Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование вклада сердечного миозин-связывающего белка C во взаимодействие сократительных белков миокарда

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование вклада сердечного миозин-связывающего белка C во взаимодействие сократительных белков миокарда"

На правах рукописи

Г

ЩЕПКИН Даниил Владимирович

Исследование вклада сердечного миозин-связывающего белка С во взаимодействие сократительных белков

миокарда

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Л 6 ИЮН 2011

Екатеринбург - 2011

4850495

Работа выполнена в лаборатории биологической подвижности Учрежден Российской академии наук Института иммунологии и физиологии Уральско отделения РАН

Научные руководители:

Доктор биологических наук Бершицкий Сергей Юрьевич

кандидат биологических наук, в.н.с. Никитина Лариса Валерьевна

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН, ЗДНРФ, доктор биологических наук, профессор Мархасин Владимир Семенович

лауреат Государственной премии РФ, доктор биологических наук Прошева Валентина Ивановна

Ведущая организация; ГУНУ Факультет фундаментальной медицин

Московского государственного университета имени М.В .Ломоносова (119192, Москва, Ломоносовский пр., д. 31, корп.5).

УС?

Защита состоится «¿д » _2011 г. в часов на заседали

совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 004.027.01 пр учреждении РАН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адрес 620049, Российская Федерация, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Ур РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С. Ковалевской, д. 22/20), с авторефератом на сайте учреждения РАН Института иммунологии и физиологии УрО РАН http://www.iip.uran.ru

Автореферат разослан « ¡Ц » ¡М, д^ 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 004.027.01 при учреждении РАН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН, ——

доктор медицинских наук, профессор ^-Т"/ И. А. Тузанкина

Общая характеристика работы

Актуальность

Известно, что сократительный аппарат кардиомиоцита содержит собственно сократительные белки - миозин и актин, а также регуляторные белки тропонин и тропомиозин. Миозин вместе с актином участвует в механизме превращения химической энергии АТФ в механическую работу. Миозин миокарда млекопитающих представлен двумя основными изоформами - VI и V3. Изоформа VI является гомодимером a-тяжелых цепей, a изоформа V3 - гомодимером 0-тяжелых цепей. Изоформы сердечного миозина различаются по своим функциональным характеристикам. Кроме того, на характеристики миозина оказывают влияние легкие цепи. Различие в соотношениях изоформ V1/V3 в различных слоях миокарда непосредственно влияет на насосную функцию сердца [Krenz et al., 2007].

Толстый филамент саркомера кардиомиоцита содержит кроме миозина другие белки, в частности, сердечный миозин-связывающий белок С (сМуВР-С). В начале 70-х годов с помощью иммуногистохимии было продемонстрировано, что сМуВР-С располагается в A-диске так называемой С-зоны области перекрытия толстых и тонких нитей саркомера кардиомиоцита [Offer et al., 1973]. С тех пор считалось, что сМуВР-С выполняет структурную роль в организации толстых и тонких филаментов в саркомере.

В исследованиях последних лет установлено, что сердечный миозин-связывающий белок С играет не только структурную роль, но и принимает участие в регуляции сокращений сердечной мышцы. При этом предполагалось, что регуляторная функция сМуВР-С состоит в его влиянии на формирование акто-миозинового комплекса [Saber et al., 2008].

В работе Richard с соавторами [Richard et al., 2003], выполненной в рамках международного исследования EUROGENE Heart Failure Project, было показано, что причиной семейной гипертрофической кардиомиопатии являются мутации в 9 генах, кодирующих белки саркомера миофибрилл кардиомиоцита. В этой работе

было показано, что почти половина (43%) наследственных кардиомиопатий связана с мутацией в гене, кодирующем сердечную изоформу миозин-связывающего белка С. На данный момент известно 165 мутаций этого белка, способных вызвать гипертрофическую кардиомиопатию.

В связи с этими данными были проведены эксперименты по моделированию развития гипертрофической кардиомиопатии на мышах, нокаутных по гену сердечного миозин-связывающего белка С. Отсутствие сМуВР-С в сердце таких мышей приводило к гипертрофической кардиомиопатии [Körte et а!., 2003; Witt et al., 2001], которая характеризовалась утолщением стенки левого желудочка, а также её фиброзом. У таких мышей наблюдались также функциональные нарушения сократимости миокарда, выражающиеся в уменьшении фракции выброса и максимальной конечно-систолической жесткости левого желудочка при отсутствии изменений в максимальной скорости развития напряжения [Körte et al., 2003].

В экспериментах на трабекулах, изолированных из миокарда нокаутных по гену сМуВР-С мышей, Stelzer с соавторами в 2006 году было найдено, что его отсутствие приводило к увеличению скорости ненагруженного укорочения. Было также показано, что влияние сМуВР-С на регуляцию сокращений, т.е. на связь «рСа-сила», крайне противоречиво: в разных экспериментальных моделях гипертрофической кардиомиопатии на мышах сМуВР-С либо влиял, либо не влиял на коэффициент кооперативное™ Хилла и кальциевую чувствительность связи «рСа-сила» [Stelzer et al., 2006; Körte et al., 2003]. Такие противоречия объясняли тем, что при отсутствии cfvlyBP-С в кардиомиоците могут запускаться различные компенсаторные процессы, которые выражаются в смене изоформ сердечного миозина с быстрой VI на медленную V3, а также в изменении степени фосфорилирования белков саркоплазматического ретикулума [Pohlmann et al., 2007].

К настоящему времени имеется лишь несколько публикаций по исследованию влияния сМуВР-С на кальциевую регуляцию взаимодействия актина с миозином, выполненных на уровне взаимодействующих молекул сократительных белков, т.е. на искусственной подвижной системе, причём во всех из них в качестве

экспериментальной модели использовалась быстрая изоформа скелетного миозина [Кагшпоуа е1 а1., 2006]. В результате открытым оставался вопрос о корректности этой модели для изучения влияния сМуВР-С на сократительную функцию миокарда и ее регуляцию. Опубликована только одна работа, в которой сМуВР-С и сердечный миозин использовались в искусственной подвижной системе одновременно, но в этой работе вопрос регуляторной роли сМуВР-С не затрагивался [ЬесагрепЦ'ег й а1., 2008].

Таким образом, до настоящего времени вопрос о влиянии сМуВР-С на регуляцию взаимодействия тонкого филамента как с сердечным миозином, так и его отдельными изоформами не ставился.

Методически наши исследования регулирующего влияния сМуВР-С на акто-миозиновый комплекс основаны на использовании искусственной подвижной системы, а также измерении скорости гидролиза АТФ миозином и его изолированными изоформами.

Цель работы: исследование молекулярных механизмов влияния сердечного миозин-связывающего белка С (сМуВР-С) на характеристики взаимодействия сократительных и регуляторных белков сердечной мышцы.

Задачи:

1. Исследовать влияние сМуВР-С на гидролитические свойства изоформ скелетного и сердечного миозина кролика.

2. С помощью метода искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом исследовать влияние сМуВР-С на зависимость скорости движения тонкого филамента по сердечному миозину кролика от концентрации кальция.

3. С помощью метода искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом исследовать влияние сМуВР-С на зависимость скорости движения тонкого филамента по изоформам сердечного миозина кролика от концентрации кальция.

4. Исследовать влияние сМуВР-С на взаимодействие регулируемого тонкого филамента с изоформами скелетного и сердечного миозина, используя искусственную подвижную систему.

5. Исследовать влияние сМуВР-С на тропомиозиновую регуляцию акто-миозинового взаимодействия методом искусственной подвижной системы.

Научная новизна

Впервые исследовано влияние сМуВР-С на гидролитические характеристики изоформ сердечного миозина VI и УЗ. Характер влияния сМуВР-С на актин-зависимую Мд2+-АТФ-азную активность изоформ сердечного миозина VI и УЗ различен, что может иметь адаптивное значение при патологиях, связанных с изменением состава тяжёлых цепей миозина.

Впервые методом искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом исследовано влияние сМуВР-С на зависимость «рСа-скорость» для сердечного миозина кролика и его изоформ. Обнаружено, что сМуВР-С оказывает различное влияние на кальциевую чувствительность и коэффициент Хилла зависимости «рСа-скорость» изоформ сердечного миозина VI и УЗ.

Впервые выявлено влияние состава лёгких цепей миозина на характер взаимодействия сМуВР-С с акто-миозиновым комплексом.

Впервые исследовано влияние сМуВР-С на тропомиозиновую регуляцию акто-миозинового взаимодействия и показано, что это влияние зависит от типа миозина.

Научная и практическая значимость

Получены доказательства неадекватности использования быстрого скелетного миозина в качестве экспериментальной модели для изучения свойств сердечного миозин-связывающего белка С.

Получены новые данные о роли сердечного миозин-связывающего белка С в регуляции сокращений сердечной мышцы. С помощью искусственной подвижной системы и биохимических методов выявлено, что влияние сМуВР-С на процессы

кальциевой регуляции сократительной функции миокарда определяются составом тяжелых и лёгких цепей изоформ сердечного миозина, что может иметь значение при патологиях, связанных с изменением состава тяжёлых и легких цепей миозина.

Полученные в работе данные позволят понять механизмы нарушения сократительной функции миокарда при мутациях сМуВР-С, которые приводят к тяжёлой форме наследственной кардиомиопатии, так называемой «семенной гипертрофической кардиомиопатии» (familial hypertrophic cardiomyopathy).

Внедрение:

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре экспериментальной физики физико-технического факультета Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н.Ельцина; на кафедре нормальной физиологии ГОУ ВПО «Уральской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России».

Положения, выносимые на защиту:

1. Сердечный миозин-связывающий белок С (сМуВР-С) по-разному влияет на актин-зависимую Mg^-АТФ-азную активность быстрой и медленной изоформ сердечного миозина.

2. В искусственной подвижной системе добавление сМуВР-С модулирует кальциевую чувствительность и коэффициент кооперативности Хилла связи «рСа-скорость» сердечного миозина, а также специфически влияет на эти характеристики для быстрой и медленной изоформ сердечного миозина.

3. Состав легких цепей миозина влияет на характер взаимодействия сМуВР-С с акто-миозиновым комплексом.

4. Влияние сМуВР-С на тропомиозиновую регуляцию акто-миозинового взаимодействия зависит от типа миозина.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на XXXVI «European Muscle Congress» (Стокгольм, Швеция, 2007 г.); на международных конференциях «Biological motility:

Achievements and Perspectives» (г. Пущино, 2008 г.); «Biological motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (г. Пущино, 2010 г.); на международном форуме по нанотехнологиям (г. Москва, 2008).

