Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование условий реализации тканеспецифического контроля дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование условий реализации тканеспецифического контроля дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени крысы"

' Форма 3.3

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЭЛЕАКВДЗЕ Ирина Михайловна

ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ РЕАЛИЗАЦИИ ТКАНЕСПЕЦИФШЕСКОГО КОНТРОЛЯ ДЫХАНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАПИЯ ММШВДРИЙ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ

(03.00.02'- Биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН- 1990'

Работа выполнена в лаборатории биофизических испытаний Научно-исследовательского института технологии и безопасности лекарственных средств.

Научный руководитель : кандидат биологических наук

.. Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор ОГАНЕСЯН С.С.

доктор биологических наук БАДКИНЯН С.А.

Ведущая организация : Институт Биофизики АН СССР

г

Защита диссертации состоится "_" _ 1990 г

в _ час. на заседании специализированного Совета

К 055.01.08 по" присуждению ученой степени кандидата биологи ческих наук при Ереванском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете (375049, Ереван, ул.ГЛравяна, I, Ереванский университет, биологический факультет, кафедра биофизики) .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университ

та.

Автореферат разослан "_" ___ 1990 г.

Ученый секретарь ' ?

специализированного Совета,

ЭЛБАКВДЗЕ Г.М.

кандидат биологических наук

Л.Г.АНАНЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Физиологически активные соединения природного происхождения широко применяются в медицине в,качестве средств для коррекции функционального состояния органов и тканей. В связи с этим поиск и изучение свойств эндогенных регуляторов метаболизма представляет не только теоретический, но и практический интерес. В последние годы большое внимание уделяется исследованию эффекторов внутритканевых межклеточных взаимодействий, К которым ОТНОСЯТСЯ кеЙЛОНЫ (Bullough ,Lourence ,1960; verly ,1976), контактины (Маленков с соавт., 1977) и комутоны (Элбакидзе, Миронова, Кондрашова, 1974; Злбакидзе, Ливанова, 1977). Общим свойством этих регуляторов является тканевая специфичность действия в отношении регулируемых ими процессов. Показано, что кейлоны и контактины тормозят рост вырабатывающих их тканей, подавляя синтез ДНК в ядрах клеток. Было обнаружено, что комутоны тканеспецифически стимулируют -дыхание митохондрий в среде с субстратом и разобщают окислительное фосфорилирование митохондрий из гомологичной ткани (Элбакидзе, Ливанова, 1977; Элбакидзе, Лухин, 1984). Существование комутонов было показано в печени, почке, сердце, легком и тимусе крысы (Элбакидзе, 1979), а также в печени других животных (Ливанова, Элбакидзе, 1980).

Механизмы, определяющие характер эффектов комутона в отношении гомологичных митохондрий, а таюке условия активации кому-тонной регуляции оставались неизученными. Их исследование способствовало бы более полному пониманию места этой регуляции в системе механизмов внутритканевой интеграции клеток.

Цель исследования. Изучение условий реализации комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени крысы.

Задачи исследования. I. Изучение факторов, влияющих на характер действия комутона печени в отношении дыхания и окислительного фосфорилирования гомологичных митохондрий. 2. Изучение условий активации комутонной регуляции в печени крысы "ин виво". 3. Изучение некоторых физико-химических свойств комутона и его действия на митохондриальные процессы.

Научная новизна. В работе впервые показано, что лимитиро- . ванный транспорт ионов Ca в митохондрии, а также активация

перекисного окисления липидов в митохондриальной мембране может изменять характер комутонной регуляции, что выражается в дополнении тканеснецифической стимуляции скорости тканеспецифи-неским разобщением окислительного фосфорилирования.

Впервые обнаружено, что активация комутонной регуляция в печени происходит При повышении нагрузки на специальные функции этого органа, а также после повреждения её клеток. Установлено, что комутон, образующийся в печени в этих условиях, термостабилен. Фракционирование комутона, активирующегося в печени крысы, под действием продигиозана показало, что этот регулятор является низкомолекулярным соединением, отрицательно заряженным при щелочном рН. Высокоочищенный препарат термостабильного комутона тканеспецифически стимулирует дыхание митохондрий в среде с субстратом у-щзтактных митохондрий и вызывает разобщение окислительного Фосфорилирования у митохондрий, преянкубированных с ионами Са^+. Он не влияет на отношение Са^+/0, но усиливает высокоамплитудное набухание митохондрий, индуцированное ионами Са2+ и Н^. _ '

Практическая ценность. Разработка методов, позволяющих значительно увеличивать активность комутона в печени,^а также выявление условий, влияющих на характер проявления этой активности в отношении ОФ." представляет практический интерес. Полученные результаты могут быть использованы в лабораториях, занимающихся исследованием механизмов внутритканевых регуляций и проблемами биоэнергетики. \ ,

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на Международном симпозиуме по биологической регуляции клеточной пролиферации (9-ой кейлонной конференции), Милан, 1986 г., на I и П Всесоюзных Школах-семинарах "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий", Тбилиси, 1987 г. и 1989 г. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы, включающего 215 наименований. Текст изложен на 154 страницах и иллюстрирован 46 рисунками Введенные сокращения. МХ - митохондрии; ОФ - окислительное фосфорилирование; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ВАН -высокоамплитудное набухание; ЕЦФ - безмитохонцриальная цитоплаз-матич'еская фракция; РФК - растворимая фаза клеток;' РК - рутений

красный.

