.).

3. Исследование адгезионных, агрегационных свойств тромбоцитов человека, измерение их концентрации и вычисление оптических характеристик после активации. Эксперименты, в которых наблюдались значимые различия для значений концентрации тромбоцитов до и после активации, исключались из рассмотрения.

4. Сопоставление параметров гемостатической активности и оптических характеристик клеток тромбоцитов до и после активации клеток.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных и построение диаграмм и графиков проводили с помощью программы Microsoft Excel®, используя встроенные функции и пакет анализа. Данные в таблицах и на диаграммах представляли в виде среднее значение±стандартное отклонение (пЗ -повторные обсчёты одного образца). Для проверки гипотезы о различии средних значений концентрации клеток (Nabx), степени агрегации (I), общего количества адгезированных тромбоцитов (NoeuO, количества сильно (Ncll) и слабо (Nc„) активированных форм клеток, коэффициента преломления (в) и среднего объёма тромбоцитов (СОТ) до и после активации использовали парный двухвыборочный t-тест Стьюдента с уровнем надежности р^).05. Для количественной оценки взаимосвязи между параметрами, изменяющимися при активации, проводили корреляционный анализ и вычисляли коэффициенты корреляции между следующими величинами: Дп = пюетроль - tw, ДСОТ = СОТкотрШ1ь - СОТшсг с одной стороны И AI ~~ Iконтроль — 1ахт И ОПАТ с другой.

Результаты и их обсуждение

Добавки АДФ

В первой серии из 9 экспериментов исследовали влияние воздействия АДФ в малых концентрациях и напряжения сдвига на средний объём, коэффициент преломления тромбоцитов и их адгезионную и агрегационную активность.

После добавки АДФ в концентрации 0.S цМ наблюдается уменьшение коэффициента преломления тромбоцитов во всех 9 экспериментах. Усреднённое по всем экспериментам уменьшение среднего объёма клеток составило 12%.

Степень агрегации, отражающая агрегационную активность тромбоцитов, снижалась после добавки АДФ в концентрации 0.5 цМ по сравнению с контрольными клетками на 28%.

Адгезионная активность тромбоцитов после добавок АДФ в концентрации 0.5 цМ выше, чем для контрольных клеток. Имеется тенденция к увеличению общего количества адгезированных тромбоцитов. Анализ классов адгезированных клеток позволяет установить, та) после активации тромбоцитов появляется большее количество сильно активированных форм на поверхности: распластанных и агрегатов. Количество слабо активированных тромбоцитов на поверхности изменяется незначительно. Наблюдающееся, таким образом, увеличение общего количества адгезированных объектов, происходит лишь за счёт увеличения количества сильно активированных форм клеток.

В результате статистической обработки были выявлены значимые различия для значений коэффициента преломления, среднего объёма тромбоцитов, степени агрегации а так же общего количества и количества сильно активированных форм тромбоцитов на поверхности эталонного материала до и после активации. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты парного двухвыборочного ^теста Стъюдеята с уровнем надёжности р«0.05 дам

показатель контроль 0.5 цМ АДФ результат (-теста (различие)

и 1.389±0.001 1.380±0.005 значимо

СОТ.мюг* 5.7±0.6 5.0±0.4 значимо

Ыобщ, шт/25000 мкм2 234±22 260±29 значимо

Н;,,, шт/25000 мкм2 124±29 155±38 значимо

Ыс„, шт/25000 мкм* 110±23 105±25 не значимо

1,% 70±11 42±16 значимо

1.60 1.50 1.40

| 1.30 О

1.20 1.10

Рисунок 2. Корреляционная зависимость между

относительным показателем адгезии сильно активированных форм клеток ОПАТсн и уменьшением коэффициента преломления тромбоцитов Ли после их активации при добавке 0.5 рМ АДФ.

1.00 0.000

0.005

0.010 ДП

0.015

0.020

Рисунок 3. Корреляционная зависимость между

уменьшением коэффициента преломления тромбоцитов Ал и уменьшением степени агрегации клеток Д1 после активации при добавке 0.5 цМ АДФ.

0.020

Из рисунков 2 и 3 видно, что при активации тромбоцитов добавками 0.5 цМ АДФ наблюдается значимая положительная корреляция между уменьшением коэффициента преломления клеток и увеличением их адгезионной активности с одной стороны (г = 0 96) и уменьшением агрегационной активности тромбоцитов (г = 0.97), с другой.

Контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров

Во второй серии из 5 экспериментов исследовалось влияние часового контакта в условиях медленного перемешивания с поверхностью тромбоцитарного контейнера изготовленного из ПВХ на средний объём, коэффициент преломления тромбоцитов и их адгезионную и агрегационную активность.

После хранения в тромбоцитарном контейнере в течение часа наблюдается уменьшение коэффициента преломления тромбоцитов во всех 5 экспериментах. Средний объём тромбоцитов не имеет однозначной тенденции в изменении, при усреднении же, значимо не изменяется.

Степень агрегации, отражающая агрегационную активность тромбоцитов, снижается после хранения в контейнере по сравнению с контрольными клетками на 27%.

Адгезионная активность тромбоцитов после хранения в тромбоцитарном контейнере в течение 1 часа выше, чем для контрольных клеток. Имеется тенденция к увеличению общего количества адгезированных тромбоцитов. Анализ классов адгезированных клеток позволяет установить, что после активации тромбоцитов появляется большее количество сильно активированных форм на поверхности эталонного материала: распластанных и агрегатов. Количество слабо активированных тромбоцитов на поверхности уменьшается, что и обуславливает небольшое увеличение общего количества адгезированных объектов, происходящее лишь за счёт увеличения количества сильно активированных форм клеток.

После часового контакта с поверхностью тромбоцитарных контейнеров значимо изменяются все характеристики адгезии тромбоцитов, агрегационная активность клеток и их коэффициент преломления (таблица 2).

Таблица 2

Результаты парного двухвыборочного ^теста Стьюдента с уровнем надёжности р*0.05 для

показатель контроль 1 час хранения результат Ьтестя (различие)

п 1.388±0.001 1.381±0.003 значимо

СОТ, мкм* 5.7±0.4 5.б±0.б не значимо

Иобщ, шт/25000 мкм2 237±30 263±39 значимо

Ыс, шт/25000 мкм7 118±27 160±39 значимо

Ксл, шт/25000 мкм7 120±11 103±13 значимо

1% 66±15 39±12 значимо

Значимая корреляция, однако, наблюдается лишь между уменьшением коэффициента преломления тромбоцитов и относительным показателем сильно активированных форм адгезированных тромбоцитов с коэффициентом г = 0.87 (рисунок 4).

Таким образом, активация тромбоцитов в результате их кратковременного хранения в тромбоцитарных контейнерах сопровождается уменьшением коэффициента преломления клеток, при этом происходит увеличение их адгезионной активности.