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 5 публикаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной глав, обсуждения, выводов и списка литературы из 145 наименований. Диссертация изложена на 127 страницах, включая 34 рисунка и три таблицы.

Автор приносит благодарности д.ф.-м.н. Кацнельсону Л.Б. за консультации и обсуждение результатов; Копыловой Г.В. за сотрудничество в проведении экспериментов; к.б.н. Машанову Г.И. за предоставленную программу записи и обработки видеоизображения.

Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ, Программы фундаментальных исследований Президиума РАН, гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущей школы РФ.

Содержание работы

Обзор литературы

В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему моменту сведения о структуре и свойствах изоформ сердечного миозина и белков тонкого регулируемого филамента (актин, тропонин и тропомиозин). Детально рассмотрен механизм кальциевой регуляции сокращения миокарда. Особое внимание уделено работам по исследованию структуры и функциональных свойств сердечного миозин-связывающего белка С.

Материал и методы исследования

Растворы. Буфер AB состоял из 25 мМ KCl, 25 мМ имидазола, 4 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА и 10 мМ дитиотриэтола, pH 7,5.

Получение белков. Актин выделяли из ацетонового порошка по стандартной методике [Pardee and Spudich, 1982]. Сердечные тропомиозин и тропонин выделяли из миокарда левого желудочка сердца быка методами Sniille [Smille et al., 1982] и Potter [Potter et al., 1982] с небольшими модификациями. Сердечный миозин-связывающий белок С (сМуВР-С) был получен из куриных сердец по методу Hartzell и Glass [Hartzeil and Glass, 1985] с небольшими модификациями. После экстракции сМуВР-С осаждался сульфатом аммония до финального насыщения 55% и растворялся буфером, содержащим 70 мМ КС1, 10 мМ MES, 2 мМ NaN3, 0,1 мМ ЭДТА, 3 мМ 2-меркаптоэтанола, рН 6,45, и диализовался против этого же буфера. После диализа сМуВР-С был очищен с помощью жидкостной хроматографии (АКТА basic 10FPLC, Amersham Biosciences) на 5-mI HiTrap Q HP колонке с линейным градиентом от 70 мМ до 300 мМ NaCl в буфере следующего состава 10 мМ MES, 2 мМ NaN3, 0,1 мМ ЭДТА, 3 мМ 2-меркаптоэтанола, рН 6,45. сМуВР-С который элюировал в области 90-130 мМ по NaCl, концентрировали добавлением сульфата аммония с последующим центрифугированием при 15000 g в течение 15 минут. Осажденный сМуВР-С растворяли буфером АВ, содержащим 80 мМ КС1, и диализовали против этого же буфера. Чистоту полученных белков проверяли с помощью ПААГ-электрофореза.

Изоформа VI миозина была получена из миокарда левого желудочка гипертиреоидных, изоформа V3 - гипотиреоидных кроликов [Litten et al., 1985; vanBuren et al., 1995]. Миозин выделяли из левого желудочка сердца кролика по стандартной методике [Margossian and Lowey, 1982] с небольшими модификациями. Состав тяжелых цепей сердечного миозина проверялся методом ПААГ-электрофореза [van der Velden et al., 1999]. Миокард левого желудочка гипертиреоидных кроликов содержал преимущественно изоформу миозина VI (-90%), гипотиреоидных - изоформу миозина V3 (~90%). В день эксперимента неработающие молекулы миозина удаляли ультрацентрифугированием с F-актином и АТФ [Gordon et al., 1997].

Выделение изоформ скелетного миозина производили в соответствии с методом [Margossian and Lowey, 1982] с незначительными модификациями. Быстрый

скелетный миозин выделяли из спинной мышцы кролика, а медленный скелетный миозин выделяли из полумембранной мышцы кролика.

Получение реконструированной тонкой нити. Регулируемую тонкую нить, состоящую из актина, тропонина и тропомиозина реконструировали путем смешивания этих белков в следующих концентрациях: 400 нМ ТМРФ-F-aicraHa, 80 нМ тропонина и 100 нМ тропомиозина при 4 °С в буфере АВ. Соотношение белков в тонких нитях проверяли с помощью ПААГ-элекгрофореза [Laemmli et al., 1970].

Измерение АТФ-азной активности. Актин-активируемая Mg2+-AT(£>- азная активность миозина измеряли колориметрическим методом по свободному неорганическому фосфату [Kodama., et al 1986] при 28 °С в буфере АВ, содержащем 0,05 мкМ миозина, от 10 до 30 мкМ F-актина и 1 мМ АТФ. Основные параметры кинетики Михаэлиса-Ментен определялись с помощью графика Лайнуивера-Бэрка.

Са2+-регулируемая М§2+-АТФазная активность миозина определялась в присутствие регулируемого филамента, состоящего из актина, тропомиозина и тропонинового комплекса. Реакционная смесь при определении Са2+ -регулируемой Mg2+-АТФ-азной активности миозиновых филаментов содержала белки в следующих концентрациях: 0,05 мкМ миозиновых филаментов (по миозину), от 0,01 мкМ до 0,1 мкМ сМуВР-С; 10 мкМ актина, 2 мкМ тропомиозина и 2 мкМ тропонина. Са2+-ре1улируемая М§2+-АТФазная активность миозина была измерена при двух характерных концентрациях свободного кальция в растворе: ненасыщающей (рСа7) и насыщающей (рСа4).

Во всех экспериментах по измерению Mg2 ^-АТФ-азной активности миозина с сМуВР-С миозиновые филаменты предварительно инкубировались в течение 2 мин с сМуВР-С в соотношении молярных концентраций сМуВР-С к миозину: 1:5, 1:2, 1:1 и 2:1.

Необходимая концентрация свободного кальция достигалась добавлением в финальный раствор, содержащий АТФ и ЭГТА, соответствующего количества СаС12, которое было рассчитано с помощью доступной в интернете программы WEBMAXC STANDARD (http://www.stanford.edu/~cpatton/webmaxc/webmaxcS.htm').

Эксперименты на искусственной подвижной системе. Для установки был использован инвертированный флуоресцентный микроскоп (Axiovert 200 М, Carl Zeiss Microimaging GmbH), укомплектованный ртутной лампой HBO 100, набором фильтров для тетраметилродамина (ТРМФ) и масляно-имерсионным объективом Alpha Plan-Fluar 100x1,45 (Carl Zeiss Microimaging GmbH). Изображение меченого актина регистрировалось с помощью EMCCD видеокамеры (Andor) и записывалось на жесткий диск компьютера с помощью программы GMimPro [Mashanov et al., 2007].

Проточная камера состояла из предметного стекла с приклеенным к нему покровным стеклом, внутренняя поверхность которого была покрыта нитроцеллюлозой. 50 мкл миозина в высокоионном буфере AB, содержащем 500 мМ KCl, загружали в проточную камеру и инкубировали в течение 3 мин. Для каждого типа миозина мы использовали свою концентрацию миозина. Изоформы сердечного миозина и скелетный медленный миозин загружали в проточную камеру в концентрации 300 мкг/мл, а скелетный быстрый миозин загружали в камеру в концентрации 100 мкг/мл. Затем камеру промывали последовательно высоко- и низкоионным буфером AB и добавляли 50 мкл БСА в концентрации 0,5 мг/мл на 1 мин. Далее загружали 500 мкг/мл F-актина в буфере AB с 2 мМ АТФ на 5 мин для блокировки неработающих миозиновых головок; после чего камеру трижды промывали буфером AB. Далее добавляли 50 мкл раствора флуоресцентно меченых F-актина или тонких регулируемых филаментов в концентрации 10 нМ в буфере AB, содержащем 100 нМ тропонин и 100 нМ тропомиозини, и инкубировали 10 мин. Затем промывали камеру буфером AB с 0,5 мг/мл БСА, 3,5 мг/мл люкозы, 0,02 мг/мл каталазы, 0,15 мг/мл глюкозо-оксидазы, 20 мМ ДГТ, 2мМ АТФ и 0,5 % метиллцеллюлозы. В случае экспериментов с регулируемым тонким филаментом раствор с АТФ содержал дополнительно ЮОнМ тропонина и 100 нМ тропомиозина для предотвращения диссоциации регуляторных белков от актина. Необходимая концентрация свободного кальция в растворе достигалась добавлением Са2+-ЭГТА. Все эксперименты были выполнены при температуре 28 °С. В случае экспериментов с

сМуВР-С миозин предварительно инкубировали в течение 2 мин с сМуВР-С в соотношении молярных концентраций сМуВР-С к миозину: 1:5 и 1:2.

Построение зависимости «рСа-скоростъ». Для построения зависимости «рСа-скоросгь» были определены скорости скольжения регулируемого тонкого филамента по различным типам миозина при концентрациях кальция в растворе проточной камеры от рСа=4 до рСа=8. Скорость скольжения филаментов определяли с помощью компьютерной программы GMimPro. Кривая зависимости «рСа-скорость» была построена согласно уравнению Хилла методом наименьших квадратов:

V = Утах(1+"*'фСа'рС'а5о})~!, где V и У„ш - скорость при данном значении рСа и максимальная скорость при насыщающей концентрации кальция, соответственно; рСа$о -величина, при которой достигается половина максимальной скорости скольжения филаментов (кальциевая чувствительность), h - коэффициент кооперативное™ Хилла.

Статистическая обработка.

Эксперименты по определению АТФ-азной активности миозина проводились от трёх до шести раз. Значения Кт и Vmax представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Для построения зависимости «рСа-скорость» была усреднена скорость не менее 100-150 филаментов для каждого значения рСа в растворе.

Значения скоростей представлены как среднее значение^ ± стандартное отклонение.

Эксперименты по определению зависимости «рСа-скорость» были проведены трижды. Значения коэффициента Хилла и рСа50 для этих зависимостей получены для каждого эксперимента и усреднены. Значения скоростей, коэффициентов Хилла и рСа50 представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы «Microsoft Excel» и «Статистика 6.0», для оценки значимости различий использовался непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты и их обсуяедение

Для исследования влияния сердечного миозин-связывающего белка С на взаимодействие скелетных и сердечных изоформ миозина с филаментарным актином и регулируемым тонким филаментом мы провели эксперименты на искусственной подвижной системе, а также изучили влияние сМуВР-С на скорость гидролиза АТФ изоформами скелетного и сердечного миозина.

