Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование вегетативной несовместимости Phitophthora infestans (Mont.) de Bary

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Исследование вегетативной несовместимости Phitophthora infestans (Mont.) de Bary"

РГ6 ог

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА. Ж-ЙЙД. - ОР1ЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ 'РЕВОЛЮЦИИ И "ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ' ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНКВ2РСКТЕГ имена М.В.ДОМОНОСОЕА

БИОЛОГИЧЕСКИ^ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УЖ 562.281.14:575.224:632.4

АНИКИНА Марина Игоревна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЕГЕТАТИШСЙ НЕСОШЕСГуМХЖ РЕЕЕОЕНШШ- 1ЫЕЕЗ!ШК (ШВЛ») Ш ВДНХ. •

"Л

Специальность 03.00.24 - микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена ка кафедре микологии и альгологии Биологи-чевкого факультета МГУ

Научный руководитель

- . л

доктор биологических наук, профессор Ю.Т.ДЬЯКОВ

Официальные оппонента: доктор биологических наук кандидат биологических наук Ю.М.СТРОЙКОВ

Ведущая организация -'научно-исследовательский институт картофельного хозяйства.

Защита диссертации состоится .........1994г. в

........часов на заседании специализированного Совета

Д'053.05.65 при Биологическом факультете МГУ им.М.В.Ломоносова. Адрес: Л 9899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан ..............1994 г.

Ученый секретарь Совета кандидат биологических наук , С.Н.ЛЕКОШЕВА

J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТА.

Актуальность темы. Гриб ДуЬ>рЫаюга ¿лйегйап* {Нэлгйве валу вызывает опасное заболевание картофеля и томэтоз - фитофтороз. Болезнь распространена во всех районах, где ваздеанвают эти культуры. Потери урожая от егитофтороза составляв? в нашей стране 20-50/£. а в годы эпифитоткй достигают 60-7СЙ /Зорожкин и др., 1976/. Основными способами зашиты растений от болезней в настоящее время являются химическая зашита и выведение устойчивых сортов. Лля успешной борьбы с фитофторозсм путем выведения ■ устойчивых к возбудителю болезни сортов растений необходимы глубокие знания биологии и генетики паразита, особенно закономерностей его изменчивости. Причинами изменчивое® являются мутапионнне процессы, рекомбкнационные события го время мейоза. .образование гетерокариона. Происходяшие в полуляпаях гриба изменения приводят к образованию новых патотзпов. Изучение роля половой, совместимости к вегетативной несонееслглягти штаммов Р-Ал?ез£апа . имеет ванное фундаментальное- е иркнзадное- значение.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось изучение особенностей изолятов Р-1г£зггалз, вцдсленных из картофеля и томатов. Ранее были выделены две группы вегетативной несовместимости /Горбунова л др.. 1989/. 3 нашей работе были поставлены следующие задачи:

1.исследовать взаимосвязь между половой совместимостью и вегетативной Несовместимостью у Р.1 ттРесЬапз-;

2.исследовать морфологию вегетативной несовместимости; 3»исследовать самофертильные штамгёи; '

4.изучить коноооспорозое потомство РЛв£ев£&паг ео наслелова-нко признаков;

5.изучить "слияние системного фунгицидаметалакекяа и м-нитро7 - N —нитрозометилмочевины /НМГЛ/ на тип спаригангя и вегета-

тквнув несовместимость; 6. изучить качественный состав полярных. нейтральных липидов в мицелии а культуральной жидкости; • 7.определить содержание полиненасыщенных жирных кислот в мицелии и культуральной жидкости; 8. исследовать пзофермеятный состав штаммов.

Научная новизна а практическая ценность работы. Изучены формы проявления.вегетативной несовместимости, а также взаимосвязь половой совместимости и вегетативной несовместимости мезду штаммами Е^пСегсбапа. Исследовано Елиякке вегетативной несовместимости на процесс Формирования ооспор. Впервые проведены . исследования по клонированию и синтезу саыофертилькых кзолятов. Впервые исследовано воздействие системного фунгицида металакси-ла на тип спаивания к вегетативную несовместимость. Показано, что воздействие ггеталакскла приводит к формирования абберант-ных ооспор. но не оказывает воздействия на вегетативные струк-„ туры. Впервые исследован качественный состав полярных .нейтральных лишдов и полиненасышенных яирных кислот генетически различных штаммов. Обнаружена С20 не идентифицированная кислота.' которая характерна для слабо патогенных штаммов.

Полученные данные могут быть использованы в практических целях при разработке системы зашиты картофеля и томатов от фито-фтороза.

