Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли онко-микроРНК в регуляции прогрессии и метастазирования опухолевых клеток меланомы in vivo

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли онко-микроРНК в регуляции прогрессии и метастазирования опухолевых клеток меланомы in vivo"

На правах рукописи

ШВЕЦОВА Юлия Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ОНКО-МИКРОРНК В РЕГУЛЯЦИИ ПРОГРЕССИИ И МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МЕЛА НОМЫ IN VIVO

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14 ОКТ 2015

Новосибирск — 2015

005563298

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Рукша Татьяна Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России,

кафедра патологической анатомии Агеева Татьяна Августовна

доктор медицинских наук, профессор руководитель лаб. метаболизма лекарств и фармакокинетики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и

биофизики» Вавилин Валентин Андреевич

Ведущая организация: ФГБНУ «Томский научно-исследовательский институт онкологии» (г. Томск)

Защита диссертации состоится «17» ноября 2015 г. на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при ФГБНУ «Научно-исследовательском институте экспериментальной и клинической медицины» по адресу: ул. Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117 Тел/факс 8 (383) 333-64-56

http://centercem.ru/nauchnaya_deyatebost/dissertacionnyj_sovet/ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭКМ.

Автореферат диссертации разослан «30у>

2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Д.6.Н.

Пальчикова Н. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Меланома кожи занимает лидирующее положение среди новообразований с непрогнозируемым течением, высоким уровнем смертности и низкой эффективностью терапии диссеминированных форм. За последний период времени частота меланомы кожи в нашей стране, как и во всем мире, значительно возросла (Новик A.B., 2011). В ряде стран наблюдается стабилизация уровня смертности от меланомы кожи, однако в РФ этот показатель сохраняет тенденцию к росту (Петрова Г.В. и др., 2014).

Меланома кожи (МК) - это опухоль нейроэктодермалыюго происхождения, возникающая в результате злокачественной трансформации меланоцитов кожи (Демидов JI. В., 2013). Несмотря на то, что меланома относится к числу визуально диагностируемых опухолей, количество случаев позднего обращения за медицинской помощью остаётся по-прежнему высоким. По гистогенезу, биологическим особенностям возникновения и роста, тяжести клинического течения опухолевого процесса меланома существенно отличается от новообразований другого генеза (Гилязутдинов И.А. и др., 2010). В связи с этим в последние годы неуклонно растёт интерес исследователей к изучению данного заболевания. Возросшая в настоящее время частота заболеваемости меланомой кожи в высокоразвитых странах объясняется не только учащением заболеваемости, но и улучшением диагностики, обусловленной высокой настороженностью людей к начальным проявлениям меланомы и возросшими знаниями предопухолевой патологии кожи у врачей. Ранняя диагностика и своевременное удаление первичной меланомы кожи являются основными составляющими успешной борьбы за излечение больного. Подавляющее большинство больных меланомой кожи -это взрослые люди, в основном трудоспособного возраста, что делает эту проблему социально значимой (Garbe С. et al., 2011). Более чем у половины больных меланома кожи развивается на фоне приобретенных или, реже, врожденных невусов (Menzies S.W., 2011). Для этой злокачественной опухоли, независимо от степени местной распространенности, характерно частое развитие отдаленных метастазов (Каплан М.А. и др., 2011).

В последние годы стало очевидным, что эпигенетические регуляторные механизмы играют ключевую роль в прогрессии опухолей и особая роль принадлежит некодирующим РНК. Необходим поиск молекулярных путей возникновения, развития и метастазирования меланомы кожи с целью дальнейшего возможного применения в диагностике и терапевтическом воздействии, что является крайне актуальным.

Степень разработанности темы исследования. Весьма значительным событием в биологии конца XX века стало открытие принципиально нового

класса малых молекул РНК (микроРНК), которые регулируют экспрессию генов (Никитин Е.Г. и др., 2014). Результатом данного открытия является возможность разъяснения молекулярных механизмов возникновения и развития меланомы кожи благодаря дальнейшему изучению и оценки регуляторов экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, каковыми являются микроРНК, представляющие собой класс малых некодирующих РНК длиной 18-25 пар нуклеотидов, которые взаимодействуют по комплиментарному принципу с 3 '-нетранслируемыми областями мРНК-мишени. Это взаимодействие инициирует деградацию мРНК или препятствует её трансляции (Cullen B.R., 2009, Lewis В.Р. et al., 2003). В ходе биогенеза микроРНК претерпевают ряд изменений - от молекулы при-микроРНК длиной 1000 нуклеотидов к конечной форме зрелой микроРНК (около 25 нуклеотидов). Делеции в генах микроРНК, а также сбой механизма их созревания могут являться важным звеном процесса трансформации клетки (Kumar M.S., 2007). Благодаря небольшому размеру каждая микроРНК, как правило может взаимодействовать с несколькими мРНК-мишенями - именно с теми, в которых имеются комплиментарные участки. В настоящее время известно, что микроРНК регулируют более 30% генов человека, включая гены, участвующие в развитии, клеточной дифференцировке, гемопоэзе, устойчивости к стрессу, метаболизме, клеточной пролиферации и апоптозе. (Esquella-Kersher A. et al., 2006.) Учитывая спектр генов, регулируемых микроРНК, очевидно, что нарушения в их функционировании могут существенно влиять на все стадии опухолевого процесса — от возникновения опухоли до метастазирования (Câlin G. et al., 2006; Anand S. et al., 2011; Esteller M., 2008; He L. et al., 2004.; Ryan В.M. et al., 2011 ; Ventura A. et al., 2009).