Для получения изоформ сердечного миозина двухмесячные кролики были подвергнуты обработке пропилтиоурацилом или трийодтиронином (тироксин или ТЗ-гормон). В результате под действием трийодтиронина доля изоформы VI миозина в миокарде увеличилась до 90%, а при ингибировании синтеза трийодтиронина пропилтиоурацилом увеличивалась доля изоформы УЗ миозина.

Для оценки чистоты полученных изоформ сердечного миозина VI и УЗ был проведён гель-электрофорез тяжелых цепей изоформ миозина из левых желудочков кроликов, обработанных пропилтиоурацилом и Ь-тироксином (рисунок 1).

Рисунок 1 - Денатурирующий полиакриламидный гель-электрофорез изоформ тяжелых цепей миозина из левых желудочков кроликов, обработанных пропилтиоурацилом (линия 1) и L-тироксином (линия 2). Примечание: аир- изоформы тяжёлых цепей сердечного миозина.

С целью изучения влияния лёгких цепей миозина на взаимодействие сМуВР-С с миозином и актином проводились эксперименты с медленным скелетным миозином. Медленный скелетный миозин содержит в своём составе ту же Р-цепь миозина, что и V3 изоформа сердечного миозина, так как эта цепь кодируется одним геном. У кролика в состав медленного скелетного миозина входят лёгкие цепи: LClsa, LClsb и sLC2. Для сравнения состава лёгких цепей сердечного миозина и медленного скелетного миозина был проведён гель-электрофорез в 10% ДСН-ПААГ (рисунок 2).

Рисунок 2 - Гель-злектрофорез медленного скелетного (левая колонка) и сердечного (правая колонка) миозинов в 10% ДСН-ПААГ.

Примечание: медленный скелетный миозин: LClsa, LClsb - существенные лёгкие цепи, LC2 - регуляторная лёгкая цепь и НСМ (slowj-тяжёлая цепь. Сердечный миозин: VCL1 - существенная лёгкая ърепь, УСЬ2-регуляторная лёгкая цепь и НСМ (сагсИас)-тяжёлая цепь.

Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на актин-активируемую М^-АТФ-азную активность изоформ скелетного и сердечного миозинов.

Результаты наших экспериментов продемонстрировали, что сМуВР-С не влияет на базовую АТФ-азную активность нзоформ скелетного и сердечного миозинов. Наши результаты согласуются с литературными данными [Moos et al., 1983; Hartzell, 1984]. По данным этих авторов сердечная изоформа белка С не влияла на базовую активность миозинов, как скелетного, так и сердечного. Мы также проверили это в отношении изоформ сердечного миозина VI и V3, что было сделано впервые.

Результаты экспериментов показали также, что сМуВР-С влияет на актин-активируемую АТФ-азную активность как сердечного миозина, так и его изоформ. Так, добавление сМуВР-С к сердечному миозину и к изомиозину V3 приводит к увеличению акгин-активируемой АТФ-азной активности на 50%. При добавлении сМуВР-С до молярного отношения сМуВР-С к миозину 1:2 Mg~+-АТФ-азная активность к изомиозину VI увеличивается на 20%. В дальнейшем с ростом концентрации сМуВР-С АТФ-азная активность VI падает до первоначального уровня. В то время как на АТФ-азная активность изоформ скелетного миозина сМуВР-С влияния не оказывает.

НСМ

(slow)

LC2

Чтобы оценить влияние сМуВР-С на кинетические характеристики актин-активируемой 1У^2+-АТФазной активности филаментов сердечного миозина, мы измерили Мд2+-АТФ-азную активность как функцию от концентрации актина в присутствии и отсутствие сМуВР-С. Результаты наших экспериментов показали, что сМуВР-С в физиологической концентрации (молярное отношение сМуВР-С к миозину 1:5) статистически достоверно не влияет на максимальную скорость гидролиза АТФ, Утах, и константу Михаэлиса, Кт. В следующей серии экспериментов оценивалось влияние сМуВР-С на кинетические характеристики актин-активируемои -АТФ -азной активности филаментов изомиозинов VI и УЗ, что было сделано впервые. Как оказалось, сМуВР-С в физиологической концентрации (молярное отношение сМуВР-С к миозину 1:5) не влияет статистически достоверно на максимальную скорость гидролиза АТФ, Vmax, и константу Михаэлиса, Кт.

Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на регулируемую Mg2+-ATФ-aзнyю активность филаментов изоформ скелетного и сердечного мнозинов.

Определение регулируемой М§2+-АТФазной активности миозина проводилось в присутствии тонкого филамента, т.е. актиновый филамент содержал тропомиозин и тропониновый комплекс. Поэтому, когда в растворе не было свободного кальция, Mg2+-ATФ -азная активность филаментов сердечного миозина отсутствовала. С увеличением концентрации свободного кальция -азная активность

филаментов сердечного миозина увеличивалась. Для наших экспериментов мы взяли две характерные концентрации свободного кальция в растворе: ненасыщающую (рСа7) и насыщающую (рСа4).

Результаты наших экспериментов показали, что на насыщающей (рСа4) и ненасыщающей (рСа7) концентрациях кальция присутствие сМуВР-С не оказывает влияния на регулируемую АТФ-азную активность изоформ сердечного миозина VI и УЗ. На насыщающей концентрации кальция сМуВР-С не оказывает влияния на АТФ-азную активность филаментов сердечного и медленного скелетного миозина.

Добавление сМуВР-С к миозиновым филаменггам сердечного и медленного скелетного миозина на ненасыщающей концентрации кальция (рСа7) приводит к увеличению АТФ-азной активности. Так, для сердечного миозина АТФ-азная активность увеличилась в два раза, а для медленного скелетного миозина увеличилась в полтора раза по сравнению с контролем.

Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на скорость движения филаментарного актина по изоформам скелетного и сердечного мнозннов.

Для сравнения влияния сМуВР-С на скорость движения актинового филамента для изоформ скелетного и сердечного миозинов в серии экспериментов на искусственной подвижной системе оценивалась зависимость скорости движения филаментарного актина от концентрации сМуВР-С в проточной камере.

В результате наших экспериментов было выявлено, что сМуВР-С не оказывал влияние на движение актина по скелетному быстрому миозину. В экспериментах с медленным скелетным миозином сМуВР-С не изменяло скорость движения Р-актина.

Также было обнаружено, что при соотношении сМуВР-С/миозин 1:5, сМуВР-С не влиял на скорость Б-актина, тогда как при отношении 1:2 сМуВР-С замедлял скорость движения филаментов (падение скорости составило ~20%) по сердечному миозину.

На рисунке 3 показано влияние сМуВР-С на скорость скольжения филаментарного актина по изоформам сердечного миозина VI и V3. Из рисунка видно, что скорость скольжения филаментарного актина различается для изоформ сердечного миозина VI и V3. Скорость скольжения филаментарного актина по изоформе VI значительно выше (1,1±0,09 мкм/с), чем по изоформе V3 (0,63±0,06 мкм/с). Добавление сМуВР-С тормозит движение филаментарного актина (панель А) по изоформам сердечного миозина VI и V3 (1,1 ±0,09 мкм/с против 0,58±0,05 мкм/с для VI и 0,63±0,06 мкм/с против 0,48±0,03 мкм/с для V3).

Рисунок 3 - Скорость скольжения филаментарного актина по изоформам сердечного миозина VI и V3 в присутствии и отсутствии сМуВР-С.

Примечание: сМуВР-С- сердечный миозчн-связывающий белок С. Концентрация миозина и сМуВР-С, загружаемых в проточную камеру, составляла 300 мкг/мл (0,65 мкМ) и 20 мкг/мл (0,13 мкМ), соответственно, что выражается в молярном отношение сМуВР-С/миозин как 1:5. Скорость представлена как среднее значение ± стандартное отклонение по трем экспериментам. Звездочками обозначены статистически достоверные отличия значения скоростей от контроля (без сМуВР-С), р<0,05.

Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на скорость движения реконструированного актин-тропомиозинового филамента по изоформам скелетного и сердечного миозинов.

В искусственной подвижной системе исследовали влияние тропомиозина на движение Р-актина по миозиновой поверхности, а также влияние сМуВР-С на движение актин-тропомиозинового филамента по миозину. Результаты наших экспериментов показали, что сердечный тропомиозин, выделенный из миокарда быка, тормозит движение Р-актина по сердечному миозину. Сердечный тропомиозин не влияет на скорость движения Р-актина по скелетному быстрому и медленному миозинам.

Добавление сМуВР-С в проточную камеру не влияет на скорость движения актин-тропомиозинового филамента по изоформам скелетного миозина. В свою очередь добавление сМуВР-С в проточную камеру приводит к увеличению скорости движения актин-тропомиозинового филамента по поверхности, покрытой сердечным миозином.

Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на связь «рСа-скорость» для изоформ скелетного и сердечного миозинов.

Для сравнения влияния сМуВР-С на связь «рСа-скорость» для изоформ скелетного и сердечного миозинов в серии экспериментов на искусственной подвижной системе оценивалась зависимость скорости движения реконструированного тонкого филамента от концентрации кальция в проточной камере (концентрацию кальция меняли в диапазоне от рСа5 до рСа8). Для кривой «рСа-скорость» оценивались как коэффициент Хилла, так и кальциевая чувствительность, определяемая величиной рСа50. В качестве моторного белка использовались быстрый скелетный миозин, медленный скелетный миозин, сердечный миозин, а также изоформы сердечного миозина.

Результаты наших экспериментов показали, что сМуВР-С не влияет на скорость движения регулируемого тонкого филамента на насыщающей концентрации кальция, кальциевую чувствительность (рСа50) и коэффициент Хилла кривой «рСа-скорость», полученной для скелетного быстрого миозина.

Добавление сМуВР-С повышает скорость движения тонкого филамента по медленному скелетному миозину при насыщающей концентрации кальция: скорость увеличивается с 3,20±0,2 мкм/с до 4,24±0,2 мкм/с . На ненасыщающей концентрации кальция (рСа7.5) добавление сМуВР-С увеличивает скорость движения регулируемого филамента: 1,24±0,19 мкм/с с С-белком против 0,48±0,08 мкм/с без сМуВР-С (рисунок 4). Добавление сМуВР-С также изменяет кальциевую чувствительность рСа50 (6,8±0,01 без сМуВР-С против 7,13±0,08 с сМуВР-С). Присутствие сМуВР-С в проточной камере влияет на коэффициент Хилла соотношения «рСа-скорость» (1,49±0,08 без сМуВР-С против 1,39±0,07 с сМуВР-С).