Апробашш работы. Результаты исследований апробированы на заседании кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ. 1994. Публикации;. Зо.теме диссергаш::* опуйсикозана 1 работа. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения. обзора литературы, методической части, результатов и обсуждений экспериментов, выводов; изложена на страницах машинописного текста.Работа содержит таблиц, рисунков.

.Список литературы включает наиг/енований, в то:.: чгсле ка иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. '

В работе использовались штаммы из коллекции кг^едря микологии к альгологии Биологического факультета МГУ.

Гриб культивировали на овсяной агаре /Дорохова. 1937/, ржаном агаре, гороховой среде и жидкой картофельной среде / (KsiElaiEK^ 1959/. . При выделении...моноооспоровых кгаг--• :..-:тур . учитывали возраст культуры, влажность, освенеие. текпе-ратуру / Wirtenhause, 1953/. Для установления типа спаривания и группы вегетативной совместимости :тппользозались .штаммы-тестеры Б5/А1ус1/ и W/А2ур2/.

Изучение половой совместимости к вегетативной несовместимости проводилось на чашках Петри с овсяник агаром. Исследуемые штаммы попарно Ексезали на чашки Петри и инкубгровали от 14 до 30/33/ дней при температуре 18 С. Место контакта изучали визуально /наличие зона, свободной ст воздушного мицелпя . и ее ширин*,/ и под световым микроскопом /наличие ооспор/.

Монозооспзровые колонии получали при рассеве зооспор P^iufentanac на среду, содгряащув 5% медицинской язлчи.

При исследовании влияния геталаксила инокулировали ча^ки Петри с овсяным агаром с добавлением металаксила 1,5 шсг/мл и 150 мкг/мл для чувствительных и устойчивых штампов соответственно. Чашки Петри инкубировали 21 день, затем кусочки ага-.ра с мицелием с края, колонии переносили в пробирки со скошенным овсяным агаром. Полученные изблятн тестировали ва тип спаривания ;: вегетативную совместность. Интересующие взоляты высевали на овсяной агар с увеличенной конпектрацивЯ металаксила.

Пби исследовании влияния ЗГ -нитро-Н -нитоозометилхочезины

I .

обрабатывалií зооссоры 0,0055? раствором н—аитро- я-нитрозоме-тилмочевянн в течении 20 часов. Отмытые от К-нитро-К-нитро-зометилшчевкны зооспоры высевали на чашки Петри с овсяной средой. Внросше колонии тестировали на тип спаривания1 и ве- 1 гетатавнуп несовместимость.

Липидн ил мицелия PJLnfeatana. и культуральной жидкости экстрагировали смесью хлороформ S метанол 2:1 /eoIC-Ь. ' et al^. 1957/. Жирные кислоты в виде метиловых эфиров анализировали гетодом газе-»жидкостной хроматографии /модель СССР/ при программировании температура от 190 до. 250 С. Кден-тификашт кирных. кислот проводили сравнением времени удерживания со стандартными препаратами фирм serva /фрг/ и glpTtfl- /СЕЬ/. Тонкослойную хроматографию полярных и нейтральных лшедов проводили на стекляных пластинках с закрепленным слоем седЕкагеля в системе хлороформ : метанол : аммиак / 65:25:4/. Хроматогракмы проявляли концентрированной серной кислотой. ...

Разделение .белкових фракций осуиесгвляли метолом вертикального ступенчатого электрофореза в блоках полиакрпламидного геля /Корочкин и др.,1977/. Экстрагирование белков и гистохимическое окрашивание гелевых блоков проводили по общепринятый методикам /tilea&äC,. 1977; Htcalee». 1 У8б/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

Вегетативная несовместимость и сахофертюапость.

Сушестзует гипотеза, что саиофёртняьные езолятн являнтся ге-' терокариогами по типу спариванкя /lafefc Sha*, 1УЭ2/. Б нашей коллеяшгк имелось несколько природных самофертклькых изо-лятов /Cí2/: 1234, 9, 522в. 182. При получении.монозооспоровых

культур из самэфертильнах кзолятов почти все. ганозооспоровне культуру б или с&чоферт.чявяшЕ, но иногда ппоисходяо вьшеп-ление одного из типов спаривания. Обычно тип спаревания соответствовал той груше вегетативной несовместимости; к конторой относился самофертидьный изолят: А2 тли икэвваяия, если саиофертильяый изолят яркнадлеаал Тс 2: А1 тяп спаривания, если -самофертильный изолят-принадлежал "7с. 1 /Табл.1/. Иногда вышепление самостерильных секторов происхагкло спонтанно, как в случае самоФертильного кзолята 182. Дсюле ряда пассажей тип спаривания сохранялся.

Таблица 1. Монозсоспоровнй анализ самофсрткльнкх кзолятов.

