Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование свойств тирозинаминотрансферазы, локализованной в ядерной фракции печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование свойств тирозинаминотрансферазы, локализованной в ядерной фракции печени крыс"

— >' 1' К) л /'

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПАТРИСА ЛУМУМБЫ

На правах рукописи УДК ¿77.15:591.436:616 АТАЕВА Гульджахан Сапардурдыевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ТИРОЗИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ, ЛОКАЛИЗОВАННОЙ В ЯДЕРНОЙ ФРАКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС

(Специальность 03.00.04 - Биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1992

Работа выполнена на кафедре биохимии (заведующий профессор X. Курбанов) Туркменского ордена Дружбы народов государственного медицинского института (ректор - член-корр. АН Туркменистана H.H. Нурмамедов).

Научный руководитель: член-корр. АН Туркменистана, доктор биологических наук, профессор X. Курбанов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.З. Горкин доктор медицинских наук Г.З. Хисамов

Ведущая организация - 2-й ММИ им. Н.И. Пирогова

час. на заседании специализированного совета Д 053.22.02 ордена Дружбы народов Университета Дружбы народов имени Патриса Лумумбы по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет.

- С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Университета Дружбы народов имени Патриса Лумумбы по адресу: Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

Защита состоится

Автореферат разослан " rf^ " QUAßM^J 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук, профессор

В.Э. ТОРБЕК

J

j

Онщ ХАРАШРИОША РАБОТЫ

Актуальность проблема. Тйрозинаг.эаотранс$ераза, катаяизиру»-пая реакцию трансаминирования мезду тирозином и &С -кетоглутаро-зой кислотой с образованием п -оксифенюшировиноградноЯ / a -ОКК/ п глутаминовой кислот, является сравнительно хорошо изученным ферментом. В частности, изучена молекулярная гетерогенность фер-. мента и возможный механизм интерконвэрсия отдельных язофори под влиянием хонвертазн /Левин, 19S9; Мертвецов, 1981; iwasaki, Pi-tot, 1971; Boctor, Сгоаевая, 1978; Gohdo, Pitot, 1980/. Изучен механизм индуцированного образования фермента под влиянием различию: индукторов. Показано, что для ткрозинаданотрансферазн характерно отсутствие узкоспвцифзчзскоЯ индукция, но для осуществления этого процесса, необходимым условием является активное функционирование у гивотзжх надпочечников /Левин, 1969; Курбанова, 1978; Мертвецов, 1978; Красильник'ов и др., 1987; Anderson, 1982/. Охарактеризован ряд физико-химических свойств данного фермента, в том числа устойчивость "его к термической обработке н зсо— ферментная заЕ&та фермента /Мервдецов а др., 1976; Hargrove, ' Grcaaor, 1982/; растворимость.':: различных буферных'растворах, молекулярный вес и аминокислотный состав, а гакгэ влияние pH а ионной силы буферных расгвороз на -активность данного фермента s другие свойства /Букин, йзтзеей, 1S74; /дяер в др., 1977; Ызрт-В6Ц0В, 1981; "Valeriote et al., 1959; Rabeaatein» Ivoide, 1979; Stajnert, 1983 и др./.

Однако все эта результат шмзгчена.на основании изучения га-розинаминотрансферазы, находящейся в растворимой фракции клетоз печени. Шесте с тем высокая удельная активность тарозннашшо-трансферазы обнаруживается з ютохоадраальноЗ а ядерной фракциях печени крыс. Наряду с бошапка дсстягеняяггз з изучении тарозия-ачинотрансферазы, локализозанясЗ в цптозатэ клэгся язчени, совершенно недостаточно изученная остается фзрганг,. находящийся з ядерной и митохоядриальноЗ фракциях.

Единичные данные, икепзияся з литература по исследсвшш) свойств митохоядриальноЗ iopr.n фермента,- доказывает,. что она отличается от цитоолазматдчэсхоа форта тгрозинаикнстрансф^разз го аминокислотному состазу а Х^ nzz субстрата. 3 огногзнгз zu лдор-ноЗ формы формопта /ее структуры в свойств/ в литература всобгзэ

отсутствует какая-либо информация. К настоящему времени остается открытым вопрос о наличии в ядерной фракции клеток печени саш-стсятельной формы тироэинашнотрансферазы, о ее структуре, свойствах г биологической рола, а такге щи других вопросов.