Добавление сМуВР-С в физиологической концентрации (отношение сМуВР-С/миозин 1:5) к сердечному миозину снижает скорость движения регулируемого филамента по миозину при насыщающей концентрации кальция. Так, скорость регулируемого филамента при рСа4 падает с 2,10±0,2 мкм/с до 1,70±0,09 мкм/с. Наоборот, добавление сМуВР-С на ненасыщающей концентрации кальция приводит

к увеличению скорости движения регулируемого филамента: 0,67±0,1 мкм/с с сМуВР-С против нулевой скорости без сМуВР-С. Добавление сМуВР-С также

Рисунок 4 - Кривые зависимости скорости скольжения регулируемого тонкого филамента по медленному скеленому миозину от концентрации свободного кальция.

Примечание: сМуВР-С- сердечный миозин-связывающий белок С. рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция. Сплошной линией обозначены значения скоростей, полученные в экспериментах на искусственной подвижной системе без сМуВР-С (-сМуВР-С), пунктирной - в присутствии сМуВР-С (+сМуВР-С). Концентрации миозина и сМуВР-С, загружаемых в проточную камеру, составляли 300 мкг/мл (0,65 мкМ) и 20 мкг/мл (0,13 мкМ), соответственно, что выражается в молярном отношение сМуВР-С/миозин как 1:5. Скорость представлена как среднее значение ± стандартное отклонение по трем экспериментам. Линия регрессии соответствует уравнению Хилла (см. методику).

изменяет кальциевую чувствительность (рСа50) с 6,3±0,01 без сМуВР-С до 6,7±0,2 с сМуВР-С. Наиболее чувствительным к наличию сМуВР-С оказался коэффициент Хилла: 3,7±0,5 без сМуВР-С против 0,7+0,08 с сМуВР-С (рисунок 5).

В экспериментах с VI изоформой сердечного миозина было показано, что сМуВР-С уменьшает скорость скольжения тонкого филамента на насыщающей концентрации кальция (1,73+0,08 мкм/с против 3,2±0,08 мкм/с без сМуВР-С). сМуВР-С не оказывал влияния на коэффициент Хилла и кальциевую чувствительность кривой «рСа-скорость», полученной в искусственной подвижной системе для VI миозина (рисунок 6А). Так коэффициент Хилла для кривой «рСа-скорость» без сМуВР-С составил 2,28±0,78, а с сМуВР-С 1,56±1,1. Кальциевая чувствительность (рСа50) кривой «рСа-скорость» без сМуВР-С составила 6,97±0,28, а с сМуВР-С 7,06±0,12.

рСа

Рисунок 5 - Кривые зависимости скорости скольжения регулируемого тонкого филамента по сердечному миозину от концентрации свободного кальция без сМуВР-С (1) и в присутствии сМуВР-С (2).

Примечание: рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция. сМуВР-С- сердечный миозин-связывающий белок С. Концентрации миозина и сМуВР-С, загружаемых в проточную камеру, составляли 300 мкг/мл (0,65 мкМ) и 20 мкг/мл (0,13 мкМ), соответственно, что выражается в молярном отношение сМуВР-С/миозин как 1:5. Скорость представлена как среднее значение ± стандартное отклонение по трем экспериментам. Линия регрессии соответствует уравнению Хилла (см. методику).

В то же время добавление сМуВР-С к изомиозину УЗ в искусственной подвижной системе приводило к уменьшению скорости скольжения тонкого филамента на насыщающей концентрации кальция (1,66±0,1 мкм/с против 2,1 ±0,02 мкм/с без сМуВР-С). сМуВР-С приводит к уменьшению коэффициента Хилла «рСа-скорость», а кальциевая чувствительность (рСа50) кривой не изменялась (рисунок 6Б). Так коэффициент Хилла для кривой «рСа-скорость» без сМуВР-С составил 1,4±0,18, а с сМуВР-С 0,7±0,14. Кальциевая чувствительность (рСа50) кривой «рСа-скорость» без сМуВР-С составила 7,2±0,2, а с сМуВР-С 7,06±0,1.

Возможные механизмы влияния сМуВР-С на кальциевую чувствительность и коэффициент Хилла могут быть связаны с опосредованным действием сМуВР-С через миозин. Результаты, полученные в эксперименте на искусственных подвижных системах, можно объяснить, предполагая, что сМуВР-С влияет на время, которое поперечные мостики находятся в присоединенном к актину состоянии, благодаря чему они способны увеличивать кооперативное присоединение мостиков вдоль тонкой нити.

Рисунок 6 - Нормированные кривые зависимости скорости скольжения регулируемого тонкого филамента по изоформам VI (панель А) и УЗ (панель Б) сердечного миозина от концентрации свободного кальция.

Примечание: рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция. сМуВР-С- сердечный миозин-связывающий белок С. Треугольниками обозначены значения скоростей без сМуВР-С (сплошная линия), полученные в экспериментах на искусственной подвижной системе, кружками — в присутствии сМуВР-С. (пунктирная линия). Концентрации миозина и сМуВР-С, загружаемых в проточную камеру, составляли 300 мкг/мл (0,65 мкМ) и 20 мкг/мл (0,13 мкМ), соответственно, что выражается в молярном отношение сМуВР-С/миозин как 1:5. Скорость представлена как среднее значение ± стандартное отклонение по трем экспериментам. Линия регрессии соответствует уравнению Хипла (см. методику).

Известны следующие кооперативные механизмы взаимодействия сократительных и регуляторных белков в миокарде. Первый - присоединение головки миозина в одной регуляторной группе (семь мономеров актина,

тропомиозин и тропониновый комплекс) способно вызвать смещение молекулы тропомиозина в этой и близлежащей регуляторной группе, что облегчает присоединение головки миозина в этой и близлежащих регуляторных группах. Второй - сильное связывание поперечных мостиков в одной регуляторной группе увеличивает сродство тропонина С к кальцию в этой и близлежащих регуляторных группах [Gordon et at., 2000]. Последний механизм является ключевым для объяснения целого ряда важнейших феноменов механозависимой активации сердечной мышцы [Izakov et at., 1991]. И в данном случае, с нашей точки зрения, он хорошо объясняет активирующий эффект сМуВр-С на ненасыщающем кальции, обнаруженный нами в экспериментах на искусственной подвижной системе. Действительно, увеличение времени присоединения миозина к актину увеличивает концентрацию поперечных мостиков в единицу времени и, согласно механизму кооперативное™, увеличивает сродство тропонина С к кальцию. Иными словами, при той же ненасыщающей концентрации кальция в присутствии сМуВР-С тонкая нить оказывается более активированной. Таким образом, сМуВР-С влияет на кинетику взаимодействия миозина с актином.

Выводы:

1. Сердечный миозин-связывающий белок С не влияет на гидролитические свойства медленного скелетного миозина, но увеличивает скорость гидролиза АТФ изоформами сердечного миозина кролика.

2. Сердечный миозин-связывающий белок С оказывает модулирующее влияние на регуляцию взаимодействия сердечного миозина кролика с тонким филаментом, предполагаемый механизм такого влияния заключается в изменении кинетики поперечных мостиков миозина при одновременном связывании сМуВР-С с актином и миозином.

3. Сердечный миозин-связывающий белок С специфически действует на кальциевую регуляцию сократительной активности миокарда в зависимости от изоформ сердечного миозина; это может влиять на адаптационную пластичность сердечной мышцы в норме и при патологии.

4. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на акто-миозиновое взаимодействие зависит от состава легких цепей миозина.

5. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на тропомиозиновую регуляцию акто-миозинового взаимодействия зависит от типа миозина.

Практические рекомендации:

Полученные данные по действию сердечного миозин-связывающего белка С (сМуВР-С) на кальциевую регуляцию сократительной активности миокарда в зависимости от изоформ сердечного миозина следует учитывать при разработке программ исследования адаптационной пластичности сердечной мышцы в норме и при патологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах:

1. Shchepkin D.V. Effects of cardiac myosin binding protein-C on the regulation of interaction of cardiac myosin with thin filament in an in vitro motility assay / D.V. Shchepkin, G.V. Kopylova, L.V. Nikitina, L.B. Katsnelson, B.Y. Bershitsky // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2010. - V. 401. - P. 159-163.

2. Shchepkin D.V. Assessment of the effect of cardiac myosin binding protein-C on 'pCa-velocity' relationship obtained in an in vitro motility assay / D.V. Shchepkin, G.V. Kopylova, B.Y. Bershitsky, L.V. Nikitina // J. General Physiology. - 2009. - 134 - la-2a.

3. Никитина JI.В. Исследование взаимодействия сократительных и регуляторных белков миокарда кролика методом искусственных подвижных систем / J1.B. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б Кацнельсон // Биохимия. - 2008. - Т. 73,№>2.-С. 219-227.

4. Никитина Л.В. Оценка механической активности сердечных изомиозинов VI и V3 методом искусственных подвижных систем с регулируемой тонкой нитью / Л.В. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б Кацнельсон // Биофизика. - 2008. - Т. 53, № 6. - С. 956-962.

5. Kopylova G.V. Mechanical characteristics of different rabbit cardiac isomyosins obtained in an in vitro motility assay with regulated thin filaments / G.V. Kopylova, L.V. Nikitina, D.V. Shchepkin, L.B. Katsnelson // J. Muscle Research and Cell Motility. - 2007. - Vol. 28.-P. 447.

Публикации в сборниках статей, материалах конференций:

6. Shchepkin D.V. Effects of cardiac myosin binding protein-C on myocardium contractile activity assessed in an in vitro motility assay / D.V. Shchepkin, G.V. Kopylova, L.V. Nikitina. // Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies: international symposium (Pushchino, May 11-15,2010). -Pushchino, 2010. - P. 237-239.

7. Nikitina L.V. pCa-Force relationship assessed in an in vitro motility assay for rabbit cardiac muscle / L.V. Nikitina, G.V. Kopylova, D.V. Shchepkin, L.B. Katsnelson // Biological Motility: Achievements and Perspectives: international symposium (Pushchino, May 11-15,2008). - Pushchino, 2008. - P. 44-48.

8. Никитина Jl.B. Связь «рСа-сила» миокарда кролика, полученная техникой in vitro подвижной системы / J1.B. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б. Кацнельсон // Сборник тезисов докладов участников Международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий. - М., 2008. - С. 512-513.