Рисунок 4. Корреляционная зависимость между

уменьшением коэффициента преломления тромбоцитов Лл и относительным показателем адгезии сильно активированных форм клеток ОПАТс после 1 часа хранения в тромбоцитарных контейнерах.

В этой серии из 7 экспериментов исследовалось влияние двух часового контакта в условиях медленного перемешивания с поверхностью трубок, изготовленных из ПВХ и СР на оптические и гемостатические характеристики тромбоцитов.

Средние значения, коэффициента преломления (и) и среднего объёма (СОТ) до и после контакта, а так же различия между этими величинами до и после активации, приведены в таблице 3.

Таблица 3

Средние значения СОТ и п тромбоцитов до и после контакта с поверхностью ПВХ и СР трубок и различия между ними по критерию Стыодента с уровнем надёжности рд0.05 (п=7)

контроль ПВХ СР контроль ПВХ СР

СОТ,мкм3 п

5.5±0.6 | 5.7±0.7 5.5±0.б 1.389±0.001 | 1.382±0.002 1.377±0.003

результат 1-теста, (различие) не значимо значимо

не значимо значимо

| не значимо | значимо

1.70 ч

г=0.87

1.60 1 р=0.05

1.50 п=5

Й 1.40 \

с о 1.30 -

1.20 -

1.10 -

100 -

0.005

0.01

ДП

Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и СР

После контакта с поверхностью материала наблюдается уменьшение коэффициента преломления тромбоцитов во всех 7 экспериментах. Средний объём тромбоцитов не изменяется.

Таблица 4

Значения степени агрегации тромбоцитов при добавке 5.0 цМ АДФ

контроль ПВХ СР

72±11 37±15 2б±13

результат ^теста (различие), п=7, р 5 0.05 значимо

значимо

| значимо

Результаты исследования агрегационной активности тромбоцитов до и после контакта с поверхностью ПВХ и СР трубок приведены в таблице 4.

Степень агрегации, отражающая агрегационную активность тромбоцитов, снижается после 2 часового контакта с поверхностями ПВХ и СР.

Результаты исследования адгезионной активности тромбоцитов до и после контакта с поверхностью материалов приведены в таблицах 5 и 6.

Адгезионная активность тромбоцитов увеличивается после контакта с поверхностями как для СР так и для ПВХ Имеется тенденция к увеличению общего количества адгезированных тромбоцитов (таблица 5).

Анализ классов адгезированных клеток (таблица б) позволяет установить, что после активации тромбоцитов появляется большее количество сильно активированных форм на поверхности: распластанных и агрегатов. Количество слабо активированных тромбоцитов на поверхности изменяется незначительно в случае контакта с поверхностью ПВХ и в сторону уменьшения в случае контакта с поверхностью СР. Таким образом, и в данном случае увеличение общего количества адгезированных объектов, происходит преимущественно за счёт увеличения количества сильно активированных форм клеток.

Таблица 5

Значения общего количества адгезированных тромбоцитов (Иобщ)

контроль ПВХ СР

N общ, шт./25000 мкм2 23б±34 281±38 307±30

результат ^теста (различие), п=7, р=0.05 значимо

значимо

| значимо

Таблица 6

Усреднённые значения общего количества слабо (Мсл) и сильно (На,) активированных форм клеток и различия между ними по критерию Стьюденга с уровнем надёжности ра0.05 (п=7)

контроль ПВХ СР контроль ПВХ СР

N сл. штЛ5000 мкм2 шт./25000 мкм1

125±18 | 121±24 108±24 111±36 | 160±42 199±40

результат М-ест», (различие) не значимо значимо

значимо значимо

| не значимо | значимо

Из рисунков 5 и б видно, что в результате 2-х часового контакта с поверхностями полимерных материалов происходит активация тромбоцитов, при этом наблюдается значимая положительная корреляция между уменьшением коэффициента преломления клеток и увеличением их адгезионной активности с одной стороны в случае контакта с обоими материалами с коэффициентами г = 0.91 и 0.92 для СР и ПВХ соответственно и уменьшением агрегационной активности тромбоцитов (корреляция в этом случае слабая, но всё-таки она

отражает тенденцию уменьшения агрегационной активности при уменьшении коэффициента преломления клеток).

Таким образом, активация тромбоцитов, вызванная контактом с чужеродной поверхностью, выражается в уменьшении коэффициента преломления клеток, при этом происходит увеличение адгезионной активности и уменьшение агрегационной активности тромбоцитов.

г=0 75 (СР) г=0.54 (ПВХ) р=0.05 п=7

Рисунок 5. Корреляционная зависимость между

уменьшением коэффициента преломления тромбоцитов Дя и относительным показателем адгезии сильно активированных форм клеток ОПАТет после 2-х часового контакта с полимерной поверхностью.

0.000

0.005

♦ СР

0.010 Дп

О ПВХ -

0.015

0.020

•СР

•ПВХ

3.00

<$2.00 О

1.00

г=0.91 (СР) г=0.92 (ПВХ) р=0.05 п=7

Рисунок 6.

зависимость

уменьшением

Корреляционная между коэффициента

преломления тромбоцитов Ди уменьшением степени агрегации клеток Д1 после контакта после 2-х часового контакта с полимерной поверхностью..

0.000 0.005 0.010 ДП

♦ СР О ПВХ -

0.015

0.020

-СР - - ПВХ

Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и СР в условиях потока

В этой серии экспериментов исследовалось влияние двух часового контакта разведённой тромбоцитарной плазмы с конечной концентрацией клеток 22 - 38 тыс./мм3 в условиях потока с поверхностью трубок, изготовленных из ПВХ и СР на средний объём, коэффициент преломления тромбоцитов и их адгезионную и агрегационную активность.

Сначала было проведено 10 экспериментов для изучения закономерности изменения оптических характеристик тромбоцитов во времени при циркуляции в контурах из ПВХ и СР трубок, по 5 экспериментов для каждого материала. На рисунках 7 и 8 представлены усреднённые

зависимости, отражающие изменение коэффициента преломления и среднего объёма тромбоцитов.

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 время циркуляции, мин. ♦ СР ОПВХ

Рисунок 7. Изменение коэффициента преломления тромбоцитов и в зависимости от времени

циркуляции в контуре.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 время циркуляции, мин. ♦ СР ОПВХ

Рисунок 8. Изменение среднего объёма тромбоцитов в зависимости от времени циркуляции

в контуре.

Коэффициент преломления тромбоцитов ведёт себя достаточно стабильно на протяжении первых 20 минут циркуляции для магистралей из СР и 30 минут циркуляции для магистралей из ПВХ Затем начинается его постепенное уменьшение. Значимые различия (п = 5, р ¿0.05) в значениях коэффициента преломления для магистралей разных типов наблюдаются уже к 40 минутам циркуляции. Такая тенденция в значимом различии наблюдается вплоть до 120 минут

циркуляции в контуре. Видно, что скорость уменьшения коэффициента преломления больше при циркуляции в контуре с магистралями из силиконовой резины и составляет 0.010±0.002 1/час, в то время как в контуре из поливинилхлорида коэффициент преломления уменьшается со скоростью 0.006±0.002 1/час.