СОДЕРЖАНКЕ РАБОТУ

Обзор литературы содержит сведения об основных принципах организации и репудяторных механизмах ОФ МХ, а также данные о синтетических и эндогенных разобшителях. Рассмотрено современное состояние проблемы механизмов внутритканевых регуляций.

Методы исследования изложены во 2-й главе диссертации.

Препаративные методы. МХ из печени и почки крыс выделяли методом Шнейдера в модификации (Мосолова с соавт., 1975). Среда выделения МХ печени содержала 280 мМ сахарозы и 10 мМ трис-буфе-ра, рН 7,4. В среду выделения МХ почки вместо трис-буфера вводили 5 мМ ЭДТА, рН 7,4. Комутонсодержащую ЕЦФ из печени крысы получали методом (Элбакидзе, Устинов, 1984). Среда выделения состояла из 280 мМ сахарозы и 20 мМ трис-буфера, рН 9,0. ЕЦФ отде- ■ ляли от ядерной и митохондриальной фракций посредством их одновременного осаждения из гомогената центрифугированием при 10000x9, 20 мин. Комутонсодержащуто РФХ из печени получали методом Эрнсте-ра и Джонса в модификации (Элбакидзе, Ливанова, 1977). Гомогенат печени, приготовленный на среде выделения ЕЦФ подвергали ультрацентрифугированию при 105000 х д в течение I часа для одновременного осаждения всех меточных органелл. Супернатант (РФК) хранили при 0°С, рН 9,0.

Температурное Фракционирование комутонсодержащей БЦФ провопит при рН 7,0 (20°С) посредством её прогрева при 90°С в течете 10 мин.

Гель-фильтрацию термостабильной БЦФ проводили на колонке зефадекса о,-25 (грубый) размерами 530x35 мм.

Комутонсоцержащий элгоат, полученный в результате гель- -фильтрации, использовали для колоночной хроматографии и рехрома-гографии на ДЭАЭ-цаллюлозе (ДЕ-52) на колонке размерами 35x20 дм. Злюирование проводили 50 мМ КС1 с 10 мМ трис-буфера, рН 9,0. [омутоноодержащий элюат использовали» для рехроматографии на той ш колонке. В ходе этой процедуры нанесенный материал, предварительно разведенный в 10 раз, 10 мМ трис-буфером, рН 9,0, элюиро-вали ступенчато раствором КС1 в интервале концентраций от 15 до :00 мЛ с 10 мМ трис-буфера, рН 9,0.

Ионообменную хроматографию на колонке с Тойоперлом-6501,1 зазмерамд 180x15 га в градиенте концентраций КС1 проводили с ис-юльзованием комутонсоцержащего элюата после ионообменной хрома-

тографии на ДЕ-52. Первоначально нанесенный материал,предварительно разведенный в 10 раз 2 мМ трис-буфером, эЛюировали 2 мМ трис-буфером pH 7,0, затем 5 мМ KCl в том же буфере, после чего продолжали элшрование в градиенте концентраций KCl от 5 до 15 мМ. На колонку с Дауэксом 1x4 размерами 180x10 мм наносили кому-тонсодержащую фракцию-после гель-фильтрации на сефадексе G-25. Затем проводили ступенчатое элшрование раствором KCl на 2i трис-буфере, pH 9,0 в интервале концентраций KCl от 30 до 100 мМ, после чего создавали градиент KCl в интервале от 100 до 250 мМ"кС1 на том se буферном растворе.

Аналитические методы. Оценку активности комутона печени проводили по величине тканеспецифических эффектов этого регулятора в отношении дыхания и ОФ MX из гомологичной ткани. Для выявления тканевой специфичности упомянутых эффектов сравнивали действие фракций из печени на параметры дыхания и ОФ MX печени и почки, регистрируемых полярографическим методом. Измерения дыхания и ОФ MX проводили.в закрытой термостатируемой'при 28°С ячейке объемом I мл с вращающимся платиновым электродом и ртутно-каломельным электродом сравнения.' Среда инкубации с учетом добавления инградиентов комутонсодеряащей фракции в пропорции 1:1 состояла из 280 мМ сахарозы, 3 мМ ЭДТА, 3 мМ KHgPO^, 5 ыМ сукци-ната и 10 Ш трис-буфера, pH 7,0. Суспензию MX (2 мг белка/мл) добавляли в ячейку после введения в неё комутонсодержащей фракции и начинали регистрацию дыхания в состояниях 4' , 3 и 4, вплоть до полного исчерпания кислорода в ячейкб.

Затем рассчитывали количество кислорода, потребленного MX в активном метаболическом состоянии ( Д0акт) -И время фосфорилл-рования АДФ ( добавленного в среду инкубации. За единицу активности комутона было пронято тканеспецифическое увеличение скорости v4. у интактных MX печени в;2 раза под действием комутонсодержащей фракции в стандартных условиях эксперимента.

С целью определения отношения Са^+/0 полярографическим методом измеряли количество кислорода, поглощенного в ходе транспорта в матрякс этих- органелл. Среда инкубации состояла из 280 мМ сахарозы, 0,7 мМ KHgPO^ 5 мМ сукцината и 10 мМ тр::а-буфера pH 7,0. Через 1-1,5 мин после начала регистрации -йыхания в среду добавляли 200 мкМ СаС^ и продолжали регистрацию дыхания вплоть до полного исчерпания кислорода в ячейке.