9. Копылова Г.В. Определение соотношения а - и р- тяжелых цепей сердечного миозина в миокарде различных животных методом одномерного SDS гель-электрофореза / Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.В. Никитина // Тезисы докладов XX съезда физиологического общества им. Павлова. - М., 2007. - С. 277.

Список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДСН - додецил сульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

ТМРФ - тетраметилродамин-фаллоидин

ТЦМ - тяжелые цепи миозина

ЭГТА - этиленгликоль тетрауксусная кислота

ЭДТА - этилдиметил тетрауксусная кислота

сМуВР-С - сердечный миозин-связывающий белок С

сТш - сердечный тропомиозин

F-актин - филаментарный актин

h - коэффициент Хилла

Кт - константа Михаэлиса

LC - легкие цепи миозина

MES - 2-(Ы-морфолино) этансульфоновая кислота

рСа - отрицательный десятичный логарифм концентрации кальция

ТпС - тропонин С

Vmax- максимальная скорость гидролиза АТФ

Щепкин Даниил Владимирович

Исследование вклада сердечного мнозин-связывающего белка С во взаимодействие сократительных белков миокарда

Специальность 03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 14.05.2011 Тираж 120 экз. Заказ № 515

Отпечатано с готовых файлов заказчика в ИП Звозников А.Н. Салон оперативной печати «Копирус». 620072, г. Екатеринбург, ул. Сыромолотова, 18/1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щепкин, Даниил Владимирович

Список сокращений

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сердечная поперечнополосатая мышечная ткань

1.2. Структура саркомера

1.3. Структура тонкого филамента

1.4. Вызванные кальцием структурные изменения в тонком филаменте

1.5. Кооперативность

1.6. Структура и свойства миозина

1.7. Структура и свойства сердечного миозин-связывающего белка-С (сМуВР-С)

1.8. Регуляторная функция сердечного миозин-связывающего белка-С (сМуВР-С)

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ

2.1. Получение мышечных белков

2.2. Определение АТФ-азной активности миозина

2.3. Турбидиметрия

2.4. Метод искусственной подвижной системы

2.5. Статистическая обработка данных

Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ СЕРДЕЧНОГО

МИОЗИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЖА С (сМуВР-С)

Глава 4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СЕРДЕЧНОГО

МИОЗИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЖА С С АКТИНОМ

Глава 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СЕРДЕЧНОГО

МИОЗИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА С С МИОЗИНОМ 60 5.1. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на актин-активируемую Mg2+-ATФ-aзнyю активность изоформ скелетного и сердечного миозинов

5.2. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на регулируемую Mg -АТФазную активность филаментов изоформ скелетного и сердечного миозинов

5.3. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на скорость движения филаментарного актина по изоформам скелетного и сердечного миозинов

5.4. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на скорость движения реконструированного актин-тропомиозинового филамента по изоформам скелетного и сердечного миозинов

5.5. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на связь «рСа-скорость» для изоформ скелетного и сердечного миозинов

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование вклада сердечного миозин-связывающего белка C во взаимодействие сократительных белков миокарда"

Актуальность

Известно, что сократительный аппарат кардиомиодита содержит собственно сократительные белки - миозин и актин, а также регуляторные белки тропонин и тропомиозин. Миозин вместе с актином участвует в механизме превращения химической энергии АТФ в механическую работу. Миозин миокарда млекопитающих представлен двумя основными изоформами - VI и V3. Изоформа VI является гомодимером а-тяжелых цепей, a изоформа V3 — гомодимером |3-тяжелых цепей. Изоформы сердечного миозина различаются по своим функциональным характеристикам. Кроме того, на характеристики миозина оказывают влияние легкие цепи. Различие в соотношениях изоформ V1/V3 в различных слоях миокарда непосредственно влияет на насосную функцию сердца [41].

Толстый филамент саркомера кардиомиоцита содержит кроме миозина, другие белки, в частности, сердечный миозин-связывающий белок С (сМуВР-С). В начале 70-х годов с помощью иммуногистохимии было продемонстрировано, что сМуВР-С располагается в А-диске так называемой С-зоны области перекрытия толстых и тонких нитей саркомера кардиомиоцита [105, 133]. С тех пор считалось, что сМуВР-С выполняет структурную роль в организации толстых и тонких филаментов в саркомере.

В исследованиях последних лет установлено, что сердечный миозин-связывающий белок С играет не только структурную роль, но и принимает участие в регуляции сокращений сердечной мышцы. При этом предполагалось, что регуляторная функция сМуВР-С состоит в его влиянии на формирование акто-миозинового комплекса [19].

В работе Richard с соавторами [46], выполненной в рамках международного исследования EUROGENE Heart Failure Project, было показано, что причиной семейной гипертрофической кардиомиопатии являются мутации в 9 генах, кодирующих белки саркомера миофибрилл кардиомиоцита. В этой работе было показано, что почти половина (43%) наследственных кардиомиопатий связана с мутацией в гене, кодирующем сердечную изоформу миозин-связывающего белка С. На данный момент известно 165 мутаций этого белка, способных вызвать гипертрофическую кардиомиопатию.

В связи с этими данными были проведены эксперименты по моделированию развития гипертрофической кардиомиопатии на мышах, нокаутных по гену сердечного миозин-связывающего белка С. Отсутствие сМуВР-С в сердце таких мышей приводило к гипертрофической кардиомиопатии [86, 67], которая характеризовалась утолщением стенки левого желудочка, а также её фиброзом. У таких мышей наблюдались также функциональные нарушения сократимости миокарда, выражающиеся в уменьшении фракции выброса и максимальной конечно-систолической жесткости левого желудочка при отсутствии изменений в максимальной скорости развития напряжения [86].

В экспериментах на трабекулах, изолированных из миокарда нокаутных по гену сМуВР-С мышей, 81е1гег с соавторами в 2006 году было найдено, что его отсутствие приводило к увеличению скорости ненагруженного укорочения. Было также показано, что влияние сМуВР-С на регуляцию сокращений, т.е. на связь «рСа-сила», крайне противоречиво: в разных экспериментальных моделях гипертрофической кардиомиопатии на мышах сМуВР-С либо влиял, либо не влиял на коэффициент кооперативности Хилла и кальциевую чувствительность связи 'рСа-сила' [123, 86]. Такие противоречия объясняли тем, что при отсутствии сМуВР-С в кардиомиоците могут запускаться различные компенсаторные процессы, которые выражаются в смене изоформ сердечного миозина с быстрой VI на медленную УЗ, а также в изменении степени фосфорилирования белков саркоплазматического ретикулума [23].

К настоящему времени имеется лишь несколько публикаций по исследованию влияния сМуВР-С на кальциевую регуляцию взаимодействия актина с миозином, выполненных на уровне взаимодействующих молекул сократительных белков, т.е. на искусственной подвижной системе, причём во всех из них в качестве экспериментальной модели использовалась быстрая изоформа скелетного миозина [44]. В результате открытым оставался вопрос о корректности этой модели для изучения влияния сМуВР-С на сократительную функцию миокарда и ее регуляцию. Опубликована только одна работа, в которой сМуВР-С и сердечный миозин использовались в искусственной подвижной системе одновременно, но в этой работе вопрос регуляторной роли сМуВР-С не затрагивался [24].

Таким образом, до настоящего времени вопрос о влиянии сМуВР-С на регуляцию взаимодействия тонкого филамента как с сердечным миозином, так и его отдельными изоформами не ставился.

Методически наши исследования регулирующего влияния сМуВР-С на акто-миозиновый комплекс основаны на использовании искусственной подвижной системы, а также измерении скорости гидролиза АТФ миозином и его изолированными изоформами.

Цель работы: исследование молекулярных механизмов влияния сердечного миозин-связывающего белка С (сМуВР-С) на характеристики взаимодействия сократительных и регуляторных белков сердечной мышцы.

Задачи:

1. Исследовать влияние сМуВР-С на гидролитические свойства изоформ скелетного и сердечного миозина кролика.

2. С помощью метода искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом исследовать влияние сМуВР-С на зависимость скорости движения тонкого филамента по сердечному миозину кролика от концентрации кальция.

3. С помощью метода искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом исследовать влияние сМуВР-С на зависимость скорости движения тонкого филамента по изоформам сердечного миозина кролика от концентрации кальция.

4. Исследовать влияние сМуВР-С на взаимодействие регулируемого тонкого филамента с изоформами скелетного и сердечного миозина, используя искусственную подвижную систему.

5. Исследовать влияние сМуВР-С на тропомиозиновую регуляцию акто-миозинового взаимодействия методом искусственной подвижной системы.

Научная новизна

Впервые исследовано влияние сМуВР-С на гидролитические характеристики изоформ сердечного миозина VI и УЗ. Характер влияния сМуВР-С на актин-зависимую М^2+-АТФ-азную активность изоформ сердечного миозина VI и УЗ различен, что может иметь адаптивное значение при патологиях, связанных с изменением состава тяжёлых цепей миозина.

Впервые методом искусственной подвижной системы с регулируемым тонким филаментом исследовано влияние сМуВР-С на зависимость «рСа-скорость» для сердечного миозина кролика и его изоформ. Обнаружено, что сМуВР-С оказывает различное влияние на кальциевую чувствительность и коэффициент Хилла зависимости «рСа-скорость» изоформ сердечного миозина VI и УЗ.

Впервые выявлено влияние состава лёгких цепей миозина на характер взаимодействия сМуВР-С с акто-миозиновым комплексом.

Впервые исследовано влияние сМуВР-С на тропомиозиновую регуляцию акто-миозинового взаимодействия и показано, что это влияние зависит от типа миозина.

Научная и практическая значимость

Получены доказательства неадекватности использования быстрого скелетного миозина в качестве экспериментальной модели для изучения свойств сердечного миозин-связывающего белка С.

Получены новые данные о роли сердечного миозин-связывающего белка С в регуляции сокращений сердечной мышцы. С помощью искусственной подвижной системы и биохимических методов выявлено, что влияние сМуВР-С на процессы кальциевой регуляции сократительной функции миокарда определяются составом тяжелых и лёгких цепей изоформ сердечного миозина, что может иметь значение при патологиях, связанных с изменением состава тяжёлых и легких цепей миозина.

Полученные в работе данные позволят понять механизмы нарушения сократительной функции миокарда при мутациях сМуВР-С, которые приводят к тяжёлой форме наследственной кардиомиопатии, так называемой «семейной гипертрофической кардиомиопатии» (familial hypertrophic cardiomyopathy).

Внедрение:

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре экспериментальной физики физико-технического факультета Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н.Ельцина; на кафедре нормальной физиологии ГОУ ВПО «Уральской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития России».