Средний объйм тромбоцитов имеет тенденцию к уменьшению от, однако значимых различий в зависимости от материала не наблюдается.

На трёх донорах было так же исследовано изменение агрегационной и адгезионной активности тромбоцитов параллельно с определением оптических характеристик клеток при контакте с поверхностью ПВХ и СР в условиях потока. Во всех трёх случаях наблюдались сходные тенденции в изменении оптических характеристик тромбоцитов, их адгезионной и агрегационной активности. Для демонстрации обнаруженного эффекта ниже будут приведены результаты одного эксперимента.

Поскольку функциональное состояние тромбоцитов одного донора может зависеть от многих факторов, клетки могут иметь различную степень индивидуальной реакции даже на одно и то же воздействие. В качестве критериев для проведения эксперимента на тромбоцитах одного донора в разные дни, явились результаты предварительной оценки оптических характеристик тромбоцитов, их агрегационной и адгезионной активности непосредственно после процедуры выделения (таблица 7).

Таблица 7

Результаты парного двухвыборочного Ответа Стьюдента с уровнем надёжности р ¿1.05 для

средних значений (п=4) для одного донора в разные дни.

показатель день 1 день 2 результат Ответа (различие)

и 1.389±0.001 1.389±0.001 не значимо

СОТ, ыкы1 5.5±0.2 5.6±0.2 не значимо

Мобщ, пгт/25000 мкм7 312±18 323±15 незначимо

Ня, шт/25000 мкм2 130±11 134±16 не значимо

Исл, шт/25000 мкм2 182±17 190±5 не значимо

1,% 76±11 72±16 не значимо

NABX, тыс/мм'* 321±24 315±34 не значимо

На рисунках 9, 10 приведены зависимости изменения среднего объёма и коэффициента преломления тромбоцитов донора при циркуляции в контурах с магистралями из ПВХ и СР.

Коэффициент преломления клеток ведёт себя достаточно стабильно на протяжении 20 минут для СР и 40 минут для ПВХ. Затем начинается его постепенное уменьшение вплоть до 100 минут для СР и 160 минут для ПВХ. Дальнейшее уменьшение коэффициента преломления не наблюдается Скорости уменьшения коэффициента преломления отличаются для различных материалов и составляют 0.010±0.002 1/час для силиконовой резины и 0.007±0.002 1/час для поливинилхлорида. Средний объём тромбоцитов изменяется с первых минут циркуляции. Значимое уменьшение среднего объёма заканчивается к 90 минутам циркуляции и составляет 0.5±0.2 мкм3 для обоих материалов. При этом на данном доноре не было зарегистрировано влияние природы материала на характер изменения среднего объёма тромбоцитов.

Достоверных различий для значений концентрации тромбоцитов до начала и через 3 часа циркуляции не выявлено. Это свидетельствует о том, что изменение функционального состояния тромбоцитов происходит в результате активации клеток, не сопровождающейся процессами спонтанной агрегации или адгезии, которые приводили бы к уменьшению концентрации объектов в объёме жидкой фазы. При этом значения для концентрации, полученные при помощи гематологического анализатора можно считать вполне удовлетворительными.

время циркуляции, мин. —♦—СР - в - ПВХ

Рисунок 9. Изменение коэффициента преломления тромбоцитов и в зависимости от времени

циркуляции в контуре.

время циркуляции, мин. —♦—CP - в - ПВХ

Рисунок 10. Изменение среднего объёма тромбоцитов в зависимости от времени циркуляции в

контуре.

С интервалом в 30 минут (за исключением точки 150 минут) исследовалась агрегационная и адгезионная активность тромбоцитов В таблице 8 приведены значения степени агрегации тромбоцитов при добавке 5.0 цМ АДФ.

Таблица 8

Значения степени агрегации (I) тромбоцитов при добавке 5.0 цМ АДФ, а так же

время циркуляци и, мин. CP ПВХ

Nabxo> ТЫС./ММ3 1,% Nabxi. ТЫС./ММ3 NABXOj ТЫС./ММ3 1,% Nabxi» тысУмм3

0 32±6 32±6 5±4 30±7 30±4 2±3

30 36±8 41±5 6±4 28±б 46±7 5±4

60 35±8 8±6 15±5 27*6 18±5 8±3

90 30±7 3±5 24±4 34±8 5±4 32±4

120 26±7 -5±3 22±9 29±8 3±2 26±7

180 34±9 -7±4 Зб±8 32±7 -2±3 33±5

Из таблицы видно, что степень агрегации, отражающая агрегационную активность тромбоцитов, снижается при увеличении времени циркуляции. Видно, что реальная агрегация тромбоцитов, за счёт слипания и образования агрегатов, происходит лишь на временах до 90 минут, о чём свидетельствует изменение концентрации клеток после добавок АДФ.

Таблица 9

Значения общего количества адгезированных тромбоцитов (Ы0бщ), слабо (Ъ1СЛ) и сильно (Мси)

время циркуляции, мин. No6iU! штЛ5000 мкм2 шт./75000 мкм1 Ncn, шт./75000 мкм2

CP ПВХ CP ПВХ CP ПВХ

0 312±18 232±15 182±17 190±5 130±11 134±16

30 323±9 299±4 186±11 172±14 138±9 127±12

60 357±32 309±21 138±12 166±7 219±28 143±16

90 494±18 367±11 139±4 139±6 355±17 228±7

120 490±13 367±35 132±7 135±10 359±14 232±30

180 486±16 457±27 120±16 123±15 366±15 333±21

При анализе адгезионной активности тромбоцитов, циркулирующих в контуре из СР (таблица 9), заметно увеличение сильно активированных форм и общего количества клеток на поверхности ПЭНП к 60 минутам циркуляции. С увеличением времени до 90 мин. адгезионная активность клеток растет, оставаясь затем неизменной после 120 и 180 мин. циркуляции. При циркуляции в контуре с магистралями из ПВХ (см. табл 9) изменение в адгезионной активности заметно лишь к 90 мин., при этом адгезионная активность продолжает расти вплоть до 180 мин. Циркуляции При этом происходит увеличение количества сильно активированных форм клеток, что и обеспечивает увеличение общего количества адгезированных тромбоцитов. Принимая во внимание предыдущие данные, логичным будет сделать заключение о том, что в результате активации и в этом случае так же наблюдается увеличение адгезионной активности тромбоцитов, наряду с уменьшением их агрегационной активности и уменьшением коэффициента преломления клеток.

На рисунках 11,12 представлены результаты корреляционного анализа. Из рисунков видно,

что в результате 3-х часового контакта с поверхностями полимерных материалов в условиях

потока происходит активация тромбоцитов, при этом наблюдается значимая положительная

корреляция между уменьшением коэффициента преломления клеток и увеличением их

адгезионной активности с одной стороны в случае контакта с обоими материалами с коэффициентами г = 0.99 и 0.98 для СР и ПВХ соответственно и уменьшением агрегационной активности тромбоцитов с коэффициентами г = 0.90 и 0.87 для СР и ПВХ.

