Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование свойств бислойных липидных мембран, содержащих лизолипиды и холестерин

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование свойств бислойных липидных мембран, содержащих лизолипиды и холестерин"

на правах рукописи УДК 577 3

КАРПУНИН ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН, СОДЕРЖАЩИХ ЛИЗОЛИПИДЫ И ХОЛЕСТЕРИН.

Специальность 03 00 02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Институте Электрохимии РАН им А Н Фрумкина

Научный руководитель

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Вадим Александрович Фролов

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

Юрий Николаевич Антоненко

кандидат физико-математических наук, доцент

Виктор Борисович Киреев

Ведущая организация

Институт биоорганической химии РАН

Защита диссертации состоится « 17 » ноября 2005 г в 10 00 часов на заседании диссертационного совета К 212 156 03 при Московском физико-техническом институте по адресу

141700, Московская обл , г Долгопрудный, Институтский пер , д 9, МФТИ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ

Автореферат разослан « 14 » октября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук

Брагин В Е

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования. Лизолипиды и холестерин являются важными и широко распространенными компонентами биологических мембран, они активно участвуют во многих биологических процессах, ключевым этапом которых является изменение проницаемости мембран Так, холестерин необходим для взаимодействия мембраны с цитолизином, некоторыми токсинами, лизолипиды участвуют в формировании пор апоптозными белками (Bel - семейство). Поэтому исследование механических свойств и механизмов регуляции проницаемости (формирования пор, свойств пор) в мембранах, содержащих лизолипиды и холестерин, является одной из приоритетных задач биофизики мембран. Активность лизолипидов и холестерина связана в первую очередь с их небислойностью Небислойные липиды - это липиды, имеющие существенно разные площади поперечного сечения на уровне гидрофильных голов и на уровне гидрофобных хвостов - ненулевую спонтанную кривизну (СК) Как холестерин (отрицательная СК) так и лизолипиды (положительная СК) стремятся в области липидного бислоя, обладающие большой геометрической кривизной, а также в области дефектов упаковки липидов Именно поэтому оба компонента активно участвуют в регуляции внедрения в мембрану белков и формировании белок-липидных пор и комплексов. Одним из важнейших аспектов поведения мембран с холестерином и лизолипидами, остающимся мало изученным, является взаимодействие холестерина и лизолипидов, которые, по сути, являются антагонистами (имеют противоположную по знаку СК) В модельных системах было показано, что они могут взаимно компенсировать свое действие на липидный бислой, а также склонны к образованию бимолекулярного комплекса, формируя водородную связь (Рис 1 ) Как такое сродство влияет на интегральные свойства мембраны (в т ч. латеральную однородность), и порообразование остается невыясненным Это особенно актуально для оценки поведения лизолипидов в биологических мембранах, где лизолипиды зачастую функционируют в присутствии большого количества холестерина. В последнее время наметилась тенденция к переоценке роли липидного бислоя в биологических процессах в рамках концепции активных мембран. Ученые склоняются к тому, что липидная мембрана является не просто пассивным механическим барьером, а сложноорганизаванной многокомпонентной структурой, способной принимать непосредственное участие в регуляции различных процессов Активная мембрана кроме минимума энергии соответствующего состоянию «однородный плоский равновесный бислой» имеет и другие, которые соответствуют состояниям «мембрана с порой», «мембрана с кластерами», и др. Возможность переходов из плоского

однородного состояния в одно из

ИОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИОТЕКА, / J

ием структурной

Рис 1 Липиды с разной СК «Циллиндры» - нулевая СК (диолеоилфосфатидилхолин), «обратные конусы» - положительная СК (лизолипиды), «конусы» отрицательная СК (холестерин) Холестерин и лизолипиды могут формировать между собой водородные связи В соотношении 1 1 формируют стабильные липосомы

уд

целостности и служит критерием активности мембраны Присутствие небислойных липидов является практически необходимым условием активности' любая модификация плоского равновесного бислоя (добавка белка, формирование поры), значительно облегчена при соответствующей подстройке локальной кривизны мембраны Мембраны, содержащие холестерин и лизолипиды в больших количествах, представляют собой идеальную модель для реализации различных типов активности Такие мембраны начинают широко использовать в моделях доставки лекарств, однако даже возможные пути реализации активности (реакция таких мембран на белок, спонтанная активность) охарактеризованы мало Таким образом, изучение мембран, содержащих лизолипиды и холестерин, является одной из актуальных тем современных исследований липидных мембран.

Цель работы. Исследовать свойства бислойных липидных мембран, содержащих лизолипиды (Л) и холестерин (X), либо целиком сформированных из Л-Х, используя модели плоской бислойной липидной мембраны (БЛМ) и сферических везикул (липосом). Во-первых, определить границы стабильности Л-Х мембран при вариациях состава Во-вторых, исследовать интегральные свойства Л-Х бислоя- механические (латеральное натяжение, модуль изгиба) и электрические (удельная емкость и проводимость) параметры, их изменения при вариациях состава В-третьих, определить условия стимуляции активности Л-Х мембран образование пор, кластеризация липидов В-четвертых, охарактеризовать свойства липидных пор в Л-Х мембранах В-пятых, выяснить механизмы контроля активности, его практические применения Научная новизна. Автором получены следующие новые результаты

- Впервые сформированы стабильные плоские бислойные липидные мембраны (т н «сухие» - не содержащие растворителя БЛМ, изготовленные по методу Мюллера-Рудина) целиком состоящие из компонентов противоположной спонтанной кривизны - Л и X Показано, что такие мембраны имеют удельную проводимость, емкость и натяжение, характерную для мембран из фосфолипидов, однако модуль изгиба таких мембран аномально высок -более 100 кТ (обычно - 10 кТ) Исследована стабильность мембран, сформированных из смеси Л и X (на липосомах) Показано, что при отклонениях ~ 10% от соотношения 11 в сторону роста содержания Л, мембраны теряют стабильность и разрушаются.

- Установлено, что при малых отклонениях от соотношения один к одному в смеси Л и X растет проницаемость мембраны через формирование липидных пор, не сопряженная с разрушением мембраны Порообразованием можно управлять при помощи модификатора липидного состава циклодекстрина, экстрагирующего X из мембраны Показано, что такое поведение сохраняется для мембран, сформированных из смеси Л и X в соотношении один к одному с добавлением базового липида

- Показано, что в плоских мембранах, содержащих смесь Л-Х в соотношении один к одному и базовый липид, сразу после формирования наблюдается спонтанное порообразование, которое затухает в течение 5-10 мин

- Исследованы свойства одиночных липидных пор, формирующихся в БЛМ — размер и среднее время жизни в зависимости от количества Л и X в мембране Размер пор не зависит от состава, среднее время жизни растет с ростом концентрации Л и X

- Разработано качественное теоретическое описание, объясняющее экспериментальные данные по одиночным порам В расчетах получено уменьшение на -15 кТ энергии поры при замене 80% базового липида на смесь Л-Х, при этом характерный размер поры, соответствующий энергетическому минимуму не меняется, что позволяет объяснить наблюдаемую в эксперименте независимость размера и увеличение времени жизни липидных пор при добавке Л и X в мембрану.

- На БЛМ и гигантских липосомах показано, что в условиях, совпадающих с условиями появления спонтанного порообразования возникает неоднородное распределение в мембране флуоресцентно-меченного липида (маркера жидкой неупорядоченной фазы).

- Показано, что можно управлять открытием и закрытием пор в липосомах при помощи циклодекстрина, добавляя его к липосомам на фиксированное короткое время.

Теоретическая и практическая ценность. Возможность практического приложения исследований мембран из JT и X обуславливается широким спектром биологических процессов, в которых задействованы эти компоненты Например, известно, что макрофаги неограниченно поглощают окисленный липопротеид низкой плотности, что ведет к накоплению в них X, деградации и последующей гибели Это является причиной возникновения холестериновых бляшек на стенках сосудов - одного из проявлений атеросклероза Окисленный липопротеид отличается от нормального наличием JT и окисленной формой входящего в состав протеина Также в нем содержится большое количество X До сих пор неизвестно, что ведет к изменению метаболизма липопротеида в макрофагах при его окислении Именно смесь JI и X может играть решающую роль в регуляции метаболизма макрофагов В работе показано, что липосомы из JI и X действительно перерабатываются в макрофагах отлично от липосом из фосфолипидов Наличие этих компонентов ведет к повышенному накоплению липидного материала в клетках Такое свойство может быть использовано для создания систем доставки лекарств к макрофагам

Апробация работы. Результаты работы докладывались на семинаре лаборатории биоэлектрохимии института электрохимии им АН Фрумкина РАН, на семинаре лаборатории молекулярной и клеточной биологии национального института детского здоровья и человеческого развития (LCMB, NICHD, USA) и на международной конференции «Membrane bioelectrochemistry from basic principles to human health» (Москва, 2002)

Публикации. За время работы над диссертацией опубликованы две статьи в отечественных реферируемых журналах

Объем и структура диссертации. Работа изложена па 109 страницах и иллюстрирована 32 рисунками Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов Список цитируемой литературы содержит 105 наименований

