Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование сопряженности потребления кислорода с ростом и содержанием структурных липидов в каллусных клетках гороха

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование сопряженности потребления кислорода с ростом и содержанием структурных липидов в каллусных клетках гороха"

Г Б ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

На правах рукописи УДК 581.121:631.589

ИВАНОВА АННА БОРИСОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СОПРЯЖЕННОСТИ ПОТРЕБЛЕНИЯ

КИСЛОРОДА С РОСТОМ И СОДЕРЖАНИЕМ СТРУКТУРНЫХ ЛИПИДОВ В КАЛЛУСНЫХ КЛЕТКАХ

ГОРОХА

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 1994

Работа выполнена в Казанском институте биологии Казанского научного центра РАН.

Научный руководитель

доктор оиологических наук, профессор Л.Х.ГОРДОН

Соруководитель

кандидат химических наук, А-В.ЛЫГИН

Официальные оппоненты

доктор биологических наук,

Ф.Г.КАРИМОВА

кандидат биологических наук,

М.Б.ХУСАИНОВ

Ведущая организация"

Санкт-Петербургский государственный университет, каф. физиологии и биохимии растений

Защита состоится /г 1994 г. в "/С' час

на заседании Специализированного Совета К 002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (специальность - физиология растений) при Казанском институте биологии КНЦ РАН (420503, г.Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского физико-технического института КНЦ РАН.

Автореферат разослан " р _ 1994 г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета »

кандидат биологических наук

Н.Л.ЛОСЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

На современном этапе все большее внимание исследователей обращается к возможности культивирования тканей, органов, а также отдельных клеток растений на питательных средах. Однако перспективы управления морфогенезом в условиях in vitro ограничиваются необходимостью выявления морфологических, генетических и физиолого-биохимических особенностей клеток, находящихся в искусственной среде обитания. Это связано с тем, что условия изолированной культуры приводят к изменению метаболизма (Fowler, 1986). В ряде случаев при продолжительном культивировании на питательной среде возникают особые формы каллусных тканей, получивших название "привыкших" или химических опухолей (Рубин, 1978). Изучение их интересно с точки зрения адаптационных возможностей клеток в условиях культивирования.

Перевод клеток в культуру и последующий питательный стресс являются для них экстремальными условиями. Индуцируя геномную нестабильность, они вызывают быстрые и существенные изменения генома (Негрук, 1987). Логично предположить, что любые изменения в нем повлекут за собой существенную перестройку обмена веществ клеток. Геномную изменчивость в ответ на действие стрессовых факторов можно рассматривать, как одну из сторон клеточного ответа на стресс. С другой стороны, клеточный ответ на любые стрессовые воздействия состой1 из защитного и мутабильного компонентов (Соловьян, 1991). Без всестороннего изучения защитной составляющей клеточного ответа на стресс, невозможно выявить рычаги управления геномом, т.к. изменения в нем сопряжены с изменением {и цнюлого-био химических процессов клетки, являющихся ранней ответной реакцией на любые стрессовые воздействия яа нее.

Целью работы явилось исследование взаимосвязи роста.

дыхания, содержания структурных липидов в каллусных клетках в различных условиях их культивирования.

Задачи исследования

1. Исследование роста и дыхания каллусных -клеток в процессе пассажа.

2. Выявление динамики содержания структурных липидов в каллусе в течение пассажа.

3. Исследование ультраструктурных перестроек в каллусных клетках в процессе пассажа.

4. Изучение особенностей роста и дыхания каллуса при блокировании АТФ-азных систем и проводимости плазмалеммы.

5. Выявление изменений в ростовых процессах, дыхании, содержании структурных липидов каллусных клеток, растущих на среде, лишенной ионов Са2+.

Все результаты были получены на рыхлом (неморфогенном) типе каллуса.

Научная новизна

Впервые проведен сопоставительный анализ дыхательного газообмена каллусных клеток и ткани - источника получения каллуса. Показано, что интенсивность дыхания каллуса в 8-10 раз ниже, чем в исходной ткани, что обусловлено, по-видимому, реализацией эффекта Крэбтри (подавление дыхания глюкозой).

