Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование полиморфзма генов казеинов у крупного рогатого скота с помощью ПЦР маркеров

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование полиморфзма генов казеинов у крупного рогатого скота с помощью ПЦР маркеров"

РОССИЙСКАЯ АЕАДШЯ НАУК ИНСТИТУТ ОЕЩЕ1 ГЕИЕТШШ им. Е И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

•БЕРБЕРОВ Ешд Шронов Уда 575.174.015.3 : 636. £

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЖШШЫА ГЕНОВ КАЗЕИНОВ У ¡КРУПНОГО . РОГАТОГО СКОТА С ПОШЩ>Ю ПЦР МАРКЕРОВ

(03.00.-15 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученной степени кандидата биологических наук

Шскза 1993

Работа выполнена в Лаборатории сравнительной генетики животных, Института'Общей Генетики т. II II. Вавилова, РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНГЫ:

доктор биологических наук профессор Захаров II А.

доктор биологических наук Янковский II II кандидат биологических наук Каледин А. С.

* ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Центр"Биошшшерия", РАН

Защита состоится ""Ь" АПР£ЛЯ " 1993г. в __на

заседании , специализированного Ученого совета (Д 002.49. 01) при Институте Общей Генетики им. -Н. И. Вавилова РАН по адресу: Москва, ул. Губкина 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КОГен РАН Автореферат разослан НА РТА"1993г.

" ■ ученый секретарь

специализированного совета

кандидат биологических наук Г. а, Полухина

В настоящее время большое внимание уделяется вопроса!,i изучения í сохранения биоразнообразия-как разнообразия еидоб так и внутрипо-¡улнцконного полиморфизма. Основными методическими подходами для (©•езяия этих вопросов по праву считаются генетические Их успешное :рименение в свою очередь зависит от наличия быстрых и удобных ме-одов тестирования генотипов животных. С згой точки зрения особый ятерес представляют шлекулярна-генетические методы, дающе воз-ожность выявлять изменчивость на уровне генетического материала детки (полиморфизм ДНК) и позволяющие разрабатывать на их основе кспресс-методы тестирования генотипов.

Одной чз тагах високоинформативиых маркерных лютемм могут агь казеиновые гены, представляющее собой кластер из четырех тесно _ цэплешшх генов: AS2-, ASI-, b-, и ктказеинов (Гроклед, 1979). Гены азеинов привлекают внимание исследователей и с практической точки эения, так как они связаны с молочной продуктивностью крупного ро-iToro скота Казенны к тому же, являются группой быстро эволюцио-фуюздах белков,- что существенно при проведении эволюционных и по-гдяциокных исследований. Среди кластера казею.^вых генов наУолее (ученным является ген каппа-казеина, что делает возможным сравни-!дьный анализ эволюции этого гена у разных представителей •и. Bovidaeii других таксонов.

В настоящей работе для решения задачи' определения аллельных .риантов гена каппа-казеина и поиска полиморфных участков геи-1 бь -казеина крупного рогатого скота применен современный метод полиразной цепной реакции (ПЦР) "с последующим рестрикционным анализи.. одукта ашлификации. Преимущества этого, подхода связан;., с возмоя-стьи в короткое врега получить большое число кот исследуемого астка ДНЯ. Невысокие требования к лолимерности и очистке ДНК взя- 1 й для анализа, как и возможность де: :о исследовать продукта реак-и другими методами (рестрикция, гибридизация и г. д.) ставят ТЦР тесло основных современных молекулярна-гейегических методов.

Целью данной работы являлся анализ полиморфизма геног каппаи га-казегагоз у крупного рогатого скота и исследование возможности ■ зучекия на этой основе ДНК-каркеров, пригодных для быстрого гено-шрования животных по исследуемым локусам. Для решения этих воп-:ов были поставлены следующие конкретные задачи:

1) Оптимизация методов исследования полиморфизма ДНК (ВДРФ и '-анализа).

2) Анализ полиморфизма бедок-кодирущей части гена :алпа-казе-

ина у крупного рогатого скота.