Пель и задачи исследования. В ^вязи о вышеизложенным нам представлялось валшьм решение вопроса о наличии ядерной форш та-розива*.шнотранс$еразы в ядерной фракции печени крыс, выделение и изучение ряда свойств указанной формы фермента. Для решения вопроса о тем, является ли тирозйначшгогравсфераза, обнаруживаемая в ядерной фракции, самостоятельной формой фермента, ставили себе очередную цель - провести сравнение полученных данных с результатами исследования тирозянамияотрансферазы, локализованной в цаго-плазматической фракции печени.

Согласно целям исследования была поставлены елгдувдие задачи: получить чистую фракциз ядер, свободную от цитоплазматической и митоховдриальной форш тирозинагдшотраясферазы; выделить из ядерной фракции фермент и изучить нзоанзвмный спектр выделенного фермента.

Учитывая, что для тирозЕнаадаютрансферазы печени крыс наиболее гарактерным является ее способность к индуцированному образовании под влиянием индукторов, ставилась задача: исследовать влияние гидрокортизона, ь-тирозина я солнечно-теплового воздействия ка активность ядерноЗ формы фермента. Провести также сравнительное исследование оптимума рй и кинетических параметров для обеих форм гирозияаминотрансфераэн печени крыс.

Научная новизна. Вперит выделена и пятидесятикратно очищена тар-оз2яа\таютрансфераза из ядерной фракции печени крыс. Показано, что в печени крыс наряду с цитоплазштической и митохонд-риальной формами тирозинамлнотрансферазы существует также ядерная форма фермента.

Впервые изучены некоторые свойства ядерной формы тирозинами-нотранефлразы. Показано, что указанная форма отличается от цдто-плазматической форш фермента по изоэнзимному спектру. Установлено также, что индуцированное образование ядерной форш тирозин-аминотрансферазы под влиянием гидрокортизона, тирозина и солнечно-теплового воздействия осуществляется как за счет увеличения активности существухжеЯ изофорилн, та? и путем появления новых додфракцвй. Показано, что ядерная форма тирозинаминотрансферазы

несколько отличается по оптимуму рН, Ку я 7~гг> от д&лзшшзштз-чвекой форма фермента.

Нчтчяо-гтшктичедкая реннооть. Результата проведенных есояэ-дований- показывает, что основной формой тпрозгаалшнотрансферааа в печенз крыс является цитоолазматнчесхая форма. фермента. Однако наряду с ней имеются ядерная в матохондриальная формы этого фермента, тю необходимо учитывать при оценке роли а значения тиро-зина'.шютрансферазы в регуляции метаболизма тирозина. Хрокв того, полученные нами результаты расширяют представление о структуре а функциях адаптивных ферментов б зивотноы организма.

На защиту внносягся следтатоэ положения.

1. Путем изучения активности тирозанаман'отрансферазн в ядерной фракции клеток печена было установлено наличие ядерной форггн тирозаяамянотрзясферазы. С использованием различных детергентов удалось выделить и пятидесягикратно очистить ухазаннув форму фермента.

2. Сравнительные исследования свойств ядерной форты тирозин-амннотраясферазы позволила установись, что указанная форьз фермента отличается от цитодяазмагической форд! тирознна\!инотргнс-феразы отсутствием-в ней каюдаой изофоря фермента; по степени индукции под влиянием гидрокортизона, тирозина и солнечно-теплового воздействия я по зоне рН для каксииалвного проявления ферментативной активности. Охарактеризованы -кинетические параметра этих форм тзроэинамизотрансфераза печени крыс.

3. Получены новые подтверзденгя, что цлтошгазкатическая форма тирозияагагпотрансферазы-состоит аз индуцируемой и конститутивной пзоформ фермента. Ивдуцируекне' изоформы индуцируются гидрокортизоном, тирозином и соднечно-тепдовки воздействием.- Индукция ферментов осуществляется как путем увеличения активности существующих пзофори, так г путем появления новых подфракций в этой труппе изоферментов.

Апробация работа,' Материалы диссертационной, работы заслуианы и обсуздены за 17 конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана /Аагабад, 1986/; на яаучшгх конференциях профессорско-преподавательского состава Туркменского государственного лэ-дицикского института /19В5/; на иеаяунароянш сшяюзпу>лэ з г.Мосхзе /19Б5/.

Публикация рязультатоя ядолддовяяяЯ. По тема диссертация опублжозало 6 работ з открытой печати.

