Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Исследование резистентности клеща Varroa destructor к акарицидам и разработка экологически-безопасных средств борьбы с варроатозом пчёл

ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат диссертации по теме "Исследование резистентности клеща Varroa destructor к акарицидам и разработка экологически-безопасных средств борьбы с варроатозом пчёл"

На правах рукописи

КОТОВА АКСИНЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КЛЕЩА VARROA DESTRUCTOR К АКАРИЦИДАМ И РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЧСКИ-БЕЗОПАСНЫХ СРЕДСТВ БОРЬБЫ С ВАРРОАТОЗОМ ПЧЁЛ.

06.02.05 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 8 АПР 2013

Москва-2013

005052193

005052193

Работа выполнена в лаборатории ветеринарной санитарии в пчеловодстве ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Клочко Раиса Тимофеевна,

ГНУ ВНИИВСГЭ, ведущий научный сотрудник лаборатории ветеринарной санитарии в пчеловодстве

доктор биологических наук, Удавлиев Дамир Исмаилович,

ГНУ ВНИИВСГЭ, заведующий лабораторией арахноэнтомологии

кандидат биологических наук Сотников Анатолий Николаевич,

ГНУ ВИЭВ, и.о. заведующего лабораторией болезней пчёл

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВ-МиБ)

Защита состоится «£9» ¡.¿¿¿¿с? 2013 г. в —7 на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при ГНУ «Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, дом 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Росельхозакадемии.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность проблемы

Клещ Varroa destructor Anderson et Trueman, 2000 и вторичные вирусные инфекции, связанные с паразитированием этого клеща, по мнению большинства исследователей (Martin, 2001; Vanengelsdorp et al., 2008; Conte et al., 2010; Currie et al., 2010; Dahle, 2010; Gusmán-Novoa et al., 2010; Клочко и Луганский, 2011), являются основными факторами гибели семей пчёл.

В связи с паразитированием на пчёлах клеща варроа во всем мире получили широкое распространите некоторые вирусные заболевания, такие как вирус ме-шотчатого расплода и вирус деформации крыла, которые осложняют эпизоотический процесс и в 2-3 раза ускоряют гибель пчёл (Клочко, Воронков, 2009). С ростом интенсивности инвазии инфекционные заболевания развиваются быстрее, так как клещ способствует прямому попаданию возбудителей в гемолимфу пчёл и более быстрому развитию вторичных инфекций. Клещ варроа является не только переносчиком вирусов (внутри и между колониями пчёл), но и способствует активации размножения вируса в инфицированных и ослабленных личинках и взрослых особях. В экспериментах было доказано, что клещ варроа может конта-минировать теми или иными микроорганизмами до 20% расплода в период развития пчелосемей (Смирнов и Кудрявцев, 1977; Гузева, 1981; Ritter, 1990; Гробов и Гузева, 1991; Brodsgaard et al., 2000; Calderone, 1999).

Наиболее широко используемыми при борьбе с варроатозом пчёл являются препараты, относящиеся к группе пиретроидов. Однако в научной литературе всё чаще появляются сообщения о возникновении популяций клеща варроа, резистентных к пиретроидам. Всё вышеперечисленное говорит о необходимости изучения резистентности популяций этого клеща с целью подбора оптимальной схемы лечения варроатоза пчёл, а также совершенствования химического метода борьбы с клещом варроа для предупреждения развития его устойчивости к акарицидам (Watkins, 1997).

Все большее внимание исследователей привлекают вещества природного происхождения (карбоновые кислоты, эфирные масла и их компоненты), которые при определенных способах применения не токсичны для пчёл и не приводят к

накоплению остаточных количеств в мёде и продуктах пчеловодства (Arculeo et al., 1993; Brodsgaard et al., 1999; Calderone, 2000; Charrier et Imdorf, 2002; Al-Abbadi, Nazer, 2003; Nanetti et al., 2003; Rademacher, Harz, 2006; Burlew, 2009).

Изучение эпизоотологических особенностей варроатоза пчёл, определение резистентности клеща варроа к синтетическим пиретроидам, разработка экологически-безопасного лекарственного средства для борьбы с варроатозом пчёл составили теоретическую и практическую основу наших исследований.

1.2. Цель работы

Целью диссертационной работы являлось изучение эпизоотологического процесса при совместном течении варроатоза и вирусных инфекций, исследование резистентности клеща варроа к применяемым в пчеловодстве синтетическим пиретроидам и изыскание новых экологически безопасных средств борьбы с варроатозом пчёл.

1.3. Задачи исследования

- изучить особенности развития варроатоза на фоне вирусных инфекций;

- изучить резистентность клеща варроа к синтетическим пиретроидам;

- разработать экологически-безопасный препарат для борьбы с варроатозом

пчёл;

- оценить лечебную эффективность и безопасность для пчёл рекомендуемых

средств;

- разработать метод определения и изучить динамику накопления тимола в мёде.

1.4. Научная новизна

Изучены особенности течения варроатозной инвазии при сочетанном поражении семей пчёл варроатозом и вирусными инфекциями.

Установлены показатели резистентности популяций клещей Varroa destructor к синтетическим пиретроидам.

Разработано новое экологически-безопасное лекарственное средство для борьбы с варроатозом - санокс (совместно с ООО «АПИ-САИ», г. Москва).

Для стимуляции развития семей пчёл и повышения их продуктивности совместно с ООО «АПИ-САН» разработан препарат аписоль для поилок на пасеке.

Разработан метод газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) для определения остаточных количеств тимола в мёде.

Определена динамика накопления остаточных количеств тимола и щавелевой кислоты в мёде.

1.5. Практическая значимость

В соавторстве с сотрудниками лаборатории ветеринарной санитарии в пчеловодстве и лаборатории токсикологии и санитарии кормов ГНУ ВНИИВСГЭ и лаборатории болезней пчёл ГНУ ВИЭВ разработаны:

- методические рекомендации по изучению средств и приёмов борьбы с вар-роатозом пчёл (утв. отделением ветеринарной медицины РАСХН 08.06.2010 г.);

- методическое пособие по определению тимола в мёде (утв. отделением ветеринарной медицины РАСХН 19.03.2013 г.).

На основании проведённых исследований в соавторстве с сотрудниками ООО «АПИ-САН» разработаны и внедрены:

- инструкция по применению санокса для лечения и профилактики варроатоза медоносных пчёл (утв. Россельхознадзором, 2010);

- инструкция по применению порошка аписоль для поилок на пасеке (утв. ООО «АПИ-САН», 2011).

1.6. Апробация работы

Материалы диссертации доложены:

- на международной конференции «Пчеловодство - XXI век» (г. Москва, Международная промышленная академия, 17-20 мая 2010 г.);

- на XVIII Международном ветеринарном Конгрессе (г. Москва, гостиничный комплекс Измайлово, 24-26 апреля 2010 г.);

- на Международной научно-практической конференции «Современное пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии» (г. Ярославль, 12-18 августа 2010 г.);

- на семинаре: «Болезни пчёл, способы их профилактики и лечения, правила обследования пасек» (г. Курск, Институт переподготовки и повышения квалификации руководящих кадров и специалистов АПК, 31 мая 2011 г.);

- на международной научно-практической конференции «Пути развитая пчеловодства в России через успешный опыт регионов России, стран СНГ и Дальнего Зарубежья» (г. Ярославль, 6-8 октября 2011 г.);

- на международной научно-практической конференции «Пчеловодство России на пути вступления в ВТО» (г. Ярославль, 18-23 октября 2012 г.).