Впервые установлено, что в процессе роста каллуса происходят изменения в содержании структурных липидов: увеличение содержания фосфолипидов в экспоненциальной фазе роста и снижение в стационарной фазе; в экспоненциальной фазе роста повышается степень ненасыщенности жирнокислотных остатков фосфолипидов и снижается соотношение стерины/фосфолипиды. В стационарной фазе эти изменения носят противоположный характер. Можно полагать, что они имеют регуляторное значение в процессах перехода каллуса из одной фазы роста в другую.

Получены новые данные о, снижении пролиферативной активности каллуса и более быстрому переходу его в стационарную фазу при дефиците ионов кальция.

Выявлены особенности в ультраструктуре каллусных

клеток гороха: преобладание агранулярного эндоплазма-тического ретикулума (АЭПР) в виде коротких цистерн и присутствие в цитоплазме свободных рибосом и полисом; появление кольцевых крист в митохондриях.

Практическая значимость работы

Результаты работы дают возможность получить представление об изменениях физиолого-биохимических процессов, протекающих в каллусных клетках, что имеет существенное значение для дальнейших разработок в области биотехнологии.

Обнаруженные изменения в энергетическом обмене каллусных клеток, по сравнению с клетками исходной ткани, из которой каллус получен, являются основой для выявления регуляторных механизмов, обеспечивающих экономное расходование энергетических ресурсов.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при разработке методов культивирования клеток, тканей, необходимо учитывать роль ионтранспортирующих систем плазмалеммы в обеспечении ростовых функций.

Апробация работы. Результаты работы доложены на конференциях молодых ученых (Казань,1985; Уфа,1987), на отчетных конференциях Казанского института биологии КНЦ РАН (Казань, 1987, 1988, 1989, 1991, 1992), на конференции "Биология • сельскому хозяйству" (Казань, 1987), на Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), на II съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), на Международной конференции "Липиды" (Казань, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 7 рисунков и 15 фотографий. Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 222 источника, из них 136 иностранных.

ГЛАВА I. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Способ получения каллусов. Объектом исследования явилась каллусная культура гороха (Pisum sativum.) сорта Татарстан-2. Каллусообразование индуцировали культивированием измельченных апексов 5-6 дневных проростков на средах, разработанных Т.А.Ежовой с соавторами (1985), или их модификациях, предложенных нами, с уменьшенным вдвое содержанием фитогормонов, на свету (20 Вт/м2, 16-часовой светопериод, t°-27°-28°C).

Характеристика каллусов. Было получено три типа каллусов, резко отличающихся морфологически:

а) твердый, медленнонарастающий каллус, способный к единичному побегообразованию;

б) частичнодифференцированная, содержащая многочисленные меристемы культура, дающая множественную регенерацию побегов. Достигнут высокий процент укоренения побегов при культивировании их в жидких питательных средах, содержащих низкие концентрации ауксинов: НУК (0,05мг/л-0,4мг/л), ИМК (0,5мг/л-1,0мг/л) и ИУК (0,3мг/л-0,7мг/л). Наиболее успешно процесс укоренения происходил на средах с НУК. В течение полутора месяцев из 48 побегов 63% образовали корни. Данные литературы свидетельствуют о больших трудностях, связанных с укоренением побегов гороха, полученных в культуре in vitro (Hussey, Gunn, 1984);

в) рыхлый, быстронарастающий каллус, полностью лишенный способности к морфогенезу.

В отличие от 2-х первых типов каллуса рыхлый каллус не имеет меристематических клеток. Он характеризуется существенным изменением цитогенетических характеристик в сравнении с исходным растением и другими полученными культурами (Иванова и др., 1987; Киямова и др., 1991; Киямова, 1992).