Содержание работы МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плоская бислойная липидная мембрана (БЛМ) - метод Формирования и измерения проводимости и электрической емкости. Для изготовления мембран использовались липиды 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (ДОФХ), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (ДОФЭ), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Lissamine Rhodamine В Sulfonyl) (ДОФЭ-родамин), 1,2-Dioleoyl-s«-Glycero-3-[Phospho-L-Senne] (ДОФС), 1-01еоу1-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphocholine (ОФХ), 1 -01eoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (ОФЭ), Cholesterol (X) В качестве буферного применялся

раствор ЮОмМ КС1 и ЮмМ Hepes, в дистиллированной воде (удельное сопротивление 1018 МОм*см) Раствор имел рН=7,5 Мембраны формировались по методу Мюллера-Рудина в растворе электролига на отверстии в тефлоновой ячейке Смеси, содержащие лизолипиды в концентрации, ближой к 50 мол%, плохо растворялись в неполярных растворителях (декане, сквалане, используемых при формировании мембран по метолу Мюллера-Рудина) Для ОФХ, основного Л в данной работе, не удалось получить смеси, содержащие его более 40 мол%, поэтому для создания смесей, содержащих большее количество JT, использовалась комбинация ОФХ и ОФЭ Экспериментальная установка была собрана на базе флуоресцентного инвертированного микроскопа Leitz Fluovert (Leitz, Германия) Микроскоп был оборудован видеокамерой, присоединенной к монитору и компьютерной плате, оцифровывавшей видеосигнал Это позволяло визуально наблюдать за мембраной с помощью обыкновенной и флуоресцентной микроскопии и сохранять изображение для дальнейшей обработки Одновременно можно было измерять электрические параметры БЛМ - проводимость и электрическую емкость Для этого в два отсека рабочей ячейки, разделенные мембраной, помещались два хлорсеребряных электрода Электрическая часть установки состояла из пэтч-кламп усилителя List ЕРС 7 (Нека, Германия), частотного фильтра F-900 (Frequency Devices, США), генератора электрических сигналов Model 175 Universal Programmer (EG&G Parc, США), осциллографа KDS-102 (Kawasaki Electrónica, Япония) Измерения проводимости велись в режиме фиксации потенциала на мембране, при этом определялся ток через мембрану Для определения электрической емкости мембраны измерялась скорость зарядки мембраны при подаче на нее переменного напряжения Во всех экспериментах напряжение, подававшееся па мембрану, не превышало 50 мВ, для того чтобы минимизировать влияние электрического поля на формирование пор в мембранах

Рис 2 Фотографии выдутой БЛМ при разных разностях гидростатическою давления. На крайней правой фотографии вырезана область снаружи БЛМ.

Измерение механических параметров мембран. Латеральное натяжение (л) измерялось методом выдувания мембраны. К мембране прикладывалась

разность гидростатического давления и измерялся радиус кривизны (Я) поверхности мембраны (Рис 2) Натяжение вычислялось по формуле Лапласа п АР К '2 Модуль изгиба определялся методом вытягивания мембранных нанотрубок (НТ) при помощи микропипетки Микропипетка (диаметр 1 мкм) приводилась в плотный контакт с плоской БЛМ, участок мембраны под пипеткой прорывался, затем при помощи манипулятора пипетка отводилась от плоскости мембраны с образованием мембранной трубки При достижении определенной длины отведения, зависящей от геометрических параметров системы, мембранная трубка коллапсирует, превращаясь в НТ (Рис За) Радиус НТ зависит лишь от свойств мембраны, а именно, от отношения модуля изгиба и поверхностного натяжения Однако регистрируемая проводимость включает в себя как проводимость НТ, так и проводимость утечки в местах контакта мембраны с микропипеткой Предполагали, что при движении пипетки меняется только длина НТ, а токи утечки постоянны

а

V

я

Рис 3. а - Схема формирования НТ б -Аппроксимация зависимости проводимости от длины отведения пипетки Точками показаны экспериментальные данные, черная линия показывает теоретическую аппроксимацию (гипербола) в - Нахождение радиуса (константа при любой длине отведения пипетки)

б

2 600

О

х 500

ь о о

2400

К

ч

§ 300 о а. с

в

21,5

N.

>1

N..

-•Ч

к

Н 21.°

X

а

^ 20,5

э

о*

20,0

"ИТ

I

ю

11 12

отведение, мкм

ю

и

отведение, мкм

12

Полученную зависимость проводимости от длины, с учётом неопределённости начального значения длины и проводимости, аппроксимировали гиперболической функцией следующего вида С = рх/Цлрг) + где р\ -коэффициент удельной проводимости,/^ -смещение нуля длины,р^ - смещение нуля проводимости, а С и Ь - регистрируемые проводимость и положение микропипетки (Рис 36) Аппроксимация проводилось методом наименьших

квадратов Из определяемого параметра р\ (Рис Зв) вычислялся радиус НТ, R = (р\р!ж) , р - удельное сопротивление раствора Далее из найденных значений радиуса нанотрубки определялся модуль изгиба мембраны При этом использовались следующие предположения Для каждого монослоя можно записать выражение для энергии упругих деформаций E=\[ol2+p{('\+(\f]dS, где Сь С2 - главные кривизны мембранной поверхности, ft - модуль изгиба монослоя НТ представляет собой цилиндрическую мембрану длины L и радиуса /?, энергия упругих деформаций мембраны НТ находится по формуле Е = Tt{R+a)Liт + 2жfiL/(R+a) + 7r(R+h+a)Lrr + 2лfL/(R+h+a), где И - толщина гидрофобной части БЛМ, а - толщина гидрофильной части внутреннего монослоя и R - радиус просвета НТ Из условия минимума энергии dE/dR = О, получается уравнение (<х/Д) - \l{R^a)1+\l(R+a+hf, связывающие модуль изгиба и латеральное натяжение мембраны и радиус нанотрубки Модуль изгиба бислоя В вычислялся, как R~2fi=2fr/(]/(R+af+\/(R+a+h)2)

Приготовление больших униламеллярных липосом (БУЛ), содержащих флуоресиентные маркеры. Липосомы изготавливались методом экструзии через поликарбонатную мембрану Приготовление включало следующие стадии-сушка смеси липидов (в хлороформе) в атмосфере аргона с образованием тонкой пленки, сушка под вакуумом (4 часа) для окончательного удаления остатков органического растворителя, гидратация липидной пленки раствором водной краски или буферным раствором, многократное (10 циклов) замораживание и последующее оттаивание полученной суспензии, экструзия через поры поликарбонатного фильтра (10 циклов) Последний этап - очистка липосом от водной краски снаружи на гелевой колонке и проверка распределения липосом по размерам по светорассеянию Готовые липосомы хранились в холодильнике при температуре 4 °С и использовались в течении педели после приготовления БУЛ приготавливались заполненными водорастворимой флуоресцентной краской - использовалась пара ANTS/DPX (в дальнейшем просто ANTS) либо FITS-меченные декстраны массой 10 и 70 кДа, в концентрации самотушения (КСТ) Концентрация фосфолипидов в суспензии определялась фосфатным методом Полная концентрация липидов вычислялась по известному составу липосом (холестерин не содержит фосфатных остатков и не обнаруживается фосфатным методом) Для измерения изменений проницаемости мембраны липосом в кювету спектрофлуориметра помещались липосомы в расчете 100 мкг (174 нмоль) липида на эксперимент Добавлялся буферный раствор до объема 2 мл Регистрация утечки велась по росту интенсивности флуоресценции при выходе из липосом и разбавлении краски Интенсивность нормировалась на сигнал полностью разбавленной краски (после разрушения липосом детергентом - Triton Х-100) Для вариации липидного состава готовых липосом использовались methyl-p-cyclodextrin (циклодекстрин,

ЦД) и бычий сывороточный альбумин (альбумин) Циклодекстрин формирует водорастворимый комплекс с холестерином, уменьшая его содержание в мембране Альбумин образует комплекс с лизолипидами, уменьшая их концентрацию в мембране. Ни циклодекстрин, ни альбумин не вызывают формирование пор в мембране Это подтверждено контрольными экспериментами (на липосомах из ДОФХ/ДОФЭ и ДОФХ/ДОФЭ/Х) - оба вещества не вызывают утечки краски из липосом