Йзмерение кальциевой емкости MX проводили рН-электродом в

открытой ячейке объемом 3 мл, термостатяруемой при 28°С при непрерывном перемешивании ореды инкубации, содержавшей 280 мМ сахарозы, 3 мМ трис-буфера, рН 7,5, 3 мГЛ КН^РОд, I мМ мдс12 , 5 мМ сукцината, 50 мкМ АДФ, 4 мкг ротенона и 4 мкг олигомицина, в которую добавляли МХ (2 мг балка/мл).

ВАН регистрировали путем измерения оптической плотности суспензии этих органелл на 520 нм в кювете объемом 1,5 мл и длиной оптического пути в 0,5 см на спектрофотометре СФ-26. Среда инкубации содержала 150 мМ сахарозы, 50 мМ КС1, 10 мМ трис-буфера, рН 7,0.

Количество балка в препарате МХ определяли по методу Лоури. Содержание белка в комутонсодержащих фракциях оценивали по поглощению' раствора на 280 нм на спектрофотометре СФ-26, а также по Лоури.

Приведенные результаты являются средними по 3-5 экспериментам. При статистической обработке данных применяли метод вычисления ошибки генерального среднего.

Результаты экспериментов изложены в 3-5 главах диссертации. В предыдущих исследованиях было' показано, что характер действия комутона из печени на гомологичные МХ зависит от степени интакт-ности этих органелл (Элбакидзе, Духин, 1984). В процессе их старения тканеспецяфическая стимуляция , наблюдаемая под действием комутона, нэ снимаемая олигомицином, дополнялась у МХ тканеспецифическкм разобщением ОФ. Причины изменения характера комутонной регуляции оставались неизвестными. С целью исследования этого вопроса нами было изучено влияние кратковременной пре-инкубации МХ с ионами Са"+ в различных концентрациях. Преинкуба-цию проводили в полярографической ячейке в присутствии комутон-содержащей фракции и .без нее. Затем ионы Са^+ связывали добавлением ЭДТА и проводили регистрацию дыхания МХ в состояниях "4' ", "3" и "4". Эксперименты проводили в условиях "лимитированного" и "массивного" транспорта ионов Са°+ в МХ. Было установлено, что в обоих случаях характер действия комутона печени в отношении гомологичных МХ изменяется единообразно. Преипкубация МХ с более низкими концентрациями Са^+ вызывала тканеспецшическое увеличение Д0акт . не чувствительное к ротенону. При повышении концентрации ионов Са тканеспецифический разобщающий эффект наблюдался лишь в присутствии ротенона в среде инкубации. Преинку-бация с ионами Са + МХ печени и почки в отсутствие комутонсодер-

жащей ЕЦФ печени, а также МХ почки в присутствии,упомянутой фракции не влияла на сопряжение' их ОФ во всем диапазоне испытанных концентраций Са2+.

Наблюдавшаяся на интактных МХ тканеспецифическая стимуляция , не снимаемая олигомицином, получила название ос -состояния комутонной регуляции. Тканеспецифическое разобщение ОФ МХ, не чувствительное к ротенону.и ротенон-зависимый разобщающий эффекты комутона были названы - и % -состояниями комутонной регуляции, соответственно.

Показано, что РК обладает способностью ингибировать транспорт ионов Са + из наружного пространства в матрикс МХ ( УавЗ-пд-мп ег аХ ,1972). Добавление этого ингибитора в среду инкубации перед введением в нее ионов Са2+ в наших экспериментах полностью блокировало инд^квдю (* - и ^-состояний комутонной регуляции. РК усиливал также тканеслецяфическую я нетканеслецифяческую компоненты скоростей У4, при концентрациях ионов Са2+, индуцирующих /з-и ¿'-состояния исследуемой регуляции. Между тем РК, введенный по окончаний преинкубадии МХ с ионами Са2+ на индукцию этих состояний влияния не оказывал (рис.1). Действующие концентрация РК не оказывали влияния на параметры дыхания ледени и почки в отсутствие цомутонсодержащей фракции.

Было исследовано также влияние хлорпромазина - ингибитора МХ-фосфолипазы А - на индукцию р> - и Ц -состояний комутонной регуляции ионами Са2+ (№сНЬаиг ег аХд972). Добавление в среду инкубации МХ хлорпромазина перед их лреинкубацией с ионами Са2+ предотвращало индукцию /ь-состояния комутонной регуляции.

Нами было изучено влияние ионов Ре3+ на (шдукцию ¡ь - ж ^ -состояний комутонной регуляции. Как известно, эти ионы обладают способностью активировать ПОЛ'' в МХ-мембране (Кудзина с со-авт., 1979). Преинкубацию МХ из печени и почки с Яе2(504)3 проводили в полярографической ячейке в присутствии РФК из печени и без этой фракция. Затем в среду добавляли 3 мМ ЭДТА для связывания ионов Ре3+ . Одновременно вводили 5 мМ сукцината в качестве субстрата и через 30 сек добавляли АДФ. Было установлено, что преянкубацяя МХ печени с 0,6-0,8 мМ Ре3+ в присутствии комутонсодержащей фракции приводит к индукции р -состояния комутонной регуляции. При I мМ этих ионов было, индуцировано ^ ■ состояние комутонной регуляции (рис.2).