Возникновение каллуса с измененным кариотипом, высокая скорость его нарастания, а также неспособность к регенерации привели нас к выводу, что он требует дальнейшего изучения с точки зрения оценки некоторых интегральных

показателей его физиологического статуса и ультраструктуры.

Методы исследования рыхлого, быстронарастающего каллуса.

Исследования проводили через 24 часа, на 3-й, 10-е, 17-е и 24-е сутки (сут.) культивирования.

Сырую массу каллуса определяли по среднему значению 10-ти-12-ти кусочков, рассчитывая относительную скорость нарастания ее в процентах.

Изменения дыхательного газообмена регистрировали манометрически в аппарате Варбурга на протяжении 1 часа, снимая показания каждые 30 мин (Семихатова, Чулановская, 1965).

При изучении дыхания каллусных клеток был также использован ингибиторный метод. Применяли: а - NaF [2,5-102М] - блокирует гликолиз; б - KCN[5-103M] - ингибитор цитохром-оксидазы; в - салицилгидроксамовая кислота (СГК)[10"2М] -блокатор цианидустойчивого окисления в митохондриях.

Липиды экстрагировали модифицированным методом Блайя и Дайера (Кейтс, 1975). Количественное содержание фосфолипидов в экстракте определяли по (Eble, Lands, 1969). Фосфолипидную и стериновую фракции выделяли из общего экстракта методом тонкослойной хроматографии (Кейтс, 1975). Качественный и количественный состав фитостеринов определяли методом обращеннофазовой ВЖХ (Bulder et al., 1984). Жирнокислотный состав фосфолипидов анализировали методом ГЖХ (Lepage,Roy, 1986).

Содержание С02 в чашках определяли методом ГЖХ. Хроматограф Chrom-5. НФ-молекулярные сита СаН, ПФ-гелий. VHe= ЗОмл/мин, t=50°C. Детектор - катарометр.

Для электронномикроскопических исследований кусочки каллуса фиксировали в 2,5% глютаровом альдегиде на фосфатном буфере (рН 7,2), постфиксировали 1% раствором 0s04 на том же буфере с добавлением сахарозы (25 мг/мл), обезвоживали и заливали в Эпон-812. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III, контрастировали по методу (Tandler, 1990) и цитратом свинца. Просматривали на электронном микроскопе Jem-100 СХ.

Экспериментальные данные обрабатывали методом вариационной статистики (Вознесенский, 1969).

ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Рост и дыхание каллусных клеток гороха в условиях модуляции активности транспортных систем плазмалеммы блокаторами ионных каналов и АТФ-азных систем В результате исследования особенностей роста и дыхательной активности клеток каллуса гороха при блокировании ионных каналов лантанидами (Ос1(ЬГОз)з [5-10"5М]) и АТФ-азных систем ионами серебра (АёШ3[10 6М])

показано, что рост каллуса характеризуется типичной в-образной кривой. Наибольшая интенсивность роста наблюдалась на 10-ые сут. пассажа (рис.1). Скорость потребления кислорода была максимальной на 3-й сутки (рис.2), что, по-видимому, отражает подготовительный этап к пролиферации, требующий значительных энергетических затрат. Этим

4

23

в ходе

ю те яо

Рис.1. Изменение веса каллуса гороха культивирования его на разных средах. По горизонтали - длительность культивирования, сут.

По вертикали - относительный вес каллуса в % от исходного:

а - при культивировании на нормальной среде; Ь - при культивировании на среде с Ос1(>Юд)д, [5х10"5М];

с - при культивировании на среде с А^Од, [10"®М]. Вертикальные отрезки - доверительные интервалы средних.

объясняется отсутствие тесной корреляции между интенсивностью потребления кислорода и приростом массы каллуса (рис.2.1).