3) Разработка экспресс-иэтода генотишфОЕанил крупного рогатого енота по логсусу каппа-казеина с использованием ПЦР-анализа.

4) Исследование полиморфизма 5'-яетраяслируемо<. области' гена бета-казеина у крупного рогатого скота методом ЩР-аналива.

В рамках работы была поставлена методическая задача применить ЭВМ для ускорения расчетов, связанных с использованием метода ПЦР.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе исследован полиморфизм ДНК белок-кодирующей части гена кагша-казеинг и 5'-нетранслируемой области гена бета-казеина у крупного рогатогс скота с использованием лолимеразной ценной реакции (ПЦР-анализ). Предложен способ определения аллельных вариантов гена каппа-казеиие с помощью ПЦР-анализа и показана высокая сходимость результатов ге-нотипирования, полученных этим методом, с данными изучения белкового полиморфизма. Проведено цитирование А- и В-аллелей каппа-казеииг для некоторых пород европейского скота и гибридов Bos taurus :? Bos indi cus. Показана высокая Частота В-адлеля (0,343) и высокий уровень гетерозиготности (62,7%) у гибридов.

Впервые определена нукльотидяая последовательность исследуемого участка каппа-казеина у зебу (Bos indicus) и показана его полная гомология с последовательности А-аллеля каппа-казеина у крупного рогатого скота европейского происхождения..

Практическая ценность. В ходе работы была проведена оптимизация условий быстрого и эффективного проведения блот-гибридизащш с разными типами гибридизациошых мембран и составлены рекомендация, которые могут Сыть использованы в научно-исследовательских лабораториях, использующих метод блот-гибридизации. Разработано программное обеспечение для практических расчетов на ЭВМ при испольвовашн ПЦР, а также программа для считывания последовательностей с секве-нирувдих гелей. Перечисленные программы в настоящее вреш исвояьау-ются в Институте молекулярной биологии РАН, Институте общей тенетники РАН, ВНИИ Генетики и седегарг лромьшенных микроорганизмов ¡ могут быть предоставлены другим заинтересовант™ организациям. Разработан исспресс-метод генотипированля локуса каппа-казеина f крупного рогатого скота с помощью ПЦР-анализа, позволяющий тестировав животных независимо от лактации, в той числе быков и молодняк,' чк существенна для селекционной практики. Показаны преимущества данного метода при необходимости массового тестирования генотипов местных в популяционных и генетико-селекционных исследованиях.

- О -

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения; обзора литературы, посвященного 'вопросам применения ДНК-маркеров, теоретическим основам пояиме-pasnoft цепной реакции и а..лпзу структуры и полиморфизма генов ка-зеинов; методической части; результатов и их обсуждения; выводов и cmrcica литературы.

Апробация.

Материалы 'диссертации докладывались на некдабораторном семинаре "Генетт« животных" ЙОГен им. Е И. Вавилова РАИ, на Всесоюзной юшференции "Геном человека 91"(г. Вереелавль-Залесский, 1991)и на 24 копференади Европейской организации генетики ч<~ човвка (ESHQ Annual ШвЬтг.Эхьсшюр, Дания, 1992).Основные результаты работы представлены в 3-х статьях.

материалы и методы

Исследование проведено па двух породах крупного рогатого скора: гибридной черяо-иестрой породы (Душерсгорф-Росток, Германия), :озданной_ па основе черно»пестрой породы с участием быков дарсейской. и голиткио-фризской пород, и "зебувидной" породи, в • (орщфовакш! которой участвовала! азербайджанские аебу (ОПХ "Сиеги-зи" PAIi). Били исследованы также н ДШС кубинских аебу (совхозы им. "Ахундова" и "Социалистическая 'Куба", Азербайджан)

Здеетрофоретипеский анализ ддеГ определения аллейьных вариантов жшпа-гааеина -ирЪводили по штодигсе, ; экомендопшпгй Хаертдиновым ЗЙертдигюв,' 1989). ' ' . .