Г=0.90 (СР)

2.50 -

г=0.99 (СР) г=0.98 (ПВХ) р=0.05 п=5

с О

1.50

0.50

0.000

0.005

0.010

0.015

♦ СР

ДП

О ПВХ-СР

Рисунок 11. Корреляционная зависимость между

уменьшением коэффициента преломления тромбоцитов Ал и относительным показателем адгезии сильно активированных форм клеток ОПАТя при циркуляции в контурах с различными магистралями.

0.020

Рисунок 12.

зависимость

уменьшением

преломления

уменьшением

тромбоцитов

5.0 цМ АДФ

контурах

магистралями.

Корреляционная между коэффициента тромбоцитов Ли и степени агрегации в ответ на добавку при циркуляции в с различными

0.020

•ПВХ

В таблице 10 приведены результаты сравнения коэффициента преломления, среднего объёма, агрегационной и адгезионной активности клеток после трёх часов циркуляции в контуре с контрольными значениями. Из таблицы видно, что циркуляция в контуре значимо сказывается на изменении коэффициента преломления, количестве сильно активированных форм клеток и агрегационной активности тромбоцитов Таким образом, среда, используемая для разведения тромбоцитарной плазмы, необходимого для проведения корректных измерений среднего объёма и коэффициента преломления тромбоцитов, значимым образом влияет лишь на средний объём клеток. Безусловно, происходит активация тромбоцитов, что выражается в уменьшении их среднего объёма и незначительного уменьшения коэффициента преломления по сравнению с контрольными значениями. Однако степень активации незначительна по сравнению с дополнительными

активирующими факторами, используемыми в эксперименте, а именно: наличие, хоть и очень малых, напряжений сдвига и контакт с поверхностью материала.

Таблица 10

Результаты парного двухвыборочного Ответа Стьюдента с уровнем надежности р=0.05 для средних значений (п=4) I (5.0 цМ АДФ), N0», п, СОТ и концентрации тромбоцитов для

показатель контроль СР результат 1-теста (различие)

и 1.385±0.002 1.374±0.002 значимо

СОТ, мюкГ* 5.1±0.3 4.9±0.2 не значимо

N0,, шт/75000 мкм2 118±17 366±15 значимо

1,% 18±8 -7±4 значимо

показатель контроль пвх результат 1-теста (различие)

л 1.386±0.002 1.37б±0.002 значимо

СОТ, мкм1 5.0±0.2 5.1±0.2 не значимо

шт/75000 мкм' 108±21 333±21 значимо

1,% 12±9 -2±3 значимо

Коэффициент преломления тромбоцитов как параметр активации клеток (влияние АИК) Проведена апробация возможности оценки активации тромбоцитов пациентов по изменению величины коэффициента преломления пациентов до и после подключения аппарата искусственного кровообращения (АИК) при операциях на открытом сердце. 1.410

1.403

Рисунок 13. Изменение коэффициента преломления тромбоцитов пациента во время ИК.

1.385

1.386

-I

20 40 60

время использования АИК, мин.

Все значимые изменения оптических характеристик тромбоцитов и их гемостатической активности происходят уже к пяти минутам искусственного кровообращения (ИК), при этом существенной разницы в показателях в дальнейшем не наблюдается. Стоит отметить, что тромбоциты данного пациента обладают аномально большим коэффициентом преломления ещё до операции: 1.403±0.001.

Уже через пять минут работы АИК наблюдается падение коэффициента преломления до значения 1,385±0.001, которое не претерпевает значимых изменений и после часа (рисунок 13).

Поскольку, из закономерности, установленной в предыдущих модельных экспериментах, известно, каким образом коэффициент преломления связав с адгезионной и агрегационной

активностью клеток, то не проводя дополнительных исследований можно было бы сказать, что адгезионная активность тромбоцитов должна иметь тенденцию к увеличению, а агрегационная к уменьшению.

20 40

время использования АИК, мин.

20 40

время использования АИК, мин.

20.

Рисунок 14. Изменение среднего объёма тромбоцитов пациента во время ИК.

15.

Изменение агрегации

Рисунок степени тромбоцитов пациента при добавке 5.0 Ц.М АДФ во время ИК.

¡га 5 минут АИК 60 минут здоровый АИК донор □одиночные а активированные ■ распластанные ■агрегаты о общ ее количество

Рисунок 16. Количество адгезированных тромбоцитов на поверхность ПЭНП общей площади 25000 мкм2 во время ИК.

И действительно (рисунки 15,16) уменьшение степени агрегации составляет около 40 %, в то время как наблюдается рост общего количества тромбоцитов и сильно активированных форм клеток на поверхности эталонного материала. Следует отметить, что адгезионная активность клеток пациента существенно ниже активности клеток здорового среднестатистического донора, причем до операции практически отсутствуют сильно активированные формы, наблюдаются лишь слабо активированные единичные тромбоциты.

Заключение

В данной работе впервые проведено исследование влияния добавок АДФ на средний объём, коэффициент преломления тромбоцитов, их адгезионную и агрегационную активность. При этом показано, что изменение коэффициента преломления в этом случае может быть вполне информативным, поскольку отражает изменение адгезионной и агрегационной активности клеток.

Проведено исследование изменения коэффициента преломления тромбоцитов человека при контакте с поверхностью полимерного материала в условиях потока и медленного перемешивания с параллельным контролем агрегационной и адгезионной активности клеток. В случае контакта с чужеродной поверхностью так же установлена взаимосвязь между изменением коэффициента преломления тромбоцитов и их гемостатической активности. В работе показано, что методика оценки активации клеток по изменению их коэффициента преломления обладает достаточной для того, чтобы определять разницу в степени активации тромбоцитов при контакте с различными полимерами.

Обоснована возможность использования коэффициента преломления тромбоцитов в качестве параметра, характеризующего изменение функционального состояния клеток. Продемонстрирована возможность оценки активации тромбоцитов пациентов по степени изменения коэффициента преломления тромбоцитов до и после подключения аппарата искусственного кровообращения прн операциях на открытом сердце.

Выводы

1 Найдены экспериментальные условия активации тромбоцитов, не приводящие к изменению концентрации клеток в суспензии, что позволяет по картине светорассеяния вычислять средние значения объема и коэффициента преломления тромбоцитов.

2. Обнаружено, что добавки 0.5 цМ АДФ в суспензию тромбоцитов приводят не только к первичной агрегации клеток, но и влияют на средний объём, коэффициент преломления, адгезионную и агрегационную активность тромбоцитов человека.

3. Показано, что изменение коэффициента преломления является более чувствительным параметром, характеризующим активацию тромбоцитов при контакте с чужеродной поверхностью, по сравнению с изменением среднего объема клеток.