Гигантские липосомы. Гигантские липосомы изготавливались по методу осторожного гидратирования (gentle gydration) Липосомы приготавливались либо в бессолевом растворе, либо в растворе КС1 (100 мМ) При использовании раствора соли в смесь липидов добавлялось от 10 до 15 мольных процентов заряженного липида ДОФС Это нужно для того, чтобы увеличить процент униламеллярных липосом Тонкая липидная пленка перед гидратированием в течение 15 минут подвергалась т н «прегидрататши» Для этого в пробирку с липидом направлялся поток аргона, насыщенного водными парами Раствор, предназначенный для гидратации, предварительно насыщался аргоном в течение 15 минут После этого в пробирку с липидом осторожно, чтобы не смыть липидную пленку, помещалось 5-6 мл аэрированного раствора Пробирки инкубировались при 37 °С в течение 2-3 суток При этом сформировавшиеся гигантские липосомы собирались в небольшое облачко внутри пробирки Липосомы приготавливались плотнее окружающего раствора (внутри ЮОмМ сахарозы, снаружи 100 мМ глюкозы) Для визуализации кластеризации липидов к липидной смеси добавлялась флуоресцентная метка (ДОФЭ-родамин). Липосомы помещались в чашку Петри, где через насколько минут оседали на дно и наблюдались при помощи конфокального микроскопа Свежеприготовленные гигантские липосомы, вне зависимости от липидного состава, выглядели равномерно окрашенными

Клетки. Клетки линии IC-21 получены из коллекции клеточных культур Инсштута Вирусологии РАМН Клетки культивировали во флаконах в стандартной культуральной среде DMEM с 5% эмбриональной телячьей сывороткой, в СОг-атмосфере при 37°С Для проведения экспериментов клетки из флаконов пересевали на пластиковые чашки Петри Суспензия липосом добавлялась к клеткам в расчете 100 мг липида на чаттгку Петри Интенсивность поглощения липосом наблюдалась через 30 мин инкубации при помощи конфокального микроскопа по флуоресценции родамина в липосомах Накопление липидного материала в клетках определялось при помощи флуоресцентной краски Nile Red Эта краска связывается с липидами и применяется для визуализации липидных структур (мембран, липидных капель) в клетке Для этого клетки инкубировали с неокрашенными липосомами в течение суток Липосомы добавлялись прямо в культуральную среду в

количестве 100 мг (липида) на чашку Петри За сутки липосомы поглощаются и полностью перерабатываются Раствор Nile Red в ацетоне добавлялся в чашку Петри с клетками Концентрация краски в чашке была 2 мкг/мл, время инкубации 5 мин при комнатной температуре После окрашивания клетки три раза промывались буфером PBS и наблюдались при помощи конфокального микроскопа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стабильные БЛМ из Л-Х смеси. условия формирования и свойства.

Используя смесь липидов, состоящую только из Л и X (50-50) удалось сформировать стабильные БЛМ Здесь и далее цифры, разделенные дефисом «х-х» означают содержание в мембране Л и X в мольных процентах Если не оговорено особо, остаток составляет смесь ДОФХ и ДОФЭ в соотношении 21 (базовый липид). Отметим, что ранее из Л-Х смеси удавалось формировать лишь стабильные БУЛ БЛМ 50-50 обладают удельной емкостью, характерной для мембран, сформированных из обычных фосфолипидов, порядка 0,9 мкФ/см2 Характерная регистрация, использованная для вычисления емкости мембраны, представлена на Рис 4 (такие же значения удельной ёмкости были характерны для всех использовавшихся в работе липидных составов) Проводимость мембран, сформированных их лизолипидов и холестерина, остается на уровне фоновой в ходе длительного времени наблюдения (30 мин) Измерения натяжения, проведенные методом выдувания показали, что его значение лежат в области, характерной для многих фосфолипидных мембран (в том числе для базового липида) и составляет 1,0±0,2 дин/см Тем не менее, измерение модуля изгиба методом мембранных нанотрубок (Рис 3) показало, что значения его значительно превышают характерные для мембран из фосфолипидов Модуль изгиба составлял 160±30 кТ для Л-Х мембран (50-50), и только 8,6±0,5 кТ для базового липида Это может говорить о необычно плотной упаковке липидов в мембране 50-50

а О х

200 inn О--HXI

200 •

■шпряйжнт. * 100»« кВ

" Г ОН". пЛ

ш

4Штг

v

Юс

ИМ» Ш> JIHI

время, imc

Рис 4 Пример записи проводимости и емкости мембраны 50-50

Гранины стабильности Л-Х мембран при вариациях состава. Была исследована стабильность мембран из Л и X при отклонении соотношения между компонентами от одного к одному Для этого липосомы состава 50-50, заполненные смесью ANTS в КСТ, подвергались воздействию растворов циклодекстрина (ЦД) или альбумина ЦД, образуя комплекс с X, сдвигает соотношение компонент в мембране в сторону Л, а альбумин, связывая Л, наоборот, ведет к росту доли X в липосомах При этом, в обоих случаях, по росту истенсивности флуоресцентного сигнала, наблюдалась утечка краски из липосом (Рис 5а) Чем больше добавлялось ЦД или альбумина, тем больший процент липосом терял краску (Рис 56, в) При использовании липосом, заполненных флуоресцентными декстранами в КСТ, также наблюдалась утечка, однако её величина имела зависимость от концентрации ЦД, отличную от утечки ANTS (Рис 5 в, г) Это говорит о том, что при малых добавках ЦД утечка вызвана проводящими дефектами конечного размера (менее 2 нм - характерного размера меньшего из использованных декстранов), а не разрушением липосом Зависимость утечки декстранов от концентрации ЦД имеет излом, который может свидетельствовать о массовом разрушении липосом при отклонении их состава от соотношения Л-Х один к одному Об этом же свидетельствуют измерения количества X, экстрагированного из липосом при различных добавках ЦД Для этого липосомы отфильтровывались на 100 нм фильтрах, затем измерялась концентрация X во фракции, не содержащей липосом При этом часть X находилась в комплексе с ЦД, а часть могла быть в мицеллах, получившихся при разрушении липосом Зависимость концентрации комплекса ТДД с X от концентрации ЦД линейна (X присутствует в избытке) При этом мы видим, что график зависимости концентрации нелипосомального X от концентрации ЦД имеет излом (Рис 5г) Это свидетельствует о появлении в растворе мицелл с X, начиная с концентрации ЦД 0,3-0,6 мМ То есть с этой концентрации начинается разрушение липосом К этому моменту около 10 % X экстрагирование из липосом Визуальные наблюдения за гигантскими линосомами из Л и X в соотношении один к одному, также показали, что при последовательных добавках раствора ЦД сначала липосомы остаются стабильными, а с ростом его концентрации начинается их разрушение Итак, сильное (более 10%) смещение соотношения между Л и X в мембране в сторону Л ведет к разрушению мембраны В случае малых смещетгий соотношения Л-Х от одного к одному, мембраны формируют проводящие дефекты - поры, не вызывающие разрушение мембраны При добавлении раствора ЦД к БЛМ состава 50-50 происходит быстрая дестабилизация мембраны, связанная с тем, что, в отличие от липосом, БЛМ находятся под большим латеральным натяжением.

Рис 5 а - изменение проницаемости (по выходу краски в КСТ) липосом после добавок ЦД и альбумина (левые стрелки) Правые стрелки - добавки детергента б - зависимость процента липосом с утечкой от концентрации альбумина в - зависимость утечки из липосом разных по размеру красок от концентрации ЦД г - процент нелипосомального холестерина в зависимости от концентрации ЦД Пунктиром показана предполагаемая зависимость для комплекса ЦД-холестерин Треугольниками отмечены места излома графиков утечки декстранов и нелипосомального холестерина

Порообразование в мембранах. содержащих JI-X и базовый липид. При

добавке к Л-Х смеси соотношении один к одному базового липида (ДОФХ и ДОФЭ), она сохраняет способность формировать стабильные липосомы В таких мембранах также могут формироваться поры после взаимодействия с ЦД Липосомы, содержащие кроме Л и X базовый липид, менее чувствительны к добавкам ЦД Одинаковые концентрации ЦД приводят к значительно большей утечке краски из липосом состава 50-50 чем из липосом с добавкой базового липида (Рис. 6). Пониженная, за счет добавки базового липида, чувствительность к ЦД позволила исследовать его влияние на малый участок

_Г 80

2 о во

га О-.

Ы 40 Я

V 20

1) £

Рис 6. Величина утечки для липосом разных составов в зависимости от концентрации циклодекстрина.

0 2 4 6 8

концентрация ЦД, мМ

БЛМ (пэтч) Рис 7 показывает, что, так же как и в липосомах, добавка ЦД приводит к формированию пор малого размера при сохранении стабильности мембраны В случае подачи раствора ЦД на всю площадь мембраны возникает большое число пор, что ведет к дестабилизации БЛМ

2 1.4

и я 1.2

л 1.0

н о 0.8

о

0.6

5 0.4

Ч

О 0.2

со

о

о. 0,0

с

добавка 11/1,

И I I

4 6 8 10

время, с

г 1.4

У и

3 «.8

2 о,б

§ 0,4

| 0.2

а о,«

12 14 16

6,0 6,5

ИМ

7,0 7,5 8,0

время, с

8,5 9,0

Рис 7 Поры, вызываемые добавкой ЦД к БЛМ (мембранный пэтч)

Смесь, содержащая Л и X в соотношении один к одному, а так же некоторое количество базового липида (от 10 до 60%), формирует стабильные БЛМ, в которых сразу после формирования начинается спонтанное порообразование Проводимость мембран растет, достигая значений 10 нСм Это в некоторых случаях сопровождается разрушением мембраны, однако в значительном проценте случаев мембраны остается стабильной Если мембрана не разрушается, то порообразование длится в течение 3-10 мин после формирования мембраны, а потом затухает, проводимость возвращается на фоновый уровень и мембрана живет продолжительное время (Рис 8) Количество пор в БЛМ невелико - не более нескольких десятков наблюдается одновременно Поэтому в липосомах спонтанного порообразования не

наблюдается при использовании флуориметрии, имеющей ограниченную чувствительность детекции

500-. «00-<Сзоо-

Рис 8. Возникновение и затухание порообразовательной активности в БЛМ (40-40).