Объем в структуш диссвртатта. Диссертация состоит из введения, семи глаз, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемо! литературы. Диссертация казкшзна на 148 страницах машинописи, вклэчая 14 таблиц и 23 рисунка. Библиографический указатель содержат 142 Еаимеаовашш, в тш чпс."е 50 отечественных и 82 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЕ И ШВД ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводила на взрослых беспородных белых крысах-самцах массой 150-200 г. Еивотные подбирались в основном одинакового возраста. Есого в работе бнло использовано около 1200 крыс, которне содерзались на обычном рационе ваварая.

Гидрокортизон вводила аивотннм внутрибршияно из расчета 5 от на 100 г веса ишогног-о. Солнечно-тепловое воздействие на животных проводили ка открытой солнца площадке в течение 20 минут. Опыта проводили в л-зтниз месяцы /шль-август/, как правило, в 12-13 ч дня. Ректальауа температуру у зашотных измеряли как до начала солнечно-теплового воздействия, так и в процессе всей зко-по^гдаи с перерывая в 5-6 кпн. Ъ -тирозин в виде водной суспензии вводили sKBOTHHT.t внутрь через металлический зовд из расчета 20 иг ка 100 г веса кивотного,

Виде-тение цпгогшазуатичсской, митохондриальной и ядерной Фракций проводила из 10$ гомогенна печени, приготовленного в 0,05 V. К-фосфатао-л буфере рН 7,6, содеркацем 0,25 M сахарозу, 1 ЭДТА.. Для. выделения гдечной фракции из клеточного го:логона-та печени ксиользозали иетод Олфри /1957/. Для экстрагирования бзлкоз из ядерной фракцгя осадок ядер подвергали обработке детергентами /додецнлеульфат натрия, дезоксихолат натрия, тритоя-100/. Гель-хра-лагографчи белков проводили на колошеах с сефэдексом G -200, согласно списаниям Гшюдоана I.M. /19S4/ и Детермака Г. /1970/.

Активность фермента тирозинаташогрансферази /Ш 2.6.1.5/ определяли по методу Ф.Б.Левина /1959/. Урозень белка з иселедуемцх пробах определяли по методу Ьо-.тгу /1951/. При изучении кинетики тгрозанаминотрансферазн /определении Ку и vnax / использовали методы Дайкунвера-Еерка и Коршш-Еоуден.

ИЗУЯЬТАТН ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ СБСЩШЕ

Выделение в аз учете изознзикного спектра различных фора тирозинаыинотраясферазн печени крыс

Известно, что ТЕрозинашшогрансферзза печени является а оэ-новнсм дитоплазиатическим ферментом. Однако обнаружена активность этого фермента в митохондриальной и ядерной фракциях печени крзс, В сачзн с этим нами проводились исследования распространения активности тирозинаиинотрансферазы по субклеточным фракциям печена. Опыты проводились на беспородных крысах-самцах. 3 каддсй серпа использовала печена от 10-15 животных, которые объединяли!» а аз них готовился цельный гомогеаат. Из последнего выделяли ядернув« митохоядриальнуа и Еостшггохощфяадьяув фракции. Определяла активность тирозина'ягаотраясферазы д количество белка в указанных субклеточных фракциях. Рассчитывали обцее количество белка в каждой фракции а суммарную активность з -них.

Результаты исследования показали, что высокая удельная активность фермента выявляется в' цитоплаз:.!атическсй фракция и составила 257,1 !.жг п-ОЗПХДег белка/час. В' ядерной фракции она составила 233,9 мхг п-ОФПК/мг белка/час. Однако из-за низкого уровня белка, определяемого з ядерной фракции, обзая активность тгрозян-агзшотрашферазн в этой фракция с оставила болзе 1% от обг^З ал-тнвзоста фермента в клетке.. _

• Результата выделения анодных в катодных групп изофзриевтов тирозина\ишотрансф>ерзза показала, что в цнтопаазматичвсяоЗ а кз-тохондриальноЗ. фракциях таченн тирозинаюяограЕсферага представлена как в виде алодноЗ, гак а катодноЗ грушг изоберглентсз. В ядеряоЗ фракции фермент представлен только з вида анодной формы пзофергентоз. Било проведено сравнательноа исследование количества бэлг-са а актизностн тзрогшаминотранеферазн из ядерного я пост-ггнтохсндряалнюго суперватанга печена крыс прн фракдгонировакгз сульфагса агония в лредэлаг 30-70% 'наонадзия. 2рз засаливании з указанию: когдентрациях сазз знход база 23 яосмтсшяЕриаль-' еого супэрнатазта находится з прздзлах 35-4.0%', знгод феркента пра этот сссг*22л ската $0%. Пса фридионнроззла тирозиза^инэ-тро^ефзрагз нз ллзагоз ядзрзсЗ фрахша буход Фзриента составил Ее более 42%. Результата гтзх гсслэдовгжй такзз показали, что лпсата, полученные из ядэргоЗ фракции пзчеяа грт з соегккмхвзд-ргальгай супернатгнг отличаются друг от друга по белковому составу.