Как известно, ПОЛ можно ингибировать добавлением ионола1

(Эмануэль, Лясковская, 1961) и сукцината (Кудзина с соавт., 1979). Было установлено, что как ионол, так и сукцинат, добав-

цоо-

300-

200

1004

1

Ш 2

ш ш

з ч

Пг. 5

□а 6

ПЬ» 7

-М 8

гыь

9 <0

Рис.1. Влияние РК, ионов К и хлорпромазина на индукцию /ь -состояния комутонной регуляции ионами Са<:+. Ордината - величина лОакт.У МХ печени (белые столбики) и почки (заштрихованные столбики) в присутствии РЖ печени, в процентах от их значений у интактных МХ. 1-6 - среда инкубации без фосфата; 1-4 - в среде 4р мМ КС1;05,6 - в среде 6 мМ КС1;01 - МХ без преинкубации с Саг+; 2-6 - преинкубация с Са^; 3,4 - добавление РК (10 нМ/мг белка IX); 4,6 -добавлен ротенон (0,5 мкг/мг белка МХ); 7-10 - среда с 3 мМ фосфата; 7 -ЛИХ без преинкубации с Са2+; 8-10 -преинкубация с Са^; 9,10 - добавление хлорпромазина (0,6 мм); 10 - добавлен ротенон (0,5 мкг/мг белка МХ).

ленные в среду инкубации перед дреинкубацией МХ с ионами Ре3+ предотвращают индукцию -состояния комутонной регуляции. Введение их после завершения преинкубации не влияло на этот процесс.

Рис.2. Влияние ионола, сукцината и ионов К+ на индукцию л-состояния ко-мумнной регуляции ионаш Ре . Ордината и обозначения - те же, что и на рис.1. I - МХ.без преинкубации с Ре , 2-8 -МХ-лреинкубировали с Ре ; 1-6 - в среде 40 мМ КС1; 7,8 - в среде 6 мМ КС1; 3,4 - добавлен ионол (2 мМ;; 5,6- добавлен сукцинат; 4,6,8 -добавлен ротенон (0,5 мкг/мг белка МХ).

Воздействие на МХ ионами Са""+, равно как и активация ПОЛ в МХ-

юмбране могут приводить к появлению неспецифической проницае-

400-

300-

200-

100.

а, 1

1_ЕЗ 3

ШОаНСъИОа

3 4 6 6 7 8

г

мости этой мембраны для моновалентных катионов. В связи с этим было изучено влияние ионов К+ на индукцию р> -состояния комутон-

' р| з+

ной рефляции ионами Са т и Ре . Оказалось, что понижение концентрации К1" с 40 до 6 мМ предотвращает индукцию р -состояния комутонной регуляции упомянутыми ионами, вне зависимости от присутствия ротенона в среде инкубации. Далее было показано, что при 42 мМ К+ в среде инкубации максимальное по величине ткане-специфическое разобщение ОФ МХ печени гомологичным Комутоном происходило после преинкубации МХ с 0,2 мМ Са2+. Между тем, при 6 мМ К*" действующая концентрация Са2+ при индукции р> -состояния комутонной регуляции повышалась до 1,8 мМ Са2+ (рис.3).

Рис.3. Индукция /з-состояния комутонной дефляции у МХ печени ионами Са^+ в условиях лимитированного транспорта этих ионов в Ж, в присутствии комутонсодержащей РФК печени при различных концентрациях ионов К* в среде инкубацш: Абсцисса - концентрация Са^4" при преинкубации с МХ; ордината -А0акт у МХ в присутствии РФК печени, в % от величины этих параметров у интактных МХ. 1,2 - в среде 40 мМ КС1; 3,4 - в среде 6 мМ КС1; 1,3 - МХ печени, 2,4 -МХ почки.

Ранее было показано, что тканеспецифическое разобщение ОФ под действием РФК печени происходит при повышении концентраций неорганического фосфата в среде инкубации (Ливанова, Элбакидзе, 1980). Нами было установлено, что понижение концентрации.ионов К+ с 40 до 6 мМ и в этом случае предотвращает тканеспецифическое разобщение ОФ МХ печени комутоном.

Нами было проведено исследование условий активации комутонной регуляции в печени крысы "ин виво". В этой серии экспериментов для тестирования активности комутона использовали МХ печени 1 почки тех же сроков после воздействия, что и комутонсодержащие фракции.

Нами было изучено влияние интрагастральной, инфузии глюкозы её сочетания с внутрибрюпшнным введением инсулина, а также интрагастральной инфузии растительного масла и фенобарбитала крысам, голодавшим в течение I суток, на активность комутона в печени.

'Установлено, что тканеспецифическая стимуляция и у4

наблюдается в печени через 3 ч. после введения глюкозы. Она резко возрастает на 5-ый и практически отсутствует на 7 и 13 ч. по-зле этого воздействия. Тканеспецифлческое увеличение Д0акт змеет место на 5-6 ч. после инфузии и полностью исчезает на [3 ч. (рис.4). Добавление ротенона в среду инкубации не влияло 1а характер влияния комутонсодержащей фракции на регистрируемые 1роцессы.

<00-

50-

Рис.4. Влияние интрагастраль-ной инфузии глюкозы (1,21 и растительного масла (3,4) на активность комутона в печени крысы. Абсцисса - время после инфузии (часы), ордината -скорость дыхания и ДОакт. У МХ печени в присутствии гомологичной БЦФ за вычетом влияния этой фракции на МХ почки (в % от величин параметров у МХ печени и почки в отсутствие этой фракции). 1,3 - V., ; 2,4- А0акт,

При сочетанном воздействий инсулином и глюкозой с I по -ч. после введения глюкозы у МХ печени в присутствии гомологич-ой ЕЦФ наблюдается лишь тканеспецифическая стимуляция .