Ядра из лейсоцитоп крови животных выделяли по ыетоду Шапиро и р. (1982). Выделение ДНК из ядер клеток' крови осуществляли! по мз^о-,у Дшиса"( Johns ot al. ,1983 )

Бактерии для выделения плавмвдной да выращивали в минимальной реде Ш (Йэниатис и др. ,1984). Плазмидные Д13С выделяли щелочным зтодом (Birnboin, Doly, 1979) о последующей -очисткой ДНК ультра-ентрнфугировагчеи в градиенте плотности CsCl (Маяизтис и др., 984). • / ' ■

Определение концентраций днк проводили спеютрофотомет^ически (Даниатио и др., 1984). Концентрацию -микроколичеств ДНК оценивали узуально, сравнивая в геле интенсивность флуоресценции пфаиешюго

бромистым этмдием образца ДНК с контрольной раститровкой. , -

Рестрикцию ДНК эндонуклеазами осуществляли при оптимальных для каждого фермента условиях:' температуре и буфоре(А5аш:атис и др. ,1984). Электрофорез проводили в 2%-ом агарозьом геле (агароза BioRad, Calbiochem или Pharmacia)или в 6%-ом подиакриламидном геле в трисборатном буфере (Маниатис и др. ,1984). '

Оптимизацию условий блот-г.ибридизации проводили на модельной системе (на Pstl-рестриктных фрагментах ДЖ фага лямбда) (Маииатис и др. ,1984). Электроперенос ДНК проводили на прибор© фирмы Hoefer Scientific Instruments, согласно инструкциям.изготовителя и условиям, рекомендуемым в статье (Bittner et al., 1980).

По-имеразную цепную .реакции проводили-по Saiki 'et al. (1988), с модификациями. Использовали'ферменты Tth-полишразу и Taq-шшшора-зу. Буферы для реакции готовили согласно указаниям производителя фермента.

Для подбора прайыеров была использована программа "Oligo". Для разработки прграш "Topt", "Primers" и. "Seq".. применяли язык.

. QuickBasic 4.5. Анализ нуклеотидиых последовательностей осуществляли с помощью программы "Micro Genie". Использовали IBM-совместшгэ пэр-сональныа компьютеры. ..

Выделение фрагментов ДНК из полиакршгашщных гелей a nepeocas-дение ДНК проводили по стандартной методике (Ыандатнс и др., 1684).

Частоты аллелдей и статистические ошибки рассчитывали по об-щэпринятой формуле (Рокицкий, 4987). Овдаемую гетерозяготность рассчитывали по фэрмуле, предложеной Айала (с'попроавкой Еейгса для малых выборок)(Айала, 1984). ■ -

результаты и обсуждение ...

1. подбор отишьшх услоеш переноса и фиксации днк м ФИЛЬтрах для аншза вдрф. v. '

к началу кашай рейоты осн^ьм способом определения полишр-физма днк был метод анализа полиморфизма ддан реетриктных фрагызп-' тов (ЦЦН>), скяаднЕахвдйся ш следующих Этапов: выделения-и рестрикции геномных днк, злактрофоретического" разделения рестрикщ'юнкых

а Экиперимеяталъиаа работа по подбору оптимальных условий переноса и фиксации ДНК на фильтрах проводилась совместно с 0. П. Се-микоэовоЯ. '■'•-"■

фрагментов и их переноса на фильтр (блоттинга) и гибридизации фрагментов на мембране с меченым зондом и радиоавтографии.

При определении ЦЦРФ однокопийных генов или генов с малым числом копий на геном успешны!, результат во многом зависит от чувствительности метода, на которую влияют эффективность переноса фрагмен-. тов' ДЕК на мембрану и способ их фиксации на мембране. В такого рода опытах необходимо выявлять ДНК в.количестве 3-4 пкг, что находится на пикнем пределе чувствительности блот-гибридизации. Повышения чувствительности блот-гибридизации чаш,е всего стараются добиваться путем увеличения удельной активности меченого зонда (Feinberg, Vogelstein, 1983, Schowalter, Sommer, 1989). Имеются .-ишь две работы, специально посвященные разработке оптимальных условий блоттинга (Khandjlan, 1986,'1987), в которых было показано, что условия переноса ДНК и способы ее фиксации существенно влияют на эффективность гибридизации и различаются для разных типов мемь^ан. Поэтому нами был'проведен подбср оптимальных условий переноса ДНК и ее фиксации на мембранах в зависимости от типа -мембран. -