Были изучены выход фермента в раствор из ядерной фракции при использовании разлитое лизкруюшдх детергентов, а такге возможность применения разных марок гелей при гель-хроматографил. Для этого использовали 1&-ные растворы тритона Х-100, ses и дезокси-холата натрия. Для гель-хроматографии - сефадекс с-100, с-200 z сефароза 43.

Результаты исследований показали, что более четкое разделение белков лизата ядер наблюдается при применении сефадекса о-200. Оказалось, что наиболее высокая удельная активность фермента обнаруживается в лизате, полученном из ядерной фракции обработкой их. тритоном Х-100 и составила 2S5.2 ыкг n-OiîDC/мг белка/час. Наибольший выход белка наблэдался в лизате, полученном обработкой ядер раствором sds. в ядерных лизатах, полученных обработкой раствором тритона Х-1СО и дезоксахолатом натрия, на хроматограмме обнаруживается более 5 белковых зон. Причем, эти белковые зонн ш-скьметрачны а оказалась достаточно диффузными.

Исследования активности гарозинаианотрансферазы в элвяруегаа из колоша фракции белков показали, что основная тсса активности фермента выходаг из колонки одяам пиком в составе белков, злш-руюцих со значением Kf 1,7-2,5.

Результаты исследования активности тирозин&ташотрансферазы во фракциях белков,"элаируемых из колонка при гель-хродагографии постжтоховдраального супернатаята показали, чФо в постмитохозд-ряальном супернатаяте обнаруживаются две группы изоферментов ти-розил£шинотракс$еразы /рас. 1/. Одна группа - анодная форма изо-форыонтов - элшруотся из колонки со значением К* от 1,20 до 2,70, и другая группа - катодные изоферыентн - выходящая из колонки узкий объекои / к* от 3,45 до 4,20/. В составе каллой из этих групп изоферментов выявляется по две изоформн гирозянашнотракс-феразы.

Исследование влияния гидрокортизона, тирозина и солнечно-теплового воздействия на активность различных фора тирозина.\шнотрансферазн печена крыс

Известно, что наиболее характерным для тарозинаминотрансфе-разы печени является наличие индуцируемой и конститутивной изеформ

Проведенные нала исследования в этом направлении показали, что гидрокортизон, ь-тирозин, а также кратковременное сол-

Рлс. 1. Удельная активность тарозишжанотрансферазы во фракциях белков постаитохокцряального супернаганта печена при голь-хрскагографии на сефадексе (3-200.

1 - интакпша крысы; 2 - краен, получившие гадр0;:°Рг;130Н! ^ - крысы, получившие Ь-тирозш; 4 - крысн, подвергнутые сол-кечзо-тз пловец зоздействип.

нечао-тешшзое всздейсетиэ на xzboîhhx ввэнваиг увелгчениэ активности. тирозшихЕЕнотрансфереЕэн в посязштохонцриальнок сушрнатан-те и ядерном sza&TB печени краг. Более резкое увеличение активности фврдента наблюдается каст вааденпЕ аавотшш гидрокортизона в значительно кенгаее увеличение - посла ссдначно-теплазого воз-дэйствия на них. /табл. I/.

Таким образом, в ядерной фракции печени крыс имеется индуда-бельная форма тирозинаыинотрансфвразы. При сравнении указанных свойств фермента со свойствами тирозинаминотраясферазы аз посткз-тохокдриального супернатанта получено, что степень индукции фер-кента больпе выражена в ядерной фракции печени крыс /рис. 2, табл.1/.

Представляло определенный интерес изучение влияния различных индукторов на изоэнзимный спектр ядерной 2 цитоолазматичзскоЗ фора тирозинаминотрансферазы.