Каждая опухоль имеет специфический набор активируемых микроРНК, но среди них можно выделить несколько микроРНК, которые наиболее часто встречаются в определенных опухолях (Câlin G. et al., 2006). Перспективным для практического использования является оценка уровней экспрессии отдельных микроРНК, благодаря их тканеспецифичности, что делает возможным использование данных молекул в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний.

Цель работы - исследовать особенности экспрессии онко-микроРНК при доброкачественных и злокачественных меланоцитарных новообразованиях in vivo и вероятную роль микроРНК в регуляции прогрессии меланомы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выявить особенности экспрессии онко-микроРНК (miR-21, miR-155, miR-200c, miR-205, miR-let-7b, miR-146a, miR-150, miR-196a, miR-218) в клетках меланомы и в доброкачественных меланоцитарных новообразованиях;

2. Определить связь относительных уровней экспрессии микроРНК (miR-21, miR- 155, miR-200c, miR-205, miR-let-7b, miR-146a, miR-150, miR-196a, miR-218) с патоморфологическими характеристиками новообразований;

3. Выявить особенности экспрессии онко-микроРНК (miR-21, miR-155, miR-200c, miR-205, miR-let-7b) в клетках первичной меланомы in vivo в преметастатическую и метастатическую фазы прогрессии опухоли;

4. Оценить особенности экспрессии онко-микроРНК (miR-21,miR-155, miR-200c, miR-205, m¡R-let-7b) в органах-мишенях для метастазов меланомы (легких, печени) in vivo на экспериментальной модели меланомы кожи В16 в преметастатическую и метастатическую фазы развития опухоли.

Научная новизна. Впервые исследованы относительные уровни экспрессии микроРНК (miR-21, miR-155, miR-200c, miR-205, miR-let-7b, miR-146a, miR-150, miR-196a, miR-218) у пациентов с меланоцитарными новообразованиями в Красноярском крае.

Впервые выявлено in vivo, что в преметастатическую и метастатическую фазы развития меланомы относительные уровни экспрессии miR-21, miR-155, miR-205, miR-let-7b остаются неизменными в первичном опухолевом узле на экспериментальной модели меланомы В16.

Впервые показано, что в преметастатическую фазу развития меланомы в органах-мишенях для метастазов меланомы наблюдается повышение относительных уровней экспрессии miR-21, miR-205 и miR-let-7b, а в метастатичесую фазу определяется увеличение относительного уровня экспрессии miR-155 в легких, что свидетельствует о роли опухолевого микроокружения в развитии опухолевого процесса.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные экспериментальные данные раскрывают механизм канцерогенеза и вносят вклад в понимание и управление процессом метастазирования в клетках меланомы.

МикроРНК принимает активное участие в формировании микроокружения и условий возникновения метастазов в отдаленных органах-мишенях, подготавливая заранее микросреду и активируя сигнальные пути для миграции метастазов первичной опухоли в «преметаститические ниши». Тем самым микроокружение опухоли может являться объектом для модуляции с целью достижения противоопухолевого эффекта.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Относительные уровни экспрессии miR-205, miR-196а и miR-218 у человека снижены в клетках меланомы в сравнении с меланоцитарными невусамн, что говорит об онкосупрессорной роли данных микроРНК. При локализации в области головы и шеи уровень miR-218 ниже, чем при локализации этой опухоли на нижних конечностях, что указывает на различные механизмы развития опухоли в зависимости от анатомического

расположения новообразования, а уровень miR-let-7b отмечается выше у лиц мужского пола, что может быть связано с характером гормональной регуляции miR-let-7b.

2. В динамике развития опухоли на экспериментальной модели in vivo уровни miR-21, miR-155, miR-205 и miR-let-7b сохраняются без изменений в первичном узле на 17 и 28 сутки после трансплантации клеток меланомы В16, что свидетельствует об отсутствии влияния данных микроРНК на прогрессию опухоли. В органах-мишенях метастазирования меланомы (легкие, печень) регистрируется повышение уровней онко-микроРНК miR-21, miR-205, miR-let-7b в преметастатическую фазу развития опухоли, а также miR-155 в легких в метастатическую фазу развития меланомы, что является свидетельством реорганизации опухолевого микроокружения в органах-мишенях для дальнейшего формирования дистантных метастазов меланомы.

Внедрение результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в учебный процесс кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии имени проф. В.В.Иванова ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава РФ».

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Научно-практические аспекты современной онкологии» (Красноярск, 2013), на Всероссийской научной школе - конференции для молодых ученых по онкологии «Современная онкология: достижения и перспективы» (Новосибирск, 2013). На заседании проблемной комиссии ГБОУ ВПО КрасГМУ Минздрава РФ (протокол заседания № 2 от 06.05.2015).

Работа поддержана грантом фонда М. Прохорова, конкурс «Академическая мобильность, 2014» на средства которого была осуществлена научная стажировка в демонстрационной лаборатории компании «Агенство Химэксперт» представляющей компанию Life Technologies (США), по теме: «Введение в ПЦР в реальном времени. Теоретические основы. Анализ экспрессии генов» (Москва, 2014). Исследование поддержано грантом фонда Президента РФ (Р.Т.Г. МД-901.2013.7), Российским фондом фундаментальных исследований (Р.Т.Г. 1304-01381), грантом Российского научного фонда (14-15-00074) и победой в конкурсе «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК-2013») фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе патент на изобретение и 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, содержащих результаты диссертационного исследования.