Положения, выносимые на защиту:

1. Сердечный миозин-связывающий белок С (сМуВР-С) по-разному влияет I на актин-зависимую Mg -АТФ-азную активность быстрой и медленной изоформ сердечного миозина.

2. В искусственной подвижной системе добавление сМуВР-С модулирует кальциевую чувствительность и коэффициент кооперативности Хилла связи «рСа-скорость» сердечного миозина, а также специфически влияет на эти характеристики для быстрой и медленной изоформ сердечного миозина.

3. Состав легких цепей миозина влияет на характер взаимодействия сМуВР-С с акто-миозиновым комплексом.

4. Влияние сМуВР-С на тропомиозиновую регуляцию акто-миозинового взаимодействия зависит от типа миозина.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на XXXVI «European Muscle Congress» (Стокгольм, Швеция, 2007 г.); на международных конференциях «Biological motility: Achievements and Perspectives» (г. Пущино, 2008 г.); «Biological motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (r. Пущино, 2010 г.); на международном форуме по нанотехнологиям (г. Москва, 2008).

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 5 публикаций. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной глав, обсуждения и списка литературы из 145 наименований. Диссертация изложена на 127 страницах, включая 34 рисунка и три таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Щепкин, Даниил Владимирович

ВЫВОДЫ:

1. Сердечный миозин-связывающий белок С не влияет на гидролитические свойства медленного скелетного миозина, но увеличивает скорость гидролиза АТФ изоформами сердечного миозина кролика.

2. Сердечный миозин-связывающий белок С оказывает модулирующее влияние на регуляцию взаимодействия сердечного миозина кролика с тонким филаментом, предполагаемый механизм такого влияния заключается в изменении кинетики поперечных мостиков миозина при одновременном связывании сМуВР-С с актином и миозином.

3. Сердечный миозин-связывающий белок С специфически действует на кальциевую регуляцию сократительной активности миокарда в зависимости от изоформ сердечного миозина; это может влиять на адаптационную пластичность сердечной мышцы в норме и при патологии.

4. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на акто-миозиновое взаимодействие зависит от состава легких цепей миозина.

5. Влияние сердечного миозин-связывающего белка С на тропомиозиновую регуляцию акто-миозинового взаимодействия зависит от типа миозина.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные по действию сердечного миозин-связывающего белка С (сМуВР-С) на кальциевую регуляцию сократительной активности миокарда в зависимости от изоформ сердечного миозина следует учитывать при разработке программ исследования адаптационной пластичности сердечной мышцы в норме и при патологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щепкин, Даниил Владимирович, Екатеринбург

1. Бендолл Дж. Мышцы, молекулы, и движение. Очерк по мышечному сокращению: пер. с англ. / Дж. Бендолл. — М.: Мир, 1970.-256 с.

2. Бэгшоу К. Мышечное сокращение: пер. с англ. / К. Бэгшоу — М.: Мир, 1985. 128 с.

3. Исследование взаимодействия сократительных и регуляторных белков миокарда кролика методом искусственных подвижных систем / JI.B. Никитина, Г.В. Копылова, Д.В. Щепкин, Л.Б. Кацнельсон // Биохимия. 2008. - Т. 73, №2. - С. 219-227.

4. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-Боуден. М.: Мир, 1979. - 280 с.

5. Курганов Б. И. Аллостерические ферменты / Б.И. Курганов. -М.: Наука, 1978.-248 с.

6. Применение метода in vitro подвижных систем для исследования кальций-механической связи в скелетной и сердечной мышцах / Г.В. Копылова, Л.Б. Кацнельсон, Д.А. Овсянников, С.Ю. Бершицкий, Л.В. Никитина // Биофизика. 2006. - Т. 51, №5. - С. 781-785.

7. A new in vitro motility assay technique to evaluate calcium sensitivity of the cardiac contractile proteins / M. Sata, H. Yamashita, S.Sugiura, H. Fujita, S. Momomura, T. Serizawa // Pfluger Arch, 1995. -Vol. 429.-P. 443 -445.

8. Activation of myocardial contraction by the N-terminal domains of myosin binding protein-C / T.J. Herron, E. Rostkova, G. Kunst, R. Chaturvedi, M. Gautel, J. C. Kentish Circ. Res, 2006. Vol. 98. - P. 1290-1298.

9. Alterations in contractile protein composition and function in human atrial dilatation and atrial fibrillation / S. Eiras, N.A. Narolska, R.B. van Loon, N.M. Boontje, R. Zaremba, C.R. Лтепег, F.C. Visser,

10. W. Stooker, J. van der Velden, G.J.M. Stienen // J Mol and Cell Cardiology, 2006. Vol. 41. - P. 467-477.

11. Barefield D. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease // D. Barefield, S. Sadayappan // J. Mol. Cell. Cardiol, 2010. Vol.48. - P. 866 - 875.

12. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal Biochem, 1976. Vol.72. - P. 248 -254.

13. Ca -regulated structural changes in troponin / M.V. Vinogradova, D.B. Stone, G.G. Malanina, C. Karatzaferi, R. Cooke, R. A. Mendelson, and R.J. Fletterick // Proc Natl Acad Sci USA, 2005. -Vol. 102.-P. 5038-5043.

14. Calcium regulation of skeletal muscle thin filament motility in vitro / A.M. Gordon, M.A. LaMadrid, Y. Chen, Z. Luo, P.B.Chase // J. Biophys, 1997. Vol. 72. - P. 1295-1307.

15. Calcium regulation of thin filament movement in an in vitro motility assay / E. Homsher, B. Kim, A. Bobkova, L.S. Tobacman // J. Biophys. 1996. Vol. 70. - P. 1881-1892.

16. Cardiac myosin binding protein C its role in physiology and disease / E. Flashman, C. Redwood, J. Moolman-Smook, H. Watkins // Circ. Res. 2004. Vol.94. - P.1279-1289.

17. Cardiac myosin binding protein c phosphorylation is cardioprotective / S. Sadayappan, H. Osinska, R. Klevitsky, J. N. Lorenz, M. Sargent, J.D. Molkentin, C.E. Seidman, J.G. Seidman, and J. Robbins//PNAS. 2006. - Vol. 103. - P. - 16918-16923.

18. Cardiac myosin binding protein-C modulates actomyosin binding and kinetics in the in vitro motility assay / W. Saber, K.J. Begin, D.M. Warshaw, P. VanBuren // J. Mol. Cell. Cardiol. 2008. - Vol. 44. - P. 1053-1061.

19. Cardiac Myosin Binding Protein-C Phosphorylation in a P-Myosin Heavy Chain Background / S. Sadayappan, J. Gulick, R. Klevitsky, J.N. Lorenz, M. Sargent, J.D. Molkentin, J. Robbins // Circulation. 2009. -Vol. 119.-P. 1253-1262.

20. Cardiac myosin-binding protein C decorates F-actin: implications for cardiac function / A.E. Whittena, C.M. Jeffries, S.P. Harris, and J. Trewhella // PNAS.-2008. Vol.105. - P. 18360-18365.

21. Cardiac myosin-binding protein C modulates the tuning of the molecular motor in the heart / Y.Lecarpentier, N. Vignier, P. Oliviero,

22. A. Guellich, L. Carrier, C. Coiraulty // J. Biophys. 2008. - Vol. 77. -P. 720-728.

23. Cardiac VI and V3 myosins differ in their hydrolytic and mechanical activities in vitro / P. VanBuren, D.E. Harris, R.A. Norman, D.M. Warshaw // Circ. Res. 1995. - Vol. 77. - P. 439-444.

24. Carnes C. A. Age-dependent changes in contraction and regional myocardial myosin heavy chain isoform expression in rats / C. A. Carnes, T. P. Geisbuhler, and P. J. Reiser // J. Appl. Physiol. 2004. -Vol. 97.-P. 446-453.

25. Characterisation of the sarcomeric myosin heavy chain multigene family in the laboratory guinea pig / D.P. Tonge, S.W. Jones, R.G Bardsley and T. Parr // BMC Molec. Biol. 2010. - Vol. 52. - P. 1- 8.

26. Chizzonite R.A. Comparison of myosin heavy chains in atria and ventricles from hyperthyroid, hypothyroid, and euthyroid rabbits / R.A. Chizzonite, A.W. Everett, G. Prior, and R. Zak // J. Biol. Chem. 1984. - Vol. 259.-P. 15564-15571.

27. Cooperative binding to the Ca2+-specific sites of troponin C in regulated actin and actomyosin / Z. Grabarek, J. Grabarek, P.C. Leavis, J. Gergely // J. Biol. Chem. 1983. - Vol. 258. - P. 14098 — 14102.

28. Danzi S. Posttranscriptional regulation of myosin heavy chain expression in the heart by triiodothyronine / S. Danzi, I. Klein // Am J

29. Physiol Heart Circ Physiol. 2005. - Vol. 288. - P. 455-460.i

30. Differential interaction of cardiac, skeletal muscle, and yeast tropomyosins with fluorescent (pyrene 235) yeast actin / W. Chen, Kuo-Kuang Wen, A.E. Sens, and P.A. Rubenstein // J. Biophysical. 2006. -Vol. 90.-P. 1308- 1318.

31. Differential roles of regulatory light chain and myosin binding protein-C phosphorylations in the modulation of cardiac force development / B.A. Colson, M. R. Locher, T. Bekyarova, J. R. Patel, D.

32. P. Fitzsimons, T. C. Irving and R. L. Moss // J. Physiol. 2010. -Vol.588-P. 981 -993.

33. Dillman W.H. Diabetes mellitus induces changes in cardiac myosin of the rat / W.H. Dillman // Diabetes. 1980. - Vol. 29. - P. 579 -582.

34. Distribution and Structure-Function Relationship of Myosin Heavy Chain Isoforms in the Adult Mouse Heart / M. Krenz, S. Sadayappan, H.E. Osinska, J. Henry, S. Beck, D.M. Warshaw, J. Robbins // J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282. - P. 24057 - 24064.

35. Distribution of myosin isozymes within single cardiac cells. An immunohistochemical study / J. Samuel, L. Rappoport, J. Mercadier, A. Lompre, S. Sartore, C. Triban, S. Schiaffino, K. Schwartz // Circ. Res. -1983. Vol. 52. - P. 200-209.

36. Dynamic interaction between cardiac myosin isoforms modifies velocity of actomyosin sliding in vitro / M. Sata, S. Sugiura, H. Yamashita, S. Momomura, T. Serizawa // Circ. Res. 1993. - Vol. 73. — P. 696-704.