азобглающий эффект комутона отсутствовал и в опытах, проведенных а среде инкубации с ротеноном. После инфузии растительного мас-

а тканеспецифическая стимуляция уд< и

у МХ печени в лри-

утствии гомологичной БЦФ появляется через 8ч., сохраняется до 1 ч. и исчезает к 18 ч. после этого воздействия. Тканесдецифи-зское разобщение ОФ МХ в этих экспериментах также отсутствовало ак в среде без ротенона, так и при добавлении этого ингибитора рис.4).

Под действием фенобарбитала тканеспецифическая стимуляция дсания МХ печени в среде с субстратом в присутствии гомологичной НС достигала максимума уже через 2 ч. после его инфузии, затем жижал'ась на "4-6"ч. и полностью исче'зала на 8 ч. Тканеспецифи-зские изменения ОФ в рассматриваемых экспериментах полностью :сутстЕовали (рис.5). Добавление ротенона не отражалось на фактере эффектов комутона. Были проведены эксперименты по из-грению активности комутона в печени после интрагастральной ин-гзии СС14, внутрибрюшишюго введения продигиозана и в опытах с юдолжительнкм голоданием животных.

V

4

Введение СС14 вызывает тканеспецифическую стимуляцию дыхания МХ печени в состояниях "4' " и "4" в присутствии гомологичной ЩФ уже через 2 ч. после этого воздействия. Она достигает максимума на 4-6 ч. и остается на высоком уровне вплоть до окончания измерений на 8 ч. эксперимента (рис.5). Тканеспецифический разобщающий эффект комутона не наблюдался как в отсутствие роте-нона в среде инкубации, так и при добавлении в неё этого ингиби-

Рис.5. Влияние интрагастраль-ной инфузии фенобарбитала (1,2) и ССЬ (3,4) на активность комутона в печени крысы. Абсцисса и ордината - те же, что и на рис.4.

При изучении влияния продигиозана на активность комутона в печени крысы было установлено, что тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ в среде с субстратом в присутствии гомологичной ЩФ наблюдается под действием всех испытанных, концентраций этого эндотоксина. Наиболее эффективным оказалось введение продигиозана в концентрации 500 мкг/кг массы.(рис.6). Тканеспецифическое разобщение ОФ МХ в описываемых экспериментах отсутствовало как в среде без ротенона, так и при добавлении этого ингибитора.

Рис.6. Влияние парэнтерального •, введения продигиозана на скорость дыхания V.. у МХ из печени (I) и почки (2) крысы в присутствии РФК печени. Абсцисса - дозы продигиозана (мкг/кг веса животного), ордината - скорость дыхания у4, (в % от её величины в отсутствие РФК печени).

Исследование динамики активности комутона печени у крыс в ходе продолжительного голодания показало, что в течение первых суток происходит резкое понижение этой активности, выражающееся в уменьшении тканеспецифической стимуляции скоростей и у4 при отсутствии эффектов комутона в отношении ОФ. На'2-е сутки •

активность комутона в печени крысы полностью отсутствовала. Тка-неспецифическая стимуляция у4-и вновь появлялась на 3-й сутки и достигала максимума по величине на 4-е сутки голодания. Затем она понижалась на 5-е сутки и полностью исчезала на 6-е сутки. Тканеспецифический разобщающий эффект комутона наблюдался на 4-е сутки голодания и сохранялся на 5-е сутки. Добавление в среду инкубации ротенона не оказывало действия на величины эффектов комутона в отношении дыхания и ОФ Ж.

Был исследован вопрос о возможном вкладе функционального состояния МХ в реализацию коэдутонной регуляции в печени после инфузии животным глюкозы. С этой целью активность комутона в печени крыс, которым проводили инфузшо глюкозы, тестировали на МХ из печени и почки интактных животных. Тканеспецифический эффект ЕЦФ в отношении дыхания МХ печени полностью отсутствовал в среде без ротенона и при его добавлении.. ТКанеспецифическое .разобщение ОФ МХ, усиливающееся ротеноном под действием ЕЦФ, имело место через I ч. после инфузии глюкозы. На 2 ч. разобщающий эффект комутона уменьшался по величине,и добавление ротенона не приводило к его увеличению.

Были проведены эксперименты по тестированию активности комутона в печени крысы после интрагастральной инфузии глюкозы в сочетании с инъекцией инсулина на МХ, полученных из печени и почки интактных животных. Крысы в этой серии опытов содержались на зерновой диете. РФК из печени интактных крыс не влияла на дыхание и ОФ МХ в среде с' ротеноном и без него. Между тем, РФК, полученная из- печени через 0,5-2 ч. после введения глюкозы, вызывала у гомологичных Ж в среде с ротеноном тканеспецифическую стимуляцию , а через 1ч.- тканесцецифическое увеличение

АОакт.

Были проведены эксперименты по изучению основных физико-химических свойств комутона, активируемого в печени крысы под влиянием различных воздействий. Комутонсодёржащие ЕЦФ, полученные после интрагастральной инфузии глюкозы, фенобарбитала, четы-реххлористого углерода, а также в результате внутрибрюпшнного введения продигиозана, подвергали прогреву при 90°С в течение ■20 мин. Было установлено, что прогрев не влиял- на величину ткане-специфической стимуляции скорости дыхания МХ в среде с субстратом в присутствии этих фракций. Оказалось, что активность комутона, полученная в результате перечисленных воздействий, устойчи-

ва и к аэрированию в течение 60 минут. Для дальнейшего фракционирования использовали комутонсодержащую термостабильную ЕЦФ, полученную из печени животных, которым предварительно вводили продигиозан. В результате гель-фильтрации на колонке с сефадек-сом- с -25 (грубый) материал разделялся на три пика. Активность комутона была зарегистрирована в Ш пике (рис.7).