Количество выделенного С02 также увеличивалось, перекрывая потребление Оа (рис.2), что привело к росту дыхательного коэффициента в первые дни пассажа (табл.1). Можно полагать, что это связано с преобладанием гликолиза и

задержкой "сброса" восстановителя через мито-хондриальное окисление. Подтверждением этому является накопление в атмосфере выращивания каллуса С02 (до 6%). При этом интенсивность потребления 02 и выделение С02 каллусными клетками намного ниже, чем у исходной растительной ткани, ДК которой =1 (табл.2). В связи с этим, мы предположили, что в

1 3 10 1Т

Рис.2. Дыхательная активность клеток каллуса гороха в ходе культивирония его на разных средах. По горизонтали - длительность культивирования, сут.

По вертикали - потребление С>2 (I) и каллусе реализуется эффект СОа (П) в мкл/г сырого веса.

а - при культивировании на нормальной среде;

Ь - при культивировании на среде с (М(К03)3, [510"5М];

с - при культивировании на среде с [Ю'вМ];

Вертикальные отрезки - доверительные интервалы средних.

Крэбтри (подавление дыхания глюкозой и активация гликолиза), свойственный опухолевым клеткам. Появление его могло быть обусловлено тем, что каллус выращивался на среде с избытком Сахаров, что не характерно для исходной ткани. Обнаруженное Г.М.КеэМто с соавторами (1989) угнетение синтеза ряда дыхательных ферментов высокими концентрациями Сахаров в каллусной культуре табака, с одновременным отсутствием чувствительности к ним алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, подтвердили наше предположение.

Поскольку двуокись углерода является специфическим ингибитором сукцинатдегидрогеназы, то в условиях ее избытка работа цикла Кребса должна модифицироваться. В серии работ А.У.Игамбердиева с сотрудниками (1990,1991) обосновано предположение, что я условиях блокирования электронтранспортной цепи митохондрий и подавления отдельных звеньев окислительных процессов возможно переключение метаболизма органических кислот в

направлении их конструктивной утилизации и восстановления за счет НАДФ Н. Процесс может возрастать из-за невозможности окисления кислородом воздуха.

Таблица 1. Дыхательный коэффициент каллусных клеток гороха в Н2О.

- Сутки 1 3 10 17

1Д4±0,06 1,28±0,17 1,08±0,04 0,9±0,13

Таблица 2. Дыхание и дыхательный коэффициент апексов 6-ти дневных

проростков гороха

о2 СО, ДК

мкл/г.сыр.в. час

1731,5*47,64 1568±188 0,9±0,084

Указанное приводит к мысли, что наблюдаемые высокие концентрации С02 (до 6%) в атмосфере выращивания каллуса являются следствием изменения метаболических путей усвоения углерода в каллусе, требующих дальнейшего пристального изучения.

Следует отметить, что в течение первых трех сут. ионы Ос13+ и Ag+ ингибировали рост (рис.1) и потребление 02 в каллусе (рис.2). По-видимому, ингибирование пусковых процессов через ионные каналы и блокирование активного ионного транспорта приводят к задержке пролиферации каллуса, что особенно выражено при торможении АТФ-азных систем серебром (рис.1). Однако, к 17-м суткам при снижении роста и потребления кислорода в контроле, ионы Ос13+ и стимулировали эти процессы (рис.1,2). Такая парадоксальная ситуация могла быть следствием синтеза новых транспортных единиц, либо индукции эндоцитоза используемых ионов, что привело каллусные клетки к выходу на новый пролиферативный уровень.

Установив определенные корреляции между ростом каллусных клеток, их дыхательным газообменом и активностью ионтранспортирующих систем, мы показали, что блокирование ионтранспортирующих систем сопровождается

первоначально торможением роста, потребления кислорода, с последующим включением адаптационных механизмов, восстанавливающих ростовые процессы.

2.2. Дыхательный газообмен и содержание структурных липидов в процессе роста каллусных клеток.

В процессе роста культуры наблюдалось постепенное снижение действия NaF на дыхание клеток (рис.3), свидетельствующее о способности гликолитической системы работать лишь на ранних этапах ростового цикла, что подтверждается и выделением С02 (рис.2).