4. В условиях in vitro доказано, что при инкубации тромбоцитарной плазмы человека с образцами силиконовой резины и поливинилхлорида медицинского назначения в течение 2 ч. в условиях потока происходит уменьшение коэффициента преломления клеток на 0.015±0.001 и 0 009±0.001, соответственно.

5. Показано, что уменьшение коэффициента преломления активированных чужеродной поверхностью или добавками АДФ тромбоцитов сопровождается статистически достоверным (р S 0.05) увеличением количества сильно активированных адгезированных клеток, с одной стороны, и уменьшением их агрегационной активности, с другой.

6. Проведен анализ результатов активации тромбоцитов поверхностью полимерных материалов и добавками АДФ в условиях in vitro, а также во время операций с подключением аппарата искусственного кровообращения. Показана возможность использования коэффициента преломления тромбоцитов в качестве параметра, прогнозирующего изменения их адгезионных и агрегационных свойств активированных клеток.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Дуплякин Е.О., Ремеева Е.А., Розанова И.Б Методы исследования взаимодействия тромбоцитов с чужеродной поверхностью. Материалы IX Научно-технической конференции с участием зарубежных специалистов «Вакуумная наука и техника», изд. МГИЭМ (ТУ), 2004, С. 250-255.

2. Дуплякин Е.О., Космовский С.Ю. Влияние оптических свойств тромбоцитов на светопропускание суспензии клеток. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2003, №4, С. 54-58.

3. Дуплякин Е.О. Измерение среднего объема и коэффициента преломления тромбоцитов человека при динамическом контакте с поверхностью полимерного материала. Труды XLVI Научной конференции МФТИ, 2003, С. 87.

4. Розанова И.Б., Васин C.JL, Титушкин И.А., Космовский С.Ю., Дуплякин Е.О., Шумаков Д.В., Толпекин В.Е., Мелемука И.В., Севастьянов В.И. Исследование функционального состояния

тромбоцитов у больных ИБС до и после аортокоронарного шунтирования. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2000, № 4, С. 38-46.

5. Duplyakin Е.О., Vasin S. L., Kosmovsky S.U. Mean platelet volume and platelets optical indices measurement during their contact with foreign surface. The International Journal of Artificial Organs, 2003,26, №7, P. 635.

6. Tihobaeva A A., Duplyakin E.O, Salomatina L.A., Sevastianov V.I. Transdermal matrix delivery system of acetylsalicylic acid. The International Journal of Artificial Organs, 2004,27, № 7, P. 636.

7. Тихобаева A.A., Дуплякин E.O., Немец E.A., Саломатина Л.А. Экспериментальное исследование чрескожной матричной системы ацетилсалициловой кислоты. Материалы IX Научно-технической конференции «Вакуумная наука и техника», изд. МГИЭМ (ТУ), 2002, С. 246-250.

8. Тихобаева А.А., Саломатина Л.А., Дуплякин Е.О., Урьяш В.Ф., Севастьянов В.И. Новая система доставки ацетилсалициловой кислоты - «Аскодерм». Материалы ХП Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва. 2005, С. 674.

№164 98

РНБ Русский фонд

2006-4 15141

Заказ №417. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ni

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Дуплякин, Евгений Олегович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Активация тромбоцитов.

1.2 Гемостатические реакции тромбоцитов.

1.2.1 Адгезия тромбоцитов.

1.2.2 Реакция высвобождения.

1.2.3 Агрегация тромбоцитов.

1.3 Концентрация и объём тромбоцитов.

1.4 Оптические методы исследования активации тромбоцитов.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1 Выделение тромбоцитов.

2.1.1 Забор крови в пробирки.

2.1.2 Забор крови в контейнеры.

2.2 Определение концентрации тромбоцитов.

2.3 Лазерный дифракционный анализ дисперсионного состава суспензии тромбоцитов.

2.3.1 "Mastersizer Micro" - блок схема.

2.3.2 Восстановление распределения частиц по размерам из картины светорассеяния.

2.3.2 Объёмная концентрация рассеивающих частиц.

2.3.3 Экспериментальные условия для вычисления углового распределения рассеянного света.

2.3.4 Вычисление среднего объёма тромбоцитов.

2.3.5 Вычисление концентрации тромбоцитов.

2.3.6 Выбор презентации.

2.3.7 Вычисление среднего объёма и коэффициента преломления тромбоцитов.

2.4 Исследование агрегационной активности тромбоцитов.

2.5 Исследование адгезионной активности тромбоцитов.

2.5.1 Подготовка образцов.

2.5.2 Визуализация адгезированных тромбоцитов и параметры оценки адгезионной активности клеток.

2.6 Активация тромбоцитов.

2.6.1 Добавки АДФ.

2.6.2 Контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров.

2.6.3 Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и CP.

2.6.2 Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и CP в условиях потока

2.7 Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека, их агрегационной и адгезионной активностью.

3.1.1 Добавки АДФ.

3.1.2 Контакт с поверхностью тромбоцитарных контейнеров.

3.1.3 Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и CP.

3.1.4 Контакт с поверхностью трубок из ПВХ и CP в условиях потока

3.2 Коэффициент преломления тромбоцитов как параметр активации клеток.

3.2.1 Влияние АИК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их агрегационной и адгезионной активностью"

Актуальность темы

Гемосовместимость материалов и изделий медицинского назначения во многом определяется реакцией тромбоцитов на чужеродную поверхность, т.к. именно эти клетки играют важную роль в поддержании гемостаза и сохранении агрегатного состояния крови [10, 11, 16]. Традиционно функциональное состояние тромбоцитов связывают с протекающими при изменении окружающей среды процессами адгезии, агрегации и высвобождения внутриклеточных биологически активных компонентов [8, 13]. Так, например, адгезия клеток на поверхность имплантата провоцирует реакцию высвобождения тромбоцитарных факторов во внеклеточное пространство, в том числе индукторов агрегации. Это приводит к активации не адгезированных тромбоцитов, что сопровождается интенсификацией процессов адгезии клеток, а также их агрегацией на поверхности и в объеме.

Несмотря на прогресс в изучении механизмов активации тромбоцитов, процессы, протекающие при контакте этих клеток с чужеродным материалом, остаются до конца не изучены. В значительной степени это связано с ограниченностью, трудоёмкостью и иногда недостаточной информативностью имеющихся методологических подходов к изучению свойств и реакций тромбоцитов. В связи с тем, что регистрация активации тромбоцитов в реальном масштабе времени трудно осуществима, функциональное состояние тромбоцитов обычно исследуется до и после того или иного воздействия.

Одним из наиболее информативных методов является исследование характера адгезии клеток с помощью сканирующего электронного микроскопа, что дает возможность одновременно изучать количество и морфологию адгезированных тромбоцитов [15, 16]. Однако эти два параметра не всегда дают полную информацию об изменениях функционального состояния тромбоцитов. Так например, в потоке, при наличии напряжения сдвига, на поверхности материала не всегда удается найти адгезированные тромбоциты. При этом активированные поверхностью тромбоциты могут накапливаться в циркулирующей крови и состояние клеток, таким образом, будет отличным от исходного [34, 35, 38]. Помимо этого, активированные контактом клетки могут иметь большую адгезионную активность, что может реализоваться в образовании тромбов в застойных зонах.