На защиту выносятся следующие положения:

• некоторые эпизоотологические и биологические особенности развития варроатоза на фоне вируса деформации крыла и вируса мешотчатого расплода;

• разработка экологически-безопасного лекарственного препарата для борьбы с варроатозом пчёл;

• оценка лечебной эффективности при варроатозе и безопасности для пчёл препаратов апигард и санокс;

• оценка резистентности клеща варроа к пиретроидам.

1.7. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 5 - в научных журналах, рекомендованных ВАК.

1.8. Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц, 2 рисунка и 11 диаграмм. Список литературы включает 303 источника отечественных и зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Экспериментальная часть исследований проводилась в период с 2009 по 2013 г.г. на экспериментальной пасеке и в лаборатории ветеринарной санитарии в пчеловодстве ГНУ ВНИИВСГЭ, а также на частных пасеках Московской, Воронежской областей и Ставропольского края. Всего было обследовано 143 пасеки, где содержалось 2252 семей пчёл. В лабораторных условиях было исследовано 2500 проб живых пчёл.

Проведение лабораторных и пасечных испытаний акарицидной активности и токсичности для пчёл изучаемых препаратов осуществлялось согласно следующим нормативным документам:

• Основные методические требования к постановке экспериментов в пчеловодстве. Современные методы исследования патологии пчёл (утв. РАСХН, 2000).

• Методические рекомендации по изучению средств и приёмов борьбы с клещом варроа (утв. РАСХН, 2010).

• Рекомендации о мероприятиях по предупреждению и ликвидации болезней, отравлений и основных вредителей пчёл (утв. РАСХН, 2005).

• Методические рекомендации по оценке действия и потенциальной опасности пестицидов для медоносных пчёл (утв. РАСХН, 2000).

• Методические рекомендации по изучению токсического действия пестицидов и биопрепаратов на пчёл (утв. ВАСХНИЛ, 1989).

• Методические указания по количественному определению щавелевой кислоты в мёде (утв. ГУВ МСХ СССР, 1984)

При проведении лабораторных исследований акарицидов для борьбы с клещами варроа определяли действие препаратов на пчёл в зависимости от их возраста и сезона года, при различных способах воздействия испытываемых средств и кратности обработки; действие препаратов на взрослых самок клеща варроа и наиболее эффективный способ их практического применения.

Изучение акарицидной активности лекарственных средств в лабораторных условиях проводили на изолированных группах здоровых и инвазированных

клещами варроа пчёл, содержавшихся в энтомологических садках. Садки с пчёлами на время опыта помещали в термостат (температура 30-32°С, относительная влажность 75-80%). Кормили пчёл сахарным сиропом (1:1) по общепринятой методике.

Оценку токсичности препаратов проводили по дозам, вызывающим гибель 0-5-25-50-75-100% клещей или пчёл, ЛД50 рассчитывали через 24 и 48 часов после обработки. О длительности остаточного действия препарата судили по продолжительности жизни опытных и контрольных пчёл в лабораторных условиях.

Наиболее перспективные средства, отобранные после проведения лабораторных испытаний, изучали на семьях пчёл.

В пасечных испытаниях определяли эффективность препаратов, процент осыпи клещей варроа, снижение экстенсивности поражения клещами пчёл и расплода, оптимальную дозу препаратов на одну улочку пчёл в улье, семью пчёл, курс лечения, необходимое число обработок, интервалы между ними, продолжительность курса лечения.

Акарицидную эффективность препаратов устанавливали по числу осыпавшихся клещей после обработки пчёл изучаемыми акарицидами в течение определённого периода времени, с учётом гибели клещей в опыте и контроле, по изменению степени инвазированности клещами пчёл и пчелиного расплода. Расчёт проводили по формуле Эббота:

гибель клещей в контроле, % - гибель клещей В опыте, % х|00О/ гибель клещей в контроле, %

Токсичность испытываемых лекарственных средств оценивали также по изменению поведенческих реакций внутриульевых и рабочих пчёл, трутней и маток, количеству и качеству засева до и после обработки.

Репродуктивную способность пчелиных маток оценивали по количеству печатного расплода, измеряемого рамкой-сеткой со стороной квадрата 10x10 см.

Исследование влияния варроатозной инвазии и изучаемых препаратов на пчёл проводили путём определения изменения у них основных биохимических показателей.

Для этого определяли:

- гемолимфоформулу по методу Шишкина и возрастной коэффициент гемолимфы (ВКГ) по методу Гробова;

- степень развития жирового тела по методу Маурицио;

- содержание глюкозы в гемолимфе по методу Шомоньи-Нильсона;

- содержание общего количества липидов в гемолимфе по методу Свана;

- содержание общего белка в гемолимфе по методу Лоури.

Остаточные количества тимола в пробах мёда определяли методом газожидкостной хроматографии-масс-спекгрометрии (ГЖХ-МС), щавелевой кислоты - химико-аналитическим селективным методом, основанным на специфическом осаждении ок-салат-иона хлоридом кальция.

Определение поражённое™ пчёл вирусом мешотчагого расплода и вирусом деформации крыла определяли методом ПЦР с обратной транскрипгазой. Дня исследований использовали тест-наборы для ПЦР отечественного производства.

Резистентность клещей варроа к пиретроидам проводили экспресс-методом (Thompson, 2003) и методом сравнения опытных данных с фоновым значением резистентности (Milani, 1995).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Динамика развития варроатозной инвазии в семьях пчёл

В результате проведённых исследований было установлено четыре связанных с биологией пчелиной семьи периода развития клеща Varroa destructor в семьях пчёл Средней полосы РФ.

Первый (подготовительный) период - с марта по май - был связан со сменой зимовавших пчёл новыми и началом нарастания численности пчёл в семьях. В этот период экстенсивность поражения семей пчёл клещом варроа с не превышала 3,61±0,76%, что связано с естественной гибелью и осыпью клещей во время зимовки и весной.

Второй период - с мая по автуст - характеризовался увеличением численности пчёл в семье и ростом экстенсивности поражения семей пчёл клещом варроа.

Третий период (с август по октябрь) определялся прекращением роста семьи, сменой летних пчёл молодыми, идущими в зимовку и формированием зимнего

9

клуба. В конце этого периода отмечался пик экстенсивности поражения пчёл клещом варроа - в среднем 21,9%.

Четвертый период - зимовка (с октября по март). Для этого периода было характерно отсутствие расплода, в связи с чем, размножения клеща варроа не происходило, в семье присутствовали только самки клеща, которые находились под брюшными стернитами пчёл.