шт&мм ... группа количество монозоо-споровых клонов тип спагавания

А1 А2 СФИ

1'234 2 • 30 - -30 •

9 ' 1 18 2 .. - 16

182 2 • 1

При попарном посеве в вегетативно совместимых комбинациях количество ооспор или снижалось / относительно количества оойпор, форжзруемшс сачоФерткяьгшг.: язолятом .з' «ззокультуре/, или самофертильные кзоляты не формиоовали соспорг вообще /Табл.2/.

Таблица 2. Нэтянке вегетативной сош/есикости на форм:роБанке ооспор самофертильншк штаммами Btqrtopbthoxa. 1 тгРвааапя »

число ооспор в 10 полях зрения при посеве

штамм монокультура с вегетативно сов. местимым штаммом с вегетативно несовместимым штаммом

9 8 40

1234 12 2 47

182 6 3 42

При попытке вырастить на жидкой картофельной среде га сме-'си зооспор типа А1Тс1 и А2^с2 самофертилыше езоляты т наблюдали ношальный мицелиальннй рост только в вегетативно совместимых когабияадаях /A1Vc1 с A1Vc1 и А2тс2 с А2ус2/.

Также был поставлен эксперимент по синтезу самофертклвных изояятов на хищной картофельной среде посредством агаровых блочков. Агаровые блочки с мицелием разного типа спаривания и разных групп вегетативной совместимости высевали в различных соотношениях /10 AtVct, 9 А1ТЫ+1 А2тгс2, 8 А1ур1 + 2 А2 Т с2, » 1 AVc1 •+ 9 Ä2Yc2, 10 А27С2/. Через 21 день Ьи-' • пелий был высушен и взвешен. На основании полученных данных построен график /рис.1/.

сухой вес ми-пелия/г/

0.01

0.005

л-

—

10 987654321 О количество isi 1S1 iai iai isi isi iai iai iai isi isi агаровых

■0 1 2 3-4 5 6-7- 8 ,9.-10 -£Жс2/ и Б5 Б5 Б5 Б5 Б5 Б5 Б5 Б5 Б5 Б5 Б5 ¿frivol/

Рис.1. Зависимость Bgca мицелия от различного соотношения А1 и А2. типов спаривания вегетативнонесовместимых штаммов;

' Максимальный вес мицелия приходится на контроль. При добавлении инокулша противоположного типа спаривания и другой группы вегетативной совместимости происходит подавление мицели-ального роста. В скрещиваниях 3 AÍ^cl + 7 А27с2 и 7 A1vc1 +

3 A2vc2 наблюдаем .некоторую стимуляцию мицелкального роста. При посеве в равных соотношениях /5 А1тс1 + 5 А2ус2/ наблюдаем самый низкий сухой вес. мицелия. Бил поставлен вопрос: лизиру-ются ли гифы под действием диффушгеруших'вешеств "ели после слияния гиф. Мы сращивала.- 1234 +13-!, 1234 + E5^ls1 + Б5. Штамма находились по разные стороны мембранного фильтра. Обнаружили, что лизиса воздушных гиф' в несовместимых скрещиваниях -нет. Оба штамма подрастали непосредственно к мембранному филь-~

тру. по обе сторона которого бшш обнаружены оослоры. Из таблицы 3 видно» что сааофертильний изолят стимулирует пзоляты ¿1 типа спарзгвашш к образованию большего числа ооспор, чем изодяты А2 пша спаривания. ,

Таблица 3. Стимуляция ооспорообразования самофертильным взолятом изолятов AI и А2 типов спаривания.

скрещивания количество ооспор в 10 полях зрения со стороны:

Е5 iai 1234

1234 + Б5 12,3 - 14

1234 + 134 - 5,5 13,8

Б5 .+ 1S1 3,9 „ 1'1: -

Конверсия типа спаривания и вегетативной несовместимости под воздействием металаксила.

Из литературных источников известно, что грибы рода ИчПдарЬНшга. способна менять тип спаривания на противоположный под воздействием металакскла / 1990/. Для работы были взятн штампа с различными генетическими характеристиками /Табл. 4/. После посева на овсяной агар с добавлением металаксила толысо у штаммов, принадлежащих к AI типу .спаривания и Vc1 группе, иозко было наблюдать изменение типа спаривания и/или реакпги вегетативной несовместимости, т.е. реакция совместимости с тестером-Б5 менялась на несовместимую. При последующих пассзлах у большинства тестируемых штаммов, реакция ве- .