Результаты исследования показали, что при пропускания посг-митохсщдриального супернатанта печени крас через колонку с сефа-дексом G -200 тирозинаьшнотрансфераза элшруется двумя грушами кзоформентов - анодными и катодшии. Катодные группы изоферменгов всегда выходили из колонки двумя лодфракциями и воздействие на животных индукторами тирозшалшногрансферазы не вызывало заметных качественных п количественных изменений в этой группе пзофермектов.

Анодные группы изоферменгов, как оказалось, имеют очень сложный КЗОЭНЗИГ.ИЫЙ спектр /рис. 1/. Больше всего подфракций этой труппы иаоферменгов обнаруживается у животных, получивших нагрузку гидрокортизоном. Кзоэнзеший спектр анодной группы из оферентов тирозинаминотрансферази из постмитохондриального супернатанта у зевотных, подвергнутых солнечно-тепловому воздействии, аналогичен с таковым у животных, получивших нагрузку гидрокортизоном, и резко отличается от изоэнзимного спектра, наблюдаемого при нагрузке еивотных Ь - ^ирозтаом.

Тирозинампнотрансфераза из ядерного лкзата у животных, получивших гидрокортизон ели тирозин, или подвергнутых солнечно-тепловому воздействии, элшруется аз колонки широкой зоной, соответствующей элздии анодной группы изоферментов, а имеет очень сложный спектр /см. рис. 2/. Количество подфракций при этом /в частности, после нагрузки животных гидрокортизоном/ доходят до семи, а суммарная активность феряента возрастает почти десятикратно.

Таким образом, ядерная фракция тирозшаминотрансферазы явля-

Таблица 1

Изменения удельной активности /в ют п-О^ПК/.дг болгл/час/ тирозинашшотрансфорози в различных фракциях гозчвна крыс посла нагрузки зашояшх гидрокортизоном, тирозином

и солночко-хзплового воздействия

!Ингакт-! Лоело" нагрузки I Поело нагрузки 1 Поело оолиочио-твп<

Фракции печени;НЫ9 —ШРМт^ИШ , 1 . .^ШОХШШ^_ ., { Г.ОЦОУО ПОЯДайШ

^¿А^иа ли1ишмБотнцо 1удедь-1уволачо1шо I удоль-! уш>яачопиб1 удаль- !уьолаченао ! ¡нал ¡удэлъной &к-!ноя (удолъной шс-!нал (удельной а

'ныв жа-}_дщ)ояо^;яэоном , 'тирозином.. лопого пгшпйотпед

. . Iудоль-!увелдчошю Гудоль- Гуьолаченао

. - __________ ___________________ - ......- „.__________ак-

!актив-!ташюсга по ! актив-(кшности по (актив- (тивиоста по

!кость Тотиошашш к !кость (отношошш к 1пооть !отношению к

! ¡ши дктшл . I (илтакишм „ I (интактннм

I-№рт'р':*.| „Ч.! 1дамтчич. '

■ |ГИЯ9ТДНМ«.

779,0

Цельный гомо-

генат 130,0 1076,2

Лосшитохонд-риалышй су-

порнатант 175,7. 2038,7 1160,3 Лизат из ядерной фракции 44,8 406,7 907,0

Фракции белков, осажденных из лизатов ядер сульфатом

аммония 91,1 1860,0 2041,7

287,4 208,3 224,0 162,3

379,4 215,9 260,0 248,0

118,0 263,4 88.0 197,1

648,1 911,4

286,8

314,0

Гидрокортизон вводили по 5 от/100 г веса виутрнйргашшпо; Ь -тирозин - вовнутрь по 20 шУ100 г веса; солночпо-те пловсыу воздсшсгваа криси подвергалась в точа-кяа 20 мал при температуре 44-48°С. Активность форшита исследовали чороз 5 часов после воздействия.

р*- -;--

0,93 1,85 2,78

Рас. 2. Удельная активность тпрозшаминотраясферазы во фракциях белков ядерного лизата печени крыс при гель-хралатографин на сефадексе 6-200,

1 - нктактнне крыса; 2 - крысы, получившие гидрокортизон; 3 - крысы, получившие 1-тирозин; 4 - крысы, подвергнутые сол-нечно-тешховому воздействия. Ядра лизи-ровали 1% тритошк 1-100.

ется индуцируемой формой фермента и этот процесс осуществляется как путем увеличения активноста существующих изоформ, так и появлением новых подфранций в аяодяой группа изоферыентов.