Потеря чувствительности в ходе пассажа дыхания каллуса к KCN и появление чувствительности к СГК (рис.3) указывает на то, что в стационарной фазе роста в митохондриях клеток каллуса запускается альтернативный путь переноса электронов.

Обращало на себя внимание, что к концу пассажа наблюдалось аномальное действие всех используемых ингибиторов (NaF, KCN, СГК, СГК+RCN) (рис.3), проявляющееся в усилении потребления 02 клетками. Основываясь на данных В.К.Акименко и А.Г.Меденцева (1980), В.М.Пахомовой и Л.Х.Гордона (1987), можно полагать, что наблюдаемое действие ингибиторов дыхания имеет общий характер и определяется физиологическим состоянием клеток. По-видимому, это связано с неспецифической ответной реакцией клеток, обусловленной выводом

JOB ■ 1 п п П I

1® ■ 1 п П п П п

1CD- ■ П П п п ш

toa- 8 „ г, п IV

К I Л 10 17 Я*

Рис.3. Влияние ингибиторов на интенсивность дыхания клеток каллуса гороха в ходе его культивирования.

По вертикали - интенсивность дыхания клеток, % от контроля (К), условно принятого за 100%. „ Х-1У - при действии соответственно: N01" [2,5-10 М], КСЛ [ИО-'М], СГК [10_/М] и СГК+КСМ. По горизонтали - длительность культивирования, сут.

их из состояния покоя. Можно ожидать, что переход каллуса в состояние покоя будет сопровождаться изменениями в метаболизме структурных липи-дов, т.к. они играют определяющую роль в формировании клеточного ответа на воздействие (Бужу-рина, Панов, 1986).

. В ходе роста культуры наблюдалось резкое возрастание количества фосфолипидов (ФЛ), достигавшее максимума к 10-м сут. Затем уровень их снижался, становясь минимальным к концу пассажа (рис.4). Степень же насыщенности жирнокислотных остатков ФЛ к 10-м суткам была минимальна, а к концу культивирования вновь увеличивалась (рис.4). Аналогичным образом изменялось соотношение СТ/ФЛ (рис.4). На основании последних двух показателей можно оценить микровязкость мембран, которая в момент нахождения каллуса в фазе экспоненциального роста (10-е сут.) значительно уменьшалась. При этом зафиксирован высокий уровень дыхания и максимальный прирост биомассы (рис.2, 1).

При переходе к стационарной фазе роста .микровязкость мембран возрастала (рис.4), уменьшалась их проницаемость. С этим, по-видимому, связаны и минимальные энергетические затраты на транспорт ионов, метаболитов и, соответственно, снижена активность потребления 02 (рис.2)..

Таким образом, показано, что в процессе роста каллуса существует взаимосвязь между дыхательным газообменом и

клеток гороха в ходе их культивирования. По горизотали - длительность культивирования, сут.;

По вертикали :

А - содержание фосфолипидов (мкМ xlO'Vr сырого веса);

Б - отношение стерины/фосфолипиды х50; В - степень насыщенности фосфолипидов (S/U).

метаболизмом структурных липидов. Взаимодействие этих двух метаболических систем, по-видимому, реализуется через изменение ионной проницаемости мембран.

2.3. Рост, дыхание и содержание структурных липидов в каллусных клетках при недостатке ионов Са2+.

Известно, что рост клеточных культур замедляется при снижении концентрации кальция в среде, а при достижении ее 0,05-0,01 мМ размножение нормальных клеток останавливается (Веренинов, Марахова, 1986). Однако, в некоторых случаях инициация проли-феративной активности возможна и в отсутствии ионов Са2+ в среде (Епифанова и др., 1988). В данном случае запуск ее может быть следствием внутриклеточного перераспределения кальция, не сопровождающегося изменением его общего .--..держания в клетке (Гуковская, 1984).

В литературе практически нет информации о росте каллусных культур в условиях недостатка

кальция. Сведений о взаимосвязи между процессами роста и дыхания клеток каллусов в этих условиях, а также содержанием липидов в их мембранах также нет.