Результаты исследования динамики экстенсивности поражения пчёл клещом варроа представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Динамика развития экстенсивности варроатозной инвазии в семьях пчёл

на пасеках Воронежской области

Месяц сезона Экстенсивность поражения групп пчёл, %

имаго расплод рабочих пчёл трутневой расплод

Февраль 1,86+0,23 1,23±0,27 1,63±0,15

Март 2,13±0,34 2,23+0,11 2,49±0,52

Апрель 3,27+0,29 3,61±0,76 3,54±1,31

Май 5,47±0,11 7,43±0,26 11,7+0,11

Июнь 7,47±0,82 10,1 ±0,42 13,6±1,24

Июль 8,31 ±0,35 13,6±1,64 27,2±0,87

Август 12,8±0,64 16,3±0,26 —

Сентябрь 13,4+1,15 19,6±0,93 —

Октябрь 21,9±1,12 - -

Как видно из таблицы 1, при изучении динамики развития варроатоза на обследуемых пасеках было установлено, что минимальная поражённость семей пчёл отмечалась в феврале и составляла в среднем 1,86%, максимум достигался в конце сентября-начале октября - в среднем 21,9%.

2.2.2. Особенности течения варроатоза на фоне вирусных инфекций При эпизоотологических исследованиях, проводимых в мае-июне 2010 года на пасеках Московской, Воронежской областей и Ставропольского края наблюдалось резкое снижение лётной активности пчёл в семьях, поражённых клещом варроа. Экстенсивность поражения пчёл клещом варроа на момент исследования составляла 25,7±1,3%. Пчёлы хаотично двигались по прилётной доске и предлетш-

10

вой площадке, не имея возможности взлететь. Рядом с ульем на земле находили множество погибших пчёл с уменьшенным брюшком. У некоторых особей отмечалась различной степени деформация крыльев, вплоть до полной редукции. В некоторых семьях пчёл исследуемых пасек было отмечено появление пёстрого расплода. При вскрытии ячеек были найдены личинки, представляющие собой тонкую оболочку, заполненную мутноватой жидкостью. Извлечь личинку из ячейки без повреждения оболочки не представлялось возможным.

Для проведения дифференциальной диагностики и постановки окончательного диагноза были сформированы пробы запечатанного расплода из этих семей для проведения вирусологического исследования. Пробы для исследования отбирали из семей с явными клиническими признаками, вызывающими подозрение на наличие вирусного заболевания неизвестной этиологии. Для этого вырезали участок сота размерами 10 х 15 см с пораженным расплодом на различных стадиях развития.

Вирусологическое исследование проб проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) совместно с сотрудниками отдела генетики и природопользования Института общей генетики им. Н.И: Вавилова (Калашников и Удина, 2012). Специфические праймеры для идентификации вируса мешотчатого расплода и вируса деформации крыла (Berenyi et al., 2006), предоставленные отделом, приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Праймеры для индикации вируса мешотчатого расплода (BMP)

и вируса деформации крыла (ВДК)

Вирусное заболевание Последовательность праймера 5'- 3' Положение в геноме Величина продукта, bp

BMP Forward: 5' ACCAACCGATTCCTCAGTAG 3' 221-240 487

Reverse: 5' CCTTGGAACTCTGCTGTGTA 3' 689-708

ВДК Forward: 5' ATTGTGCCAGATTGGACTAC 3' 2345-2364 434

Reverse: 5' AGATGCAATGGAGGATACAG 3' 2760-2997

Таблица 3.

Результаты исследования семей пчёл методом ПЦР

Место исследования Всего Вирус Вирус Смешанная

исследовано мешотчатого деформации форма

семей расплода крыла (ВМР+ВДК)

Воронежская об- 15 6 5 з

ласть

Московская область 18 12 4 2

Ставропольский край 15 9 0 0

Всего 48 27 9 5

Исследования показали, что в 27 исследованных семьях, поражённых клещами варроа, был обнаружен вирус мешотчатого расплода, в девяти - вирус деформации крыла, а в пяти семьях наблюдалась смешанная форма этих двух заболеваний.

2.2.3. Изучение сочетанного влияния вируса мешотчатого расплода и клеща варроа на биохимические показатели гемолимфы пчёл

По сообщениям многих исследователей (Домацкая, и Гробов, 1980, Шатрова, 1992; Hershey & Merrick, 2000; Getchev, 1994), при паразитировании на пчёлах клещей варроа происходят значительные потери гемолимфы, в результате чего пчёлы теряют возможность полноценно синтезировать необходимые им белки. Процесс усугубляется при поражении семьи пчёл вирусами. При проникновении вирусных частиц в клетку начинается их интенсивная репликация. Выход вирусных частиц из клетки сопровождается её лизисом, в гемолимфу попадают вирионы и свободные аминокислоты из разрушенной клетки.

При определении количества общего белка в гемолимфе пчёл нами было установлено, что варроатоз вызывал снижение этого показателя с 4,56±0,39 до 2,96±0,34 г%. Наличие вирусных заболеваний в поражённых клещом варроа семьях пчёл приводило к дальнейшему снижению количества общего белка в гемолимфе пчёл до 2,05+0,19 г%.

При проведении исследования сочетанного влияния вируса мешотчатого

расплода и клеща варроа на аминокислотный состав гемолимфы поражённых

12

пчёл было установлено увеличение количества лейцина в 3 раза, изолейцина -1,9 раза, аланина - в 2 раза, фенилаланина - в 3,5 раза и серина - в 1,5 раза по сравнению с чистым контролем, что указывало на интенсивный распад тканевых белков в организме пчёл.

2.2.4. Влияние препарата аписоль на развитие семьи пчёл и её устойчивость к инфекционным заболеваниям

При паразитировании на пчёлах клеща варроа происходят значительные потери гемолимфы, а вместе с ней и питательных веществ. В результате восполнение недостающих веществ происходит из естественного депо - жирового тела пчёл. Помимо депонирующей функции, жировое тело также выполняет функцию защиты организма пчёл от проникновения патогенных микроорганизмов. При уменьшении степени развития жирового тела пчёлы оказываются менее устойчивыми к инфекциям (Гробов, Лихотин, 2003).

Для стимуляции развития семей пчёл и повышения их устойчивости к заболеваниям нами был разработан препарат аписоль, в состав которого вошли микроэлементы: кобальт, магний, калий и йод. В ходе пасечных испытаний было изучено влияние препарата на развитие семьи пчёл: по медовой продуктивности, репродуктивной активности пчелиных маток и степени развития жирового тела отдельных особей, поражённых клещом варроа и вирусом мешотча-того расплода. Отдельно оценивалась репродуктивная активность пчелиной матки.

Проведённые нами исследования показали, что применение препарата аписоль способствовало развитию жирового тела пчёл в среднем на 26%, повышению яйценоскости пчелиных маток на 15% по сравнению с контролем. Медовая продуктивность опытных семей была на 11,7% выше, чем в контрольных.

2.2.5. Изучение резистентности клеща варроа к акарицидам

Исследование резистентности популяций клещей варроа проводили экспресс-методом (Thompson, 2003) и методом сравнения опытных данных с фоновым значением резистентности (Milani, 1995).

В качестве диагностического устройства в экспресс-методе использовали пластиковый стакан объёмом 400 мл с мелкоячеистой сеткой в крышке. В исследовании были испытаны препараты: апистан (флувалинат) и байварол (флумет-рин) в форме полимерных полосок.

Исследования проводили на пасеках Воронежской области и Ставропольского края. На пасеке Воронежской области, расположенной на территории заповедника, обработка семей пчёл пиретроидами никогда не проводилась. На пасеке Ставропольского края на протяжении последних 10 лет борьба с варроа-тозом осуществлялась апистаном, байваролом и другими препаратами на основе пиретроидов.

Для проведения опыта в стакан сметали с рамок около 400 пчёл, закрывали крышкой и располагали его сеткой вниз на листе белого пластика, смазанном вазелином. В щалевидное отверстие на дне стакана, которое служило верхней частью устройства при проведении опыта, вводили полоску препарата и оставляли её на 4 часа. В конце срока экспозиции стакан поднимали и подсчитывали осыпавшихся с пчёл на вазелин клещей.

Для определения числа клещей, оставшихся на пчёлах (проявивших резистентность к акарициду), опытных пчёл промывали в воде с поверхностно-активными веществами и подсчитывали на дне ёмкости отпавших с пчёл клещей. Расчёт акарицидной эффективности препаратов проводили по следующей формуле:

число отпавших клещей после 4-х часовой экспозиции

_ — - * 11ш /о

общее число клещей

Возникновение резистентных популяций клеща варроа устанавливали в случае, если полученный результат оказывался ниже 60%.

Таблица 4.

Устойчивость клещей варроа к химическим акарицидам на пасеках Воронежской области и Ставропольского края

Препарат (действующее вещество) Воронежская обл. Ставропольский край

Общее число клещей на пчёлах, шт. Число устойчивых клещей, шт. Эффективность, % Общее число клещей на пчёлах, шт. Число устойчивых клещей, шт. Эффективность, %

Апистан (флувалинат) 94,1+15,8 13,3+4,3" 86,0+2,7 77,б±9,7 33,1±6,42) 57,1 ±7,83)

Байварол (флуметрин) 97,7±14,5 11,9+3,1" 88,0±1,6 83,6+10,4 33,7+4,8" 58,9±4,і"

Примечание: "Р<0,001; ^Р<0,002; ))Р<0,01.

Полученные данные (табл. 4) показали, что на пасеке в Воронежской области, ранее не обрабатывавшейся пиретроидами, не отмечалось резистентности клещей варроа к флувалинату и флуметрину. Опыты, проведённые на пасеке в Ставропольском крае, показали достоверное снижение эффективности флувалината до 57,1±7,8% и флуметрина - до 58,9±4,1% по сравнению с результатами на пасеке Воронежской области.

Методика сравнения опытных данных с фоновым значением резистентности была испытана на изолятах клещей варроа, отобранных с пасеки Воронежской области, на которой никогда не применялись препараты на основе пиретроидов и сельскохозяйственные культуры вблизи пасеки никогда не обрабатывались химическими средствами защиты растений на основе пиретроидов. В исследованиях также были использованы изоляты клещей с пасек Ставропольского края и Московской области, где пиретроиды использовали в течение нескольких лет, отмечая при этом снижение эффективности обработок, на основании чего такие изоляты рассматривались нами как резистентные к флувалинату и флуметрину.

Для проведения исследования акарицидной эффективности пиретроидов, были отобраны рамки с трутневым расплодом сразу после запечатывания. Хранение рамок во время проведения опытов осуществляли в сетчатых изоляторах в термостате при температуре 32,5-33,0°С.

Перед проведением испытаний участок сотов 10x15 см вырезали из рамки, скальпелем вскрывали ячейки, препаровальной иглой извлекали куколок трутней и собирали с них самок клеща варроа, отличающихся от самцов большими размерами и цветом хитинового покрова.

Для проведения исследования резистентности клещей варроа к флували-нату и флуметрину готовили парафиновые капсулы в чашках Петри (50><15 мм). Для этого флувалинат растворяли в ацетоне, чтобы получить следующие концентрации: 5,8; 11,5; 23,0; 57,0 и 114,0 ррт, флуметрин - в этилацетате, чтобы получились концентрации 0,6; 2,9; 5,7; 11,4; 28,6; 57,3 и 286,3 ррт. После этого 2 мл полученного раствора вносили в 9 г (10 см3) расплавленного парафина и подогревали его на водяной бане при постоянном помешивании в течение 20 минут. Парафин с растворённым в нём пиретроидом равномерно наносили на нагретые чашки Петри по 2 мл и остужали. Все работы проводились в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты органов дыхания и рук.

В результате испытанные дозировки для флувалината в парафине составили 0,2; 2,0; 4,0; 10,0 и 20,0 ррт, для флуметрина - 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 и 50,0 ррт.

В подготовленные таким образом чашки Петри помещали самок клеща варроа на 6 часов, после чего переносили их в чистую чашку Петри с умеренно увлажнённым диском из фильтровальной бумаги и двумя живыми личинками рабочих пчёл из свежезапечатанного расплода. Для каждой дозировки использовали не менее 15 живых самок клеща в трёх повторностях. Через 48 часов после начала опыта (т.е. через 42 часа после переноса клещей в чистые чашки Петри) проводили подсчёт погибших клещей. Определение СК50 проводили методом пробит-анализа по Беленькому М.А. (1959). По оси абсцисс откладывали концентрацию действующего вещества в парафине, а по оси ординат - процент гибели клещей.

В результате опыта было определено, что для клещей с пасеки Воронежской области, никогда ранее не подвергавшейся обработке пиретроидами, СК50 флувалината составляло 0,74±0,06 ррт, а СК50 флуметрина - 0,19+0,03 ррт.

16

Это являлось фоновым значением, превышение которого позволило установить наличие устойчивости к синтетическим пиретроидам у тех тестируемых популяций клеща варроа, которые ранее имели контакт с препаратами на основе флувалината и флуметрина, а также оценить показатель резистентности.

Показатель резистентности клещей варроа к флувалинату и флуметрину определяли следующим образом. Семьи пчёл, которые в течение нескольких лет обрабатывались только препаратами на основе флувалината или флуметрина, были разделены на 3 группы:

• обрабатываемые только флувалинатом (Ставропольской край) - С1;

• обрабатываемые только флувалинатом (Московская область) - М1;

• обрабатываемые только флуметрином (Московская область) - М2.

Исследование СК5о проводили по той же схеме, что и в первом случае.

На основании полученных результатов определяли показатель резистентности (ПР) по следующей формуле:

СК5р исследуемой группы клещей СК50 интактной группы клещей

Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Чувствительность клещей варроа к флувалинату и флуметрину

Группа пчёл Флувалинат Флуметрин

СК50, ррт ПР СК5о, ррт ПР

Интактные клещи 0,74±0,06 - 0,19±0,03 -

С1 2,8110,13° 3,8 0,27±0,014) 1,4

М1 4,81±0,16° 6,5 0,31±0,022) 1,6

М2 3,99+0,18" 5,4 0,29+0,013) 1,5

Примечание: "Р<0,001; 2)Р<0,001; 3)Р<0,01; ^Р<0,02.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что длительное применение пиретроидов привело к возникновению резистентных популяций клеща варроа. Величина СК50 флувалината для этих клещей на исследованных пасеках была достоверно выше по сравнению с фоновым значением с пасеки заповедника Воронежской области: в Ставропольском крае в 3,8 раза и составила

2,81+0,13 ppm, в Московской области в 6,5 раз и составила 4,81±0,16 ррт. Величина СК50 флуметрина увеличилась по сравнению с фоновым значением в Ставропольском крае в 1,4 раза и составила 0,27+0,01 ррш, в Московской области в 1,6 раза и составила 0,31 ±0,02 ррш.

2.2.6. Изучение эффективности акарицидных препаратов при варроатозе пчёл 2.2.6.1. Сравнение акарицидной эффективности препарата санокс и щавелевой кислоты в производственных опытах

Наиболее экологически-безопасными акарицидами доя борьбы с клещом варроа остаются до сих пор карбоновые кислоты (щавелевая и муравьиная), которые в небольших количествах содержатся в натуральном мёде. Однако бесконтрольное применение карбоновых кислот в 70-80 годы прошлого столетия приводило к повышению кислотности в ульях и резкому увеличению количества адгезированных микробных клеток, что способствовало широкому распространению аскосфероза и гнильцовых заболеваний пчёл. В связи с этим использование карбоновых кислот для борьбы с клещом варроа в России было фактически приостановлено.

С одной стороны, чтобы избежать повторения ошибок применения щавелевой кислоты в 80-е годы, и, с другой стороны, расширить ассортимент акарицидных средств для обеспечения возможности чередования препаратов разных химических групп, нами был разработан препарат санокс, в состав которого в качестве основных действующих веществ вошли щавелевая кислота и тимол.

Определение эффективности препарата санокс проводили в сравнении с чистой щавелевой кислотой. Санокс применяли путём смешивания 15 г препарата с 500 мл водного раствора сахара (1:1) и последующего мелкокапелыюго поливания из шприца на пчёл в дозе 5 мл на каждую улочку. Щавелевую кислоту применяли в форме 3% раствора тем же способом. Результаты проведённого исследования представлены в таблице 6.

Таблица 6.

Эффективность применения санокса и щавелевой кислоты при варроатозе пчёл в пасечных условиях

Препарат Поражённость клещом варроа, % Эффективность обработки, %

до обработки после обработки

Санокс 21,0±2,1 1,9±0,б" 91,2±2,13)

Щавелевая кислота 20,9±1,9 3,7±0,3° 82,3±2,8

Контроль 20,8+2,0 21,4+1,9 0

Примечание: иР<0,001; 2)Р<0,05.

Экспериментальные данные показывают, что эффективность щавелевой кислоты в пасечных условиях составила 82,3±2,8%, а препарата санокс -91,2±2,1%. Достоверно более высокая эффективность санокса в сравнении с чистой щавелевой кислотой обеспечивалась введением в состав препарата тимола.

2.2.6.2. Сравнение акарицидной эффективности препарата апигард и тимола в производственных опытах

Препарат апигард (Vita Europe Ltd.) представляет собой медленно испаряющийся гель, расфасованный в алюминиевые контейнеры по 50 г, содержащий в качестве действующего вещества 25% тимола и дополнительные компоненты, которые обеспечивают медлешгое испарение тимола и пролонгируют, таким образом, действие препарата.

Для сравнения акарицидной эффективности препарата апигард и тимола были выделены три группы семей пчёл, подобранных по принципу аналогов, по десять в каждой.

В первой группе контейнер с препаратом апигард помещали на соторамки под холстик, предварительно установив на него деревянную планку для облегчения доступа пчёл к акарициду. Препарат применяли дважды, с интервалом 14 дней. В семьях второй группы двухслойные марлевые мешочки с 20 г кристаллического тимола помещали сверху на соторамки. Их также использовали два-

жды через 14 дней. Семьи пчёл третьей группы ничем не обрабатывались и служили контролем.

Таблица 7.

Эффективность применения препарата апигард и тимола при варроатозе пчёл в пасечных условиях

Препарат Поражённость клещом варроа, % Эффективность обработки, %

до обработки после обработки

Тимол (испарение) 21,5±5,2 3,411,3і' 70,7±1,3

Апигард 19,3±4,2 2,0±0,62) 89,5±2,7°

Контроль 20,3+1,2 21,1±1,2 0

Примечание: "Р<0,01,2)Р<0,001.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение препарата апигард более эффективно при лечении варроатоза пчёл, чем применение кристаллического тимола. Акарицидная активность апигарда составила 89,5±2,73%, а кристаллического тимола - 70,7±1,26%.

2.2.7. Изучение токсичности препарата санокс для пчёл

Оценку токсичности для пчёл препарата санокс, основными действующими веществами которого являются щавелевая кислота и тимол, проводили согласно «Методическим рекомендациям по изучению токсического действия пестицидов и биопрепаратов на пчёл». Испытания проводились методом скармливания с сахарным сиропом и топикального нанесения. ЛД50 определяли методом пробит-анализа.

В результате проведённых испытаний было установлено, что ЛД50 препарата санокс при скармливании его пчёлам с сахарным сиропом составила 53,7 мкг/пчелу, при топикальном нанесении - 66,1 мкг/пчелу. Это позволяет, согласно действующей классификации токсичности пестицидов для пчёл, отнести препарат к 4 классу - малоопасные вещества.

Параллельно с исследованием токсического действия препарата санокс на пчёл проводили определение его влияния на физиологические показатели пчёл,

такие как гемолимфоформула, возрастной коэффициент гемолимфы (ВКГ), степень развития жирового тела, количество линидов и глюкозы в гемолимфе.

При определении гемолимфоформулы было отмечено, что поражение пчёл клещами варроа приводило к увеличению в гемолимфе количества более старых форм платоцитов (4 и 5 стадий) и повышению возрастного коэффициента гемолимфы с 0,15 до 0,18. После обработки опытных семей препаратом санокс показатель ВКГ составлял 0,11 и был близок к таковому у здоровых пчёл.

При исследовании степени развития жирового тела пчёл было установлено, что его величина у контрольных пчёл изменилась незначительно - от 2,7±0,2 до 2,9±0,1 баллов, в то время как у опытных пчёл, через месяц после обработки препаратом санокс, этот показатель повысился с 2,8±0,4 до 3,3±0,1 баллов.

Количество липидов в гемолимфе пчёл, поражённых клещами варроа, на протяжении опыта изменялось незначительно и составляло 622-634 мг%. Обработка опытных пчёл препаратом санокс за 4 недели опыта приводила к повышению уровня липидов в гемолимфе с 652,0±12,5 мг% до 790,0+22,7 мг%.

При изучении влияния препарата санокс на количество глюкозы в гемолимфе пчёл было установлено, что обработка семей этим препаратом сопровождалась достоверным повышением количества глюкозы в гемолимфе с 464,0+13,4 мг% до 518,0+15,7 мг%. В группе семей пчёл, поражённых клещом варроа и не обработанных препаратом санокс, уровень глюкозы оставался практически неизменным на протяжении всего опыта и составлял в среднем 450,0±15,8 мг%.

2.2.8. Динамика накопления остаточных количеств тимола и щавелевой кислоты в мёде

Для определения остаточных количеств тимола в мёде после обработки семей пчёл препаратами санокс и апигард нами был разработан метод газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС). Остаточные количества щавелевой кислоты определяли химико-аналитическим селективным методом, основанном на специфическом осаждении оксалат-иона хлоридом кальция.

Для исследования остаточных количеств щавелевой кислоты и тимола при обработке препаратами санокс и апигард были отобраны три группы по пять семей-аналогов.

Первую группу семей пчёл обрабатывали препаратом санокс [15 г на 500 мл водного раствора сахара (1:1)] однократно, путём мелкокапельного поливания на пчел в улочках, из расчёта 5 мл на одну улочку, согласно рекомендациям по применению препарата.

Вторую группу семей пчёл обрабатывали препаратом апигард двукратно с интервалом 14 дней, помещая контейнер с препаратом (50 г) на верхних планках соторамок.

Из опытных и контрольных групп семей пчёл регулярно отбирали усреднённые пробы мёда в количестве 50 г. При этом было установлено, что после обработки пчёл препаратом санокс в течение первых суток количество щавелевой кислоты в мёде увеличивалось до 4,5 мг/кг и понижалось через пять суток до первоначального уровня (3,6 мг/кг); остаточных количеств тимола в кормовых запасах семей пчёл обнаружено не было.

Количество тимола в мёде обработанных апигардом семей пчёл после двукратного его применения достигло 3,62 мкг/кг, а через 14 дней остаточных количеств тимола в кормовых запасах семей пчёл обнаружено не было.

ВЫВОДЫ

1. Анализ эпизоотодогического обследования пасек в период 2010-2013 г.г. показал строгую соподчинённость жизненных циклов клеща варроа ([Varroa destructor) и медоносной пчелы {Apis mellifera). Поражение пчёл клещом варроа достигало максимального значения в конце сентября - начале октября.

2. Из обследованных 2252 семей пчёл, поражённых варроатозом, в 41 семье пчёл было установлено совместное течение варроатоза и вирусных инфекций. Сочетанное поражение семей пчёл этими заболеваниями характеризовалось значительной гибелью пчёл и расплода в сравнении с отдельным течением этих заболеваний.

3. В пробах из семей пчёл с клиническими признаками поражения варроатозом и вирусными заболеваниями методом ПЦР были идентифицированы: вирус деформации крыла и вирус мешотчатого расплода.

4. В семьях пчёл, поражённых вирусными болезнями на фоне варроатоза, было выявлено достоверное снижение количества общего белка в гемолимфе пчёл и характерное изменение её аминокислотного состава.

5. Установлено, что длительное применение (более пяти лет) пиретроидов для борьбы с варроатозом пчёл приводит к возникновению резистентных популяций клеща Varroa destructor. Показатель резистентности к флувалинату достигал 6,5, к флуметрину -1,6.

6. Разработано новое экологически-безопасное лекарственное средство для борьбы с варроатозом пчёл - санокс (совместно с ООО «АПИ-САН», Москва). Определены динамика накопления остаточных количеств тимола и щавелевой кислоты в мёде и влияние препарата санокс на семьи пчёл.

7. Изучена эффективность препарата апигард (Vita Europe Ltd.) рекомендованного для борьбы с варроатозом пчёл, которая составила 89,5+2,7%. Количество тимола в мёде семей пчёл, обработанных апигардом, после двух обработок достигало 3,62 мкг/кг, а через 14 дней остатков тимола обнаружено не было.

8. Разработан метод газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) для определения остаточных количеств тимола в мёде.

9. Разработан препарат аписоль для поилок на пасеке (совместно с ООО «АПИ-САН»), который стимулирует развитие семей пчёл и повышает их продуктивность.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Результаты проведённых исследований были использованы при разработке:

- инструкции по применению санокса для лечения и профилактики варроатоза медоносных пчёл (утв. Россельхознадзором, 2010);

- инструкции по применению порошка аписоль для поилок на пасеке (утв. ООО «АПИ-САН», 2011);

- методического пособия по определению тимола в мёде (утв. отделением ветеринарной медицины РАСХН, 19.03.2013 г.).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Котова A.A. Альтернативные методы лечения варроатоза пчёл/ Международная научно-практическая конференция «Современное пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии». - Ярославль, 2010.

2. Котова А.А Апигард - эффективное и надёжное средство против варроатоза пчёл/ Пчеловодство. - №9. - 2010.

3. Котова A.A. Изучение резистентности клеща варроа к акарицидам/ Сборник Международной научно-практической конференции «Российское пчеловодство на пути вступления в ВТО». - 2012 г.

4. Котова А.А Новое средство борьбы с варроатозом пчёл/ Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». -№17.-2012.

5. Клочко Р.Т., Луганский С.Н., Котова A.A. О карантинных и ограничительных мероприятиях в пчеловодстве / Пчеловодство. - №6. - 2012.

6. Клочко Р.Т., Луганский С.Н., Котова A.A. Ветеринарно-санитарные мероприятия при варроатозе./ Пчеловодство. - №7. - 2012.

7. Котова A.A. Препарат аписоль для поилок в условиях пасеки/ Пчеловодство. - №2 - 2013.

Подписано в печать 01.04. /і> г. Усл. печ. л. 1,0, тираж 80 экз, заказ // ГНУ ВНИИВСГЭ 123022, Москва, Звенигородское ш., д.5.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Котова, Аксинья Александровна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ САНИТАРИИ, ГИГИЕНЫ И ЭКОЛОГИИ

(В Н И И В С Г Э)

04201356652

На правах рукописи

КОТОВА Аксинья Александровна УДК 619:614.449.57:638.157

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КЛЕЩА VARROA DESTRUCTOR К АКАРИЦИДАМ И РАЗРАБОТКА ЭКОЛОГИЧЕСКИ-БЕЗОПАСНЫХ СРЕДСТВ БОРЬБЫ С ВАРРОАТОЗОМ ПЧЁЛ.

06.02.05 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н., в.н.с. Клочко Р.Т.

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................8

2.1. Распространение варроатоза и экономический ущерб, наносимый им пчеловодству.........................................................................................................8

2.2. Характеристика возбудителя варроатоза и его роль как переносчика вирусных заболеваний..........................................................................................9

2.3. Средства и способы борьбы с варроатозом пчёл........................................20

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.............................................39

3.1. Методики испытаний акарицидных средств..............................................40

3.2. Исследование влияния варроатозной инвазии и лечебных препаратов на пчёл.................................................................................................................42

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...................................................................44

4.1. Некоторые эпизоотические и биологические особенности варроатоза пчёл .44

4.1.1. Динамика развития варроатозной инвазии в семьях пчёл...................44

4.1.2. Особенности течения варроатоза на фоне вирусных инфекций.........49

4.1.3. Изучение влияния вируса мешотчатого расплода и клещей варроа на биохимические показатели гемолимфы пчёл.................................................52

4.1.3.1. Влияние вируса мешотчатого расплода и варроатоза на количество общего белка в гемолимфе пчёл..............................................52

4.1.3.2. Влияние вируса мешотчатого расплода и варроатоза на содержание свободных аминокислот в гемолимфе пчёл...........................54

4.1.4. Влияние препарата аписоль на развитие семьи пчёл...........................57

4.2. Изучение резистентности клещей варроа к пиретроидам..........................61

4.2.1. Полевая диагностика резистентности клещей варроа к пиретроидам.... 62

4.2.2. Определение резистентности клеща варроа к пиретроидам путём сравнения опытных данных с фоновым значением резистентности...........64

4.3. Изучение эффективности акарицидных препаратов при варроатозе пчёл.....69

4.3.1 Изучение специфической активности препарата санокс и щавелевой

кислоты в лабораторных условиях.................................................................69

4.3.2 Изучение специфической активности препарата апигард и тимола в лабораторных условиях...................................................................................73

4.3.3. Изучение специфической активности препарата санокс и щавелевой кислоты в производственных опытах.............................................................74

4.3.4. Изучение специфической активности акарицидного препарата апигард и тимола в производственных опытах..............................................77

4.3.5. Изучение влияния санокса на репродуктивные свойства пчелиных

маток.................................................................................................................80

4.3.6 Изучение влияния санокса на биохимические показатели гемолимфы пчёл...................................................................................................................81

4.3.6.1 Определение влияния препарата санокс на гемоцитарную формулу пчёл................................................................................................................82

4.3.6.2 Определение влияния препарата санокс на степень развития жирового тела пчёл по Маурицио...............................................................83

4.3.6.3 Определение влияния препарата санокс на количество липидов в гемолимфе пчёл по Свану............................................................................85

4.3.6.4 Определение влияния препарата санокс на количество глюкозы в гемолимфе пчёл по методу Шомоньи-Нильсена........................................85

4.4. Изучение токсичности препарата санокс для пчёл....................................87

4.5. Динамика накопления остаточных количеств тимола и щавелевой кислоты в мёде....................................................................................................90

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИСЛЕДОВАНИЙ........................................94

6. ВЫВОДЫ..........................................................................................................102

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..............................................................103

8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..........................................104

9. ПРИЛОЖЕНИЕ................................................................................................132

1. ВВЕДЕНИЕ

Клещ Varroa destructor Anderson et Trueman, 2000 и вторичные вирусные инфекции, связанные с паразитированием этого клеща, по мнению большинства исследователей (Martin, 2001; Vanengelsdorp et al., 2008; Conte et al., 2010; Currie et al., 2010; Dahle, 2010; Gusmán-Novoa et al., 2010; Клочко и Луганский, 2011), являются в последние годы основными факторами гибели семей пчёл.

В связи с паразитированием на пчёлах клеща варроа во всем мире получили широкое распространение некоторые вирусные заболевания, такие как вирус мешотчатого расплода и вирус деформации крыла, которые осложняют эпизоотический процесс и в 2-3 раза ускоряют гибель пчёл (Клочко, Воронков, 2009). С ростом интенсивности инвазии инфекционные заболевания развиваются быстрее, так как клещ способствует прямому попаданию возбудителей в гемолимфу пчёл и более быстрому развитию вторичных инфекций. Клещ варроа является не только переносчиком вирусов (внутри и между колониями пчёл), но и способствует активации размножения вируса в инфицированных и ослабленных личинках и взрослых особях. В экспериментах было доказано, что клещ варроа может контаминировать теми или иными микроорганизмами до 20% расплода в период развития пчелосемей (Смирнов и Кудрявцев, 1977; Гузева, 1981; Ritter, 1990; Гробов и Гузева, 1991; Brodsgaard et al., 2000; Calderone, 1999).

Наиболее широко используемыми при борьбе с варроатозом пчёл являются препараты, относящиеся к группе пиретроидов. Однако в научной литературе всё чаще появляются сообщения о возникновении популяций клеща варроа, резистентных к пиретроидам. Всё вышеперечисленное говорит о необходимости изучения резистентности популяций этого клеща с целью подбора оптимальной схемы лечения варроатоза пчёл, а также совершенствования химического метода борьбы с клещом варроа для предупреждения развития его устойчивости к акарицидам (Watkins, 1997).

Всё большее внимание исследователей привлекают вещества природного происхождения (карбоновые кислоты, эфирные масла и их компоненты), которые при определённых способах применения не токсичны для пчёл и не приводят к накоплению остаточных количеств в мёде и продуктах пчеловодства (Arculeo et al., 1993; Brodsgaard et al., 1999; Calderone, 2000; Charrier et Imdorf, 2002; Al-Abbadi, Nazer, 2003; Nanetti et al., 2003; Rademacher & Harz, 2006; Burlew, 2009).

Изучение эпизоотических особенностей варроатоза пчёл, определение резистентности клеща варроа к синтетическим пиретроидам, разработка экологически-безопасного лекарственного средства для борьбы с варроатозом пчёл составили теоретическую и практическую основу наших исследований.

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

- изучить особенности развития варроатоза на фоне вирусных инфекций;

- изучить резистентность клеща варроа к синтетическим пиретроидам;

- разработать экологически-безопасный препарат для борьбы с

варроатозом пчёл;

- оценить лечебную эффективность и безопасность для пчёл рекомендуемых

средств;

- разработать метод определения и изучить динамику накопления тимола в

мёде.

Исследования проводились в лабораторных и производственных условиях на пасеках, неблагополучных по варроатозу и вирусным заболеваниям, на современном методическом уровне, при использовании энтомологических, токсикологических, биохимических и вирусологических методик.

Научная новизна

Изучены особенности течения варроатозной инвазии при сочетанном поражении семей пчёл варроатозом и вирусными инфекциями.

Установлены показатели резистентности популяций клещей Varroa destructor к синтетическим пиретроидам.

Разработано новое экологически-безопасное лекарственное средство для борьбы с варроатозом - санокс (совместно с ООО «АПИ-САН», г. Москва).

Для стимуляции развития семей пчёл и повышения их продуктивности совместно с ООО «АПИ-САН» разработан препарат аписоль для поилок на пасеке.

Разработан метод газожидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) для определения остаточных количеств тимола в мёде.

Определена динамика накопления остаточных количеств тимола и щавелевой кислоты в мёде.

Практическая ценность

В соавторстве с сотрудниками лаборатории ветеринарной санитарии в пчеловодстве и лаборатории токсикологии и санитарии кормов ГНУ ВНИИВСГЭ и лаборатории болезней пчёл ГНУ ВИЭВ разработаны:

- методические рекомендации по изучению средств и приёмов борьбы с варроатозом пчёл (утв. отделением ветеринарной медицины РАСХН 08.06.2010 г.);

- методическое пособие по определению тимола в мёде (утв. отделением ветеринарной медицины РАСХН 19.03.2013 г.).

На основании проведённых исследований в соавторстве с сотрудниками ООО «АПИ-САН» разработаны и внедрены:

- инструкция по применению санокса для лечения и профилактики варроатоза медоносных пчёл (утв. Россельхознадзором, 2010);

- инструкция по применению порошка аписоль для поилок на пасеке (утв. ООО «АПИ-САН», 2011).

Апробация работы

Материалы диссертации доложены:

- на международной конференции «Пчеловодство - XXI век» (г. Москва, Международная промышленная академия, 17-20 мая 2010 г.);

- на XVIII Международном ветеринарном Конгрессе (г. Москва,

гостиничный комплекс Измайлово, 24-26 апреля 2010 г.);

- на Международной научно-практической конференции «Современное

пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии» (г. Ярославль, 12-18

августа 2010 г.);

- на семинаре: «Болезни пчёл, способы их профилактики и лечения, правила обследования пасек» (г. Курск, Институт переподготовки и повышения квалификации руководящих кадров и специалистов АПК, 31 мая 2011 г.);

- на международной научно-практической конференции «Пути развития пчеловодства в России через успешный опыт регионов России, стран СНГ и Дальнего Зарубежья» (г. Ярославль, 6-8 октября 2011 г.);

- на международной научно-практической конференции «Пчеловодство России на пути вступления в ВТО» (г. Ярославль, 18-23 октября 2012 г.).

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из которых 5 - в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Проведённые исследования и полученные результаты позволяют вынести на защиту следующие основные положения диссертационной работы:

• некоторые эпизоотические и биологические особенности развития варроатоза на фоне вируса деформации крыла и вируса мешотчатого расплода;

• разработка экологически-безопасного лекарственного препарата для борьбы с варроатозом пчёл;

• оценка лечебной эффективности при варроатозе и безопасности для пчёл препаратов апигард и санокс;

• оценка резистентности клеща варроа к пиретроидам.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Распространение варроатоза и экономический ущерб, наносимый им пчеловодству

Клещ Varroa destructor (Oudemans, 1904 part.) Anderson et Trueman, 2000 распространился по всему миру и, согласно исследованиям D. De Jong (1990), D.J.T. Sumpter & S.J. Martin (2004), это связано в первую очередь с торговыми перевозками пчёл, кочевой деятельностью пчеловодов, перелётами пчёл и роёв. Первое описание клещей варроа было сделано в 1904 году голландским акаро-логом Удемансом (Oudemans, 1904), по материалам, собранным энтомологом Э. Якобсоном в семьях восковой пчелы Apis cerana F. на острове Ява. В дальнейшем клещи варроа были зарегистрированы в Сингапуре (Gunther, 1951), Гонконге и Филиппинах (Delfínado, 1963), КНР (Tzien-He, 1965), Индии (Phadke et al., 1966), Северной Корее (Tian, 1967), Камбодже и Японии (Ehara, 1968), Вьетнаме (Stephen, 1968), Таиланде (Laigo & Morse, 1969), Южной Корее (Delfínado & Baker, 1974), Парагвае и Румынии (Orosi-Pal, 1975), Тайване (Akratanakul & Burgett, 1975), Аргентине (Montiel & Piola, 1976), Бангладеше и Мьянме (Marin, 1978), Бразилии (Alves et al., 1975), Венгрии (Buza, 1978), Тунисе (Hicheri, 1978), Греции и Югославии (Santas, 1979), Иране (Crane, 1979), Ливане (Popa, 1980), США (Wenner & Bushing, 1996), Южной Африке (Allsopp et al., 1997). Впервые в фауне СССР клещи V. jacobsoni зарегистрированы Н.Г. Брегетовой в 1953 году на Дальнем Востоке по материалам, собранным с китайского подвида восковых пчёл в районе железнодорожной станции Косогор-ное (Хасанский район, Приморский край).

За время распространения данной инвазии на медоносных пчёлах в мире интерес к изучению возбудителя только возрастает, о чём свидетельствуют последние научные данные, полученные D. Anderson & J.W.H. Trueman (2000), об изменении его биологической классификации. Авторы провели сравнительное изучение ДНК клещей, паразитирующих на пчёлах в разных природно-

географических зонах мира, и установили, что паразитом Apis mellifera является новый вид клеща - Varroa destructor, а не Varroa jacobsoni, как это считалось ранее. Вместе с тем это не изменило эпизоотического значения данного паразита, а наоборот, потребовало дополнительных исследований (Koeniger & Fuchs, 1988; Шешуков, 1995; Koeniger, 2000).

Варроатоз по сей день остается одной из актуальных проблем из-за ущерба, который он наносит пчеловодству и поэтому отнесён Международным эпизоотическим бюро в список «Б» карантинных болезней пчёл, наряду с американским гнильцом (Brodsgaard & Brodsgaard, 1998; Dinar & Efrat, 1990; Sammataro et al., 2000).

По сообщению Dahle В. (2010), экономический ущерб, наносимый вар-роатозом, складывается из снижения медовой продуктивности (на 30-80%) семей и воспроизводительной функции маток, ослабления оплодотворяющей способности трутней, гибели семей пчёл, а также расходов на лечебные, профилактические и санитарные мероприятия.

2.2. Характеристика возбудителя варроатоза и его роль как переносчика вирусных заболеваний

Взрослая самка клеща варроа крупная (1,1*1,6 мм), красно-коричневого цвета, тело сплюснуто в дорсо-вентральном направлении. Самцы белого или желтовато-белого цвета, имеют меньшие размеры (De Jong, 1990).

Функцию расселения, то есть заражения новых ячеек внутри улья и новых семей пчёл, выполняют исключительно самки варроа. Забираясь осенью под стерниты брюшка пчёл, оплодотворённые самки находятся там 3-4 месяца в период зимовки пчёл. В летний период, если клещей в семье мало, они встречаются исключительно на молодых пчёлах, которые, как известно, кормят расплод и заносят самок в новые ячейки. Когда же количество клещей в семье на 100 пчёл превышает 20, они несколько чаще начинают встречаться на лётной пчеле (Ланге и др., 1977).

Биологический цикл развития представлен двумя фазами: фаза фореза, когда самки клеща находятся непосредственно на пчеле и питаются её гемолимфой, и фаза репродукции, когда клещ локализуется в запечатанном расплоде. При паразитировании на взрослых пчёлах самка обычно располагается на сочленении между головой и грудью, грудью и брюшком, а также между первыми брюшными сегментами (Rosenkranz et al., 2010).

W.J. Boot et al. (1994) указывают, что фаза репродукции начинается непосредственно перед закрытием ячеек с расплодом. По данным О.Ф. Гробова и А.К. Лихотина (2003), самка клеща переходит с взрослой пчелы в ячейку, которую она находит благодаря выделению личинками эфиров пальмитиновой кислоты. Сам клещ также содержит соединения пальмитиновой кислоты, присутствующие в воске и теле пчёл, в связи с этим он не распознаваем для последних. Преобладающее количество клещей локализуется в трутневых ячейках, так как трутни выделяют эфиров в 5,6 раз больше и в 1,7 раза продолжительнее, чем рабочие пчёлы.

Сразу после проникновения в ячейку самка опускается на дно в личиночный корм, погружается в личиночный корм дорсальной частью ко дну ячейки и головой к её крышечке (Fernandez & Coineau, 2006).

Самка откладывает спустя 60 часов после запечатывания ячейки первое -неоплодотворённое яйцо, из которого выходит самец. Остальные яйца (оплодотворённые, из которых выходят самки) она откладывает с интервалом в 30 часов. Таким образом, самки имеют диплоидный набор хромосом, а самцы - гаплоидный. M.D. Ifantidis (1983) отмечает, что самка за один цикл может отложить до шести яиц в трутневые ячейки и до пяти - в ячейки рабочих пчёл. Примерно через 36 часов после откладки яиц выходит шестиногая протонимфа. В течение следующих трёх дней протонимфа питается, растёт и трансформируется в восьминогую дейтонимфу, которая по размерам сравнима со взрослой самкой. Стадия дейтонимфы длится 3 дня. И протонимфальная и дейтоним-фальная стадии включают подвижную стадию и стадию покоя. Через 7,5-8

дней после откладки яиц дейтонимфа преобразуется во взрослую самку (Ifantidis, 1983; De Jong, 1990).

Самцы развиваются во взрослую особь за 5,5-6 дней. Они мельче и бледнее, чем самки. Ротовой аппарат самцов (хелицеры) приспособлен для переноса спермы в половые пути матки и непригоден для питания. Поэтому после оплодотворения самок самцы погибают, а оплодотворённые самки выходят из ячеек вместе с молодыми пчёлами.

Степень выраженности клинических признаков заболевания зависит от интенсивности инвазии. Цикл развития паразита строго подчинён биологичес