Исследование влияния рН буферных растворов за активность тирозинаманогрансферазы печена крыс

Влияние рН буферных растворов на активность для обеих изофорл цитоплазглагаческой форда тирозинаманотрансферазы печени изучено достаточно /Мертвецов H.Ü. и др., 197S; Чесноков, 1975/. lipa этом установлено, что в области оптимума рй для обеих групп изофермен-тов цитошхаз.\нтаческой формы тирозишшщогрансферазн близки друг к другу а для катодной группы изоферлэятоз он находится з пределах от 7,0 до 8,0; для анодной - границы этого показателя оказались заметно уяе и находятся в районе рН 7,5.

Результаты исследования влияния рН буферных растворов на активность тирозвдаминотрансферазы, локализованной в ядерной фракции печени крыс, показали, что оптимальная 'зона рН для проявления максимальной активности фермента находится з зоне, соответствующей по значение рН зоне оптшальпой активности алодной группы изофер-мэнтов, выделенной из постыитохсндриальяого супорнатаята.

Таким образом, изучено влияние рЯ на активность тярозянашшо-трансферазы печени крыс. Показало, что тирозянаминотрансфэраза из ядерной франции проявляв? активность в апрохих пределах - в sobo от 6,0 до 9,5. Оптимальная зона для этой £орт фермента находится на зиачэшт рй 7,8-8,0.

Изучение кинетических свойств гирозанаманогрансфзразц печена крнс

Дгас цигоплазматичесхой формы глрозшгамкаотрансфаразы показано, что значения константы Михаэлиса по субстрату тирозина для разных азоформ /индуцируемых а конститутивных/ фермента, выделенных из печена крыс, мало чем отличаются друг от друга и соответственно составили 1,3* 10"%; 4,VIO-3?« /Мертвецов Н.П., 1981/. Этот zo показатель по «/-кетоглутарату для инцуцяруолоЯ азофорад составил 3,5'10~%, для конститутивной формы - Í.S'IO"5!^.

Тирозана'.пшотрансфораза строго специфична по отношению к L-гярозгшу. 3 связа с чем при изучении кинетики тирозинамиЕо-трансферазы в качестве субстрата использовала Ь-тарозан. Определяли кинетические параметры фермента в интервале концентр?тдй ти-

розина от 0,5*10~% до 5,5*10-%. Время реакции вздергивала от 5 до 30 мня. За активность фермента пришвали начальную скорость ферментативной реакции s вырагали в шоль субстрата за ыин. Кинетические показатели - в - определили методами Лайнуиве-ра-Берка б Корниа-Боуден.

Результаты определения кинетических показателей для тирозин-ашнотрансферазы из постмитохондриального супернатанта печени крыс дали следушие значения: Кц для анодной изофорыы составило 1,24±0,2&'10~%; для катодной дзофориы - 6,10±1,86*10~%. VBax для этих изофоры соответственно составила 0,3±0,06 шоль субстрата за ш., 0,21±0,04 шояь субстрата за мин. Как видно из этих дактгаг. значения К^ и для анодной группы изоферментов находятся в соответствии с литературными данными /Мертвецов и др., 1976; Кешеу, 1959; HeysM et al., 1957; Aaierson, Piopa, 1982/.

Результаты исследования кинетических параметров для тирозин-ананотрансфераза из ядерной фракции печени крыс представлены в табл. 2. Эта данные показывают, что тарозЕнашшогрансфераза, обнаруживаемая в ядерноЗ фракции печени крас как в цельном лазате, так и ее анодные изофорьш имеют примерно одинаковые значения ^ -от 5,С до 10,8 M /сы.табл. 2/. Различия в значениях F^ для анодной азорориы дитошазматЕческой и ядерной фракций тирозинамино-траксфераза ш-^чительньш.