При определении прироста массы каллуса в норме и при отсутствии в среде ионов Са2+ обнаружено, что их дефицит приводит к ослаблению ростовой функции и способствует боле*1 быстрому переходу культуры в стационарную фазу роста (рис.5).

ходе культивирования его на разных средах.

По горизонтали - длительность культивирования, сут.;

По вертикали - относительный вес каллуса в % от исходного: А - при культивировании на нормальной среде;

Б - при культивировании на среде без кальция.

Вертикальные отрезки - доверител; тые интервалы средних.

Ид fill Ш »л

900 аре rf rh '

100 fl Л 1 t)f]

С помощью ин-гибиторного анализа (КаГ) было установлено, что система аэробного гликолиза в клетках каллуса работает, как в контроле, так и при дефиците кальция (рис.6).

Отсутствие ионов Са2+ в среде привело к значительному уменьшению содержания в клетках фосфолипидов после 3-их сут. пассажа (рис.7). На пике активации проли-феративных процессов (рис.5) отношение СТ/ФЛ минимально (табл.3). Однако, к концу культивирования оно резко увеличивалось, значительно превышая контрольный вариант (табл.3). По-видимому, проницаемость плазмалеммы

Таблица 3. Изменение липидного состава каллусных клеток гороха в ходе его культивирования на разных средах, а - культивирование каллуса на нормальной среде; б - культивирование каллуса на бескальциевой среде

Рис.6. Влияние NaT на дыханиие клеток каллуса гороха, культивируемого на разных средах. По вертикали - потребление кислорода в мкл за 1 час на 1г сырого веса;

a) в отсутствие действия ингибитора,

b) при действии ингибитора.

I - при культивировании на нормальной среде; П - при культивировании на среде без кальция. По горизонтали - время культивирования, сут.; Вертикальные отрезки доверительные

интервалы средних.

Длительность Степень насыщенности Отношение

пассирования жирнокислотных остатков стерины/фосфолипиды

(сутки) фосфолипидов (S/U) x±s

x*s

а б а б

1 - 1.9*0.12 0.18*0.017 0.16*0.065

3 1.9*0.12 2.2*0.25 0.12*0.025 0.10*0.021

10 2.8*0.4 2.0±0.26 0.11*0.021 0.12*0.025

17 3.5*0.25 2.6*0.2 0.17*0.03 0.14*0.021

24 - - 0.17*0.05 0.37*0.06

для ионов у клеток каллуса к этому времени ниже, чем в контроле. Возможна компенсация недостатка кальция стеринами.

В ускоренном переходе клеток в стационарную фазу роста при отсутствии Са2+ в среде (рис.5) определенную роль,. по-видимому, сыграло более быстрое снижение содержания в клетках ФЛ (рис.7), а также увеличивающаяся сте-ринизация мембранных структур (табл.3).

Наблюдавшееся, особенно в первые 10 сут. культивирования, снижение дыхания клеток в опытном варианте (рис.6) также обусловило их замедленную пролиферацию. По данным А.С.Гуковской и В.П.Зинченко (1988) ингибирова-ние энергетического обмена тимоцитов крысы сопровождается исчезновением кальциевых сигналов в ответ на митогены. Возможно, что существует и обратная зависимость — отсутствие ионов Са2+ в среде может привести к торможению энергетического обмена и снижению пролиферации.

Полученные результаты позволили заключить, что снижение пролиферативной активности каллусных клеток гороха при дефиците ионов Са2+ в среде обусловленд, по-видимому, нарушением в системе передачи сигнала репродуктивному аппарату клетки. Оно может быть связано с изменением синтеза фосфолипидов и нарушением энергообеспечения пролиферации клеток.

Рис.7. Изменение содежания фосфолипидов в клетках каллуса гороха в ходе культивирования его на разных средах. По горизонтали - длительность культивирования, сут.;

По вертикали - содежание фосфолипидов в нМ на 1г сырого веса:

А - при культивировании на нормальной среде; Б - при культивировании на среде без кальция. Вертикальные отрезки - доверительные интервалы средних.