о

£

10 15

20

время, мин

Липидные поры, спонтанно образующиеся в Л-Х БЛМ: вероятность формирования поры, стабильность одиночных пор и мембраны в целом в зависимости от состава БЛМ. Во многих записях проводимости БЛМ можно выделить события, похожие на работу ионных каналов - события, соответствующие стабильным одиночным липидным порам Здесь под стабильностью понимается наличие определенного размера (проводимости) и долгое время жизни (позволяющее выделить событие в записи и охарактеризовать его) Записи проводимости БЛМ были обработаны с целью поиска таких событий При этом критерием служили наличие стабильного уровня проводимости (отклонение не более 5 % амплитуды), быстрота (менее 5 мс) и схожесть амплитуд (разница не более 10%) скачков проводимости, соответствующих открытию и закрытию пор На Рис 9 изображены события соответствующие (а) и не соответствующие (б, в, г) этим критериям Количество стабильных одиночных липидных пор зависит от липидного состава (Рис 10) Состав значительно влияет на свойства формирующихся в мембране пор В мембранах состава 40-40 проявлялась электрическая активность Характерный пример регистрации показан на Рис 10а Сразу после формирования мембраны, проводимость соответствовала фоновой Через некоторое время наблюдались скачки проводимости После каждого скачка проводимость выходила на стационар - формировала новый стабильный уровень Это похоже на работу ионных каналов - акты открытия и закрытия, разделенные некоторым временем жизни в открытом состоянии Через некоторое время (около 10 мин) проводимость снижалась, постепенно возвращаясь к нулевой Для статистической обработки электрическая активность мембран регистрировалась в течение 5 мин после формирования (чтобы не захватывать зону снижения активности) Всего проведено 64 эксперимента В 35 экспериментах наблюдалась активность канального типа Длина регистрации с «канальной»

Л 400

150

<

с 5"°

К «о О

ь 200

в

<

С 50

и о

Н о

4 6 Я

время, с

время' с

<

с

г

^ 100 С

О 50

н

время, с

2 4 6 8 10

время, с

Рис 9 Критерии отбора одиночных литшдных пор а - липидная пора б, в, г - неподходящие события.

активностью составляла 152 мин Электрическая активность канального типа коррелировала с некоторой дестабилизацией БЛМ 15 из 35 мембран с активностью имели время жизни меньшее 10 мин, в то время как для неактивных мембран соотношение было 4 29 (Рис Юг). Мембраны состава 3030 так же самопроизвольно меняли проводимость в ходе эксперимента. Протокол был такой же как и в случае мембран состава 40-40. Проведен 51 эксперимент В 25 случаях наблюдалась активность канального типа, суммарное время таких регистрации 64 мин Однако, в этих регистрациях очень мало сигналов, соответствующих одиночным липидным порам (Рис. 106), хотя процент мембран с проводимостью был высок (Рис. Юг) При этом, мембраны 30-30 проявляющие активность, были менее стабильными, чем активные мембраны группы 40-40 15 из 25 «активных» мембран имели время жизни меньшее 10 мин, в то время как для мембран без детектируемой канальной активности, только 7 из 26 разрушились за время меньшее 10 мин (Рис Юг) «у Мембраны состава 20-20 так же демонстрировали изменения проводимости Однако, такие изменения наблюдались лишь в небольшом проценте мембран (около 20%), и интегральная проводимость не превышала 10 нС Событий, соответствующих одиночным липидным порам в таких мембранах не наблюдалось Изменения проводимости имели вид хаотичного дрейфа (Рис 10в) То есть, проводящие дефекты не имели четко определенного размера, либо

б

< >0 с

Ж 5

о

н

В

360-1 300 < 250

С 200 ьй 150

О юо ь 50 О -50

1 2 3 4 5 6 7 8

время, с

1(1 20 30 Л1 50

время, с

]Ы )|>%ШМШ111!1ЧН 4 ПО|ММН

время, с

Рис. 10 Примеры регистрации для разных составов БЛМ а - 40-40, б -30-30, в - 20-20. г - процент мембран с норами, и процент разрушившихся мембран с порами для разных составов

обладали очень коротким (менее 10 мкс) временем жизни При полном отсутствии лизолипидов и холестерина в мембранах, так же как и в случае когда мембрана сформирована только из них, проводимость не меняется, остается тта уровне фона в течении всего эксперимента (30 мин) Были построены гистограммы распределения пор по размерам и времени жизни для составов, в которых они наблюдались (Рис ! 1) Видно, что вне зависимости от состава мембран, поры имеют схожее распределение по размерам с пиком в районе 0,6 нСм

Теоретические оценки энергии поры в Л-Х мембране с учетом латерального перераспределения липидов. Был проведен теоретические оценки энергии поры с учетом молекулярной геометрии липидов Лизолипиды считались молекулами с положительной спонтанной кривизной (./,), холестрин - молекулами с отрицательной спонтатпгой кривизной Важным условием была возможность неравномерного распределения липидов в кромке поры Пора считалась тороидальной Выражение для энергии единицы поверхности записывается в виде

д/- = £ {п, + ди,^/ -У,)2

а0 - площадь на липид, В - изгибный модуль

30% лизолгащца 30% холестерина

I = 1,2±0,4 с

ф

V =1,9*Шгс

1 2 3 4 5 6

проводимость, нС

§

ю о о

о

о

я т

во

40

20

о *

40%лизсяипвда 40% холестерина

V = 3*Ш2е

«р

1 2 3 4 5 6

проводимость, нС

Рис 11 Распределение пор по размерам для разных составов БЛМ Средние времена жизни 0ср) и средние частоты (Ч'ср) формирования пор в этих мембранах

Получающийся функционал варьировался для нахождения минимума энергии по параметрам п, (концентрация компонентов) Численно получены зависимости энергии поры от радиуса поры для разных составов мембраны (Рис 12а) Снижение энергии обусловлено распределением липидов в кромке поры таким образом, что спонтанная кривизна липида компенсирует геометрическую кривизну поры Так, X преимущественно концентрируется в канале поры (экваториальной, самой узкой части поры с отрицательной геометрической кривизной), а Л - в области соединения с плоским бислоем На Рис 126 показала расчетная зависимость доли X в экваториальной части поры от ее радиуса для разных составов мембраны Видно, что на малых радиусах поры (когда отрицательная геометрическая кривизна в канале поры максимальна) X составляет основную долю липида в канале поры Теоретические оценки объясняют стабильный размер пор - минимум энергии не смещается при изменении доли смеси Л-Х Рост числа пор и времени жизни при увеличении содержания Л и X объясняеся снижением энергии поры Это происходит из-за минимизации изгибной энергии поры за счет перераспределения липидов в кромке Такие теоретические расчеты, однако не могут описать процесс зарождения пор Некоторые экспериментальные факты, такие как затухание порообразовательной активности через некоторое время после формирования БЛМ, отсутствие такой активности в БЛМ не содержащих базовый липид, позволяют сделать следующее предположение Зарождение пор происходит в ходе неравновесных процессов, связанных с установлением латерального

т

радиус, ангстрем радиус, ангстрем

Рис 12 Тороидальная пора Радиус считается на уровне нейтральной поверхности (под головками липида) Холестерин накапливается в экваториальной часш - месхе с максимальной отрицательной кривизной поверхности (выделена темным), а - расчет энергии норы б - доля X в экваториальной части поры Значками помечены кривые для разных составов мембран

распределения (кластеризации) липидов в мембране В пользу кластеризации Л и X говорит наличие специфического взаимодействия между ними (водородные связи), аномально высокий изгибный модуль мембраны из Л и X в пропорции один к одному, стабильность мембран в соотношении близком один к одному Исследование латеральной неоднородности мембран, содержэащих Л-Х и базовый липид. Для исследования латерального распределения липидов в мембрану добавлялся флуоресцентно меченный липид (ДОФЭ-родамин) Известно, что этот липид является маркером жидкой неупорядоченной фазы Через несколько минут после формирования БЛМ, содержащей флуоресцентно меченный липид, проводилось наблюдение за мембраной при помощи микроскопа Исследовались содержащие Л-Х смесь мембраны составов 30-30, 40-40 и мембраны, целиком сформированные из Л-Х Для состава 30-30 было