Рис.7. Профиль элюции термоста-

бильной ЬДФ печени при гель-фильтрации на колонке с сефадексом G -25 (грубый). Абсцисса - HS пробирок, левая ордината - поглощение проб при 280 нм, правая ордината - тканеспецисбическая стимуляция дыхания v4."y MX печени в присутствии ЕЦФ, в $.от величины этого параметра у интактных MX. Сплошная линия - Eggg; пунктир - тканеслецифические изменения V., у MX печени в присутст-«с .10 50 чо so ВИИ айоата.

Было показано, что при щелочном pH молекулы комутона не взаимодействуют с КМ-целлшозой, но сорбируются на ДЭАЭ-целлшо-зе. В связи с этим дальнейшее фракционирование проводилось на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Нанесенный на эту колонку материал разделился на два пика. Активность комутона элюировалась с колонки вместе со П пиком. Далее комутонсодержащий элюат был использован для рехроматографии на той не колонке, но уже в условиях ступенчатого элюирования повышающимися концентрациями KCl. Нанесенная на колонну фракция в результате описанной процедуры была разделена на два пика, причем активность комутона присутствовала в I пике. Было проведено также фракционирование комутонсодержащей Фракции, полученной путем гель-фильтрации термостабильной ЕЦФ на колонке с сефадексом G-25 (грубый), на колонке с Тойоперлом марки "ДЕАЕ-650М". Фракционируемый материал в этом эксперименте разделился на три пика.

Было осуществлено фракционирование комутонсодержащей фракции, полученной после гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (грубый) на колонке с ионообменной смолой марки Дауэкс -1x4. Ступенчатое элюирование нанесенного материала раствором KCl с последующим градиентом раствора этой соли позволило разделить комутонсодержащую фракцию на 4 пика. Активность комутона присутствовала в 4-ом пике элюированного материала (рис.8).

Наш было изучено влияние ВОЖ из печени крысы на некоторые МХ-процессы. Для получения ВОЖ была использована комутон-

содержащая РФК из печени крысы, которой предварительно вводили продигиозан. Фракционирование РФК осуществляли сочетанием гель-фильтрации с обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке С-18.

Рис.8. Профиль элюции термостабильной комутонсодержащей фракции, полученной в результате гель-фильтрации на колонке с се-фадексом <з -25 (грубый), при ступенчатой элюции на колон-■ ке с ионообменной смолой ДАУЭКС - 1x4. Абсцисса, ординаты и обозначения - те же, что и на рис.7. Под абсциссой приведены концентрации КС1 в ходе ступенчатого элюирога-ния нанесенного материала.

Добавление ВОФК из печени к интактным гомологичным МХ вызывало тканеспецифическую стимуляцию их дыхания в среде с субстратом, не снимаемую олигомицином. Далее было установлено, что преинкубация Ж печени с ионами Са^+ и неорганическим фосфатом способствует тканеспецифическому разобщению их ОФ по^ действием НЖ, не чувствительному к'ротенону.

• Повышение концентрации ионов Са^+ до величины, индуцирующей ротенон-стимулируемый разобщающий эффект комутона в экспериментах с неочищеннойл<омутонсодержащей фракцией,'не приводило к реализации этого эффекта под действием ВОФК.

Было проведено исследование влияния ВОФК из печени на эффективность транспорта ионов Са^+ в МХ печени и почки. Оказалось, что при использовании ВОФК в концентрации, вызывающей у гомологичных МХ выраженную тканеспецифическую стимуляцию дыхания в среде с субстратом, изменений величины отношения Са2+/0 у МХ из упомянутых тканей не наблюдалось.

- 16 -

Изучалось влияние ВОФК из печени на кальциевую емкость МХ из печени и почки крысы. Было установлено, что добавление этой фракции к МХ, осуществляющим "массивный" транспорт ионов Са^+, не влияет на величины кальциевой емкости у обоих препаратов МХ.

Было изучено также влияние ВОФК из печени на ВАН МХ из печени и почки, индуцированное добавлением в среду инкубации ионов

и неорганического фосфата. Введение в среду ВОФК вызывало ускорение понижения оптической плотности суспензии МХ печени при 520 нм, что свидетельствовало об ускорении набухания этих орга-нелл. Добавление ВОФК к МХ почки не влияло на скорость их набухания (рис.9).

Рис.9. Влияние высокоочищенной комутонсодержащей фракции на ВАН ' МХ печени и почки крысы, индуцированное совместным действием ионов Са^+ и Ф . Ордината г ОП 520 нм, абсцисса -время (мин). Сплошная линия - набухание МХ в присутствии Фракции, пунктир - набухание без0добавления фракции. Стрелками указаны моменты введения I - МХ печени, Са -26 мкг/мг белка МХ, 2 - МХ печени, Са - 13 мкг/мг белка МХ; 3 - МХ почки, Са - 26 мкг/мг белка МХ.

Обсуждение результатов содержится в 6 главе диссертации. На основании данных экспериментов по индукции /з - и / -состояний комутонной рефляции посредством преинкубации МХ с ионами Са^+ и проведенного ингибиторного анализа этого процесса можно представить себе следующую последовательность событий, приводящих к активации комутонного контроля ОФ. Поступление ионов Са^+ в матрикс МХ и их рециклинг на внутренней мембране активирует МХ-фосфолипа-зу А, вследствие чего индуцируется проницаемость упомянутой мембраны для ионов К*". Необходимость этой проницаемости для реализации комутонного контроля ОФ была подтверждена в экспериментах по индукции /> - и ¿г -состояний комутонной регуляции валиномицином (Элбакидзе, Федоров, 1985). В связи с тем, что (ъ -состояние комутонной регуляции удается.индуцировать также добавлением в среду низких концентраций 2,4-ДНФ или малоната (Челидзе, Злбакицзе,

1989), можно полагать, что вклад ионов К+ в активацию комутон-ного контроля ОФ носит неспецифический характер и обусловлен деэнергизацией МХ.