гетативной несовместимости восстанавливалась к исходной. У штаммов, принадлежащих к А2Ус2, изменение реакции вегетативной .несовместимости не наблюдали. Тип спаривания сохранялся, за исключением одного случая /Табл.4/. Штамм К29 после обработки ке-талаксялом • /К29-4/ в концентрации 1,5. мхг/мл стал.самофертиль- • ным и при тестировании на реакпию вегетативной несовместк.гости бкл несовместим с обою.ж тестерами. При последщдос обработках штамма К29-4 более высокими концентрациями метглггснла /2:»ткг/мл. Юмнг/мл, 20мкг/мл/ изменения типа спаривания не наблюдали ни к исходному А1, ни к Л2: штамм К29-4 оставался сажхгертильным. При проведении монозооспорового анализа из 65 клонов только 14 имели исходный тип спаривания, остальные клонн баш самофертиль--ны /Табл.4/. В то ке время при яровезеяии монозооспорового анализа самофертильного "золята К29-2£¡^ / стамм К2Э обработали 1,5мкг/мл металаксила, затем 20ют/мл металакскла/ из 1? изо-лятов б имели' исходный теп спаривания А1. При г.пфоскопировании самофертильных клонов наблюдали формирование как нормальных, так и абберантных ооспор. Иногда такие оосяороподобные тела можно наблюдать у природных изолятов,- чте подтверждается литера--турными данными / 2Ъо1еу, 1993/.

При наблюдении влияния металаксила на реакции вегетативной несовместимости можно отметить, что только при первом тестировании /сразу после выделения со среды с металаксплом/ большая часть изолятов показала изменение реакции вегетативной несовместимости, т.е. они становились несовместимыми . ' с 1БЭ. . .с Б5. При последующих посевах с тестерами большинство из них ревертирова-ли к исходний реакшш вегетативной несовместимости, т.е. становились совместимыми о Б5 и несовместимыми с 1а1. Етамм К29-4 показал устойчивую, реакпию несовместимости с Е5 после, пяти пассажей.При проведении ¡монозооспорового анализа пэ 55 клонов реакцию несовместимости с Б5 показали 4 клона , остальные были совместимы с Б5, т.е. давали реакцию,- морфологически сходную с

Таблица 4. Влияние кеталаксяла на тпп спаривания а

вегетативную совместимость.

штамм ТС ВС устойчивость к мет обработка металак- СИЛОМ.: конц. ккт/мя- 41! СЛО прове- сохранили изменили

1S1 Б5 1С I Ш

ренных клонов ТС ВС А1 А2 А1А2 1S1 |Б5

К16 А2 С н уосп. 1.5 23 23 23

К16 А2 с н воен. 20 ^ 20 20 20

К22 А2 с н уст. 150 40 40 40 -

К22 А2 с н уст. 200 28 27 28 - - 1 - -

138 А1 н с уст. 150 62 62 62

138 А1 н с уст. 200 10 10 10

138-2 А1 н с уст. 150-400 4 г 4 - - - 2 - -

К29 AI н с восп. 1.5 4 3 _ _ 1 1н н

К29 А1 н с восп. 2,0 30 21 26 — _ 9 4н н

К29-4 А1А2- Е Н ' 1.5-20 16 16 •2 - - - р 4н с

конт-

роль

К29 ■ А1 н г» - 47 47 47

К29-4 А1А2 н н - 65 • 51 4 14 _ Ян с

К29- А1А2 г с - 17 11 16 6 - - 1 н н

-220 -

ТС - теп спаривания. ВС - вегетативная совместимость, с - совместимы, н - несовместимы

• реакцией Тс1 группы. При взаимодействии этих клонов мевду собой и с щяродннми кзолктами были выделены новые формы совместимости. Дю части клонов бшш характерны ооспороподобнке тела. Поэтому мы предполонЕлк, что металаксил влияет на комплекс генов, связанных с половым процессом / от выделения половых <те рамной до формирования осспор /. -и тени вегетативной совместимости явдяэтся частью этого комплекса.

Конверсия типа спаривания и вегетативной несовместимости под влиянием н-нитро- н-нитрозометалхэчевины.

При исследовании реакции совместимости и типа спаривания мутантов, полученных из штамма-Б5 после обработки Я-нктро--к-нитрозометшгг/очеЕкной» кн.обнаружили'случаиизмеяения типа спаривания и вегетативной несовместимости под воздействием мутагена. Так. мы наблюдали, что мутанты была несовместимы со шташами TS.1 и Б5 при попарных посевах /мутант + 13.1 и мутант + Б5/, и два мутанта были совместимы с обоими тестерами при попарном посеве /Табл.5/. Но изменение группы v cl на группу

под воздействием мутагена не наблюдали. Из 36 я^гтантов один был самофертилен.

Таблица 5. Вегетативная несовместимость изолятов. полученных "из штамма Б5 под воздействием н-пгтро-И-нитрозо-метклмочевины.