установлено, что через 5-10 минут после формирования мембраны в ней наблюдается неравномерное распределение флуоресцентно меченого липида по поверхности Это распределение имеет вид двух больших зон на мембране с четкой и гладкой границей (как будто бы мембрана поделена пополам гибкой нитью) - Рис. 13в Отметим, что в БЛМ состава 30-30 на временах, характерных для установления неравномерного распределения ДОФЭ-родамин, также наблюдается спонтанное формирование пор В мембранах, целиком сформированных из Л-Х смеси, после формирования БЛМ в течение длительного времени (30 мин) не наблюдалось никаких неоднородностей в распределении флуоресцентно меченого липида по бислою (Рис 136)

Рис 13 а - кластеризация в гигантских липосомах (3030) при добавке циклодекстрина б - БЛМ без пор и без кластеров (5050), БЛМ с порами и кластеризацией (30-30) На «б» и «в» световое пятно ограничено диафрагмой

Фазовое разделение изучалось так же на гигантских липосомах К липосомам добавлялся циклодекстрин в концентрации, вызывающей порообразование (1,5 мМ) Липосомы, сформированные из состава ДОФХ ДОФЭ ОФХ X ДОФЭ-родамин в соотношении 23 17 30 30 0,5 (состав 30-30) после добавки ЦД продемонстрировали наличие кластеризации (Рис 13а) В значительном процеше таких липосом наблюдались участки с разной интенсивностью флуоресценции, имевшие на срсзс вид сегмент окружности Для трехмерной реконструкции липосом были проведены серии параллельных срезов проходящих на расстоянии 1 -2 мкм друг от друга, и позволяющих просканировать весь объем, занимаемый липосомой Полученные трехмерные изображения липосом позволяют охарактеризовать участки с повышенной интенсивностью как круглой формы области с четкой границей Соотношение площадей участков разной интенсивности свечения приблизительно соответствует соотношению мольных долей компонентов' 60% Л-Х и 40% базового липида Таким образом, для смеси 30-30 наблюдается корреляция между порообразованием и латеральным перераспределением (кластеризацией)

липидов Для мембран состава 40-40 достоверно зафиксировать такую корреляцию не удалость Возможно, это связано с малым размером кластеров в этой смеси' если неоднородности и присутствовали, то они были неразличимы при использовавшемся увеличении Отметим также, что ЦД легко дестабилизировал как БЛМ, так и ГУВ, сформированные из состава 40-40, поэтому, вероятно, при условии сохранения стабильности мембран существенного латерального перераспределения липидов не достигалось Загрузка липосом и поглощение липосом клетками ТС-21. В специальных экспериментах было показано, что можно управлять как открытием, так и зарытием пор в липосомах К содержащим внутри водорастворимой краски липосомам добавлялся раствор циклодекстрина и водной краски в КСТ Сразу после этого (так как поры возникают в течение первых же секунд после добаки циклодекстрина) суспензия очищалась от циклодекстрина (на гелевой колонке, отбалансированной раствором водной краски в КСТ) После прохождения через первую колонку (около 5 мин.) суспензия очищалась от водной краски на колонке, отбалансированной буферным раствором Показано, что липосомы, полученные на выходе содержат инкапсулированную водную краску в КСТ При этом, если циклодекстрин и краску отмывать одновременно, липосомы оказываются пустыми, то есть популяция пор сохраняется в липосомах пока в растворе есть циклодекстрин. Клетки линии 1С-21 интенсивно поглощают липосомы различного состава (ДОФХ ДОФЭ, ДОФХ ДОФЭ X, Х/Л) Однако после 20-часовой инкубации интенсивное накопление липидного материала происходит лишь в клетках, которые инкубировали с липосомами из Л и X (Рис. 14).

а б в

где

Рис 14 Клетки, поглотившие крашенные липосомы а - ДОФХ'ДОФЭ , б - ДОФХ ДОФЭ X, в - Л-Х Клетки после 20ч. инкубации с липосомами г - ДОФХ ДОФЭ, д - ДОФХ ДОФЭХ, е - Л-Х

ОБСУЖДЕНИЕ.

Свойства бислоя, содержащего Л и X . Известно, что Л и X способны к формированию молекулярного комплекса в соотношении один к одному через образование водородных связей между ОН-группами X и ОН- и СО- группами Л Однако, влияние комплексообразования па интегральные свойства бислоя было изучено слабо Представленные результаты свидетельствуют, что X и Л кластеризуются в бислое, формируя участки (либо целый бислой) с аномально высоким модулем изгиба По всей видимости, Л-Х комплекс характеризуется плотной упаковкой липидного материала, характерной для т н жидкой упорядоченной фазы Об этом же свидетельствует исключение флуоресцентной метки и форма границы О заданной стехиометрии комплекса свидетельствует чувствительность мембраны к вариации состава' при снижении концентрации X более чем на 10% в мембране из 50% Л и 50% X, она дестабилизируется Формирование пор в Л-Х мембранах. Полученные результаты демонстрируют, что мембраны, содержащие небислойные компоненты, способны формировать долгоживущие липидные поры, оставаясь при этом стабильными Поры формируются при небольших изменениях соотношения между Л и X в готовой мембране (БУЛ, БЛМ), т е мембрана легко активизируется внешним воздействием (в частности, хелаторами X) Интересно, что Л-Х БЛМ в течение некоторого времени после формирования способны к спонтанному порообразованию Реализация спонтанного порообразования в мембране

происходит в условиях, при которых происходит латеральное перераспределение компонентов Граница кластеров - наиболее вероятное место зарождения пор, поскольку известно, что избыточный Л (некомпенсированный X) концентрируется на таких границах В пользу этого предположения говорит так же то, что преобразование затухает через 3-5 мин после формирования БЛМ (когда мембрана образуется один большой кластер минимизируя длину границы)

Свойства одиночных липидных пор. В работе впервые получены и изучены стабильные липидные поры Показано, что интенсивность порообразования и время жизни поры растет с ростом содержания Л и X в мембране, распределение же пор по размерам имеет один узкий пик и не зависит от состава мембраны Это находится в согласии с теоретическими оценками, объясняющими стабилизацию перераспределением компонентов в кромке поры Таким образом, при условии близкой к тороидальной геометрии, липидная пора конструируется из липидов противоположной СК

Распознавание БУЛ, содержащих Л-Х смесь, фагоцитами. Липосомы, сформированные из Л-Х смеси, схожи по липидному составу с окисленными липопротеинами низкой плотности, активно поглощаемыми макрофагами Полученные на клетках IC-21 результаты демонстрируют, что свойства распознавания действительно сохраняются для липосом, содержащих X и Л При этом, в отличие от стандартных методов загрузки содержимого в БУЛ в процессе приготовления липосом (при этом загружаемый материал подвергается сильным внешним воздействиям, таким, как мнокократное замораживание-оттаивание, приложение больших градиентов давления, органических растворителей), в БУЛ, содержащие Л-Х смесь, можно инкапсулировать водорастворимые вещества (сравнимые по размеру с ANTS), при слабых вариациях состава (например, с помощью ЦД) Все это позволяет предположить, чю Л-Х липосомы можгут служить основой новой системы доставки лекарств

выводы

- Для формирования стабильного бислоя количество лизофосфатидилхолина (Л) не должно превышать количество холестерина (X) более чем на 10%, стабильность и большая изгибная жесткость такого бислоя обусловлены кластеризацией Л и X.

- Для активизации мембраны, содержащей Л-Х смесь, а именно инициации латерального перераспределения компонентов и формирования пор при сохранении общей структурной стабильности мембраны, достаточно малых вариаций соотношения Л и X, порообразованием можно управлять, используя модификаторы липидного состава мембраны • (циклодекстрин, альбумин)

- Наличие 60 и более мольных процентов Л-Х смеси в липидной мембране обеспечивает формирование стабильной липидной поры с заданной структурой, структура определяется упаковкой X и Л в кромку поры

- Липосомы, сформированные из Л-Х смеси, обладают особыми свойствами (такими как возможность замены содержимого при физиологических температурах, селективное поглощение липидного материала липосом фагоцитами), которые могут быть использованы при разработке новых систем доставки лекарств

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Карпунин Д В , Акимов С.А , Фролов В.А Формирование пор в плоских липидных мембранах, содержащих лизолипидьт и холестерин // в журнале «Биолог ические мембраны», 2005, том 22, № 5, 429-432.

2 А Я Дунина-Барковская, Д В Карпунин, В.А Лизунов, В А Фролов Макрофаги линии 1С-21 как модель для изучения электрофизиологии эндоцитоза // в журнале «Биологические мембраны», 2002, том 20. № 4, 322332

Для заметок

Для заметок

91 я Р

РНБ Русский фонд

2006-4

21601

Заказ № 1945 По"шисаио в печать 13 10 05 Тираж 70 зкз Уст пл 1

ООО "Цифроьичок", теч (095)797-75-76 Ч'Н'Н' с/г ги , е-та!1чп/о(а)с/г ги

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Карпунин, Дмитрий Владимирович

Введение. 4.

Часть 1. Обзор литературы 8.

Глава 1. Общие сведения о биологических мембранах и липидах. 8.

Глава 2. Проводящие структуры в липидных мембранах. Липидные поры. 12.