37. Eisenberg E. The adenosine triphosphatase activity of acto-heavy meromyosin. A kinetic analysis of actin activation / E. Eisenberg, C. Moos // Biochemistry. 1968. - Vol. 7. - P. 1486-1489.

38. Fitzsimons D.P. Aging-dependent depression in the kinetics of force development in rat skinned myocardium / D.P. Fitzsimons, J. R. Patel, and R. L. Moss // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 1999. -Vol.276.-P. 1511-1519.

39. Fitzsimons D.P. Role of myosin heavy chain composition in kinetics of force development and relaxation in rat myocardium / D.P. Fitzsimons, J. R. Patel, and R. L. Moss // J. Physiol. 1998. - Vol.513. -P. 171-183.

40. Fraser I.D. In vitro motility analysis of actin-tropomyosin regulation by troponin and calcium / I.D. Fraser, S.B. Marston // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 7836-7841.

41. Freiburg A. A molecular map of the interactions between titin and myosin-binding protein C. Implications for sarcomeric assembly in familial hypertrophic cardiomyopathy / A. Freiburg, M. Gautel // Eur. J.Biochem- 1996.- Vol. 235.-P. 317-323.

42. Funatsu T. Structural and functional reconstitution of thin filaments in skeletal muscle // J. Muscle Research and Cell Motility. -1994.-Vol.15.-P. 158-171.

43. Functional differences between the N-terminal domains of mouse and human myosin binding protein-C / J.F. Shaffer, P. Wong, K.L. Bezold, S.P. Harris // J. Biomed. Biotechnol. 2010. Vol.5. - P. 789798.

44. Geeves M.A. Structural mechanism of muscle contraction / M.A. Geeves and K.C. Holmes // Annu. Rev. Biochem. 1999. - Vol.68. - P. 687-728.

45. Giulian G.G. Improved methodology for analysis and quantitation of proteins on one-dimensional silver-stained slab gels / G.G. Giulian, R.L. Moss, M .Greaser // Anal Biochem. 1983. - Vol. 129, № 2. - P. 277-287.

46. Gordon A.M. Regulation of contraction in striated muscle / A.M. Gordon, E. Homsher, M. Regnier // Physiol Rev. 2000. - Vol.80. - P. 853-924.

47. Gordon A.M. Skeletal and cardiac muscle contractile activation: tropomyosin "rocks and rolls" / A.M. Gordon, M. Regnier, E. Homsher //News Physiol Sci. 2001. - Vol. 16.-P. 49—55.

48. Gruen M. Mutations in beta-myosin S2 that cause familial hypertrophic cardiomyopathy (FHC) abolish the interaction with the regulatory domain of myosin-binding protein-C / M. Gruen, M. Gautel // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 286. - P. 933-949.

49. Hartzell H.C. Phosphorylation of purified cardiac muscle Cprotein by purified cAMP-dependent and endogenous Ca2+-calmodulin dependent protein kinases / H.C. Hartzell, D.B. Glass // J. Biol. Chem. 1984. - Vol. 259. - P. 15587-15596.

50. Hartzell H.C. Effects of Phosphorylated and Unphosphorylated C-protein on Cardiac Actomyosin ATPase / H.C Hartzell // J. Mol. Biol. -1985.-Vol. 186.-P. 185-95.

51. Heterogeneity of myosin isozyme content of rabbit heart / R.Z. Litten, B.J. Martin, R.H. Buchthal, R. Nagai, R.B. Low, N.R. Alpert // Circ. Res. 1985. - Vol. 57. - P. 406 — 414.

52. Hofmann P.A. Alterations in Ca2+ sensitive tension due to partial extraction of C-protein from rat skinned cardiac myocytes and rabbit skeletal muscle fibers / P.A.Hofmann, H.C Hartzell, R.L Moss // J. Gen. Physiol. 1991. - Vol. 97. - P. 1141-1163.

53. Hoh J.F.Y. Electrophoretic analysis of multiple forms of rat cardiac myosin: effect of hypophysectomy and thyroxine replacement / J.F.Y. Hoh, P.A. McGrath, P. Hale // J. Mol and Cell Cardiol. 1977. -Vol. 10.-P. 1053-1076.

54. Homsher E. Regulation of force and unloaded sliding speed in single thin filaments: effects of regulatory proteins and calcium / E. Homsher, D.M. Lee, D. Pavlov and L.S. Tobacman // J. Physiol, 2000. -Vol. 524.-P. 233 -243.

55. Honda H. Calcium triggered movement of regulated actin in vitro / H. Honda, S. Asakura // J. Mol. Biol. 1989. - V. 205. - P. 677 - 683*

56. Huxley A.F. Muscle structure and theories of contraction / A.F. Huxley // Progress in Biophysics and Biophysical Chemistry. 1957. -Vol. 7.-P. 255—318.

57. Hypercontractile properties of cardiac muscle fibers in a knock-in mouse model of cardiac myosin-binding protein-C / C.C. Witt, B. Gerull, M.J. Davies, T. Centner, W.A. Linke, L. Thierfelder // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 5353-5359.

58. Hypertrophic cardiomyopathy in cardiac myosin binding protein-C knockout mice / S.P. Harris, C.R.Bartley, T.A. Hacker, K.S. McDonald, P.S. Douglas, M.L. Greaser, P.A. Powers, R.L. Moss // Circ. Res. -2002. Vol. 90. - P. 594-601.

59. Identification of cardiac myosin-binding protein C as a candidate biomarker of myocardial infarction by proteomics analysis / S. Jacquet,

60. X. Yin, P. Sicard, J. Clark, G.S. Kanaganayagam, M. Mayr, M.S. Marber // Mol. & Cell. Proteomics. 2009. - Vol. 12. - P. 2687 - 2699.

61. In vivo left ventricular functional capacity is compromised in cMyBP-C null mice / S. Brickson, D. P. Fitzsimons, L. Pereira, T. Hacker, H. Valdivia, and R.L. Moss // Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 2007. - Vol. 292. - P. 1747-1754.

62. Influence of viscosity on myocardium mechanical activity: A mathematical model / L.B. Katsnelson, L.V. Nikitina, D .Chemla, O.E. Solovyova, C. Coirault, Y .Lecarpentier, V.S. Markhasin // J. Theor. Biol. 2004. - Vol. 230, № 3. - P. 385-405.

63. James J. Signaling and myosin-binding protein C / J. James and J. Robbins // J. Biol. Chem. 2011. - Vol. 286. - P. 9913 - 9919.

64. Janson L.W. Actin-binding proteins regulate the work performed by myosin II motors on single actin filament / L.W. Janson, J.R. Sellers, D.L. Taylor // Cell. Motil. Cytoskel. 1992. - Vol. 22. - P. 274-280.

65. Katsnelson L.B. Mathematical modeling of relations between the kinetics of free intracellular calcium and mechanical function of myocardium / L.B. Katsnelson, V.S. Markhasin // J. Mol. Cell. Cardiol. 1996. - Vol. 28, №3. - P. 475—486.

66. Katz A.M. Physiology of the heart / A.M. Katz. Lippincott : Williams & Wilkins, 2001. - 718 p.

67. Kinetic differences at the single molecule level account for the functional diversity of rabbit cardiac myosin isoforms / K.A. Palmiter, M.J. Tyska, D.E. Dupius, N.R. Alpert, D.M. Warshaw // J. Physiol. -1999.-Vol. 519.-P. 669-678.

68. Koretz J.F. The aggregation characteristics of column-purified rabbit skeletal myosin in the presence and absence of C-protein at pH 7.0 / J.F. Koretz, L.M. Coluccio, A.M. Bertasso // J. Biophys. 1982. -Vol. 37.-P. 433-440.

69. Kron S.J. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface / S.J. Kron, J.A. Spudich // PNAS. 1986. - Vol. 83. - P. 6272-6276.

70. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. -Vol. 227. № 5259. - P. 680-685.

71. Length and protein kinase A modulations of myocytes in cardiac myosin binding protein C-deficient mice / O. Cazorla, S. Szilagyi, N. Vignier, G. Salazar, E. Kramer, G. Vassort, L. Carrier, A. Lacampagne // Cardiovasc. Res. 2006. - Vol.69. - P. 370-380.

72. Loaded shortening, power output, and rate of force redevelopment are increased with knockout of cardiac myosin binding protein-C / F.S. Korte, K.S. McDonald, S.P. Harris, R.L. Moss // Circ.Res. 2003. -Vol. 93.-P. 752-758.

73. Machackova J. Molecular defects in cardiac myofibrillr proteins due to thyroid hormone imbalance and diabetes / J. Machackova, J. Barta, and N.S. Dhalla // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2005. - Vol. 83. -P. 1071- 1091

74. Malmqvist Ulf.P. Cardiac myosin isoforms from different species have unique enzymatic and mechanical properties / Ulf.P. Malmqvist, A. Aronsham, S. Lowey // Biochemistry. 2004. - Vol. 43. - P. 1505815065.

75. Margossian S.S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle /S.S. Margossian, S. Lowey // Methods. Enzymol. 1982.-Vol. 85.-P. 55-71.

76. Margossian S.S. Reversible dissociation of dog cardiac myosin regulatory light chain 2 and its influence on ATP hydrolysis / S.S. Margossian // J. Biol. Chem. 1985. - Vol. 260. - P. 13747-13754.I

77. Martyn D.A. Ca and Cross-Bridge-Dependent Changes in N-and C-Terminal Structure of Troponin C in Rat Cardiac Muscle / D.A. Martyn, M. Regnier, D. Xu, and A. M. Gordon // J. Biophysic. - 2001. -Vol. 80.-P. 360-370.

78. Martyn D.A. Influence of Length on Force and Activation-Dependent Changes in Troponin C Structure in Skinned Cardiac and Fast Skeletal Muscle / D.A. Martyn and A.M. Gordon // J Biophysic. -2001.-Vol.80.-P. 2798-2808.

79. Mashanov G.I. Automatic detection of single fluorophores in live cells / G.I. Mashanov, J.E. Molloy // J. Biophys. 2007. - Vol. 92. - P. 21992211.

80. McKillop, D. F. Regulation of the interaction between actin and myosin subfragment 1: evidence for three states of the thin filament / D.F. McKillop, and M. A. Geeves // J. Biophys. 1993. - Vol. 65. - P. 693-701.