2.4. Изменение ультраструктуры клеток длительно культивируемого каллуса гороха на протяжении пассажа

В ходе экспериментов были выявлены существенные морфологические различия клеток между фазами их ростового цикла.

В лаг-фазе пассажа ядра клеток отличались характерными инвагинациями оболочки, наблюдалось увеличенное количество пластид, почти полностью заполненных крахмалом, множество коротких цистерн агранулярного ЭПР, присутствие липидных капель в цитоплазме, наличие мелких митохондрий с малым числом криист, плотное примыкание плазмалеммы к клеточной стенке, отсутствие плазмодесм.

По данным Н.А.Шугаевой с сотрудниками (1992) экзогенная глюкоза окисляется по пути, отличному от пути окисления эндогенного сахара, а синтезированные из экзогенных Сахаров полимеры накапливаются исключительно в пластидах и, как правило, в виде крахмала Физиологический смысл этого явления, по мнению авторов, заключается в регуляции пластидами концентрации Сахаров в апопласте.

Можно полагать, что поставщиком АТФ в клетках в начальный период лаг-фазы служит гликолитический путь утилизации крахмала, количество которого уменьшалось к ее окончанию. Это подтверждается малой активностью митохондрий и соответствует сделанному нами ранее предположению, что в лаг-фазе роста каллусных клеток источником энергии является гликолиз (Иванова и др., 1989). В это же время, вероятно, активизируется и ПФП окисления глюкозы, поставляющей НАДФ Н на разнообразные биосинтетические процессы, в т.ч. на синтез липидов и нуклеиновых кислот.

В фазе экспоненциального роста каллусной культуры наблюдалось наибольшее развитие фотосин^отического аппарата в пластидах и крист в митохондриях. Митохондрии становились крупнее и в них увеличивалось количество крист.

В стационарной фазе роста культуры наблюдались признаки старения клеток: вакуолизация цитоплазмы, появление в ней и центральной вакуоли осмиофильных капель и миелиноподобных телец, накопление крахмала в пластидах и редукция тилакоидной системы.

Основываясь на данных Е.Л.Кордюм с сотрудниками (1980), мы пришли к заключению о сходных перестройках цитоплазматических органелл в процессе культивирования клеток растений разных видов.

ВЫВОДЫ

1. При введении в культуру гороха (Pisum sativum) получено три типа каллусов, резко отличающихся морфологически:

а) твердый медленнонарастающий каллус;

б) частичнодифференцированная, содержащая многочисленные меристемы культура, дающая множественную регенерацию побегов с высоким процентом их корнеобразования (63%);

в) рыхлый, быстронарастающий каллус.

2. Установлено, что потребление кислорода каллусными клетками в 8-10 раз ниже, чем у исходной ткани, из которой каллус получен. Это может быть связано с избытком Сахаров в среде выращивания каллуса и реализацией эффекта Крэбтри (подавление дыхания глюкозой). В атмосфере выращивания каллуса обнаружена высокая концентрация С02(до6%).

3. Установлена положительная корреляция между ростом, дыханием и активностью ионтранспортирующих систем каллусных клеток. Блокирование ионтранспортирующих систем ионами гадолиния и серебра сопровождается первоначально торможением роста, потребления кислорода и последующим включением адаптационных механизмов, способствующих восстановлению ростовых процессов.

4. Впервые установлено, что при переходе из одной фазы роста в другую в каллусных клетках происходит изменение в содержании структурных липидов:

а) повышение содержания фосфолипидов в экспоненциальной фазе роста и снижение его в стационарной фазе;

б) снижение степени насыщенности жирнокислотных остатков фосфолипидов, а также отношения стеринов к фосфолинидам в экспоненциальной фазе роста и увеличение этих показателей в стационарной фазе.