Глава 3. Лизолипиды и холестерин. 28.

Глава 4. Взаимодействие X и Л с макрофагами как пример биологической активности смеси. 30.

Постановка задачи. 32.

Часть 2. Материалы и методы. 33.

Часть 3. Результаты. 51.

Глава 5. Смесь лизолипидов и холестерина, сбалансированная по СК (Л-Х смесь), формирует стабильную БЛМ. 51.

Глава 6. Измерение механических параметров мембран из лизолипидов и холестерина. 54.

Глава 7. Стабильные БЛМ, содержащие Л-Х смесь, способны к спонтанному формированию пор. 55.

Глава 8. Систематическое исследование проницаемости мембран, сформированных из смеси Л-Х плюс базовый липид. Типы активности. 56.

Глава 9. Проверка результатов по порообразованию, полученных на плоской БЛМ, на липосомах. 63.

Глава 10. Поры в липосомах обратимы (могут закрываться), как и в БЛМ. 71.

Глава 11. Теоретические оценки энергии липидной поры в мембране с небислойными компонентами. 74.

Глава 12. Возникновение неоднородностей латерального распределения липидов в мембранах с JI-X смесью. 79.

Глава 13. Поглощение липосом макрофагами линии IC-21. 82.

Обсуждение. 85.

Выводы. 92.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование свойств бислойных липидных мембран, содержащих лизолипиды и холестерин"

Лизолипиды и холестерин являются важными и широко распространенными компонентами биологических мембран, они активно участвуют во многих биологических процессах, ключевым этапом которых является изменение проницаемости мембран. Так, холестерин необходим для взаимодействия мембраны с некоторыми токсинами (Rossjohn , 1997; Billington, 2000), лизолипиды участвуют в формировании пор апоптозными белками Bel - семейства (Basanez, 1999;

Goonesinghe, 2005). Поэтому исследование механических свойств и механизмов f регуляции проницаемости (формирования пор, свойств пор) в мембранах, содержащих лизолипиды и холестерин, является одной из приоритетных задач биофизики мембран. Активность лизолипидов и холестерина связана в первую очередь с их небислойностью. Небислойные липиды - это липиды, имеющие существенно разные площади поперечного сечения на уровне гидрофильных голов и на уровне гидрофобных хвостов - ненулевую спонтанную кривизну (СК). Такие липиды in vitro могут формировать мембранные структуры большой кривизны (например, сферические мицеллы, образуемые лизолипидами, обладающими существенной положительной СК), однако в клетках они упакованы в плоский бислой. Известно, что стабильность такой упаковки обусловлена аддитивностью СК, бислой может быть создан целиком из небислойных компонентов, подобранных так, что средняя СК каждого монослоя близка к нулю. Как холестерин (отрицательная СК) так и лизолипиды (положительная СК) стремятся в области липидного бислоя, обладающие большой геометрической кривизной, а также в области дефектов упаковки липидов. Именно поэтому оба компонента активно участвуют в регуляции внедрения в мембрану белков и формировании белок-липидных пор и комплексов. Одним из важнейших аспектов поведения мембран с холестерином и лизолипидами, остающимся мало изученным, является взаимодействие холестерина и лизолипидов, которые, по сути, являются антагонистами (имеют противоположную по знаку СК). В модельных системах было показано, что они могут взаимно компенсировать свое действие на липидный бислой, а также склонны к образованию бимолекулярного комплекса, формируя водородную связь (Brockerhoff, 1974) (Рис. 1). Как такое сродство влияет на интегральные свойства мембраны (в т.ч. латеральную однородность), и порообразование остается невыясненным.

Рис. 1. Липиды с разной СК. «Циллиндры» - нулевая СК (диолеоилфосфатидилхолин), «обратные конусы» - положительная СК (лизолипиды), «конусы» отрицательная СК (холестерин). Холестерин и лизолипиды могут формировать между собой водородные связи. В соотношении 1:1 формируют стабильные липосомы.

Это особенно актуально для оценки поведения лизолипидов в биологических мембранах, где лизолипиды зачастую функционируют в присутствии большого количества холестерина. В последнее время наметилась тенденция к переоценке роли липидного бислоя в биологических процессах в рамках концепции активных мембран (Manneville; Ramaswamy, 2000). Ученые склоняются к тому, что липидная мембрана может быть не просто пассивным механическим барьером, а сложноорганизаванной многокомпонентной структурой, способной принимать t непосредственное участие в регуляции различных процессов. Активные мембраны (в отличие от активного ионного транспорта) определяются как мембраны, не находящиеся в положении термодинамического равновесия, например, содержащие источник внешнего неравновесного шума (Ramaswamy, 2000). Активная мембрана кроме минимума энергии соответствующего состоянию «однородный плоский равновесный бислой» имеет и другие, которые соответствуют состояниям «мембрана с порой», «мембрана с кластерами», и др. Возможность переходов из плоского однородного состояния в одно из других и обратно, с сохранением структурной целостности и служит критерием активности мембраны. Другим существенным свойством активных (как, впрочем, и неактивных) мембран является их стабильность во времени. Под стабильностью понимается сохранение некоторых свойств, таких как - структурная устойчивость, целостность липидного бислоя. В биологических системах мембраны далеки от равновесия т.к. содержат большое количество активных элементов и обмениваются содержимым. Присутствие небислойных липидов является практически необходимым условием активности: любая модификация плоского равновесного бислоя (добавка белка, формирование поры), значительно облегчена при соответствующей подстройке локальной кривизны мембраны. Моделирование активных, неравновесных мембран в искусственных системах началось сравнительно недавно, при этом в качестве неравновесного элемента используется белковая добавка. Таким образом, липидному бислою (как обычно, и при описании клеточных процессов) отводится пассивная роль (матрицы). Однако и чисто липидные мембраны «активны», например, вблизи точки фазового nepexofla(Antonov, 1980). Активность мембран может быть (по крайней мере, феноменологически) связана с обратимой порацией мембран. Ранее, для осуществления обратимой порации использовалось сильное-кратковременное внешнее воздействие (такое, как импульс электрического потенциала, повышение концентрации Са2+, и т.д.) поскольку даже у метастабильных мембран под натяжением, БЛМ, энергетический минимум достаточно глубок. Использовались также и небислойные компоненты, однако, их использование часто приводило к потере стабильности. Так, при добавлении в фосфолипидную мембрану более 5% лизолипидов они(мембраны) теряют стабильность(С11егпотогсШс, 1985). Обратимое порообразование в модельных системах наблюдалось редко и контролируется плохо. Тем не менее,использование небислойных липидов остается наиболее перспективным подходом т.к. именно они являются строительным материалом для стабильной поры. Мембраны, содержащие холестерин и лизолипиды в больших количествах, представляют собой идеальную модель для реализации различных типов активности. Противоположная спонтанная кривизна и существование молекулярного взаимодействия может содействовать стабилизации мембраны, а высокая степень небислойности поможет реализации активных свойств.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Карпунин, Дмитрий Владимирович

выводы

- Для формирования стабильного бислоя количество лизофосфатидилхолина (JI) не должно превышать количество холестерина (X) более чем на 10%; стабильность и большая изгибная жесткость такого бислоя обусловлены кластеризацией J1 и X.

Для активизации мембраны, содержащей JI-X смесь, а именно инициации латерального перераспределения компонентов и формирования пор при сохранении общей структурной стабильности мембраны, достаточно малых вариаций соотношения JI и X; порообразованием можно управлять используя модификаторы липидного состава мембраны (циклодекстрин, альбумин).

- Наличие 60 и более мольных процентов JI-X смеси в липидной мембране обеспечивает формирование стабильной липидной поры с заданной структурой; структура определяется упаковкой X и JI в кромку поры. Липосомы, сформированные из Л-Х смеси, обладают особыми свойствами (такими как возможность замены содержимого при физиологических температурах, селективное поглощение липидного материала липосом фагоцитами), которые могут быть использованы при разработке новых систем доставки лекарств.

В заключение считаю своим долгом выразить глубокую благодарность своему научному руководителю Вадиму Александровичу Фролову. Так же хочу поблагодарить Сергея Александровича Акимова за помощь в выполнении теоретической части работы, Павла Викторовича Башкирова за помощь в определении изгибного модуля мембран, Владимира Анатольевича Лизунова за создание программного обеспечения, использованного в работе. Хочу выразить благодарность Петру Ивановичу Кузьмину, Юрию Александровичу Чизмаджеву, Константину Владимировичу Павлову за активную помощь; плодотворные обсуждения с ними помогли в разрешении возникавших в ходе работы проблем. Так же хочу выразить благодарность Джошу Циммербергу (Joshua Zimmerberg), в лаборатории которого была выполнена часть работы во время визита в США.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Карпунин, Дмитрий Владимирович, Москва

1. Абидор И.Г., Аракелян В.Б., Пастушенко В.Ф., Тарасевич М.Р., Черномордик Л.В., Чизмаджев Ю.А. Электрический пробой бислойных липидных мембран. ДАН СССР, 1978, Т. 240, №3, С. 733-736.