Широко распространенным методом анализа свойств тромбоцитов, проявляемых в объёме жидкой фазы, является изучение их агрегационной активности [4, 23, 28, 43, 64]. В основе метода лежит регистрация увеличения светопропускания суспензии тромбоцитов под действием физических или химических индукторов. Эффект увеличения светопропускания объясняют уменьшением количества рассеивающих объектов с одновременным увеличением их размеров вследствие агрегации тромбоцитов. Однако изменение светопропускания может быть связано не только с изменением количества рассеивающих объектов, а и с изменением оптических свойств (среднего объёма и коэффициента преломления) единичных клеток.

Методика, разработанная в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава, позволила привлечь метод лазерного дифракционного анализа для измерения среднего объёма и коэффициента преломления тромбоцитов в суспензии клеток с известной концентрацией [5, 6]. Полноценное использование оптических характеристик тромбоцитов в качестве параметров оценки их функционального состояния невозможно без понимания их взаимосвязи с такими хорошо изученными свойствами клеток, как агрегация и адгезия, что и обусловливает актуальность данной работы.

Необходимость проведения подобного исследования объясняется ещё и тем, что в дальнейшем это, позволит сопоставить степень активации клеток с изменением их оптических характеристик, и, таким образом, появится возможность использования оптических характеристик, как дополнительных параметров активации тромбоцитов.

Исходя из поставленной цели, основные задачи работы сводились к следующему:

1. Найти оптимальные экспериментальные условия активации тромбоцитов, позволяющие регистрировать изменения их среднего объёма и/или коэффициента преломления и не приводящие к уменьшению концентрации клеток в суспензии за счёт процессов агрегатообразования на поверхности или в объёме;

2. Исследовать в условиях in vitro влияние поверхности синтетических полимерных материалов и индуктора агрегации тромбоцитов АДФ в малых концентрациях на оптические характеристики тромбоцитов;

Научная новизна

1. Определены экспериментальные условия активации тромбоцитов чужеродной поверхностью или добавками аденозиндифосфата (АДФ), позволяющие по картине светорассеяния для суспензии клеток вычислять их средний объём и коэффициент преломления.

Практическая значимость

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы были представлены на следующих семинарах и конференциях:

- межинститутские семинары Центра по исследованию биоматериалов ФГУ НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава (2002 г., 2003 г., 2004 г.),

XLVI Научная конференция МФТИ, 2003,

- XI научно-техническая конференция с участием зарубежных специалистов «Вакуумная наука и техника» (сентябрь 2004 г., Судак, Украина),

- XXXth Annual Congress of the European Society for Artificial Organs (ESAO) (September 3-6 2003, Aachen, Germany),

- XXXIth Annual Congress of the European Society for Artificial Organs (ESAO) (September 8-11 2004, Warsaw, Poland),

Публикации

Результаты проведённых исследований отражены в 8 печатных работах, опубликованных в России и за рубежом. Структура и объём диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дуплякин, Евгений Олегович

выводы

1. Найдены экспериментальные условия активации тромбоцитов, не приводящие к изменению концентрации клеток в суспензии, что позволяет по картине светорассеяния вычислять средние значения объема и коэффициента преломления тромбоцитов.

5. Показано, что уменьшение коэффициента преломления активированных чужеродной поверхностью или добавками АДФ тромбоцитов сопровождается статистически достоверным (р < 0.05) увеличением количества сильно активированных адгезированных клеток, с одной стороны, и уменьшением их агрегационной активности, с другой.

6. Проведен анализ результатов активации тромбоцитов поверхностью полимерных материалов и добавками АДФ в условиях in vitro, а также при операциях с применением аппарата искусственного кровообращения. Показана возможность использования коэффициента преломления тромбоцитов в качестве параметра, прогнозирующего изменения их адгезионных и агрегационных свойств активированных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обоснована возможность использования коэффициента преломления тромбоцитов в качестве параметра, характеризующего изменение функционального состояния клеток. Продемонстрирована возможность оценки активации тромбоцитов пациентов по степени изменения коэффициента преломления тромбоцитов до и после использования аппарата искусственного кровообращения (АИК) при операциях на открытом сердце.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Дуплякин, Евгений Олегович, Москва

1. Борен К., Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами. Москва, «Мир», 1986.

2. Вашкинель В.К., Петров М.Н. Ультраструктура и функция тромбоцитов человека, Д.: «Наука», 1982.

3. Верхуша В.В., Вржещ П.В., Варфоломеев С.Д. Математическое описание кинетики агрегации тромбоцитов. Вестник АМН СССР, 1991, № 10, стр. 20-27.

4. Габассов З.А, Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я., Маркосян Р.А. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов. Лабораторное дело, 1989, № 10, стр. 15-18.

5. Космовский С.Ю. Определение размеров и оптических констант тромбоцитов методом лазерной дифракционной спектроскопии. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук, Москва, 2003.

6. Космовский С.Ю., Максаев Г.И., Васин C.JI., Розанова И.Б., Севастьянов В.И. Использование лазерной дифракционной спектроскопии для измерения распределения тромбоцитов человека по размеру. Медицинская техника, 1998, №3, стр. 43-44.

7. Летов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. Москва, "Медицина", 1982, стр. 53-66.

8. Петрищев Н.Н., Папаян Л.П. Гемостаз: физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Учебное пособие, Санкт-Петербург, 1999.

9. Самаль А.Б. Агрегация тромбоцитов: Методы изучения и механизмы. Минск, "Университетское", 1990.

10. Севастьянов В.И. Гемосовместимость полимерных материалов и первичные стадии их взаимодействия с кровью. Диссертация насоискание ученой степени доктора биологических наук. Москва, 1984.

11. Севастьянов В.И. Общие представления о процессах взаимодействия чужеродной поверхности с кровью. Биосовместимость. Под ред. Севастьянова В.И. М.: ГУП «Информационный центр ВНИИгеосистем», 1999.

12. Тучин В.В. Оптика биотканей: основы лазерной диагностики и дозиметрии. Медицинская физика. 1997, №4, (www.telemedica.ru).

13. Шишкова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. Спб.: СПб ГМУ, 2000.

14. Abela G.S., Huang R., Ma H., Prieto A.R., Lei M., Schmaier A.H., Schwartz K.A., Davis J.M. Laser-light scattering, a new method for continuous monitoring of platelet activation in circulating fluid. J Lab Clin Med., 2003, Vol. 141(1), p. 50-57.

15. Adams G.A. Platelet adhesion. Past and present. In: The platelets physiology and pharmacology. Ed. Largrester G. (De). Academic Press Inc, 1985, p. 15-37.