число проверенных сохранили изменил? реакцию взаимодействуя

штатов- сеакшто

ззи::чозеГ:- несозиестяш с^ззесткж

СТВЕЯ С 1SL1 Е F5 с 1SJ к £5

34 10 22 г»

Влияние вегетативной несовместности кг веггтгтквн-ле структуры.

Зрг попагпо::. сращивании. г.-2то;<" со'~А1 -у.'-^иу. -¿зг&ято?., мутантов, полученных под воздействием металакскла. кутантов, покрученных под воздействием К-нитро-Я-нитрозокетидкочевины мы выдр-т»."« несколько типов в?аимодейсгиия: 1 - слияние воздушных мшелгев двух колоний без четко видной границы ме.и^у дав; ' ,

2 - тонкая /1-2 ш шириной/ прерывистая линия отсутствия мицелия

в зоне взаимодействия колоний /реакция "бисер"/;

3 - гонкая сплошная линия отсутсвия роста /реакция "нитка"/;

4 - узкая /5тЗ шл/ полоса ртсу?свия роста воздушного мицелия;

5 - широкая /10-20 ми/ полоса отсутствия роста.

Реакция 1 регестокровалась как показатель вегетативной.совместимости, реакция 2 - переходная, остальные - как разные степени несовместямости. Реакции 2 и 3 встречались очень редко, остальные были обычными. При длительном /26-30 сут./ вырашнвании колоний демаркационная зона /реакции С и 4/ зарастала воздушным мицелием в виде отдельных пучков гкф или мицелиального валика или, наоборот, расширялась.

По лнтературньм сообщениям /Алйесвоп, 1984/ мицелиальный валик образуется вследствии "ухода" гетерокариотических воздушных гиф от субстрата, в котором слившиеся клетки погибают. Однако определение маркерных генов у кгояятов, выросших в зоне взаимодействия, свидетельствует об отсутствии гетерокариотических гиф . и зарастания демаркационной зоны всегда одним из пар* I

тнеров.

Расширение зоны лизиса могло приводить к полному лизису воздушного мицелия одного из штажов или к появлению стерильных пятен на колонии /рис.2/. Последние напоминают аушижаъа Иптг / НгтИяг,. 1984/, которые образуются у ОрЫодЬоа* цМ- при взаимодействии полностью несовместимых штаммов /ре-акщщ^вйЛвг или гатаак, аналогичные реакциям 1 и 2 у ЕЛп£е&еапа<и представляют собой пучки пигментированных мертвых гкф. Ошс могут находиться на разном расстоянии. от края колоний и отрагазт"эффект внедрения", т.е. способность мацелик одного шташа внедряться на территорию другого. Способность к внедрению различна у разных из элятов. Можно провести

параллель между пучками мертвых пигментированных гиф, хара- .

. . ктерных для ОрЫзьтата- и1т1, к лкзисныки пятнами у.

Е.±я£ез'Ьаиз-.в обоих случаях наблюдалось как двунаправленное внедрение / с одинаковой шш разной "мицелиально!: силой"/» так й Одностороннее. в зависимости от использованных партнеров..

Однако лизис одного из штаммов может быть и не связан с реакцией несовместимости. В нашей коллекции обнаружены и самолизи-руюшиеся штаммы, причем склонность к аняолизу передается у них ооспоровому потомствуЛизисные пятна и лазе полный лизис одного или обоих штаммов южно наблюдать в совместимых комбинациях, особенно в том случае, когда чашки Петри с колониями длительное время экспонируются на свету. Так, проявление фенотипа "старение колонии" у гриба ВоЗоарога апамйда. чаще наблюдается при пересевах культур или при непрерывном освещении / Сэдкер, 1975/. . . На щ)(?явле!}ие_ реакции юаймодействия двух_ штаммов могут влиять метаболиты третьего. При этом могут бить как снятие реакции несовместимости^ несовместимых штаммов /рис.3/. так к ее возникновение у совместимых /рис.4/.

Штамм 1В. /АЕ2 при посеве мекду штаммами 1 а и Б5 обнаруживал ' несовместимость с ними . Штамм 1 Н-Л!^ несет маркерную мутацию устойчивости к акрифлавину, а штаммы 1ЗД и Б5 чувствительны к нему. Эти различия позволили исследовать направления миграции ядер. Блочки с мицелием из разных'участков колоний штам- ■ мов 134- и Б5. разделенных зоной несовместимости со штаммом 1а./Апомешали на среду с 20 мкг/мл акрифлавина. Рост мицелия наблюдался только у изолятов штамма Б5. Следовательно,

в этом направлении происходила миграция ядер из штамма 1«/АЕ ,

2

в то время как в направление штамма 1яп миграцш: не было. Это мо.тао объяснить те;:., что' несовместимость штамлоз 1 Я/Щ> к Е5 вторична и проявляется под влиянием мигрирующего фактора несовместимости штамма 151 уге после возникновения анастомозов между гифами шгамлэв 1а /ае2 и Б5 и начала миграции ядер.