2. Абидор И.Г., Черномордик Л.В., Сухарев С.И., Чизмаджев Ю.А. Обратимый электрический пробой бислойных липидных мембран, модифицированных ураниловыми ионами. Электрохимия, 1981, Т. 17, В. 12, С. 1852-1857.

3. Дерягин Б.В., Гутоп Ю.В. Теория разрушения (прорыва) свободных пленок. Коллоидный журнал, 1962, Т 24, С. 431-437.

4. Дунина-Барковская А. Я., Карпунин Д. В., Лизунов В. А., Фролов В. А. Макрофаги линии IC-21 как модель для изучения электрофизиологии эндоцитоза. Биологические мембраны, 2002, том 20. № 4, 322-332.

5. Карпунин Д.В., Акимов С.А., Фролов В.А. Формирование пор в плоских липидных мембранах, содержащих лизолипиды и холестерин. Биологические мембраны, 2005, том 22, № 5, 429-432.6. Ландау и Лифшиц, 1987

6. Петров В.В., Мольнар А.А., Иванов А.С., Предводителев Д.А., Антонов В.Ф. 1978. Появление одиночных каналов ионной проводимости внемодифицированных бислойных мембранах при температуре фазового перехода. ДАН СССР, Т. 239, № 5, С. 1245-1247.

7. Сухарев С.И., Черномордик Л.В., Абидор И.Г. Обратимый электрический пробой холестеринсодержащих бислойных липидных мембран, модифицированных голотурином А. Биофизика, 1983, Т. 28, В. 3, С. 423-426

8. Ходоров Б.И., Пеганов Э.М. О механизме изменений ионной проницаемости мембраны перехвата Ранвье при генерации гиперполяризационных ответов. ДАН СССР 1969, Т. 185. С. 1189-1192.

9. Черномордик JI.B., Абидор И.Г., Аракелян В.Б., Баскаков В.А., Тарасевич М.Р. Влияние «стрессовых» воздействий на электрические свойства БЛМ. Биофизика, 1978, Т 23Ю В. 5, С. 806-812.

10. П.Чизмаджев Ю.А., Черномордик Л.В., Пастушенко В.Ф., Абидор И.Г. Электрический пробой бислойных липидных мембран. Биофизика мембран, 1982, Т. 2. Ионные каналы и их модели, Итоги науки и техники, ВИНИТИ, АН СССР, Москва.

11. Abidor I.G., Chernomordik L.V., Sukharev S.I., Chizmadzhev Yu.A. 1982. The Reversible Electrical Breakdown of Bilayer Lipid Membranes Modified by Uranyl Ions. Bioelectrochem. Bioenerg., V. 9, P. 141-148.

12. Agre Peter, King Landon S., Yasui Masato, Guggino Wm В., Ottersen Ole Petter, Fujiyoshi Yoshinori, Engel Andreas and Nielsen Soren Aquaporin water channels from atomic structure to clinical medicine Journal of Physiology (2002), 542.1, pp. 3-16

13. Akashi K., Miyata H., Itoh H., Kinosita, K. Jr. Preparation of Giant Kiposomes in Physiological Conditions and Their Characterization under Optical Microscope. Biophysical Journal Vol. 71 (1996) 3242-3250.

14. Anderluh Gregor and Macek Peter Dissecting the Actinoporin Pore-Forming Mechanism Structure, Vol. 11, November, 2003

15. Anderson Thomas G., Tan Anmin, Ganz Peter, and Seelig Joachim Calorimetric Measurement of Phospholipid Interaction with Methyl-P-Cyclodextrin Biochemistry 2004,43,2251-2261

16. Antonov V.F., Petrov V.V., Molnar A.A., Predvoditelev D.A., Ivanov A.S. 1980. Nature, Vol. 283, P. 585.

17. Bagatolli L.A., Parasassi Т., Gratton E. Giant phospholipid vesicles: comparison among the whole lipid sample characteristics using different preparation methods. A two photon microscopy study. Chemistry and Physics of Lipids 105 (2000) 135-147.

18. Bailey Austin L. and Cullis Pieter R. Membrane Fusion with Cationic Liposomes: Effects of Target Membrane Lipid Composition Biochemistry 1997, 36, 16281634

19. Benz R., Beckers F., Zimmermann U. Reversible electrical breakdown of Lipid Bilayer Membranes: a charge-pulse relaxation study. J. Membr. Biol., 1979, V. 48, P. 181-204.

20. Benz R., Conti F. Reversible electrical breakdown of squid giant axon membrane Bioch. et Biophys. Acta, 645 (1981) 115-123.

21. Benz R., Zimmermann U. The resealing process of lipid bilayers after reversible electrical breakdown. BBA, 1981, V. 640, P. 169-178.

22. Billington Stephen J., Jost B. Helen, Songer J. Glenn Thiol-activated cytolysins: structure, function and role in pathogenesis FEMS Microbiology Letters 182 (2000)197-205

23. Bonnafous Pierre and Stegmann Toon Membrane Perturbation and Fusion Pore Formation in Influenza Hemagglutinin-mediated Membrane Fusion THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 275, No. 9, Issue of March 3, pp. 6160-6166,2000

24. Brockerhoff H. Model of interaction of polar lipids, cholesterol, and proteins in biological membranes. Lipids. 1974 Sep;9(9):645-50.

25. Chang D.C. Structure and Dynamics of Membrane Pores. 1992. In "Guide to Electroporation and Electrofusion", Chang D.C., Chassy B.M., Saunders J.A., Sowers A.E. (eds.), Academic Press, New York, P. 9-27.

26. Chernomordik L.V., Kozlov M.M., Melikyan G.B., Abidor I.G., Markin V.S., Chizmadzhev Yu.A. The shape of lipid molecules and monolayer membrane fusion. BBA, 1985, V. 812, P. 643-655.

27. Chernomordik L.V., Melikyan G.B., Dubrovina N.I., Abidor I.G., Chizmadzhev Yu.A. 1984. Solvent-Free Bilayers from Squalene Solutions of Phospholipids. Bioelectrochem. Bioenerg., V. 12, P. 155-166.

28. Chernomordik L.V., Sukharev S.I., Popov S.V., Pastushenko V.F., Sokirko A.V., Abidor I.G., Chizmadzhev Y.A. The Electrical Breakdown of Cell and Lipid Membranes: the Similarity of Phenomenologies. BBA, 1987, V. 902, P. 360-373.

29. Chonn Arcadio, Cullis Pieter R. Recent advances in liposome technologies and their applications for systemic gene delivery Advanced Drug Delivery Reviews 30(1998) 73-83

30. Choy Patric C., et all Biochem. Cell Biol. 82,212-224,2004

31. Christian Airnee E., Haynes M. Page, Phillips Michael C., and Rothblat George H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research Volume 38, 1997 2264-2272

32. Colley C. S., Kazarian S. G., Weinberg P. D., Lever M. J. Spectroscopic Imaging of Arteries and Atherosclerotic Plaques Biopolymers, Vol. 74, 328-335 (2004)

33. Dressier V., Schwister K., Haest C.W.M., Deuticke B. Dielectric breakdown of the erythrocyte membrane enhances transbilayer mobility of phospholipids. BBA, 1983, V. 732, P. 304-307.

34. Fattal Elias, Couvreur Patrick, Dubernet Catherine "Smart" delivery of antisense oligonucleotides by anionic pH-sensitive liposomes Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004) 931- 946

35. Frank, F. C. 1958. On the theory of liquid crystals. Discuss. Faraday Soc. 25:1928.

36. Frolov Vadim A., Lizunov Vladimir A., Dunina-Barkovskaya Antonina Ya., Samsonov Andrey V., and Zimmerberg Joshua Shape bistability of a membrane neck: A toggle switch to control vesicle content release PNAS July 22, 2003, vol. 100, no. 15, 8698-8703.

37. Glaser Ralf W., Leikin Sergei L., Chemomordik Leonid V., Pastushenko Vasili F. and Sokirko Artjom I. Reversible electrical breakdown of lipid bilayes: formation and evolution of pores. Biochimica et biophysica Acta 940 (1988) 275-287.

38. Glass Christopher K., Witztum Joseph L., Atherosclerosis: The Road Ahead, Cell, Vol. 104, 5003-516, February 23, 2001.

39. Goonesinghe Alexander, Mundy Elizabeth S., Smith Melanie, Khosravi-Far Roya, Martinou Jean-Claude and Esposti Mauro D. Pro-apoptotic Bid induces membrane perturbation by inserting selected lysolipids into the bilayer Biochem. J. (2005) 387, 109-118

40. Hafez Ismail M., Ansell Steven and Cullis Pieter R. Tunable pH-Sensitive Liposomes Composed of Mixtures of Cationic and Anionic Lipids Biophysical Journal Volume 79 September 2000 1438-1446

41. Helfrich, W. 1973. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z. Naturforsch. 28c:693-703.

42. Hill A. V., Solandt D.Y. The measurement of "accomodation" in nerve. Proc. Roy. Society, London, ser. B, 1936, V. 119, P. 355-379.