16. Anderson J.M., Kottke-Marchant K. Platelet interactions with biomaterials and artificial devices. CRC Critical Reviews in Biocompatibility, 1985, Vol. 1(2), p. 111-204.

17. Ashby В., Daniel J.L., Smith J.B., Mechanisms of platelet activation and inhibition. Hematol Oncol Clin North Am., 1990, Vol 4(1), p. 1-26.

18. Bath P.M., Buttervvorth R.J. Platelet size: measurement, physiology and vascular disease. Blood Coagul Fibrinolysis., 1996, Vol. 7(2), p. 156-161.

19. Bath P.M., Missouris C.G., Buckenham Т., MacGregor G.A. Increased platelet volume and platelet mass in patients with atherosclerotic renal artery stenosis. Clin Sci (Lond), 1994, Vol. 87(2), p. 253-257.

20. Baumgartner H.R. and Muggli R. Adhesion and aggregation: morphological demonstration and quantitation in vivo and in vitro, in Platelets in Biology and Pathology. Ed. Gordon J.L., Elsevier, Amsterdam, 1976.

21. Bohren C.F., Hunt A.J., Scattering of electromagnetic waves by a charged sphere, Can. J. Phys., 1977. Vol. 55, p. 1930- 1935.

22. Bolton A.E., Ludlam C.A., Moore S., Pepper D.S., Cash J.D. Three approaches to the radioimmunoassay of human beta-thromboglobulin. Br J Haematol., 1976, Vol. 33(2), p. 233-238.

23. Born G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature, 1962, Vol. 194, 927 929.

24. Boyum A., Stormorken N., Lund-Riise A. Electronic platelet counting. Scand J Clin Lab Invest., 1971, Vol. 28(4), p. 429-433.

25. Brummitt D.R., Barker H.F., Pujol-Moix N. A new platelet parameter, the mean platelet component, can demonstrate abnormal platelet function and structure in myelodysplasia. Clin Lab Haematol., 2003, Vol. 25(1), p. 5962.

26. Castle A.G., Crawford N. Platelet microtubule subunit proteins. Thromb Haemost., 1980, vol. 42(5), p. 1630-1633.

27. Cavallero F. Quantitative valuation of platelet aggregation curves through the calculation of a numerical index, Platelet aggregation in the pathogenesis of cerebrovascular disorders. 1977, Vol. 1, p. 27 32.

28. Cenni E., Cavedagna D., Falsone G., Mari G., Pizzoferrato A. Numerical and functional modifications in platelets induced by polyester coated by a hydrophilic polymer. Biomaterials, 1993, Vol. 14(8), p. 588-590.

29. Chen J.H., Wei J., Chang C.Y., Laiw R.F., Lee Y.D. Studies on segmented polyetherurethane for biomedical application: effects of composition and hard-segment content on biocompatibility. J Biomed Mater Res., 1998, Vol. 41(4), p. 633-648.

30. Chesterman C.N., McGready J.R., Doyle J.J., Morgan F.J. Plasma level of platelet factor 4 measured by radioimmunoassay. Br. J. Haemmatol., 1978, Vol. 40(3), p. 489-500.

31. Erhart S., Beer J.H., Reinhart W.H. Influence of Aspirin on Platelet Count and Volume in Humans. Acta Haematol., 1999, Vol. 101(3), p. 140-144.

32. Feinman R.D., Lubovvsky J., Charo I., Zabinski M.P. The lumi-aggregometer: a new instrument for simultaneous measurement of secretion and aggregation by platelets. J Lab Clin Med., 1977, Vol. 90(1), p. 125-129.

33. Fristma G.A. Haemostasis and thrombosis. In: Hemostasis and thrombosis in the clinical laboratory. Eds. Corriveau D.M., Fristma G.A. Philadelphia, 1988, p.206-228.

34. Frojmovic M.M., Milton J.G. Physical, chemical and functional changes following platelet activation in normal and "giant" platelets. Blood Cells, 1983, Vol. 9, p. 359-382.

35. Gemmell C.H. Activation of platelets by in vitro whole blood contact with materials: increases in microparticle, procoagulant activity, and soluble P-selectin blood levels. J Biomater Sci Polym Ed., 2001, Vol. 12(8), p. 933943.

36. Giacomini A., Legovini P., Antico F., Valverde S., Salvadego M.M., Manoni F., Gessoni G. Assessment of in vitro platelet activation by Advia 120 platelet parameters. Lab Hematol., 2003, Vol. 9(3), p. 132-137.

37. Giacomini A., Legovini P., Gessoni G., Antico F., Valverde S., Salvadego M.M., Manoni F. Platelet count and parameters determined by the Bayer ADVIA 120 in reference subjects and patients. Clin Lab Haematol., 2001, Vol 23(3), p. 181-186.

38. Harms C. Laboratory evaluation of platelet function. In: Platelet Function. Ed. Triplett, D.A. American Society of Clinical Pathologists, Chicago, 1978, p. 35-52.

39. Havviger J. Mechanisms involved in platelet vessel wall interaction. Thromb Haemost., 1995, Vol. 74(1), p. 369-372.

40. Henning B.F., Zidek W., Linder В., Tepel M. Mean Platelet Volume and Coronary Heart Disease in Hemodialysis Patients. Kidney Blood Press Res., 2002, Vol. 25(2), p. 103-108.

41. Holmsen H., Storm E., Day H.J. Determination of ATP and ADP in blood platelets: a modification of the firefly luciferase assay for plasma. Anal Biochem., 1972, Vol. 46(2), p. 489-501.

42. Ingerman C.M., Smith J.B., Silver M.J. Direct measurement of platelet secretion in whole blood. Thrombosis Research, 1979, Vol. 16(3-4), p. 335-344.

43. Ito Y., Sisido M., Imanishi Y. Platelet adhesion onto protein-coated and uncoated polyetherurethaneurea having tertiary amino groups in the substituents and its derivatives. J Biomed Mater Res, 1989, Vol. 23(2), p. 191-206.

44. Jagroop I.Л., Clatworthy I., Lewin J., Mikhailidis D.P. Shape change in human platelets: measurement with a channelyzer and visualisation by electron microscopy. Platelets, 2000, Vol. 11(1), p. 28-32.

45. Jenkins C.S., Cate J.W., Clemetson K.J. Platelet membrane glycoproteins: a role in the haemostatic process. Neth. J. Med., Vol. 19(6), p. 291 295.

46. Karpatkin S. Heterogeneity of human platelets. VI. Correlation of platelet function with platelet volume. Blood, 1978, Vol. 51(2), p. 307-316.

47. Karpatkin S. Platelet sizing. Section I: Hematology. CRC Handbook Series in Clinical Laboratory Science. 1979, Vol. 1, p. 409.

48. Kinlough-Rathbone R.L., Mustard J.F. Endogenous mediators of platelet activation. In: Platelets in biology and pathology III. Eds: Maclntyre D.E., Gordon, J.L. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, 1987, p. 239-267.