5. Дефицит ионов кальция в среде выращивания каллуса резко снижает пролиферативную активность клеток, синтез фосфолипидов и дыхание, что, вероятно, обусловлено сбоями в передаче кальциевых информационных сигналов.

6. Обнаружены характерные особенности ультраструктуры каллусных клеток гороха:

а) тесное прилегание плазмалеммы к клеточной стенке и отсутствие плазмодесм;

б) преобладание агранулярного ЭПР в виде коротких цистерн;

в) присутствие в цитоплазме свободных рибосом и полисом;

г) отсутствие пластоглобул в пластидах, содержащих крахмал и появление их с исчезновением крахмала;

д) появление кольцевых крист в митохондриях.

Список работ, опубликованных по материалам

диссертации:

1. Иванова А.Б. Индукция органогенеза в каллусных культурах различных сортов гороха, районированных в ТАССР. Деп.в ВИНИТИ 21.04.86. N 2888-В86. 5 с.

2. Иванова А.Б., Горшкова Т. А. Укоренение побегов гороха, полученных в культуре//Всесоюзная конф. молод. учен. Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов. Тез.докл., Уфа, 1987. С. 104.

3. Иванова А.Б., Киямова Р.Г., Горшкова Т.А. Различные типы каллусных культур гороха: цитогенетическая характеристика. Деп. в ВИНИТИ 14.07.87. N5055-B87. 16с.

4. Романова Т.Д., Иванова A.B., Лыгин A.B., Курбская О.Г., Рубан Н.Ф., Буртаева Т.Е. Особенности дыхательного метаболизма клеток каллуса гороха//Междунар. конф. Биология культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл. Новосибирск, 1988. С. 41.

5. Иванова А.Б., Романова Т.Д., Гордон Л.Х., Буртаева Т.Е., Лыгин A.B. Влияние ионов тяжелых металлов на рост и дыхательную активность каллусных тканей гороха. Деп. в ВИНИТИ 15.11.89. N 6898-В89. 19 с.

6. Лыгин A.B., Иванова А.Б., Буртаева Т.Е., Гордон Л.Х., Романова Т.Д. Дыхательный газообмен и содержание структурных липидов в процессе роста каллусных клеток // Регуляция ферментативной активности у растений. Горьк. гос. ун-т. Горький, 1990. С. 56-61.

7. Иванова А.Б., Романова Т.Д., Гордон Л.Х., Буртаева Т.Е., Лыгин A.B. Рост и дыхание каллусных клеток при торможении ионного транспорта//П Съезд Всес. о-ва физиологов раст., Минск, 24-29 сент., 1990: Тез. докл. 4.2. М., 1992.С.80.

8. Иванова А.Б., Лыгин A.B., Гордон Л.Х., Буртаева Т.Е., Курбская О.Г. Рост, дыхание и содержание структурных липидов в каллусных клетках при недостатке ионов icальция//Цитология. 1993. Т.35. Вып.1. С. 79-87.

9. Полыгалова О.О., Иванова А.Б., Гордон Л.Х. Динамика ультраструктурных изменений в клетках каллуса гороха ü процессе его роста//Ш Съезд Всес. о-ва физиологов раст. Санкт-Петербург, 24-29 июня, 1993: Тез.докл. Санкт-Петербург, 1993. С. 186.

10. Полыгалова О.О., Иванова А.Б., Бутакова И.В., Гордон Л.Х. Ультраструктурные изменения каллусных клеток гороха под влиянием ионов серебра//Междунар. конф. Биология культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл., Алма-Ата, 1993. С. 27.

11. Полыгалова О.О., Иванова А.Б., Гордон Л.Х., Бутакова И.В. Изменения ультраструктуры клеток длительно культивируемого каллуса гороха на протяжении пассажа//Цитология, 1994. Т.36. Вып.4. С. 354-414.

Сдано в набор 4.10.94. Подписано к печати 18.10.94. Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 120 экз. Заказ Б-87

Издательство «Заря-Тан» : 420111, г.Казань, ул.Ленина,9