Ввиду того, что индукция /1 -состояния комутонной регуляции ионами Ре ингибировалась ионолом и сукцинатом, было сделано заключение об участии ПОЛ в активации комутоннЬй регуляции ОФ. Ингибирование индукции р> -состояния этой регуляции в среде без К+ позволяет предположить, что и в рассматриваемом случае активация комутонной регуляции ОФ осуществляется посредством повышения неспецифической катионной проницаемости у внутренней мембраны МХ. Стимуляция разобщающего эффекта комутона в присутствии ротенона в % -состоянии комутонной регуляции свидетельствует о том, что при определенных величинах К+-проницаемости МХ-мембраны активация комутонного контроля ОФ может ингибироваться с участием митохондриального пула НАДН.

Таким образом, на основе полученных результатов можно заключить, что пусковыми механизмами активации комутонного контроля ОФ является перераспределение ионов Са2+ между гиалоплазмой и матриксом МХ, сопровождающееся активацией МХ-фосфолипазы А, или снижение антиоксидантной активности клетки с последующей активизацией ПОЛ во внутренней мембране МХ.

Наличие активности комутона в печени крысы после интрагас-тральных инфузий глюкозы, растительного масла, фенобарбитала, СС1^, а также инъекции продигиозана следует объяснять активацией этого регулятора, т.к. все описываемые опыты проводились на животных, голодавших 24 ч. Между тем показано, что комутонная регуляция полностью инактивируется в этом органе уже к(12 ч. после прекращения кормления животного (Элбакидзе, Духин, 1|84). Ввиду того, что повышение нагрузки на функцию печени по аккумуляции глюкозы, жировая нагрузка, а также нагрузка на детоксикационную функцию этого органа вызывают активацию в нем комутонной регуляции, можно полагать, что причиной активации комутонного контроля дыхания и ОФ в регенерирующей печени (Элбакидзе, Челидзе, Духин, 1984) мо'хет являться повышение функциональной нагрузки на неудаленную после частичной гепатэктомии дольку этого органа. Эксперименты с повреждением клеток печени посредством введения крысе СС1^, продигиозана и в ходе продолжительного голодания показали, что комутонная регуляция активируется в этом органе вне зависимости от способа их повреждения. Тот факт, что комутонная регуля-

ция активируется в ответ на саше разнообразные воздействия на печень, свидетельствует о неспецифическом механизме её активации. Следует отметить, что общим последствием всех рассмотренных воздействий для метаболизма клеток печени является создание дополнительной нагрузки на их энергообеспечивающие механизмы. В связи с этим можно предположить, что активация комутонной регуляции происходит в ответ на повышение нагрузки на энергетический гомео-стаз клетки.

Активированная в печени комутонная регуляция в основном находилась в <* -состоянии-. Лишь е опытах с инфузией глюкозы и после продолжительного голодания наблюдалось /з-состояние комутонной регуляции. Было показано, что введение крысе инсулина модулирует комутонную регуляцию, т.к. в этом случае происходила индукция -состояния комутонной регуляции, в то время как под действием одной лишь глюкозы имело место /ь -состояние комутонной регуляции. Таким образом состояния комутонной регуляции, описанные в экспериментах "ин витро", были выявлены нами и в опытах "ин виво". Возможность модуляции эффектов комутона посредством изменения функционального состояния Г.'Х была продемонстрирована и в экспериментах, где для тестирования активности комутона в печени крыс, получавших глюкозу с инсулином, использовали МХ из печени интактных животных.

Эксперименты по прогреву и аэрированию комутонсодержащих фракций, полученных из печени животных после нагрузочных и повреждающих воздействий, показали, что в этих условиях активируется термостабильный и устойчивый к кислороду комутон. В ходе дальнейшего фракционирования комутона, активированного введением продигиозана, было установлено, что он представляет собой низкомолекулярное соединение с молекулярной массой менее 5000, отрицательно заряженное при щелочных значениях рН. Проведенное хрома-тографическое разделение комутонсодержащей фракции после гель-фильтрации на сефадексе й -25 с использованием различных ионо-обменников и режимов элюирования позволило очистить комутон примерно в 100 раз по белку.

Способность ВОФК из печени тканеспецифячески стимулировать дыхание гомологичных МХ в среде с сукцинатом и олигомицином, тканеспецифически разобщать их ОФ после преинкубации с ионами Са2+, а также ускорять ВАН этих органелл, индуцированное Са2+ и фосфатом, свидетельствует о деэнергизующем воздействии комутона

на МХ. Однако отсутствие влияния комутона на отношение Са/0 и на кальциевую емкость гомологичных МХ свидетельствует о слабой деэнергизации МХ этим регулятором.