49. Loscalzo J., Schafer A.I. (Eds.). Thrombosis and Hemorrhage. Boston: Blackwell Scientific; 1994.

50. Latimer P., Brunsting A., Pyle B.E., Moore C. Effects of aspherecity on single particle scattering, Appl. Opt., 1978, Vol. 17, p. 3152 58.

51. Lim Y.A., Hyun B.H. Evaluation of platelet parameters on the AD VIA 120 as the quality indicator for stored platelets. Clin Lab Haematol., 2002, Vol. 24(6), p. 377-384.

52. Ludlam C.A., Moore S., Bolton A.E., Pepper D.S., Cash J.D. The release of a human platelet specific protein measured by a radioimmunoassay, Thromb Res., 1975, Vol. 6(6), p. 543-548.

53. Macey M.G., Carty E., Webb L., Chapman E.S., Zelmanovic D., Okrongly D., Rampton D.S., Newland A.C. Use of mean platelet component to measure platelet activation on the ADVIA 120 haematology system. Cytometry, 1999, Vol 38(5), p. 250-255.

54. Maltsev V.P. Scanning flow cytometry for individual particle analysis. Review of Scientific Instruments, 2000, Vol. 71, p. 243-255.

55. Maltsev V.P., Chernyshev A.V. Method and device for determination of parameters of individual microparticles. US Patent Number: 5,650,847. Date of patent: Jul. 22, 1997.

56. Martin J.F., Daniel T.D., Trowbridge E.A., Acute and clinic changes in platelet volume and count after cardiopulmonary bypass induced thrombocytopenia in man, Thromb Haemost., 1987, Vol. 57(1), p. 55-58.

57. Muszbeck L., Adany R. Blood Vessel Wall and Thrombosis: Hemostasis, Vol. 1. Ed. Machovich R., 1988, p. 159-196.

58. O'Brien J.R. Platelet aggregation. Part II. Some results from a new method of study. J clin Pathol., 1962, Vol. 15(2), 452-458.

59. O'Malley Т., Ludlam C.A., Fox K.A., Elton R.A. Measurements of Platelet volume using a variety of different anticoagulant and antiplatelet mixtures. Blood Coagul Fibrinolysis, 1996, Vol. 7(4), p. 431-436.

60. Penington D.G., Lee N.L., Roxburgh A.E., McGready J.R. Platelet density and size: the interpretation of heterogeneity. Br J Haematol., 1976 , Vol. 34(3), p. 365-376.

61. Pizzoferrato A, Arciola CR, Cenni E, Ciapetti G, Sassi S., In vitro biocompatibility of a polyurethane catheter after deposition of fluorinated film. Biomaterials, 1995,Vol. 16(5), p. 361-367.

62. Reininger A.J., Korndorfer M.A., Wurzinger L.J. Adhesion of ADP-activated platelets to intact endothelium under stagnation point flow in vitro is mediated by the integrin alphallbeta3. Thromb Haemost., 1998, Vol. 79(5), p. 998-1003.

63. Rendu F., Brohard-Bohn B. The platelet release reaction: granules' constituents, secretion and functions. Platelets, 2001, Vol. 12(5), p. 261273, Review.

64. Ruggeri ZM. Mechanisms of shear-induced platelet adhesion and aggregation. Thromb Haemost., 1993, Vol. 70(1), p. 119-23. Review.

65. Shvalov A.N., Soini J.T., Chernyshev A.V., Tarasov P.A., Soini E., Maltsev V.P. Light-Scattering Properties of Individual Erythrocytes. Applied Optics, 1999, Vol. 38, p. 230-235.

66. Shvalov A.N., Soini J.T., Surovtsev I.V., Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Petrov A.K., , Maltsev V.P. Individual Escherichia coli cells studied from light scattering with the scanning flow cytometer. Cytometry, 2000, Vol. 41(1), p. 41-45.

67. Siess W. Molecular mechanisms of platelet activation. Physiol Rev., 1989, Vol. 69(1), p. 58-178.

68. Slack S.M., Cui Y., Turitto V.T. The effects of flow on blood coagulation and thrombosis. Thromb Haemost., 1993, Vol. 70(1), p. 129-134.

69. Soini J.T., Chernyshev A.V., Hanninen P.E., Soini E., Maltsev V.P. A New Design of the Flow Cuvette and Optical Set-Up for the Scanning Flow Cytometer. Cytometry, 1998, Vol. 31(2), p. 78-84.

70. Trowbridge E.A., Reardon D.M., Hutchinson D., Pickering C. The routine measurement of platelet volume: a comparison of light-scattering and aperture-impedance technologies. Clin Phys Physiol Meas., 1985, Vol. 6(3), p. 221-238.

71. Wahba A., Rothe G., Lodes H., Barlage S., Schmitz G. The influence of the duration of cardiopulmonary bypass on coagulation, fibrinolysis and platelet function. J Torac Cardiovasc Surg., 2001, Vol. 49(3), p. 153-156.

72. Waples L.M., Olorundare O.E., Goodman S.L., Lai Q.J., Albrecht R.M. Platelet-polymer interactions: morphologic and intracellular free calcium studies of individual human platelets. J Biomed Mater Res., 1996, Vol. 32(1), p. 65-76.

73. Washington C. Particle size analysis in pharmaceutics and other industries. Theory and practice. Taylor & Francis, 1992.

74. White J.G. An overview of platelet structural physiology. Scanning microscopy, 1987, Vol. 1(4), p. 1677-1700.

75. White J.G. In: Cell biology of the secretory process. Ed. Cantin M. Basel, S. Karger, 1984, p. 546-570.

76. White J.G. Ultrastructural modification in platelet membranes and cytoskeleton following activation. Blood Cells, 1983, Vol. 9(2), p. 237261.

77. White J.G., Clawson C.C., Gerrard J.M. Platelet ultrastructure. In: Haemostasis and thrombosis. Eds. Bloom A.L., Thomas D.P. Churchill Livingstone, Edinburgh, 1981, p. 22-49.

78. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

79. ГУ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

80. Москва, 123182 Телефон: (095) 196-18-03ул. Щукинская, д. 1 Телефакс: (095) 943-00-081. Ю " Cl/j^CrS 200 f1.f,.1. УТВЕРЖДАЮ"• *

81. Зам. Директора по научной работе, ' д.м.н., профессор Шальнев Б.И.■■■cbfcf1. ЗАКЛЮЧЕНИЕо результатах практического использования методики определения коэффициента преломления тромбоцитов человека для оценки их активации в условиях in vitro.

82. Данный метод может быть рекомендован для оценки функциональной активности тромбоцитов с целью выбора медикаментозной тактики.

83. Зав. отделением искусственного кровообращенияи вспомогательной оксигенации к.м.н. Матвеев Ю.Г.т

Информация о работе

Дуплякин, Евгений Олегович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их агрегационной и адгезионной активностью - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Исследование взаимосвязи между оптическими характеристиками тромбоцитов человека и их агрегационной и адгезионной активностью - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы