Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование Са2+ - зависимого выхода калия и изменений объема в регидратированных эритроцитах человека

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование Са2+ - зависимого выхода калия и изменений объема в регидратированных эритроцитах человека"

Р Г Б ОА I 1 МАР 1996

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОПЇ ТА КРЮМЦДИЦИНИ

. На правах рукопису

Пересецька Наталія Михайлівна

Дослідження Саи-з:иію;аі()го транспорту калії» та змін об'єму в реіідратопашіх эритроцитах людини.

03.00.22 - кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертаці ї на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Харкіп * 1996 г.

Робота виконана в Інсппуті проблем кріобіології та кріомедицшш Національної Академії Наук України

Науковш" керівник чл.-кор. НАН України

А.М. Білоус

Офіційні опоненти доктор біологічних наук,

професор

Г.Ф.Жегуноз

кандидат біологічних наук СХ.Межідов

Керівна організація кафедра фізіології людини та

тварин Харківського Державного Університету

, Захист відбудешся *43 " бЬ-РЕЪНЭ 1996 р. в

годин на засіданні спеціальної ради Д 50.21.01 при Інсппугі проблей кріобіології та кріомедицшш Національної Ахадщаії Наук України .. ' “

(310086, м. Харків, вуя. Переяславська, 23).

З дисертацією ножна ознайомитися в бібліотеці Іисппуіу проблем кріобіології та кріомедицшш.

Автореферат розіслано /)№ / ®1~Р 1995 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради

доктор медичних наук . А.М. Гольцев

Загальна характеристика робот».

Актуальність ппоблеми. В наш час процеси дегідратації-регідратації використовують для моделювання поведінки еритроцитів під час заморожування-відтаювання [Pegg D.F., Diaper М.P., 1988]. Було показане, що еритроцити, які ке лізувалн під час дегідратації-регідратації, втрачають неідеальнісгь осмотичної відповіді, яка характерна для контрольних клітин [Руденко C.B., Панталер O.P., 1992]. Це свідчить, що

реп'дратовані клітини мають ряд прихованих дефектів, які не приводять до гемолізу на етапах дегідратації-регідратації.

Відомо, що під час заморожування-відтаювання у еритроцитах виникають порушення бар'єрної функції мембрани внаслідок зростання неоднорідності субмембранного ретікулуму, зміни в структурі комплексу цитоскелет-біслой [Білоус А.М., 1990 // Бондаренко В,А,, 1988]. З іншого боку, було встановлено, що порушення взаємодії гемоглобін-мембрана у патологічних серпоподібних еритроцитів людини корелює з інактіваціао каналів Гардоша [Joiner С.Н., 1993]. Також відомо, що

преінкубація клітин в гіпотонічному середовищі викликає зміни в регуляції Са2*-залежішх К+-каналів [Adorante J.S., 1986]. Таким чином, можно припустити, що дегідратація-регідратація також може привести до зміни функціональної активності К+-каналів, які беруть участь в регуляції об'єму клітин в ізотонічному середовищі. Отже, вивчення каналів Гардоша в регідратованнх клітинах мас сенс як для рог/мішш особливостей регуляції каналу, так і для висвітлення процесів, які визнаються під час дегідратації-регідратації.

В зв’язку з цим, метою роботи було вивчення особливостей функціювания каналів Гардоша в еритроцитах, регідратованнх в ізотошічних електролітних середовищах після дегідратації у гіпертонічних розчинах сахарози, КС1 в різних

З .

діапазонах температур та часу. . •

Згідно з поставленою метою, передбачали вирішення таких задач:

-ДОСЛІДИТИ БПЛ''В складу та осмолярносгі гіпертонічного середовища, тривалості та температурних умов дегідратації на об'ємний розподіл і виухріцшьохлітаншш склад рєгідратолаішх еритроцитів;

-вивчити особливості відновлення бар'єрної функції мембрани еритроцитів на різних етапах регідратації в залежності від тривалості осмотичного впливу і складу середовища дегідратації;

-дослідити процеси які виникають під час активації каналу Гардоша або зростання провідності для іонів калію, викликаної валіноміцином, у регідратованих еритроцитах.

Наукова новіша. В роботі показано, що під час регідратації ери роцитів з гіпертонічниг розчинів сахарози, рівень пісЗшіпертонічного гемолізу на різних етапах відновлення ізотонії визначається розміром пор, які утворюються під час регідратації, та здатністю клітин до їх репарації. Досліджено, що постійна концентрація іонів калію в регідратованих клітинах встановлюються під час переносу клітин з висококалієвого середовища регідратації до фенологічного розчину в зв'язку з різким зростанням прониклості мембрани для іонів натрію і калію. Показано, що спроможність регідратованих клітин до накопичення калію в процесі регідратаці'.', крім тривалості дегідратації та концентрації гіпотонічного середовища, залежить від температурних умов дегідратації: осмотичний вплив при 0°С запобігає акумуляції калік під час регідратації.

Виявлено, що в регідратованих еритроцитах в умовах високої селективної провідності для іонів калію активується

транспортний шлях для іонів натрію, який компенсує об'ємні зміни клітин та не блокується DIDS. Необхідною умовою для стимулювання Na+-n0T0Ky с дегідратація при 37°С як у розчинах неелектролітів, так і в розчинах солей.

Теоретичне та практичне значення роботи. Податній у роботі матеріал свідчить про активацію в регідратованих клітинах аномального транспортного шляху для іонів натрію, який приймає участь в регуляції об'єму клітин. Дослідження умов осмотичного впливу, який визначає рівень активації потоку натрію, дозволяє розширити уявлення про процеси, які проходять в еритроцитах під час дегідратації-регідратації. Розуміння мехаиизмів пошкодження клітин в процесі дегідратації-регідратації дає можливість обгрунтувати • нові підходи до розробки засобів низькотемпературної консервації еритроцитів.

Положення, які виносяться на захист:

!. Об'єм та внутрішньоклітинний склад регідратованих еритроцитів визначається осмолярніспо гіпертонічного середовища, тривалістю та температурними умовами дегідратації.

2. Дегідратація-регідратація еритроцитів не викликає порушення функцповамня Са2+-залежних К+-каналів в регідратованих клітинах, іцо свідчить про сгруїрурну цілісність каналів.

3. В регідратованих клітинах під час зростання селективної провідності для калію, яка стимулюється Саг* та А23187 або валіноміцином, активується ік.зий транспортний шлях для моновалентних катіонів, який частково або повністю компенсує вихідний потік іонів калію.

Матеріали робот» були представлені на 31 конференції товариства кріобіологів (Kyoto, Japan, 1994) та конференції молодих вчених Інстітуїу проблем кріобіології та

кріомедицини (Харків, 1994). По матеріалам дисертації , опубліковано 6 робіт. ’

Об'єм та структура роботи. Дисертаційна робота надрукована на '66 сторінках машинописного тексту та складається з вступу, огляду літератури, onjicy матеріалів та методів дослідження, глави, в якій викладені результати власних досліджень, обговорювання, висновків. Робота містить 41 малюнок та 1 таблицю. Список літератури містить 183 роботи.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.

Об'єктом досліждення були еритроцити 2 групи донорської крові людини.

. Дегідратацію еритроцитів проводили -в 0,5-1,2 М

розчинах сахарози, 1,0 М розчині КСІ при 37°С, 0°С або комбінуючи температурні режими. Для одужання регідратованих клітин ізотонію ьідновлювали поетапно: додавали 10-кратний об'єм ізотонічних NaCl, KCl або холін хлоріду та експонували 10 хвилин при 22°С. Осаджен. клітини ще раз вчдмивали в ізотонічних розчинах солей. Тіні, які утворюються в

процесі другої регідратації, (гіпертонічні тіні), відділяли від

. % ' • • ' регідратованих клітин.

Рожеві (гіпотонічні) тіні одержували при інкубації в 50

мМ розчині КСІ при 37°С з послідовніш відновленням ізотонії

150 мМ розчином КСІ.

Стимулювання каналів Гардоїш. здійснювали в

присугнісгі іонофору А23187 та СаС12. В цьому випадку

акумуляцію Саг+ оцінювали по зміні радіоактивності зразка в

присутність 45Са. •

Для активації селективної провідності для калію

клітини обробляли валіноміцином.

В роботі також використовували інгібітори аніонного транспорту DIDS (4,4'-діізотіоціаносгільбен-2,2'-ді сульфонат), Na+/K+-ATФази - уабаін, каналів Гардоша - хінін.

Залишкову кільхісгь іоноів калію визначали в гемолізаті калій-чутливим мембранним електродом або методом полум'яної фотометрії. Використовуючи дані про конц-лірацію клітин в зразку та їх середній відносний об'єм розраховували внутрішньоклітинну концентрацію іонів в иМ/л кл. Концентрацію іонів натрію вимірювали засобом полум'яної фотометрії.

Реєстрацію зміни мембранного потенціалу здійснювали методом Масеу [Масеу R.I., 1978] в присутність СССР (ш-хлорфенілгідразоп).

Для реєстрації дішамікі гемолізу еритроцитів

використовували установку вимірювання світлорозсіювання на 1,5° при довжині хвилі 720 ни.

Відносний об'єм еритроцитів вимірювали методом спектроскопії імпульсов опору [Akeson S.P., 1983].

Статистичну обробку експериментального матеріалу проводили за методікото Ст'юдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Вплзш дегідратаод-регідрятації ш визволення іоіііз калію та об'єм еритроцитів.

Відомо, що видалення кріопротекторів з суспензії

розморожених еритроцитів супроводжується розвитком

додаткового гемолізу клітин [Де Лекер В., Пенишкс Ф., 1989]. В зв'язку з цим. для одержання регідратоваїшх клітин "відновлення ізотонії здійснювали в 2 етапи, так що на І етапі регідратаип з середовищі залишалось до 110 мМ сахарози. Поступове

1.2М 1.2М+І50иМКС1

.Мал.1. Вплив складу середовища дегідратації на рівень післягіпертонічного лізису еритроцитів в процесі регідратації. Клітини інкубували в 1,2 М р^ччині сахарози або в 1,2 М розчині сахарози, який містить 150 мМ КС1, 3 або 15 хвіших при 37°С і регідратували при 22°С в 150 мМ розчині КСІ 10 хвилин (□). Після центрифуг тїаїшя осад клітин вдруге ресуспендували в ізотонічному розчині КСі (ЕЗ). S-сумарний гемоліз на обох етапах регідратації. *

к.» , '»Yb

( Концентрація, М

Мал.2. Залежність’утримання К+ (а) та відносного об’єму (б) регідратованих еритроцитів від концентрації сахарози в середовищі дегідратації. Клітини інкубували 15 хвилин при 37°С і регідратували в Ьотонічних розчинах МаСІ (О) або КСІ (□). Після регідратації еритроцити були відмиті в 100 об'ємах ізотонічного ршчину ЙаСІ; Д- утримання К* в еритроцитах після інкубації в розчинах сахарози без регідратації.

відновлення Ізотонії опісля осмотичного впливу веде до двохетапного розвитку післягіпертонічного гемолізу (Мал.І). Наявність в середовищі дегідратації 150 мМ КСІ припшчує гемоліз на І етапі регідратації. Проте сумарний рівень післягіпертонічного гемолізу залежить від тривалості дегідратації.

Відомо, що дегідратація в розчииах цеелектролітів, які містять додатково солі, викликає менш значні перебудові клітинних структур в порівнянні зрозчинами цеелектролітів [Sitaramam V., 1988]. Можливо припустити, що присутність на І етапі регідратації1 ПО мМ сахарози запобігає гемолізу еритроцитів в залежності від рівня пошкодження клітин під час дегідратації. Еритроцити, які формуються б процесі двохетапної регідратації, характеризуються унімодаііьшім об'ємним розподілом та здатні до підіримування внутрішньоклітинного складу і середнього відносного об'єму тривалий час.

Існує дві області концентрації гіпертонічного середовища, дегідратація при 37°С в межах яких веде- до формування клітин з різним об’ємом (Мал.2б). При регідратації з 0,5-0,8 М розчинів сахарози утворюються клітини з об'ємом, меншим в,ід ізотонічного. При регідратації з 0,9-1,2 М розчинів сахарози формуються еритроцит з . об'ємом більшім від ізотонічного. ' Зростання тривалості дегідратації викликає зростання об'єму регідратованих клітин. Таким чином, осмолярність гіпертонічного сер дозища та тривалість інкубації спільно визначають об’єм регідратованих клітин.

Збільшення прониклосгі мембрани еритроцитів на етапі регідратації [Woolgar А.Е., Morris G.J., 1973] дозволяє варіювати внутрішньоклітинний склад еритроцитів, регулюючи склад середовища регідратації. Регідратація в ізотонічному розчині ІСС1

сспрняє накопиченню іонів калію в порівнянні з їх утриманням в дегідратованнх еритроцитах. Але регідратація в 150 мМ розчині N30! супроводжується додатковою втратою іонів калію (Мал.2а). В тому випадку, коли о мотичний вплив здійснюється при 0°С, здатність клітин до акумуляції калію в процесі регідратації залежить від тривалості дегідратації. Дегідратація більше чим 180 хвилин викликає формування клітин, нездатних до захоплення калію під час регідратації. Отже, температурні умови дегідратації спільно з осмолярніспо та складом гіпертонічного середовища визначають об'єм та внутрішньоклітинний склад регідратовиних еритроцитів.

V/Vo і.б 1А

1.2 і

0.S 0.6 -j 0.4

0.2 0

KNaCb KNaCh KNaCh KNaCh Мал.З. Відносний об'єм контрольних та регідратованнх клітин, гіпотонічних та гіпертонічних тіней при експозиції в ізотонічних розчинах KCl, NaCl та ChCl. Регідратовані клітини були одерзкані в процесі 15 хвилин дегідратації при 37°С у 1,2 М розчині сахарози, який містить 150 мМ КС1, та двох послідовних регідратацій в 15G. мМ розчині КС1. Гіпертонічні та гіпотонічні тіні були одержані як описано в матеріалах та методах дослідження. Зміна відносного об'єму оцінювалась відносно об'єму контрольних еритроцитів у відповідному середовищі.

Дегідратація в розчині сахарози, який містить 150 мМ КС1, та регідратація в ізотонічному розчині КС1 повинні

запобігати втраті калію клітинам». Але кінцеве утримання калію в еритроцитах менше, від контрольного.'Це вказує на можливість віггоку калію в процесі перенесення з 150 мМ розчину КСІ до фізіологічного середовища, що повинно супроводжуваться зменшенням об'єму. Встановле.іо (Мая.З), що регідратовані клітини і, в значно більшому рівні, гіпертонічні тіні стискуються в розчинах КаСІ та С!\СІ, що відповідає частковій (у випадку клітин) або повній (у випадку гіпертонічних тіней) втраті калію. Ймовірно, тіні містять пору, яка не репарується в процесі регідратації і має катіонну селектівнісгь в ряду К+>Ма+>холін.

Транспорт іонів калію та зміна об'єму рсгідратовашк клітин при сттіулюваїпгі кагалів Гардоша.

Активація каналів Гардоша в • контрольних та регідратоваїшх еритроцитах в присутність Са3+ та іонофора А23І87 викликає втрату внутрішньоклітинного калію (Мал.4). У випадку контрольних хлітин втрата калію супроводжується відповідним зменшуванням' об’єму. В цих умовах зміни об’єму регідратоваїшх клітин зменшуються з зростанням тонічності середовища дегідратації. Сиостерігаємий ефект неможливо пояснити порушенням бар'єрної функції мембрани еритроцитів або пошкодженням каналу Гардоша по наступним причинам. По-перше, регідратовані клітини здатні до підтримання стабільного об’єму та внутрішньоклітинного утримання калію тривалий час. По-друге, в відсутність А23187 мембрана клітин не проникла для іонів Са2+. По-третє, в присутності А23187 як контрольні, так і регідратовані клітини акумулюють 45Са. Четверте, Са2+-залеяшин вихід калію з регідратоваїшх клітин бтокуєгься специфічним інгібітором каналів Гардоша -хініном- в тій же концентрації, що й в натішішх клітинах.

Хоча утримання внутрішньоклітинного калію в

к.%

о)

Y/Vo

б)

100

IO D А ^-О-О-СЬО-О

so

60

40

20

0

0.8

0 6 12 .18 24 30

Час, хвші.

0 6 12 18 24 30

Час, хвші.

• Мал.4. Динаміка виходу іонів К+(а) та зміна відносного об'єму (б) при стимуляції каналів Гардоша в еритроцитах, дегідратованих в розчинах сахарози та регід; ітованих в 150 мМ розчині КС1. Регідратовані клітини бухпі відмиті в ізотонічному розчині NaCl і перенесені до середовища, яке містіть 0,15 мМ СаС12 і 5 мкМ А23І87. Зміна з дносного об’єму розрахована відносно об'єму контрольних та регідративаяях клітин, відповідно, в 150 мМ розчині NaCl; О -контроль;0-0,5 М, Д -0,8 М, 0 -1,2 М.

регідратованих днпроцитах є достатній для стимуляції К*-каналів [Simons TJ.B., 1976], необхідно оц.нити ефективність , об'ємної відповіді клітин з обліком вихідного утримання калію. Селективна - втрата клітиною іонів калію повинна супроводжуватися відповідним зменшенням об'єму [Lew V.L., Bookchin R.M., 1986]. Спрощена модель, яка описує тільки стаціонарний стан та враховує- осмотичний баланс

внутрішньоклітинного та зовнишньоклітанного середовищ, веде

. * ■ ■

до виразу

де, V,V0 - поточний та вихідний об'єм клітини в умовах ізотонії;

іисі п% - поточна та вихідна кількість іонів калію в клітині в молях; с£ - коїщеігграція іонів калію, яка віднесена до усього об'єму клітині; и.* - коефіцієнт, який емпірічно описує вклад осмотично неактивних речовин.; я£„,-осмоляршсть зовнішнього середовища.

Для перевірки справедливості виразу були проведені контрольні експерименти, в яких виснаження клітин по калію досягалось обробкою Са2+ та А23І87, валіноміцином, ііжубацією в ізотонічному розчині сахарози. В усіх випадках відносний об'єм еритроцитів є лінейною функцією процентного утримання в них іонів калію. Експериментально одержане значення їй для контрольних клітин !ік=0,36.

Оцінка ступеню стискання регідратованих клітин при активації каналів Гардоша, враховуючи вихідну концегарацію калію, показала, що розраховане зменшення об'єму значно більше експериментальних даних. Це може бути пов'язано з тим, що значення й* для регідратованих кліггіш є меншим, в порівнянні з контрольним, тобто з зростанням частки осмотично неактивної води в регідратованих клітинах. Ллє в ряду гіпертонічних розчинів ШСІ 0,'4-0,3 М регідратовапі клітини стискуються більш, ніж контрольні, та по сззоєї поведінці наближаються до тіней, які являються ідеальними осмометрами [НенЬїкІї Р„ 1985]. Це свідчить, що значення Я* для регідратованих клітин, як мінімум, не зменшилось. Таким чином, невідповідність об'ємних змін регідратованих клітин при активації каналу Гардоша негожливо пояснити зменшенням вихідної концентрації калію.

В процесі осмотичного впливу у гіпертонічних розчинах сахарози дегідратація клітин поєднується з значною втратою калію. Для пояснення, який з цих факторів с найбільш значним

хвил хвил хвил хвил

Мал.5. Зміна утримання К (□) та відносного об'єму (0) контрольних та регідратованих клітин при стімуляції каналів Гардоша 4 або 15 хвилин при 37°С. Клітини були дегідратовані в 1 М розчині КС! 15 хвилин при 37°С та регідратовані в 150 мМ розчині КС1. Утримання К та об'єм еритроцитів був розрахований відносно відповідних значень для контрольних клітин.

для формування специфічної об'ємної відповіді клітин при Са1*-гілежним виходу калію, селективна калієва провідносгь була стимульована в клітинах, дегідратованих в 1 М розчині" КС1 та регідратованих в 150 мМ розчині КС1. Запропоновані умови дегідратації -регідратації запобігають втраті калію під час гіперосмотачної інкубації та регідратації та ведуть до формування регідратованих клітин з об'ємом, близький до ізотонічного (Мал.5). Але об'ємна відповідь цих клітин прц активації каналів Гардоша є значно меншей, ніж в контрольних еритроцитах. Це свідчить, що формування специфічного "недостискання” регідратованих клітин при селективної втраті калію є наслідком зменшення об'єму клітин під час дегідратації.

Зниження стискання регідратованих клітин встановлено

також при стимуляції втрати калію валіноміцш'ом. Можливо припустити, що збільшення селективної калієвої провідності в регідратованих еритроцитах.веде до активації потоку іонів, який частково або повністю компенсує об'ємні зміни клітин.

Вплів валіномщшіу, БГОБ, СССР на концентрацію іонів N3* в еритроцитах.

Иа, К, мМУлК0!ІТ1,0ІІЬ 100 тЛ Д 80

60

40

20

0

І І

Регідратовані клітини х. х. ай

УЛ'о

коятр Уаі ССС? ОШЗ+ СССР 4 -»-Уаі Уіі +СЮ5

*8** '

Уіі коитр Уаі СССР ОГО"* СССР Уаі

і +7з1 Чаї 15

х9кх хімі ~^а1 хай«

Мал.6. Зміна в концентраціїЮ (□), 'Ла+ (В) і відносного об'єму (0) в контрольних' та регідратованих з 1,2 М розчину сахарози еритроцитах в Присутності 1 мкМ валіноміцину (Уаі), 20 мкМ СССР 20 мкМ БЮ§. Клітини інкубували 4 або 15 хвилин при 37°С. Значення відносного об'єму розрахована відносно ■ початкового об'єму контрольних та регідратованих клітин в 150 мМ оозчині ИаСІ. ' .

В присутності валіноміцину в контрольних клітинах виникає втрата калію при збереженні концентрації Иач на постійному рівні (Мад,б). В .регідратовашіх з 1,2 М розчину сахарози кліпшах стимульований валіноміціном вихід калію супроводжується накопиченням іонів на фоні постГ.ності об'єму клітини. Стискання регідратованих клітин в присутності валіномшіну визначено тільки в наявність' СССР і в такому випадку акумуляція іонів Из+ не спостерігається. Можливо

припустити, що компенсація оЄ'гмшисзмін регідратованих клітин пов'язана з активацією вхідного потоку Na+. В контрольних еритроцитах DIDS запобігає стимульованому валіноміцином виходу калію. В регідратованих клітинах вплив DIDS виявляється в тому, що в його присутності протонофор СССР не перешкоджає акумуляції Na\ стимульованої! селективною калієвою провідноспо. Механізм дії СССР в даному випадку не відомий. Алетак як вихід калію з клітин.повинен бути обмежений відповідними потоками аніонів, то прискорення вихіду калію в присутності СССР свідчить про протилежність дії DIDS та СССР на транспорт іонів калію через мембрану.

Показано, що як в контрольних, так і в регідратованих еритроцитах в присутності D1DS та валіноміцнну виникає додаткове збільшення амплітуди гіперполярізації мембрани. Це свідчить про ефективність DIDS як інгібітору транспорту аніонів [Орлов С.Н., 1992]. Отже, в цьому випадку вихід калію з регідратованих клітин є можливим тільки при умові активації протиспрямованого потоку катіонів. Швидкість акумуляції натрію в відсутності СССР - 120 мМ/(л кл. год), при наявності DIDS та СССР - 450 мМ/(л кл. год). Ці зна"ення Пфебільшують' дані про швидкість потоків іонів, які забеспечуються Na+-K+-2C1--котранспортом, Кч-С1--котранспортом,г Ыа+/Н4-обмшом [Bernhardt Т.І., 1988// Joiner С!Н., 1993]. Це дозволяє виключити участь перерахованих систем в компенсуванні змін в об'єму .регідратованих клітин при стимулюванні селективної калієвої провідності.

Na’-поток, виявлений в .регідратованих еритроцитах, неідентичний потоку іонів, пов'язаному з формуванням фракції пролішшнх еріпрошітів (пошкоджені клітини, які лізують лри подшшіені концентрації Са1* в середовищі інкубації) [Crespo

L.M., 1987], гак як, по-перше, вхід Na* відзначений тільки при стимулюванні К+-провід юсгі; по-друге, об'ємний розподіл регідратованих клітин є унімодальним і стискання клітин супроводжується односпрямованою зміною об’єму на відміну від пролітичних клітин.

Висока проникливість На+-шляху в більшій мірі характерна для каналів, чим для транспортерів [Mannuzzu L.M., 1993], хоча неможливо виключити й обмінний механізм.

Вплив умов дегідратації га зміну об'єму регідратованих клітин в присутності валіноміщпіу або Са1+ та А23187.

Відомо, що температурні умови, при яких здійснюється дегідратація, мають вплив на рівень післягіпертонічного гемс *ізу [Білоус Л.М., 1990], на об'єм регідратованих клітин. В зв'язку з ції1.', можливо припустити, що умови дегідратації можуть виплинути на здатність регідратованих клітин компенсувати зміни об'єму при стимуляції втрати калію. На иал./ показано, що для еритроцитів, підданих охолодженню в процесі дегідратації, здатність до стискання при активації каналів Гардоша також залежить віх:, тонічності середовища дегідратації.

Проте, охолодження в. гіпертонічному середовищі, викликає зниження концентрації розчину сахарози, -тривалості дегідратації, необхідних для формування клітин, які зовсім he змінюють об’єм прн активації К+-каналів,. з 1,2 М сахарози (дегідратація при 37°Q до 0,8 М (холодовий шок у гіпертонічному розчині). З іншого боку, мн встановили, їло клітішн, які дегідратуються при 0°С, в процесі стимуляції селективної калієвої провідності стискуються відповідно вихідній концентрації калію. Таким чином, осмотичний вплив при 37°С с необхідною умовою для формування спрямованого у клітину потоку Na+ в регідратованих еритроцитах в присутності Саг+ та .

— «видав.,.і—еиі

0.5М 0.8М ' ЇМ 1.2 М

Мал.7. Експериментально та теоретично розрахована зміна відносного об’єму еритроцитів, підданих холодовому шоку в

• процесі дегідратації, при стимуляції каналів Гардоша. Еритроцити експонували в гіпертонічних розчинах сахарози за наступною програмою: а) 1 хвил. 37°С та 14 хвил. 0°С; 6) 3 хвил. 37°С та 12 хвил. 0°С; в) 10 хвил. 37°С та 5 хвил. 0°С. Після цього клітини регідратували два рази в 150 мМ розчині КС1. Канали Гардоша були стимульовані 0,15 мМ СаС12 та 5 мкМ А23187 О-утримапня К* в регідратованих клітинах відносно контролю; И-експернментальне значення V/Vc; S-V/V0, . яке теоретично розрхчовано за виразом (1).

А23187 або валіноміцину.

Формування таких регідратованих клітин здійснюється під час преінкубації в тій же області концентрацій гшеросмотичннх розчинів, де клітини досягають критичного мінімального об'єму. З іншого боку, гіпертонічна експозиція яри 37'\С, але не при 0°С, викликає "сгіекання" цитосхедету та цнтогеяю, що веде до збільшення неоднорідності субмембранного ретікулуму [Бондаренко В.А., ¡988]. Ймовірно,-осмотичний вплив , який супроводжується "об'єі'чою“ та / або "структурною" дегідратацією, може викликати порушення старих та формування нових білох-ліпідпих та ^ічок-білкових взаємодій, що може сприяти виникненню аномального К‘а+-шляху в регідратованих ер’ троцитах.

ВИСНОВКИ.

1. Дегідратація при 37С’С у 0,5-0,8 М розчинах сахаро лі веде до формування регідратованих клітин з об'ємом меншим від ізотонічного . Інкубація в 0,9-1,1 М розчинах сахарози викликає набухання регідратованих клітин. -Якщо осмотичний вплив здійснювала. при 0°С, то регідратовані еріпроцити стабілізуються на об'ємі меншому, від ізотонічного. •

2. Показано, що регідратація еритроцитів в ізотонічному розчині

КС1 сприяє зростанню уіримаїшя калію в клітинах з порівнянні з дегідратованим станом,‘якщо осмотичний вплив здійсгшовався при 37°С. Дегідратація при 0°С більше трьох годин ггк< охолодження в гіпертонічному середовищі з 37°С до £Г’С викликає зниження або повну відсутність акумуляції калію уігд час регідратації в КС1. .

3. Досліджено, що тіні, які формуються в процесі регідратації, мають довгоіснуючи дефекти з відносною проникливістю для ноновалентнпх катіонів в ряду К+>Иа+>холін. Розміри т.ор

можливо порівняти по порядку з розмірами дефектів, утворених полієновіш антибіотиком амфотеріцином Б.

4. Встановлено, що дегідратація-регідратація не викликає порушення ' функціонування Са2+-залежннх К+-каналів в регідратованих еритроцитах шодини, що свідчить про структурну цілістність каналів. -

5. Продемонстровано, що в регідратованих клітинах в умовах стимуляції селективної калієвої провідності при допомозі валіноміцину або Саг* та А23І87 активується новий транспортний шлях для моновалентних катіонів, який частково або повністю компенсує потік калію, спрямований до позаклітинного середовища. Потік іонів, який здійснюється цим транспортним механізмом, не блокується DIDS та по порядку швидкісгі ноже бути порівняний з потоком іонів через канал Гардоша.

6. Встановлено, що необхідною умовою для формування в регідратованих клітинах нового транспортного потоку с дегідратація при 37°С. Максимальна активація транспортного шляху для іонів Na* спостерігається в клітинах, регідратованих з

1,2 М розчину сахарози. Якщо еритроцити піддають охолодженню в гіпертонічному розчині з З'/’С до 0°С, то повна

компенсація об'ємних змін клітин завдяки активації нового

і.

потоку іонів спостерігається в клітинах, регідратованих з 0,8 М розчину сахарози.

' Список побК. опублікованим* по темі дисертації.

І. Белоус A.M., Землянских Н.Г., Пересецкая Н.М. Влияние Саг* на. сгруктурпо-функциональное состояние белков цитоскелета, регулирующих ответ клеток на температурно-осмотическое воздействие // Сб. Фундаментальные и прикладные проблемы криобиологии, Харьков.- 1993.- С. 17-24.

2. Пересецгая Н.М. Особенности изменения объема и Саг+-

шщуцировапного выхода калия в . интактных и репщратированных эритроцитах // Проблемы криобиологии.-1994.-№2.-С. 54-55. .

3.Rudenko S.V., Peresetskaya N.M. Influence of rehydration on CaH-acu vated К transport and volume of human erythrocytes II Ciyo-Letteis -1994,-15.-P. 367-376

4. Rudenko S.V.,Peresetskaya N.M. Anomalous cation transport under stimulation of Ca2+- dependent K+-channel in rehydrated erythrocytes //Biochemistry (Moscow).-¡995.-60, N7.-P. 871-876.

5. Rudenko S.V., Peresetskaya N.M. Specific transport pathway for monovalent cations in membrane of rehydrated human erythrocytes //31th A: nual Meeting of Society for Cryobiology.- Japan, Kyoto, 1993.-P. 230.

6. Peresetskaya N.M., Belous A.M., Rudenko S.V. EPsct of red blood cel! dehydration on the CaJ+-induced alteration in the volume and release of K+// 31th Annual Meeting of Society for Cryobiology. -Japan, Kyoto, 1994.- P. 233.

Пересецкая Н.М. “Исследование Саг+-зависимого . выхода калия и изменений объема в репщратированных эритроцитах человека”. Рукопись. Диссертация ка. соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности

03.00.22,- криобиология. Институт проблей криобиолопш и крномеднцнны Национальной Академии Наук Украш.ы, Харьков, 1996.

Показано существование различных классов пор в мембране эритроцитов в результате посггнп^ттоннческого гемолиза. Исследовано влияние условий дегидратации-

регидратации на внутриклеточный состав и объем регидратированных клеток. Установлено, что дегидратация-регидратация не приводит к повреждению каналов Гардоша в эритроцитах- человека. Однако, хотя активация селективной калиевой -проводимости в результате стимуляции каналов Гардоша или в присутствии валиномнцина в клепках, регидратированных из гипертонических растворов сахарозы с тоничносгью свыше 0,8 М, вызывает утечку калия, но, в отличии от нативных клеток, не сопровождается соответствую’цим уменьшением объема клеток. Анализ несоответствия между выходом калия и изменением объема предполагает возможность активации в регидратированных эритроцитах нового транспортного пути для моновалентных катионов, что сопровождается частичной или полной компенсацией изменении объема. Стимуляция нового транспортного потока в регидратированных клетках, возможно, связана с уменьшением объема клеток в процессе дегидратации при 37°С.

Peresetskaya N.M. "Investigation of Ca2+-depcndent potassium loss and volume changes in rehydrated human erythrocytes". Thesis for getting a Candidate of Biology Degree with the speciality in cryobiology 03.00.22., Institute for Problem of Cryobiology and Cryomedicine.of the National Academy of Science of the Ukraine, Kharkov, 1996.

Ex’stenoe of a different classes of pores formed in erythrocyte membranes as a result of posthypertonic hemolysis has been showed. Influence of conditions, of dehydration-rehydration on intracellular composition and volume of rehydrated cells has been investigated. It was stated that dehydration-rehydration do not lead to damage of CaJ»-dependent K*-channel in human eiythrocytes.

However activation of selective K^-conductivity by stimulation of Gardos channel or incubation with valinomicyn in cells rehydrated from hypertonic sucrose solution with tonicity more than 0,8 M causes K> loss, but, in contrast with native cells, this is not ^accompanied by a corresponding decrease in cell volume. Analysis of the discrepancy betw een K+ release and volume changes suggests that a new transport mechanism for monovalent cations (which is inactive in normal cells) may be activated in rehydrated cells, which results in partial or complete compensation of volume changes» .It is suggested that stimulation of the new transport pathway in rehydrated cells is connected with decrease of cell volume dur'ng dehydration at 37°C.

. . Ключові слова : Ca2t-залежний транспорт калію, іс ний транспорт, еритроцити, дегідратація, регідратація.