Таблица 2

Заачзшаз Е^ л для тирозиваминотрансферазы из ядзраой. фракции печени крас

Варианты !£азирутадаа ! Изофорггы ! к ! "^„-.Диодь

опытов !детергенты!фзршнтаГ -субстрата за

( } « jsâm./

I .......... I 11 i i ' i> i i

1,1*0,12 0.3£±0,01

0,19±0,05 0,24-0,002

1,16±0,04 1,4-0,02

Следует указать, что при сравниваемых значениях для

йзтактше • крысы

Крысн, получившие нагрузку гздрокор-ТД30Н0У

дезоксихо- цельный, лат ватрая лгзат

анодная

ц&шшй лизат

анодная

тратоа 1-100

дезоксихо- цельный лат натрия лизат

анодная

7,0*0,5*10"% 5,6±0,82*10"%

10,8*1,4*10"% 10,CÎ1,4*10"%

6,2^0,6'10~% 6,2^0,22*10"%

ядерного лизата, подученного обработкой дззокснхолатса натрия, максимальная скорость ферлеятатизнсЭ регздии /''¡зад/ оказалась несколько больше, чем в лизате, полученном обработке!! гратонсн 1-100. Такие расхождения. вядззио, связана с тем. что тритон I-1C0 достаточно прочно связывается с бежовоХ шлзкулсЗ: а обнчзо применяемые методы диализа оказнвавтся здесь тало эффективными. Воз-мояяо тают, что дезоксяхадаг натрия, как ионизированный детергент , способствует максимальному выходу в лизат анодпсЗ изоформы фермента, чем в этих гэ условиях неЕонизироваяныЙ детергент тритон Х-100.

Результаты исследования влияния индукции фермента на кинетические параметры понизали, что взедениэ гормона приводит а возрастании Увпу для ядерной фора фермента в 3,5-4,0 раза.

Таким образом, гидрокортизон не вызывал появления ковоЗ фра дай фермента, а скорее индуцировал сутаствукзиэ формы ферлента в ядерной фракции клеток.

Анализируя в целом следует откатать, что з печени крыс по локализации по субклеточным фракдогл могло различать три формы тирозинаминотрансферазы: цитоплазгатическуз, етлохоядриалзнуэ а ядернун форма. По данным Лхтвак я сотрудников /глиог, Li tract, 1969; Sapico, shear, bit-,таек, 1S71/, митохоцдрзальная отличатся по некоторым своим свойствам от паговлазматаческсй форз феркп-та. Как показывают результаты наших исследований, ядерная форма тирозинашнотрансфераэи такнэ отличается от датоплазматяческой Форш фермента по изоэнзшлному спектру, по степени индуцированного образования под действием различных индукторов а по некоторый другим свойствам.

Литвак с сотр. /Sapico et al., 1971/, применив антитела, специфичные по отношению к цитоддазматическоа форме тарозпиаишно-трансферазы, показали, что увеличение активности митохондриальяой формы тнрозикзмииотраясферазы при уремии обусловлено транслокацией индуцируемой цитоаяазмагической форм фермента з матохекцрзг.

Учитывая, что цятоплазматическая форла ф-зргавта таэот макеку-'ляршй вес 115000, авторы сознают, что ыаяоварстгЕа способность ео проткать через нарузнув мнтохокдрнальяуэ мембрану, и предполагают, что фермент, вероятно, как бы "прилипает" к мембране :ги-тохоадрий. Причем, по мнении авторов, транслокация фермента должна иметь место в результате изменения самого фергоята, а нэ митохондрий /sapiso et al., 1371/. В отнопеняз происхождения ядерной

формы тврозшгашнотраЕсферазы ыогно считать, что источником данной формы изсфермзнта, как и для штохоадргаяьной форты, возмогло, является цгтошазштичесхая тщюзинаминотрансфераза. Такому предположению не противоречат результаты исследования ряда свойств ядерной формы тгрозинаминотрансферазн печени крыс.

ВЫВОДЫ

1. В ядерной фракции печена крыс обнаружена тирозинамино-трансфераза с высокой удельной акгизностыо и названа ядерной формой тирозинаминотрансферазы. Путем газирования детергентами из ядерной: фракции выделена и штвдесятикратно очищена указанная форш тафозизашнотрансферазы.

2. Показано, что количественно ядерная форма тирозинамгно-трансфаразы не превышает 1% от суммарной активности фермента в печена; в отличие от цитош1азш.тичзской формы фериента ядерная форма тарозинат-ганотрансферазы представлена только в виде индуци-руешй форш фаршнтоз; катодные изоформы тирозинаминотрансферазы в ней отсутствуют.

3. Ядерная форма тнрозинагшнотрансферазы индуцируется гидрокортизоном, тирозином е солнечно-тепловым воздействием. Показано, что степень аддукции указанной формы фермента более зыражекг по сравнению с цитозлазматической формой и индуцированное образование этой, фореаг фермента под влиянием названных выазе индукторов осуществляется как путем увеличения активности существующей изоформы, так в путей появления новых подфракций в анодной группе изофсрментов.

4. Установлено, что ядерная форш тярозинамивотрансферазн проявляет активность в пгароких пределах значения рН: от 6,0 до 9,5. Показано, что максимальная активность фермента проявляется в зоне рН 7,8-8,0, которая несколько выае /7,2-7,6/, таковс- у анодной фракции изоферыенгов цатоплазмапсческай форш тирозинами-нотрансферазы.