81. Molecular mechanics of mouse cardiac myosin isoforms / N. R. Alpert, C. Brosseau, A. Federico, M. Krenz, J. Robbins, and D. M. Warshaw, // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2002. - Vol.283. - P. 1446-1454

82. Movement and force produced by a single myosin head / J. E. Molloy, J. E. Burns, J. Kendrick-Jones, R. T. Tregear, D. C. S. White // Nature. 1995. - Vol. 378. - P. 209-212.

83. Myosin from failing and non-failing human ventricles exhibit similar contractile properties / T. Noguchi, P. Jr. Camp, S.L. Alix, J.A.

84. Gorga, K.J. Begin, B.J. Leavitt, F.P. Ittleman, N.R. Alpert, M.M. LeWinter, P. Van'Buren // J. Mol and Cell Cardiol. 2003. - Vol. 35. -P. 91-97.

85. Myosin isoenzyme redistribution in chronic heart overload / A.M. Lompre, K. Schwaetz, A. d'Albis, G. Lacombe, N. van Thiem, B. Swynghedauw, // Nature. 1979. - Vol. 282. - P. 105-107.

86. Myosin isozymic distribution correlates with speed of myocardial contraction / K. Schwartz, Y. Lecarpentier, J.L. Martin, A.M. Lompre, J.J. Mercadier, B. Swynghedauw // J. Mol. Cell. Cardiol. 1981. - Vol. 13.-P. 1071-1075.

87. Myosin S2 is not required for effects of myosin binding protein-C on motility / J.F. Shaffer, M.V. Razumova, An-Yue Tu, M. Regnier, S.P. Harris // FEBS Let. 2007. - Vol. 581. - P. 1501-1504.

88. Myosin types and fiber types in cardiac muscle. I. Ventricular myocardium / S. Sartore, L. Gorza, S. Pierobon Bormioli, L. Dalla Libera, S. Schiaffino, // J. Cell. Biol. 1981. - Vol. 88. - P. 226 - 233.

89. Offer G. A new protein of the thick filaments of vertebrate skeletal myofibrils. Extractions, purification and characterization / G. Offer, C. Moos, R. Starr // J. Mol. Biol. 1973. - Vol. 74. - P. 653 - 676.

90. Pardee J.D. Purification of muscle actin / J.D. Pardee, J.A. Spudich // Methods Enzymol. 1982. - Vol. 85. - P. 164-179.

91. Perry S.V. Vertebrate tropomyosin: distribution, properties and function / S.V. Perry // J. Muscle Res. Cell. Motil. 2001. - Vol. 22. -P.5-49.

92. Phosphorylation switches specific for the cardiac isoform of myosin binding protein-C: a modulator of cardiac contraction? / M. Gautel, O. Zuffardi, A. Freiburg, S. Labeit // J. EMBO. 1995. - Vol. 14.-P. 1952-1960.

93. Pope B. The ATPase activities of rat cardiac myosin isoenzymes / B. Pope, J.F.Y. Hoh, A. Weeds // FEBS Lett. 1980. - Vol. 118. - P. 205-208.

94. Potter J.D. Preparation of troponin and its subunits / J.D. Potter // Methods Enzymol. 1982. - Vol. 85. - P. 241-263.

95. Putkey, J. Fluorescent probes attached to Cys-35 or Cys-84 in0 l cardiac troponin C are differentially sensitive to Ca -dependent eventsin vitro and in situ / J. Putkey, W. Liu, X. Lin, S. Ahmed, M. Zhang, J.

96. D. Potter, and W. G. Kerrick // Biochem. 1997. - Vol. 36. - P. 970978.

97. Reiser P.J. Electrophoretic separation and quantitation of cardiac myosin heavy chain isoforms in eight mammalian species / P.J. Reiser and W.O. Kline // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 1998/ -Vol.274.-P. 1048-1053.

98. Reiser P.J. Multiple isoforms of myosin light chain 1 in pig diaphragm slow fibers: Correlation with maximal shortening velocity and force generation / P.J. Reiser, S. Bicer // Arch. Biochem. Biophys. -2006. Vol.456. - P. 112-118.

99. Role of cardiac myosin binding protein C in sustaining left ventricular systolic stiffening / B.M. Palmer, D. Georgakopoulos, P.M. Janssen, Y. Wang, N.R. Alpert, D.F. Belardi, S. P. Harris, R.L. Moss,

100. P.G. Burgon, C.E. Seidman, J.G. Seidman, D.W. Maughan, D.A. Kass // Circ. Res. 2004. - Vol.94. - P. 1249-1255.

101. Rome E. X-ray diffraction of muscle labelled with antibody to C-protein / E. Rome, G. Offer, F.A. Pepe // Nat. New. Biol. 1973. - Vol. 244.-P. 152-154.

102. Rybakova I.N. Myosin binding protein C interaction with actin: characterization and mapping of the binding site / I.N. Rybakova, M.L. Greaser and R.L. Moss // J. Biol. Chem. 2011. - Vol. 286. - P. 2008 -2016.

103. Single-myosin crossbridge interactions with actin filaments regulated by troponin-tropomyosin / N.M. Kad, S.Kim, D.M. Warshaw, P. VanBuren, J.E.Baker // PNAS. 2005. - Vol. 102, №47. - P. 1699016995.

104. Skeletal muscle regulatory proteins enhance F-actin in vitro motility / A.M. Gordon, Y. Chen, B . Liang, M. LaMadrid, Z. Luo, P.B. Chase // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. - Vol. 453. - P. 187-196.

105. Smillie L.B. Preparation and identification of alpha- and beta-tropomyosins / L.B. Smillie // Methods Enzymol. 1982. - Vol. 85, №2. -P. 234-241.

106. Squire J.M. Structural evidence for the interaction of C-protein (MyBPC) with actin and sequence identification of a possible actin-binding domain / J.M. Squire, P.K. Luther, C. Knupp // J. Mol. Biol. -2003.-Vol. 331.-P. 713-724.

107. Starr R. The interaction of C-protein with heavy meromyosin and subfragment-2 / R. Starr, G. Offer // J. Biochem. 1978. - Vol. 171. -P. 813-816.

108. Stelzer J.E. Ablation of myosin-binding protein-C accelerates force development in mouse myocardium / J.E. Stelzer, D.P. Fitzsimons, R. L. Moss // J. Biophys. 2006. - Vol. 90. - P. 4119 - 4127.

109. Structural and functional reconstitution of thin filaments in the contractile apparatus of cardiac muscle / H. Fujita, K. Yasuda, S. Niitsu, T. Funatsu, and S. Ishiwata // J. Biophys. 1996. - Vol. 71. - P. 23072318.

110. Structural Studies of Myosin:Nucleotide Complexes: A Revised Model for the Molecular Basis of Muscle Contraction / A. J. Fisher, C. A. Smith, J. Thoden, R. Smith, K. Sutoh, H. M. Holden, and I. Rayment // J. Biophys. 1995. - Vol. 68. - P. 19 - 28.

111. Structure and Interactions of myosin-binding protein C domain CO: cardiac-specific regulation of myosin at its neck? / J. Ratti, E. Rostkova, M. Gautel , M. Pfuhl // J. Biol. Chem. 2011. - Vol. 286. - P. 12650 -12658.

112. Structure of the mid-region of tropomyosin: Bending and binding sites for actin / J.H. Brown, Z. Zhou, L. Reshetnikova, H. Robinson, R.D. Yammani, L.S. Tobacman, and C. Cohen // PNAS. 2005. - Vol. 102.-P. 18878 - 18883.

113. Sugiura S. Functional characterization of cardiac myosin isoforms / S. Sugiura H. Yamashita // J. Physiol (Japanese). 1998. - Vol. 48. -P. 173 - 179.

114. Support for a trimeric collar of myosin binding protein C in cardiac and fast skeletal muscle, but not in slow skeletal muscle / E. Flashmanb, L. Korkiea, H. Watkinsb, C. Redwoodb, J.C. Moolman-Smook // FEBS Let. 2008. - Vol. 582. - P. 434-438.

115. The binding of skeletal muscle C-protein to F-actin, and its relation to the interaction of actin with myosin subfragment-1 / C. Moos, C.M. Mason, J.M. Besterman, I.N. Feng, J.H. Dubin // J. Mol. Biol. -1978.-Vol. 48.-P. 571-586.

116. The major myosin-binding domain of skeletal muscle MyBP-C (C protein) resides in the COOH-terminal, immunoglobulin C2 motif / T.

117. Okagaki, F.E. Weber, D.A. Fischman, K.T. Vaughan, T. Mikawa, F.C. Reinach // J. Cell. Biol. 1993. - Vol. 123. - P. 619 - 626.

118. The Role of the N-Terminus of the Myosin Essential Light Chain in Cardiac Muscle Contraction / K. Kazmierczak, Y. Xu, M. Jones, G. Guzman, O.M. Hernandez, G.L.W. Kerrick, D. Szczesna-Cordary // J. Mol. Biol. 2009. - Vol. 387. - P. 706 - 725.

119. The ultrastructural location of C-protein, X-protein and H-protein in rabbit muscle / P. Bennett, R. Craig, R. Starr, G. Offer // J. Muscle Res. Cell. Motil. 1986. - Vol. 7. - P. 550 - 567.

120. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor / I. Rayment, W.R. Rypniewski, K. Schmidt-Base, R. Smith, D.R. Tomchick, M.M. Benning, D.A. Winkelmann, G Wesenberg and H.M. Holden // Science. 1993. - Vol. 261. - P. 50-58.

121. Tobacman L.S. Isolation and functional comparison of bovine cardiac troponin T isoforms / L.S. Tobacman, R. Lee // J. Biol. Chem. — 1987. Vol. 262. - P. 4059 - 4064.

122. Volkmann N. Evidence for an interaction between the SH3 domain and the N-terminal extension of the Essential Light Chain in Class II myosins / N. Volkmann, L. D. Saraswat S. Lowey // J. Mol. Biol. -2007. Vol.371. - P. 902 - 913.

123. Weisberg A. Relation Between Crossbridge Structure and Actomyosin ATPase Activity in Rat Heart / A. Weisberg, S. Winegrad // Circ. Res. 1998. - Vol.83. - P. 60 - 72.

124. Yamamoto K. The binding of skeletal muscle C-protein to regulated actin / K. Yamamoto // FEBS let. 1986. - Vol. 208. - P. 122 - 127.

125. Yamamoto K. The c-proteins of rabbit red, white, and cardiac muscles / K.Yamamoto, C. Moos // J. Biol. Chem. 1983. - Vol. 258. -P. 8395-8401.