Описанные наблюдения наводят на ¡щель о существовании диффундирующего через среду фактора, влиявшего на реакцию взаимодействия двух штаммов. Мы попытались снять няиянке такого фактора добавлением в среду активированного угля, который адсорбирует грибные метаболиты и влияет на взаимодействие штаммов у" других грибов /ВхО-рг, ВпЛЕ-ап, 1973; ВаууАааеааа^аОсЬа, 1973/. В присутствии адсорбента ширина зоны барража кевду несовместимыми штаммами уменьшилась вдвое /Табл. 6/. Активированный уголь

Таблица 6. Влияние активированного угля на взаимодействие колоний штаммов Иф'ЬорЬ.'ЬЬагв. ЗлЕез^пв .

реакция взаимодействия с тестерами на средах

штамм , без активированного угля с активированным углем

1&4 Б5 1Я1 Б5

522Ь- н н с н /0,8/

1234 с н /0,6/ с н /0,3/.

9 н /1.0/ - с н /0,5/ с

45-з с н /1,5/ с н /0.7/

Кр н /1.0/ с н /0,4/ с

Нв ■ н/1,0/ с н /0,5/ с

303 н /0,9/ с н /0,4/ с

Г-6 н /0.8/ с н /0,3/ с

6-ТР н /1.2/ с н /0,7/ с

Полный лизис одного штамма. Примечание, н - реакция несовместимости, с - реакция совместимости,- в скобках---пшрЕна зоны лизиса.см'

предотвращал лкзис некоторых штаммов. Так, штамм 522Ъ_лизировал-ся при взаимодействуй! с тестернымй штаммами 1 й к Е5. В прксут-

Рис. 2. Изменение зоны взаимодействия при длительной инкубации культур.

Н6-

Рис.З. Потеря несовместимости при взаимодействии орех штаммов: 1,2 -реакшя взаимодействия гибрида 0-9 с тестерами, 3,4 - потеря несовместимости тташа 6-9 с тестером 1 1 в присутствии тестера Б5.

Рис.4. Потеря совместимости при,взаимодействии трех штаммов: 1,2. - взаимодействия с тестерами несовместимым /1.1/ и совместимым /Б5/ тетраплоидно-го штамма 1 /А!^; справа - появление несовместимой реакции с тестером Б5 при посеве трех штададов "в линию"/4/ или,"треугольником" /3/.

• ствик активированного угля, происходила конверсия реакпки штаммов 522^-и 1^1 на совместимую. Лизис отсутствовал. В то же время автолиз не снимался активированным углем, хотя в некоторых случаях снимался при посеве с совместимым штаммом без угля. Активированный уголь, вероятно, адсорбировал и половые феромоны, ибо в его присутствии не наблюдались оосдорн в зоне взаимодействия штаммов, гетероаллельных по локусу спаривания.

Анализ первого поколения монооспорового потомства.

Мы провели скрещивание между штаммами 1^1 и Б5. Получено 13 моноооспоровых потомков, сочетающих в себе признаки родительских штаммов. Характеристика родительских изолятов и гибридов приведены в таблице 7.

Таблица 7. Характеристика родительских штаммов 131 и Б5 и моноооспорового потомства /П/

характеристика 131 Б5 р 1

тип спаривания А2 А1 7А2:6А1А2

группа вегетативной несовместимости Ус2 Vc^ . Ус2

устойчивость к стрептомицину /в концентрации ЭООмкг/мя / + _ +

устойчивость к бластвцвдину /в концентрации 120мкг/мл / — + _

вирулентность П то ТО

множественные формы специфических ферментов / подвижность фракций в относит, единицах /

малик энзим малатдегидрогеназ а шелочная фосфатаза

100/10362/88/100 100/100

100/108 88/100 100/100

100/10388/100 100/100

. Устойчивость к антибиотикам. . Все моноооспоровыв изсляты,-полученнке из скрещивания штаммов 1S1 х Б5, оказались устойчивыми к стрептомицину и чувствительны к бластицвдину. Известно, что мутации устойчивости к стрептомицину и бластицвдину. у PJjxfeataiiaaMeoT ядерную природу. Исходные штаммы гомозиготны по генам, контролирующим эти признаки, причем стрептомициноус-тойчивость - доминантный признак, а бластицидиноустойчивость -рецессивный.

Вирулентность. Моноооспоровые изодяты не заражали томат

сорта Оттава 30 /ген Ph.1 /, но сохраняли патогенность в отноше-

Таллалихин__. „

нии томата сорта .... /ген РЬО/. Предполагают,. что вирулентность

.-. ' ' наследуется парой аллельных генов /Флор, 1962/. Обобщая данные нашего эксперимента и литературы, мы можем предположить, что вирулентность - рецессивна, а авирулент-ность - доминантна. Следовательно, штамм 1S1 является гомозиготой по вирулентности.

■ Тип спаривания. Соотношение типов спаривания /табл.7/*' среди моноооспоровых изолятов свидетельствует в пользу гипотезы Ко /1981/, что генетический контроль типа спаривания осуществляется парой двухаллеяьных сцепленных локусов с неполным доминированием, j

Вегетативная несовместимость. Поскольку все моноооспоровые изоляты принадлежали к группе вегетативной несовместимости 2, можно предположить, что вегетативная несовместимость Infffttttan» контролируется двумя аллелями одного гена.

Изоферментный состав. Изучение изоморф белков широко используется в генетических исследованиях для выявления, гибридов. / «»fctocJc et al», 1986/. Суммарные алектрофорстические спектры малик энзима, щелочной фосфатазы были мономорфны, в то гремя как суммарный алектрофоретнческий- спектр малатдегидрогеназы -бы Полиморфен.

В результате полученных данных установлено, что моноооспоро-вые изоляты РИ ггСпаШпзявяяются гибридными. Таким образом, маяно говорить о гибридизации А1 и А2 типов спаривания, посредством, которой реализовалась комбинатавная изменчивое»

Исследование изоферментного состава генетически различных штаммов тгСяз£ада...

Известно, что изоферменты являются ванными генетическими маркерами. Мн пытались выявить разницу между штаммами, различающимися по типу спаривания, группе вегетативной несовместимости и патогенности. Исследование проводили по следующим ферментам: шелочная фосфатаза, супероксиддисмутаза, яеспецифическим эсте-'разам, малик энйиму, малатдегидрогеназе. лактатдегидрогеназе. Корреляцию между изоморфами и генетическими признакам выявить не удалось.-

Изучение качественного состава солярных и нейтральных

с липидов генетически различных штаммов Р.±п£еаьагк

Известно, что гормоны животных, грибов имеют стерольную природу, поэтому мы решили исследовать мицелий и культуральную жадность генетически различных штаммов / различались по типу спаривания, группе вегетативной несовместимости и патогенности/ на состав полярных и нейтральных липидов. ... ■... . -

При

проведении тонкослойной хро?латографхш. экстрактов липидов из мицелия удалось.идентифицировать 4 класса полярных липидов: фосфогвдшгинозЕт. фосфгтвдшшшш, фосфотщклзтаноламия, фосфо-тидилглиперин. В культуральной жидкости удалось идентифициро-

вать только глкколмтдк.

При проведении тонкослойной. 'Хроматографии экстрактов лкпи-дов из мицелия идентифицировали' следующие классы нейтральных липидов: моноглицериды, диглицериды, стеролы, свободные жирные кислоты, трЕглицериды. стерсшьные эфиры. В культуральной жидкости были идентифицированы стеролы, свободные жирные кислоты, ■ триглицериды, стерольные эфиры. Однако, выявить различие между А1 и А2 типами спаривания, группами вегетативной несовместимости *с1 и Тс2 и между группами П и ТО не удалось.

Исследование состава полиненасышенннх жирных кислот.

Для РП rrfestena характерно высокое содержание полиненасышенннх жирных кислот / ПНВК/. Нами впервые проведено исследование ПНЖ у.генетически различных штаммов. Методо'м газог-жидкостной' хроматографии идентифицированы следующие высшие жирные кислоты: , миристиновая /14:0/, пальмитиновая /16:0/, пальмитолеиновая /16:1/, стеариновая /18:0/. олеиновая /18:1/, линолевая"/1'8:2/, линоленовая /18:3/, арахидоновая /20:4/, зйкозопентаеновая /20:5/. Также наш выявлена, но не идентифицирована 20: X кислота /рис. 5} табл.8/. Известно, что С-20 ПНЖК являются активным началом лишщного комплекса, который вызывает образование фито-алексиаов. не!фотизашш тканей картофеля и индуцирует системную пролонгированную устойчивость картофеля к ряду болезней. Все насыщенные и венасыденные кислоты С-16 и С-18 рядов алиситорной активностью не обладают,. В основном исследована способность вызывать образование. фитоалексинов и некротизацию тканей, картофеля только для арахидоновой и эйкозопентаеновой кислот. Однако, нами и друга«! исследователями доказано, что эти кислоты присутствуют в равной мере как в слабопатогенны::, так и патогенных штаммах. В то время как наличие 20: X кислоты характерно только ••

Рис. 5 Хроматограммы ШИК штаммов, принадлежащих к группе Т1 /а/ ичштаммов, принадлежащих к груше ТО /в/.

Таблица . Содержание полиненасыщенных жирных кислот /%/ в мицелии P.infe

штамм характеристика сухая биомасса, v/% &шпи- дов от жирные кислоты'

сухой биомассы 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:Х 20:3 20:4 20:5

1£il A2Vc2 Т1 томат 0,3468 8,85 10 1'8,2 5,04 1,16 15,9 11,2 1 36 1,93 - ,1 ;18 5,36:11,3

Т11Ц5 A2Vc2 Т1 томат 0,3914 12,1 9,87 29,5 8,65 1,43 21,6 12,1 3,03 2,45 - 1 ,У6 8,51 10,8

К22 A2Vc2Tl картофель 0,1767 6,31 11,7 25,6 1,02 2,42 15,7 1 4,9 1 ,03 1,88 - 1,85 8,47 1 7,5

ТА 65 A1 Vol Т1 томат 0,7104 9,01 13,3 15,9 2,8 2,00 9,15 1 0,7 1,93 1,94 - 2,45 4,42 7,27

К16 0,1097 11,9 17,5 12,7 3,92 1,67 29,2 15,5 1,24 2,36 1,44 1,01 4,1 9,31

лист ПРТ A1Vc1 ТО томат 0,3351 13,7 18.fi 28,8 2,4 .2,71 20,9 Ю,9 2,09 3,24 2,73 2,63 4,09.6,85

' 182в Мр?$фёль 0,159 12,4' • 14,4 18,3 0,31 '2,44 24,7 17,2 1,33 2,28 1,43 1,72 4,89.'11,8

Б5 AlVc1.TC> картофель 0,2953 9,41 16,3 21,9 1,79 1,73 1 0,0 17,6 4,98 4,59 1,9 2,66 7,94 8,65

ТЛ68 AlVcl ТО томат 1,038 6,83 14,2 15,7 4,96 2,61 10,2 17,6 2,24 2,09 3,43 3,26 9,36 42,3

для слайопатогенных штаммов и штаммов.. принадлежащих к группе ТО. Флор /1962/ предположил, что вирулентность •

контролируется двуаллельным геном. При атом вирулентность ре'цессивна, а авирулентность доминантна. Это позволяет предположить, что штаммы, которые являются, гомозиготами по рецессиву, не способны к продуцирований 20:Х кислоты и, следовательно, вирулентны. А штаммы гетерозиготные или гомозиготные по доминантному аллелю способны продуцировать 20:X кислоту и, следовательно, авирулентны. ,

По количественному составу полиненасыщенных жирных кислот между генетически различными штаммами отличий не отмечали.

- - - ВЫВОД! • ...

1 .Вегетативная несовместимость проявляется в отсутствии роста, воздушных и гибели субстратных гиф в зоне взаимодействия на агаризированных средах, в полном отсутствии роста при посеве на жидкую среду посредством зооспор.

2.Вцделено несколько типов реакций взаимодействия между штаммами. Показано варьирование типов реакций взаимодействия в зависимости от генотипов сращиваемых штаммов, •взат ного их расположения и длительности экспозиции.

3.Показано, что тип вегетативной совместимости оказывает влияние на число формирующихся ооспор у штаммов, гетерогенных по локусу типа спаривания.

4.Посде обработки г<-нитро-!/-нитрозометилмочевиной и метала- . ксилом получены формы с измененным типом вегетативной несовместимости и типом спаривания.

5.Выделенные самофертильные кзоляты с территории бывшего СССР отличаются от западноевропейских самофертильных изолятов

по следувшим характеристикам: хорошо образуют зооспоры, не отличаются по вегетативной структуре от самостерильных изолятов и не являются гетерокарионами по типу спаривания, стабильны в течении многолетнего культивирования.

. 6.Получили гибриды, которые паивмтрасшепление по типу спаривания À2:A1A2 = 7:6 и принадлежат к группе вегетативной совместимости 2.

7Лроведено исследование генетически различных штаммов по качественному составу липвдов. Получено различие мевду вирулентными группами ТО и П по долинекасшенной жирной кислоте /наличие 20:Х жирной кислоты у слабопатогенных штаммов/.

Материалы диссертации опубликованы в следующей работе: М.И.Аникина, А.В.Долгова, ¡О.Т.Дьяков. Формы проявления вегетативной несовместимости у фитопатогенного гриба Pbytophthore infisataas (Mont.) ✠В&хз . Вестник московского университета, сер.16, биология, 1993, Й2,стр. 61-69.