5. Определены кинетические параметра по Ь-тирозину дот ядерной и цЕтоплазыагаческой форд тирозанакинотраксферазы печени крыс. Получено: дня едержй форма Км - 5,б±0,82 - 10,00^1,40"10~% и 0,24^0,02 - 0,3610,01 шодь субстрата за гая.; дан анод-вой фрактии цитошазаагаческоЗ форш фергента К^ - 1,24^0,26"10_3И в 0,30^0,06 кыодь субстрата за ш., а для катодной фракции аго2 хе фор® К^ - 6,10±1,96-10"'3м а Угат- 0,21±0,04 кшяь

субстрата за мин. Посла нагрузка гидрокортизоном для ядерной формы тарозанаминотрансферазн получала К^ - 6,20^0,22*10"% а 1,40^0,02 ммодь субстрата за мая.

6. Изучены изоэнзимный спектр а ряд свойств цитоплазкагзчес-кой форма тарозинаминогрансферазн печени крыс. Подтверждено, что цитоплазматаческая форма тирозпнагшнотраисферазы состоят аз анодных и катодных групп азоферментов, В составе каддой группы имеется по две подфракцяя. Аноднно изоферменты индуцируются гидрокортизоном, тирозином а солнечно-тепловым воздействием. Индукция фермента осуществляется как путем увеличения активности сущестзу»>-пдах изоформ, гак и путем появления новых подфракппй в анодной груше изофергентов. Определены .такзз оптимальные уровни рН а кинетические показатели для анодных а катодных изоферментсз тирозин-аминотрансферазн аз посташтохондриального суперватавта печени кр: .

СЛИСОК РАБОТ, ОПШИШАНННХ ПО ХЕШ ДЙССЕРВДКИ•

1. Курбапов Х.К., Атаева Г.С., Кризорогоза Л.С. К вопросу

о выделении из клеточного ядра печена крыс ядерной формы, гирозин-аманотраясферазы'// Сериала научной конферснцзп проф.-препод, состава ИМИ. - Ашхабад: Нлыа, 1985. - С.94-55.

2. Агаош Г.С., Краворотова Л.С., Курбапов Х.К. К вопросу выделения ядерной форма татрозинамнзотрансферззн // 17 конференция биохимиков респубящс Средней Азии л Казахстана. Тззисн докладов.-Ашхабад, 1585. - С.55.

3. Курганов Х.К., Чарыева Г.Х., Атаева Г.С. Над опыт применения гель-хроматографап для изучения изознзимного спектра тиро-зинаминотрансферазы // Тезисы докладов. Международный симпозиум "Хроматография в биологии а медицине". - М., 1986, - С.48-49.

4. Курбанов Х.К., Атаева Г.С. Влияние рН на активность различных форм тирозанаминотраясферазы печена ярке // Изв. АН ТСС?. Сер. баол. наук. - 13В9. - Ш 5. - С.65-69.

5. Атаева Г.С., Курбанов Х.К. Влияние некоторых индукторог на активность тарозинамяногрансферазн, выделенной из.ядерной фракции печени крыс // Здравоохранение Туркменистана. - 1990. -Л 12. - С.26-28.

6. Курбанов Х.К., Атаева Г.С. Изучение изознзимного спектра различных форм тарозаначшлотрансферазы печени крнс // Здравоохранение Туркменистана, - 1991. - .'г 3. - С.12-15.

7. Курбавов Х.К., Азгаева Г.С. Внделвниа тврозгвамшзотрансфе-раан из ядерноЗ фракции пачеш крыс // Изв. Ш ТССР. Сер. биол. наук. - Ашхабад: Ылкм. - 1931. S.

8. Курбаяов И.1., Курбаноа I.K., Атаева Г.С. Некоторые свойства ядерной формы тирозжналвдютрансферазы / Сборник трудов проф.-препод. состава ТГЛИ. - Ашхабад: Ылш, 199L. - C.116-12S.

Э. Курбанов Х.К., Атаеэа Г.С. Свойства ядерной фор,ш таро-гинашнотранс^еразы // У конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Тезиса докладов. - Tornear. 1521. - С.1".

Тираж /00 . Зак.& Ц

Формат 60x84Vl6

ТуркменНШНТИ Госплана ТССР, г.Аяхабад, ул.Бородянская.2.