Общеизвестно, что разобщение ОФ МХ сопровождается активацией аэробного гликолиза. Такое изменение в энергообеспечивающих механизмах клетки описано в условиях повреждения клеток (Браун, Булычев, Ганелина, 1967), а также при резком повышении нагрузки на их специальные функции (Меерсон, 1973). При этом возрастает устойчивость клеток к другим повреждающим воздействиям (Браун, Моженок, 1987). В связи с этим можно4полагать, что активация ко-мутонного механизма внутритканевых межклеточных взаимодействий в таких условиях вносит вклад в адаптацию ткани к нагрузочным и повреждающим воздействиям.

■ВЫВОДЫ

1. Установлено, что преинкубация МХ печени с ионами Са^+ в среде без фосфата активирует не чувствительное к ротенону тканеспецифическое разобщение ОФ комутоном. Добавление РК перед преинкубацией ингибирует этот эффект. Не реализуется он и в среде без ионов К+. В результате преинкубации МХ о более высокими концентрациями ионов Са^+ активируется ротенон-стимулируемое разобщение ОФ МХ печени гомологичным комутоном.

2. Преинкубация МХ печени с ионами Са^+ в среде с фосфатом также приводит к активации ротенон-независимого и ротенон-ст'имулируемого тканеспецифического разобщения ОФ комутоном. Разобщающий эффект комутона ингибируется хлорпромазином и в среде с низким содержанием ионов К+.

3. Преинкубация МХ печени с ионами Рв3+ активирует роте-нон-независимое и ротенон-стимулируемое тканеспецифическое разобщение ОФ комутоном. Ингибиторы ПОЛ - ионол и сукцинат, а также снижение концентрации ионов К+ в среде инкубации ингибируют этот эффект.

4. Впервые показано, что комутонная регуляция в печени крысы активируется в результате повышения нагрузки на специальные функции этого органа, а также в результате повреждения его клеток.

5. Установлено, что активность комутона, регистрируемая в печени после нагрузочных воздействий на функции этого органа или введения продигиозана, выдерживает прогрев при 90°С. Термоста-

бильный комутон печени, активируемый продигиозаном,- является низкомолекулярным соединением с молекулярной массой менее 5000 и суммарным отрицательным зарядом при.щелочных значениях рН.

6. Высокоочищенннй термостабильный комутон из печени крысы вызывает у интактных гомологичных MX стимуляцию дыхания в среде с сукцинатом, которая дополняется тканеспецифическим разобщением

•ОФ после преинкубации MX с ионами Са^+.

7. Высокоочиценный термостабильный комутон из печени крысы не влияет на величину отношения Са2+/0 и кальциевую емкость MX печени в условиях "массивного" транспорта Са2+.

8. Высокоочищенный термостабильный комутон из печени крысы тканеспецифически усиливает ВАН гомологичных MX, индуцированное ионами фосфата и Са2+.

По теме диссертации опубликованы следующие работы: -I. Элбакидзе Г.М., Злбакидзе И.М., Гачечиладзе А.Г. ..Рогова Н.С. Индукция уз - и ц -состояний комутонной регуляции окислительного фосфорилирования митохондрий печени крысы при активации перекисного окисления липидов митохондриальной мембраны // Доклады АН СССР. - 1985. - Т.282, ИЗ. - С.729-7Э1.

2. Злбакидзе Г.М., Элбакидзе И.М., Гачечиладзе А.Г. Влияние рутения красного на индукцию f> - и ^ -состояний комутонной регуляции дыхания и окислит&пьного фосфорилирования митохондрий ионами Са2+ // Бюлл.эксп.биол.мед. - 1986. - F7. - С.36-38.

3. Элбакидзе Г.М., Федоров В.П., Злбакидзе И.М. Индукция уз - и ft -состояний комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени и почки крысы ионами кальция // Известия АН СССР, сер.биол. - 1986. - J'3. -

С.400-409.

4. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе И.М. Активация внутритканевого контроля энергетического метаболизма в печени при усилении нагрузки на специальные функции и её повреждении гепатотоксином // Доклады АН СССР. - 1986. - Т.291, JP3. - С.719-723.

5. Elbakidze G.М.,Elbakidze I.M., Chelidze М.А. Some basic principles of the intratissue Control of energetic metabolism in rat liver. Comuton concept.//Internatl. Symp. of Uiol. Regulation of Cell Proliferation, 9-th Chalone Conference.-Milan, 1986.-P.23.

6. Elbakidze G.H..Elbakidze I.M., Rogova U.S.Lipid peroxide oxi-

- 21 -

dation and calcium ions regulate the character of comuton control of energetic metabolism in rat liver and kidney.// Internatl. Symp. of Biol. Regulation of Cell Proliferation. 9-th Chalone Conference.-Milan,1986.-P.24.

7. Элбакидзе Г.М., Челидзе M.A., Элбакидзе И.М. Нарушение внутритканевого контроля энергетического метаболизма.печени, как возможная причина диабета // Доклады на 1-ой школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий". - Тбилиси, 1987. - С. 178185.

8. Элбакидзе Г.М., Федоров В.П., Рогова Н.С., Элбакидзе И.М. Индукция /■> - и ^-состояний комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени и почки крысы неорганическим фосфатом // Известия АН СССР, сер.биол. - 1988. - И. - С.ГЗЗ-136.

9. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М. Влияние однократного введения фенобарбитала и четыреххлористого углерода на активность комутона в печени крысы // Известия АН СССР, сер.биол. - 1989. - Ji5. - С.666-673.

10. Элбакидзе Г.М., Челидзе И.А., Элбакидзе И.М., Гачечиладзе А.Г. Физико-химические свойства комутона, активируемого в печени продигиозаном // Доклады на 2-ой школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий". - Тбилиси, 1989. - С.77-78.

I

t

М4г