43. Ickenstein Ludger M., Arfvidsson Maria C., Needham David, Mayer Lawrence D., Edwards Katarina Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition Biochimica et Biophysica Acta 1614 (2003) 135- 138

44. Jensen Morten A., Mouritsen Ole G. Lipids do influence protein function—the hydrophobic matching hypothesis revisited Biochimica et Biophysica Acta 1666 (2004) 205- 226

45. Kim Т. H., Park T. G. Critical effect of freezing/freeze-drying on sustained release of FITC-dextran encapsulated within PLGA microspheres International Journal of Pharmaceutics 271 (2004) 207-214.

46. Kinozita K., Tsong T.Y. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membrane. Nature, 1977, V. 268, P. 438-441.

47. Kinozita K., Tsong T.Y. Haemolysis of human erythrocytes by a transient electric field. Proc. Natn. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, P. 1923-1927.

48. Kinozita K., Tsong T.Y. Voltage-induced pore formation and haemolysis of human erythrocytes. BBA, 1977, V. 471, P. 227-242.

49. Korlach J., et all Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 96: 84618466 (1999).

50. Kozlov M., Leikin S., and Rand R. 1994. Bending, hydration and interstitial energies quantitatively account for the hexagonal-lamellarhexagonal reentrant phase-transition in dioleoylphosphatidylethanolamine. Biophys. J. 67:1603-1611.

51. Kritharides L, Christian A, Stoudt G, Morel D, Rothblat G. Cholesterol metabolism and efflux in human THP-1 macrophages. Arterioscler Thromb Vase Biol 18:1589-1599, 1998.

52. Kroth HS. Macrophage foam cells and atherosclerosis. Front. Biosci. 2001; 6: D429-55.

53. Kuzmin Peter I., Akimov Sergey A., Chizinadzhev Yuri A., Zimmerberg Joshua, and Cohen Fredric S. Line Tension and Interaction Energies of Membrane Rafts Calculated from Lipid Splay and Tilt Biophysical Journal Volume 88 February 2005 1120-1133

54. Lang Shenhui and Palmer Michael Characterization of Streptococcus agalactiae CAMP Factor as a Pore-forming Toxin THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 40, Issue of October 3, pp. 38167-38173, 2003

55. Leikin S., Kozlov M. M., Fuller N. L., and Rand R. P. 1996. Measured effects of diacylglycerol on structural and elastic properties of phospholipid membranes. Biophys. J. 71:2623-2632.

56. Libby, P., Ridker, P.M. & Maseri, A. Inflammation and atherosclerosis. Circulation 105,1135-1143 (2002).

57. Linton MacRae F and Fazio Sergio, Macrophages, inflammation, and atherosclerosis, International Jiurnal of Obesity (2003) 27, S35-S40.

58. Manneville J.-B., Bassereau P., Ramaswamy S., and Prost J. Active membrane fluctuations studied by micropipet aspiration PHYSICAL REVIEW E, VOLUME 64, 021908

59. Maurer Norbert, Fenske David F. and Cullis Pieter R. Developments in liposomal drug delivery systems, Expert Opin. Biol. Ther. (2001) 1(6): 923-947

60. Melikov Kamran C., Frolov Vadim A., Shcherbakov Arseniy, Samsonov Andrey

61. V., Chizmadzhev Yury A., and Chernomordik Leonid V. Voltage-Induced Nonconductive Pre-Pores and Metastable Single Pores in Unmodified Planar Lipid Bilayer Biophysical Journal Volume 80 April 2001 1829-1836.

62. Melikov К. Ch., Samsonov A. V., Pirutin S. K., Frolov V. A. Study of Conductance Changes of Bilayer Lipid Membrane Indused by Electric Field. Membr. Cell Biol., 1999, Vol. 13(1), 121-130.

63. Mouritsen O.G., Zucherman M.J., Model of interfacial melting, Phys. Rev. Lett. 58 (1987) 389-392.

64. Mueller P., Rudin D., Tien H., Wescott W. Reconstitution of Cell Membrane Structure in vitro and its Transformation into an Excitable System. Nature 4832 (1962) 979-980

65. Needham D., Nunn R. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58: 997-1009, 1990

66. Needham David, Anyarambhatla Gopal, Kong Garheng, and Dewhirst Mark W. A New Temperature-sensitive Liposome for Use with Mild Hyperthermia: Characterization and Testing in a Human Tumor Xenograft Model 1 CANCER RESEARCH 60,1197-1201, March 1, 2000

67. Neufeld Edward В., Cooney Adele M., Pitha Josef, Dawidowicz Eliezar A., Dwyer Nancy K., Pentchev Peter G., and Blanchette-Mackie E. Joan Intracellular

68. Trafficking of Cholesterol Monitored with a Cyclodextrin THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 271, No. 35, Issue of August 30, pp. 2160421613,1996

69. NISHIJO Juziro, MORIYAMA Shiho and SHIOTA Sachiko Interactions of Cholesterol with Cyclodextrins in Aqueous Solution Chem. Pharm. Bull. 51(11) 1253—1257 (2003)

70. Pfluger U.D. Physiology des Electronus. Berlin, Hirsvald, 1859

71. Qiao H., Armstrong R. Т., Melikyan G. В., Cohen F. S., White J. M. (1999) Mol. Biol, of the Cell 10,2759-2769.

72. Radhakrishnan A., McConnel H. Condensed Complexess of Cholesterol and Phospholipids. Biophys. J. 77: 1507-1517,1999

73. Ramaswamy Sriram, Toner John, and Prost Jacques Nonequilibrium Fluctuations, Traveling Waves, and Instabilities in Active Membranes PHYSICAL REVIEW LETTERS 10 APRIL 2000 VOLUME 84, NUMBER 15

74. Ramsammy Leslie S. and Brockerhoff Hans Lysophosphatidylcholine-Cholesterol Complex The Journal of Biological Chemistry Vol. 257, No. 7, Issue of April 10, pp. 3570-3574. 1982

75. Ramsammy Leslie S., et all Chemistry and Physics of Lipids, 32 (1983), 83-89

76. Ross R. Atherosclerosis -115-126.an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340:

77. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 362:801-809, 1993.

78. Rossjohn J, Feil SC, McKinstry WJ, Tweten RK, Parker MW Structure of a cholesterol-binding, thiol-activated cytolysin and a model of its membrane form. Cell 1997 May 30;89(5):685-92

79. Schneider Hans-Jorg, Hacket Frank, and Rudiger Volker NMR Studies of Cyclodextrins and Cyclodextrin Complexes Chem. Rev. 1998, 98, 1755-1785

80. Sale A.J.H., Hamilton W.A. Effects of high electric fields on microorganisms. I. Killing of bacteria and yeast. BBA, 1967, V. 148, P. 781-788.

81. Semple Sean C., Chonn Arcadio, and Cullis Pieter R. Influence of Cholesterol on the Association of Plasma Proteins with Liposomes Biochemistry 1996, 35, 25212525

82. Semple Sean С., Chonn Arcadio, Cullis Pieter R. Interactions of liposomes and lipid-based carrier systems with blood proteins: Relation to clearance behaviour in vivo Advanced Drug Delivery Reviews 32 (1998) 3-17

83. Siskind L.J. and Colombini M. The lipids C2- and Ci6- ceramide form large stable channels. The J. of Biological Chem., 2000, Vol. 275, No. 49, P. 38640-38644.

84. Steinberg D. Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological . significance. J Biol Chem 1997;272:20963-6.

85. Stampfli R., Willi M. Membrane potential of a Ranvier node measured after electrical destruction of its membrane. Experientia, 1957, V. 13, P. 297.

86. Szejtli Jozsef Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry Chem. Rev. 1998, 98,1743-1753

87. Tabas Ira, Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications, J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).

88. Takahashi Kiyoshi, et all Med. Electron. Microsc. (2002) 35, 179-203

89. Tall Alan R., Costet Philippe, and Wang Nan Regulation and mechanisms of macrophage cholesterol efflux J. Clin. Invest. 110:899-904 (2002).

90. Teissie J., Tsong T. Electric Field Induced Transient Pores in Phospholipid Bilayer Vesicles. Biochemistry (1981) 20: 1548-1554

91. Tien H.T. Bilayer Lipid Membrane (BLM). Teory and Practice. New York, 1974.

92. Tien H. Black Lipid Membranes at Bifaces Formation characteristics, optical and some thermidinamical properties 125s-143s

93. Tsamaloukas Alekos, Szadkowska Halina, Slotte Peter J., and Heerklotz Heiko Interactions of Cholesterol with Lipid Membranes and Cyclodextrin Characterized by Calorimetry Biophysical Journal Volume 89 August 2005 1109— 1119

94. Williams E.J., Bradley J. Steady-state membrane hyperpolarization by large applied currents in Nitella translucens. Biophys. J., 1968, V. 1, P. 145-147.

95. Xu X., London E. The Effect of Sterol structure on Membrane Lipid Domains Reveals How Cholesterol Can Induce Lipid Domain Formation. Biochemistry 2000 Vol. 39(5): 843-849