Структура п объем диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 23 рисунка, 9 таблиц. Библиографический список содержит 183 источника, из которых 30 отечественных и 153 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на кафедре патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии им. проф. В.В Иванова Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно — Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации в период с 2012 по 2015 годы. Утверждено биоэтической комиссией по работе с животными при локальном этическом комитете КрасГМУ (№15 от 12 ноября 2012 года) и локальным этическим комитетом КрасГМУ (№ 44/2012 от 15 ноября 2012 года).

Для оценки изменения относительного уровня экспрессии микроРНК в процессе развития опухолевой ткани объектами исследования являлись лабораторные мыши линии С57В1/6, женского пола в возрасте 8-10 недель, массой от 19 до 26 г в количестве 30 животных. 20 животным была привита меланома клеточной линии В16, а 10 мышей составляли контрольную группу.

Культура клеток меланомы В16 была получена в ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клшшческой иммунологии» г. Новосибирск.

Для изучения уровня экспрессии микроРНК в тканях меланомы и меланоцитарных невусах человека были использованы образцы меланоцитарных новообразований, фиксированные в формалине и заключенные в парафиновые блоки. Биопсийный материал был получен из ГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер им. проф. Крыжановского» и ГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро».

Анализ образцов мелапоцптарных новообразований

В исследовании использовали 97 образцов, из которых 77 являлись образцами первичной меланомы и 20 — меланоцитарными невусами, взятых от различных пациентов. Средний возраст пациентов с меланомой кожи составил 59 лет [доверительный интервал 95% (ДИ 95%), 53-65 лет], пациентов с меланоцитарными невусами - 40 лет [доверительный интервал

95% (ДИ 95%), 33-47 лет]. Группа с меланомой была представлена 25 мужчинами и 52 женщинами, а с доброкачественными меланоцитарными новообразованиями — 3 мужчины и 12 женщин, 5 образцов по полу не идентифицированы. Среди пациентов с меланомой кожи средний возраст мужчин составил 60 лет [доверительный интервал 95% (ДИ 95%), 49-71 год], женщин - 59 лет [доверительный интервал 95% (ДИ 95%), 51-67 лег], а с меланоцитарными невусами - 38 лет [доверительный интервал 95% (ДИ 95%), 19-57 лет] и 40 лет [доверительный интервал 95% (ДИ 95%), 31-49 лет] соответственно.

Распределение меланоцитарных новообразований кожи по локализации было следующим. Наиболее часто встречалось расположение меланомы в области нижних конечностей (44%), меланома туловища составила 34%, верхних конечностей - 15%, головы/шеи — 7%. Среди поставленных диагнозов преобладала поверхностно-распространяющаяся меланома (55,8%), узловая меланома (29,9%). Кроме того, присутствовали образцы лентиго меланомы (7,8%), акрально-лентигинозной меланомы (5,2%) и меланомы слизистых (1,3%).

Помимо диагноза для характеристики образцов меланомы был учтен важный диагностический параметр - толщина по Бреслоу.

Оценка толщины опухоли по Бреслоу осуществлялась при измерении толщины опухоли или ее максимального вертикального размера в миллиметрах. С этой целью использовался микрометр, установленный в окуляре микроскопа, с помощью которого производился замер наибольшего вертикального сечения опухоли. Верхней границей этого замера служит гранулярный слой эпидермиса, а нижней - наиболее глубоко расположенные клетки меланомы в структурах дермы или подкожно-жировой клетчатки.

В исследуемой выборке образцов меланомы присутствовали образцы со всеми стадиями по Бреслоу. При анализе классификации толщины меланомы кожи большую часть составила толщина 2,01 -4,0мм (35%), толщина более 4,0 мм составила 33% и по 16% представлены опухоли с толщиной 1,01-2,0мм и 0,01-1,0мм. Деление на различные субтипы основывается на анатомических и эпидемиологических особенностях, что в дальнейшем находит отражение в различиях в прогрессировании опухоли и, как следствие, в различном прогнозе заболевания.

Образцы меланоцитарных невусов были получены преимущественно с области туловища (58%), в меньшей степени с области нижних конечностей (33%), а также в области головы и шеи (9%).

Среди морфологических разновидностей невусов превалировали пигментные и внутридермальные, составляя при этом по 36%, остальные невусы представленные пигментными диспластическими,

внутридермальными пигментными, голубыми невусами и папиломатозными

составляли по 7% каждый от общего числа невусов.

Согласно поставленным целям и задачам в исследовании в дальнейшем использовали образцы меланомы с преобладанием меланомных клеток. С этой целью набор образцов сопровождался предварительной окраской парафиновых срезов с помощью гематоксилина и эозина с последующим микроскопированием, при этом критерием включения образцов в исследование являлось наличие более 60% клеток меланомы.

Экспериментальное моделирование меланомы кожи in vivo

На последующем этапе исследования было проведено исследование на экспериментальной мышиной модели меланомы кожи in vivo.

При работе с экспериментальными животными соблюдались основные принципы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (2007), а также приказа МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Создание экспериментальной модели меланомы кожи происходило на мышах линии С57В1/6, которые являются стандартной линией для создания модели меланомы кожи in vivo. Для создания модели меланомы in vivo животные были получены из вивария ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук». Мышам была произведена трансплантация культуры клеток меланомы В16.

Меланома В16 является высокометастатической линией, широко используемой для изучения механизмов метастазирования, а также тестирования различных терапевтических агентов. Меланома В16 метастазирует в 2 этапа: сначала в лёгкие, а затем из лёгких в другие системы органов (Stackpole C.W. et al., 1991). Как правило, высокометастатические линии опухолей способны сформировать отдаленные метастазы при подкожной имплантации. (Miller F.R. et al., 1990).

Животные содержались в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, 1985), при температуре 18-22 °С со свободным доступом к воде и пище. Животные были разделены на 3 группы: I группу составили контрольные здоровые животные без трансплантированной меланомы, прожившие 17 суток (n=10), И группу составили опытные животные с трансплантированной меланомой, прожившие 17 суток (п=10) и выведенные из эксперимента на этапе локализованной опухоли в преметастатической фазе, III группу составили опытные животные с трансплантированной меланомой кожи, которые прожили 28 суток (п=10), выведенные из эксперимента на этапе диссеминированной опухоли в метастатической фазе развития.

Оценка дпнамикп роста опухоли. В ходе эксперимента регистрировали число животных, у которых развилась опухоль. Линейные размеры опухоли измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях каждые три дня, начиная с пятого дня после трансплантации клеток меланомы. В двух опытных группах каждые 3 дня определяли объем опухолей по формуле: TV = L • W2/2, где TV— объем опухоли, L - длина опухоли и W — ширина опухоли (Киселев В.И. и др., 2012).

Оценка метастазнрованпя. При вскрытии внутренние органы животных подвергались визуальному осмотру. Подсчёт количества метастазов в лёгких, печени животных, проводился при помощи лампы-лупы. После чего препараты фиксировались в 10 % забуференном формалине, затем заключались в парафин. Далее с каждого органа была получена серия гистологических срезов толщиной 4-5 мкм, которые в последствии окрашивались гематоксилин-эозином. Микропрепараты оценивались под микроскопом Olympus ВХ 41. при ув. 600 с помощью программы «Infinity Capture», камеры (Lumenera Corporation) и программного обеспечения V.4.6.O. при увеличении хЮО, х400, хбОО. Подсчёт метастазов производился в основных органах метастазнрованпя: лёгких, печени. Определялось количество метастатических очагов на микропрепарате, при подсчёте парные органы рассматривались как единый органокомплекс и для них рассчитывалось среднее значение.

Молекулярно-генетическне методы исследования

Для определения относительного уровня экспрессии исследуемых микроРНК в качестве материала использовали образцы меланомы кожи и доброкачественных меланоцитарных новообразований (невусов), которые были получены в количестве 97 из коллекции ГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер им. проф. Крыжановского» и ГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Также в эксперименте использовалась ткань, полученная от экспериментальной мышиной модели меланомы кожи: первичная опухоль, здоровая ткань кожи и ткань органов-мишеней (легкие и печень).

Выделение мРНК. Первоначально образцы меланоцитарных новообразований оценивали путем анализа соответствующего среза от каждого образца, окрашенные гематоксилином и эозином. Выбирали образцы с преимущественным содержанием только опухолевых клеток на срезе. Для выделения микроРНК из парафиновых блоков готовили серийные срезы, заливали ксилолом и инкубировали при температуре 50°С в течение 30 минут, затем центрифугировали в микроцентрифуге MiniSpin (Eppendorf, США) на скорости 13400 об./мин., после чего удаляли ксилол и дважды промывали в 100% этаноле. В дальнейшем осуществляли выделение РНК с использованием набора «Рибо-золь В» (AmpliSens, Россия) в соответствии с

инструкцией производителя. Ткань, полученную от экспериментальных моделей мышей первоначально гомогенизировали и осуществляли выделение РНК с использованием набора «Рибо-золь В» (AmpliSens, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Выделенные образцы мРНК хранились при температуре не более -70°С.

Реакция обратной транскрипции. После выделения РНК осуществляли реакцию обратной транскрипции с применением комплекта реагентов «Реверта» (AmpliSens, Россия) совместно со специфичными 5х праймерами («Applied Biosystems, США») к каждой исследуемой микроРНК (hsa-miR-21, hsa-miR-155, mmu-miR-155, hsa-miR-205, hsa-miR-let-7b, hsa-miR-146a, hsa-miR-150, hsa-196a, hsa-miR-218) по протоколу производителя с целью получения комплиментарной ДНК (кДНК). Полученные образцы кДНК хранили при температуре не более -20°С.

ПЦР с детекцией в реальном времени. Синтезированную в результате обратной транскрипции кДНК непосредственно использовали для постановки ПЦР с детекцией в реальном времени, применяя комплекты реагентов содержащих зонды и специфичные праймеры к микроРНК TagMan® MicroRNA Assays по протоколам коммерческого набора TagMan® MicroRNA Assays (Applied Biosystems, США).

Амплификацию и детекцию осуществляли методом ПЦР с детекцией в реальном времени на приборе StepOne™ Real-Time PCR System («Applied Biosystems», США) в 48-луночных планшетах в объеме по 20 мкл в каждой лунке, содержащем ПЦР буфер: 7.67 мкл безРНКазная вода, 1 мкл TagMan Small RNA Assay (20X), 10 мкл TagMan Master Mix, 1.33 мкл праймера исследуемой микроРНК и snRNA-U6 в соответствующие лунки. Условия ПЦР следующие: 50°С - 2 мин., 95°С - 10 мин. и 40 циклов: 95°С - 15 сек., 60°С - 1 мин. Результаты ПЦР в реальном времени были проанализированы по методу определения величины Ст, соответствующей количеству циклов, при которых кривая флюоресценции пересекала заданный уровень фона. Каждый эксперимент выполнялся в двух технологических повторах с дальнейшим расчетом среднего значения. Нормализацию сигнала осуществляли с помощью snRNA-U6 («Applied Biosystems», США) (Martin del Campo S.E. et al., 2015). Относительные уровни экспрессии микроРНК для исследуемых образцов рассчитывали по формуле: 2~лст, согласно (Chan S.-H. et al., 2008), где ДСТ= СТ roiRNA - CTsnRNAU6.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ полученных данных был проведен с использованием программы Statistica 6.1 (Statsoft, Russia). Результаты исследования проверялись на нормальность распределения с использованием критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефортса. В выполненном исследовании распределение полученных статистических показателей отличалось от нормального,

сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи и-критерии Манна-Уитни. Сравните динамики объема опухолевых узлов по дням проводили с использованием непараметрического дисперсионного анализа Фридмана. При получении р<0,05 переходили к парным сравнениям для зависимых групп, используя критерий Вилкоксона с поправкой Бонферронн. Для количественных признаков общее межгрупповое различие оценивалось при помощи критерия Краскела - Уоллиса. При получении р<0,05, переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при р<0,05. Корреляционный анализ проводили, используя непараметрический анализ корреляционных взаимосвязей по Спирмену. Коэффициент корреляции считали значимыми при р<0,05.

Выборочные параметры, приводимые в таблицах и рисунках, имеют следующие обозначения: Ме - медиана, [25%; 75%] - межквартильный интервал, р- достигнутый уровень значимости, п - объем анализируемой подгруппы. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ экспрессии микроРНК в образцах меланоцптарных новообразований

При сравнительном анализе относительных уровней экспрессии исследуемых онко-микроРНК гшК-21, ипЯ-155, пи11-200с, гшЯ-205, ппЯ-Н-7Ь, т) Я-146а, ггиЯ-150, гшЯ-196а, ггпЯ-218 было выявлено снижение экспрессии трех микроРНК (рис.1): гтпЯ-205 снижен в ткани меланомы более чем в 15 раз в сравнении с невусами, уровень экспрессии ггп[1-196а в 14 раз, а ггп11-218 в 4 раза в образцах меланомы кожи по сравнению с уровнем экспрессии в доброкачественных меланоцитарных новообразованиях.

20

15

ю

о

см ¿0

tk

£ 5

р^б 001

s о

о ф

а с о m л

JÛ X Ф

m о

Я

>s: л х

л ц

ф

fi s о о

X Е

О

гс

15

из

ÎO

ai v* 1С

а:

р 5

со

ем ■

ее Е

Невусь! Ыегакомы

! р-0.02 .............................

vY "■■:':. Р

Нееусы Мепаномы

р=0,02

5

Невусы

Mena номы

Рис.1. Относительный уровень экспрессии гтЯ-205, пи Я-196а, ппЯ-218 в невусах и меланомах.

Значимых различий относительного уровня экспрессии других

микроРНК выявлено не было (табл. 1).

Таблица 1

Относительный уровень экспрессии микроРНК (у.е.) в меланоме и доброкачественных меланоцитарных новообразованиях (невусах)

\ Вид \ новообра-\зования Невус п Меланома п Р

МикроРНК

ппЫ-21 1,03 [0,61;68,16] 12 3,13 [0,49;20,70] 40 0,89

1ГиЫ-155 3,94 [1,00;22,41] 12 7,75 [1,20;84,77] 41 0,82

тЖ-200с - 0 0,113 [1,00;1,53] 16 -

ппЯ-205 57,63 [15,15;2862,54] 13 3,76 [0,33;13,20] 47 0,001

1т'Я-1е1-7Ь 7,15 [2,85;70,55] 12 6,16 [0,92; 119,41] 43 0,79

тП1-146а 23,35 [8,03;498,90] 12 8,04 [1,46; 127,52] 47 0,3

пп11-150 18,66 [2,26;227,79] 12 14,16 [2,39; 166,08] 48 0,96

1П1'К-196а 4,92 [0,62; 17,42] 9 0,35 [0,05;3,91] 40 0,02

гшЯ-218 2,81 [1,64;4,67] 12 0,78 [0,13;4,32] 48 0,02

Можно предположить, что гш11-205, пп11-196а и ттаК-218 при развитии меланомы кожи выступают в роли онкосупрессоров, как и при других видах рака.

Зависимости между относительными уровнями экспрессии микроРНК и клинико-морфологической формой меланом и невусов выявлено не было, что может быть связано с универсальным действием клеток меланоцитарных новообразований.

Сравнительный анализ относительных уровней экспрессии микроРНК по критерию Манна-Уитни в меланоцитарных новообразованиях по полу

показал, что уровень ггнЯ-1е1>7Ь вьпне в меланоме у лиц мужского пола в 50 раз (рис.2), что может быть связано с характером гормональной регуляции гшК-1е1-7Ь.

р=0,02

л

X & 4Г

Я) Г~-

И

I 3 л

с;

2! 5

О

О

0 б

П. !П

с

1

с»

Мужской под Женский пол

Рис.2. Относительный уровень экспрессии ппК-)е1-7Ь в меланомах в зависимости от пола.

Для других микроРНК значимых различий при распределении по полу в меланоцитарных новообразованиях кожи выявлено не было.

Помимо этого, при определении коэффициента ранговой корреляции Спирмена наблюдалось отсутствие зависимости между относительным уровнем экспрессии микроРНК и толщиной опухоли по Бреслоу. Выявленное отсутствие зависимости может являться свидетельством отсутствия развития изменений экспрессионного профиля микроРНК по мере прогрессирования первичной опухоли.

Посредством определения коэффициента ранговой корреляции Спирмена определялась зависимость относительных уровней экспрессии микроРНК от возраста в доброкачественных меланоцитарных новообразованиях, при этом выявлена умеренная связь между возрастом пациентов и относительным уровнем экспрессии ппК-1е!7Ь (г=0,59) (рис.3).

.................

......

4-0 бО

Возраст, годы

100

Рис.3. Относительный уровень экспрессии гп1 к-1с1-7Ь в невусах в зависимости от возраста.

Имеется сильная связь между возрастом пациентов с меланоцитарными невусами и экспрессией пи Я-196а (г=0,86) (рис.4) при этом для обоих случаев р<0,05.

12©

л Ф

о ..

22 (С О

О. 17!

ГЕ

Л 5

2! 2

з: а

К

о с

г ч

о «

т

у

Ж

О 1С 2С 3-0 40 50 60 70

Возраст, годы

Рис.4. Относительный уровень экспрессии гшЯ-196а в невусах в зависимости от возраста.

Для других микроРНК при наличии достаточно сильной корреляционной связи различий выявлено не было, вследствие малой выборки, так как не было достигнуто статистически значимых различий. Полученные данные зависимостей экспрессии микроРНК от возраста могут соотноситься с регуляцией микроРНК процессов старения, показывая, что на

разных стадиях развития действуют различные механизмы регуляции (Abe М. et al., 2014).

При оценке относительных уровней экспрессии выявлены значимые различия miR-218, где для локализации в области головы и шеи уровни экспрессии составили 0,05[0,01;0,09], а для локализации на нижних конечностях 1,31 [0,45; 10,96] при р=0,01, для остальных микроРНК в зависимости от локализации различий выявлено не было.

Многогрупповые сравнения, выявили, что относительный уровень экспрессии miR-218 при меланоме в зависимости от различной локализацией, выше при локализации опухоли на нижних конечностях в 26 раз, чем при локализации опухоли в области головы и шеи, где он минимален в сравнении со всеми другими локализациями, указывая на различные механизмы развития опухоли в зависимости от локализации новообразования (рис.5).

р=0,017

голова/шея туловище а/конечности н/конечности

Рис.5. Относительный уровень экспрессии пп11-218 в зависимости от локализации меланомы.

Оценка уровней экспрессии микроРНК в зависимости от клинико-морфологической формы статистически значимых различий не выявила ни для одной из исследуемых микроРНК, что подтверждает возможную гетерогенность первичной опухоли при различных клинических формах и универсальность продуцирования микроРНК.

По нашим данным относительные уровни экспрессии гш11-200с определить не удалось, возможно вследствие слишком низких уровней экспрессии в исследуемых тканях или же в связи с разрушение данной микроРНК на этапах проводки материала. Вследствие чего, роль данной микроРНК в нашем исследовании при анализе уровней экспрессии в образцах фиксированных в формалине и заключенных в последствии в

парафиновые блоки выявлена не была. По другим микроРНК значимых различий выявлено не было, что возможно связано с гетерогенностью опухоли и/или отсутствием тканиспецифичности при данном опухолевом процессе для данных микроРНК

Анализ экспрессии микроРНК на экспериментальной модели меланомы кожи in vivo

На протяжении всего эксперимента мы наблюдали динамическое увеличение размеров опухолевых узлов меланомы для двух экспериментальных групп. Динамика развития объемов опухолевых узлов в течение 17 суток для группы «Преметастатическая фаза» и 28 суток для группы «Метастатическая фаза» опухоль растет интенсивно.

Помимо этого определялось наличие или отсутствие метастазов в органах-мишенях для двух экспериментальных групп, путем визуальной оценки макропрепаратов легких и печени в виде пигментированных узлов, а также наличием клеток меланомы при микроскопии тканей органов-мишеней окрашенных гематоксилином и эозином (рис.6). Вскрытие животных показало, что для группы «Метастатическая фаза» процесс метастазирования в легкие наблюдался в 60% случаев, при этом метастазы в печени отсутствовали. В группе «Преметастатическая фаза» метастазы в органы-мишени метастазирования не наблюдались, что соответствует предположениям литературных данных о развитии метастазирования на 21 сутки после трансплантации.

Рис.6. А - Макропрепарат метастазов меланомы В16 в легкие. В - Микропрепарат метастазов меланомы В16 в ткань легкого (увеличение х40).

С - Микропрепарат метастазов меланомы В16 в ткань легкого (увеличение хЮО).

В опухолевой ткани животных для двух экспериментальных групп преметастатической и метастатической фаз относительный уровень экспрессии микроРНК (гшК-21, пиК-155, гш11-200с, ппК-1е17Ь) в динамике роста опухоли оставался неизменным, указывая на отсутствие изменений экспрессии микроРНК в первичной опухоли на различных этапах канцерогенеза.

При анализе относительных уровней экспрессии микроРНК в нормальной коже для контрольной группы и в опухолевом узле для групп «Преметастатическая фаза» и «Метастатическая фаза», выявлены значимые различия для пн11-21, пйК-155, гш!1-205 и пиЯ-М-ТЬ. Для инК-200с различий в уровнях экспрессии выявлено не было, в связи с возможным отсутствием тканеспецифичности данной микроРНК при меланоме кожи. Отмечаются статистически значимые различия в группе «Контроль» по сравнению с группами «Преметастатическая фаза» и «Метастатическая фаза» для гш'Я-21, тЖ-155, ппК-205, ппК-1е1-7Ь (рис.7).

25*10" 20*10* 1-5 «10"'

0.5*10J

Ё 1

Ко-трогь Преметгста- Метаете nt-ткческаяфаэз чеехаяфгза

3 3

z в

£ Я

ü3 в

8*10" 5*10 * 4*10"3 2*10'

Пре«е таста-тическая фаза

Мггаетат»-ческая фаза

S.S В а

7*10 у

5*10" ■ 4*10"' -3*10"';— 2*10"'": 1 *10"! | о !

Кштхжь "Рвяегаста- »«ч» таская фаза ческзя фаза

В о

45 «10;; ' 40*10 "

у-.Е"

30*10"' 25*10"' 20*10""' 15*10";: 10*10 j 5 *10"';

о

* picoas

: ¡реадетзстз-тгмескаяфаза

Метйетзтч-чесйая фзза

Рис.7. Относительный уровень экспрессии микроРНК в коже и опухолевом узле на экспериментальной модели in vivo.

При сравнении уровней экспрессии микроРНК в нормальных меланоцитах кожи мышей контрольной группы и опухолевых клеток

первичного узла двух экспериментальных групп, выявлено, что miR-21 и miR-let-7b повышен в опухолевых клетках меланомы как в преметастатической, так и в метастатической фазах в сравнении с нормальными меланоцитами, выступая в этом случае в роли опухолевого активатора, a miR-155 и miR-205 снижена в опухолевых клетках, при этом miR-155 значимо снижена в метастатической фазе, a miR-205 в преметастатичекой и метастатической фазах в сравнении с нормальными меланоцитами (см.рис.7), что свидетельствует об их действии как онкосупрессоров при канцерогенезе. При анализе miR-200c различий выявлено не было, р=0,94.

Оценивая относительные уровни исследуемых микроРНК в органах-мишенях метастазирования (легких и печени) экспериментальной модели меланомы кожи in vivo, выявлено что miR-21, miR-155, miR-205, miR- let-7b отличаются в группах «Контроль» и «Преметастатическая фаза» в легочной ткани (рис.8).

Прбметаста- Метаетатк. Кс-нг--зпь Преметаста- РЛетастатк-

печеоаяфаэа чеааяфаг-а " " ,а тн'-^скзя фаза ческаяфаза

«р=е.оз24

H

Ш Ж

Контроль

: ¡реметаста-тическзяфаза

Метастзти-чэсяая фаза

so

1 § 60 ra S

; - 0=0.0045

j

¡фшетасга-то-^еская фаз!

i-Летаетатк-ческая фаза

Рис.8. Относительный уровень экспрессии микроРНК в легких на экспериментальной модели in vivo.

Также отличаются уровни экспрессии в ткани печени для групп «Контроль» и «Преметастатическая фаза» для miR-21, miR-205, miR- let-7b (рис.9).

N « (¿

« Я

£ 5

800 ; 400 -i 230 »

Капрон» Предаваем- Ивтастат«-тхчес*ая фаза чеоая фаза

§ >.

!

1 6S

*р=С,0324

j

Ш

fóeracrsro-ческая сраза

i- л so F

с • р. oj

i» &

5

*p=Q,ÜGS&

ив •■¡ш «S»

Коктролъ

преметз статическая фазз

Метастаьт-ческая фаза

Рис.9. Относительный уровень экспрессии микроРНК в печени на экспериментальной модели in vivo.

При этом, мы не определили miR-200c в легких и печени в связи с возможной тканеспецифичностью данной микроРНК, однако, выявили, что уровни экспрессии miR-21, miR-205 и miR-let-7b повышаются в ткани легкого и печени в преметастатическую фазу в сравнении с контрольной группой, когда метастазы в этих органах отсутствуют, указывая на роль микроокружения, в котором происходят молекулярные изменения. MiR-155 значительно возрастает в легких в группе «Метастатическая фаза» в сравнении с группой «Контроль», при этом в печени различий для данной микроРНК не выявлено. Повышение уровней экспрессии микроРНК, выступающих в роли активаторов и супрессоров опухолевого процесса подтверждает диерегуляцию этих микроРНК при меланоме кожи.

Таким образом, до появления непосредственно метастазов в органах-мишенях, в этих органах определяются изменения в уровне экспрессии ряда онко-микроРНК, что может трактоваться как один из элементов формирования так называемых «преметастатических ниш», которые принимают активное участие для миграции метастазов в органы-мишени с последующей их прогрессией. Мы предполагаем, что клетки первичной опухоли продуцируют факторы, которые способны модулировать в

отдаленных органах условия для дальнейшей прогрессии опухоли, стимулируя миграцию и вторжение опухолевых клеток. Процесс метастазирования не хаотичен, как представлялось раньше, а подчиняется строго регулируемым биологическим механизмам. Этот процесс волнообразен и дискретен, имеет множество промежуточных стадий и может характеризоваться как ускоренным, так и замедленным течением. Динамика клеточно-молекулярных событий и миграции раковых клеток в преметастатическую нишу представляют собой сложную цепь биологических реакций. Следует подчеркнуть, что этап формирования преметастатической ниши не зависит от присутствия в ней опухолевых клеток.

Преметастатические ниши могут формироваться в микроциркуляторном русле периферических висцеральных органов, в костном мозге, в лимфатических узлах, а также в строме самой первичной опухоли. Достигнув преметастатической ниши, опухолевые клетки не обязательно сразу начинают пролиферировать. Обычно образованию клинически выявляемого метастаза предшествует уникальный период, который называют состоянием покоя, или дремлющих метастазов.

Использование микроРНК в качестве биомаркера, который способен предсказывать риск развития рака, является значимым, так как в настоящее время таких известных маркеров очень мало. Некоторые исследователи сообщили, что уровень экспрессии некоторых микроРНК может отличаться между представителями различных этнических групп и при различных опухолях (Уаг1а Н. е1 а1., 2009). Поэтому рекомендуется валидировать, полученные данные об экспрессии микроРНК на больных со сходными характеристиками. Результаты исследования открывают новые возможности для регуляции опухолевых процессов в терапевтических целях. И в настоящее время первичной задачей является всесторонняя валидация полученных результатов различных исследований и унификация методов выделения микроРНК, что позволит внедрить анализ микроРНК в диагностику и лечение онкологических заболеваний.

выводы

1. Относительные уровни экспрессии miR-205, miR-196a и miR-218 снижены в меланоме по сравнению с меланоцитарными невусами, что свидетельствует об их онкосупрессорной роли в патогенезе меланомы;

2. Для меланоцитарных невусов характерна зависимость уровней экспрессии микроРНК от возраста: умеренная обратная корреляционная связь с возрастом и уровнем экспрессии miR-let-7b, а для miR-196a и возрастом выявлена сильная прямая корреляционная связь. Помимо этого, в клетках меланомы наблюдается снижение относительного уровня экспрессии miR-218 при локализации в области головы и шеи по сравнению с локализацией на нижних конечностях, а уровень miR-let-7b регистрируется выше у лиц мужского пола, последнее может быть связано с характером гормональной регуляции miR-let-7b.

3. В опухолевой ткани на экспериментальной модели in vivo уровни miR-21 и miR-let-7b увеличиваются по сравнению с показателями нормальной кожи, подтверждая онкогенную роль, в то время как уровни miR-155 и miR-205 в ткани первичного опухолевого узла снижаются, выступая в роли онкосупрессоров.

4. В преметастатическую фазу в органах-мишенях для метастазов меланомы наблюдается повышение относительных уровней экспрессии m¡R-21, miR-205 и miR-let-7b, а в метастатичесуго фазу определяется увеличение относительного уровня экспрессии miR-155 в легких, что свидетельствует об активном учаспш данных микроРНК в формировании «преметастатнческих ниш» в висцеральных органах для последующей миграции метастазов меланомы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анализ экспрессии микроРНК при меланоме кожи / Ю.И. Швецова, Н.В. Палкина, М.Б. Аксененко, Т.Г. Рукша // Онкология. Журнал им. П. А. Герцена. - 2014. -№3. - С.43-46. (Из списка ВАК)

2. Изменения экспрессии микроРНК при меланоцитарных новообразованиях кожи / Ю.И. Швецова, Н.В. Палкина, М.Б. Аксененко, Т.Г. Рукша // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2015. -Т. 18, № 3. - С.6-9. (Из списка ВАК)

3. Ингибирование матриксных металлопротеиназ 9-го и 13-го типов влияет на выраженность лимфоцитарной инфильтрации и уровни экспрессии микроРНК m¡R-21 и miR-Iet-7b в клетках меланомы in vivo / Н.В. Палкина, Ю.И. Швецова, А.К. Кириченко, Т.Г. Рукша // Архив патологии. - 2015. - Т. 77, № 1. - С. 41-47. (Из списка ВАК)

4. Патент №2560711 РФ, МПК G01N 33/50. Способ дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований кожи / Ю.И. Швецова, Н.В. Палкина Н.В., Т.Г. Рукша; ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава РФ. - №2014123570; Заявл. 09.06.2014, 0публ.20.08.2015, Бюл. №23

5. Характер экспрессии онко-микроРНК при меланоцитарных новообразованиях кожи и в экспериментальной модели меланомы кожи при развитии метастазирования / Рукша Т.Г., Швецова Ю.И., Палкина Н.В., Аксененко М.Б. // Евразийский онкологический журнал. Тезисы VIII съезда онкологов и радиологов СНГ и Евразии. — 2013.- № 3. — С. 118-119.

6. Динамика опухолевого роста и метастазирования меланомы кожи in vivo / Ю.И. Яцкая (Ю.И. Швецова), Т.Г. Рукша // Новые методы в онкологической практике : материалы Российской научно-практической конференции с международным участием 25-26 июня 2013 года г. Барнаул / под. ред. д.м.н., проф. А. Ф. Лазарева. - Барнаул: АЗБУКА, 2013. - С. 239.

7. Экспрессионный анализ онко-микроРНК при меланоме кожи / Ю.И. Яцкая (Ю.И. Швецова), Н.В. Палкина, М.Б. Аксененко, Т.Г. Рукша // Всероссийская научная школа-конференция для молодых ученых РАМН по онкологии «Современная онкология: достижения и перспективы» 29 ноября 2013 г. Новосибирск. -2013. -С.38-39.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИИ

МК — меланома кожи;

кДНК - комплементарная ДНК;

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота;

ПЦР- полимеразная цепная реакция;

пнИ. - микроРНК.

Соискатель

Ю.И. Швецова

Отпечатано в типографии «Семицвет» 660049, г. Красноярск, ул. Урицкого, 117 тел. (391) 294-85-78, 214-28-68, 229-53-54

Пл. —1,0. Тираж 100 экземпляров. Бумага офсетная № 1. Печать трафаретная.