Первую серий опытов провопили с использс^а- чем для переноса ДШ нескольких "буферных систем Для каждого из исследуемых типоз мембран, но с единым унифицированным способом фиксации ДНК на фильтрах ( "отжиг" в вакуума при-80 €, 2 ч). Для сравнения была также проведена гибридизация в геле. Бил построен сравнительный ряд, от- • ражаюящй эффективность переноса и последующей гибридизации следую идм образом (тип мембраны/буфер для переноса): Zeta-Probè/MaOH > Hybond C/ltt M H ij-ацетат > Hybond" H/0,411 NaQH >

> Hybond N/20XSSC > Hybond H/1 îl Nl^-ацетат > Гибридизация в геле >

> Hybond C/EOxSSC.

Условия облучения 'фильтров ультрафиолетом варьируют у разных гвторов в . широких пределах. " В данных экспериментах были полуиены )птикальныа результаты при фиксации ультрафиолетовым облучением в •ечешш 10 - 20 секунд. .

Ясслздовая'ия эффективности, блог-гибридизации с учетом тина :зг:браны, условий, перекоса и способа фиксации, позволили получить :равпителькую 1блицу для- подбора оптимальных условии для анализа в ¡шзпснмостЦ от используемого типа мембраны. На основе полеченных ;анных мотто сделать закючекие, что для получения высокой чувстви-■елыгости блот-гнбрнднзации.не следует применять стандартные одно-шнйэ условия ' перекоса ДНК и es фиксации для разных ткгов мембран

- б -.

(в том числе и нейлоновых). Необходимо учитывать специфичность используемых в опито мембран и выбирать опгишльшз для ¡шх услсвкл переноса и фиксации ДНК Для исследованных мембран рлкоиеадуешэ условия приведены в табл 1.

Мембрана

Буфер для перекоса

+

Способ фиксации ДНК

Нитроцеллюлознио ВЛ 85 НуЬопс! С Нейлоновые геЬг РгоЬе -Му1оп р1иэ НуЬопс! N Капроновые Эстония

|1М ННц-адетат |1М НН^-ацетат I

|0, 4М ЫаОН

|20х53С, 1№ШЦ-ацетат !20х55С, 1М «Нц-ацетат

0,4М МаОИ 20зйБС '

"от.таг" при 80.С или УФ "отжиг" при 80 С или УФ

"отжиг" при' 80 С УФ

■ УФ

"отжиг" при 80 С

У Ф

Таблица 1. Рекомендуемые условия переноса ДНК-и ее фиксации на фильтрах для иеследованкых типов мембран.

Чувствительность блот-гибридизации ' при соблюдении указанных условий достаточна для тестирования уникальных последовательностей с помоцыо радиоактивно-меченых зондов. Подобранные условия были использованы для анализа 1ЩРФ гена каппа-казеина у крупного рогатого скота; Однако, ' несмотря на введенные модификации метод блот-гибри-• дизации остается достаточно трудоемким .и дорогостоящим.

В процессе выполнения данной работы в литературе появились сообщения о разработке нового более быстрого и недорогого метода анализа полиморфизма да -' метода-полимеразной цепной реакции (ЩР). Поэтому основные усилия в данном исследовании ® дальнейшем были сконцентрированы на разработке прлломения метода ПЦР-аиашза кстоп-вдш перед ками задачам, а именно к задачам анализа полиморфизма генов бета--.и каппа-казенною у крупного рогатого скота

2. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИИ ПРОВЕДЕНИЯ ПНР И Р2СГРИКЦИ0Ш0Г0 АНАЛИЗА ФРАГМЕНТОВ.

. ' .Оптимизации условий проведения ПЦР проводили на фрагменте гена каппа-казеина крупного рогш'ого скота по нескольким параметрам: концентрации фермента, времени синтеза, состава буфера для амплификации, концентрация ионов магния.

• Для успешного хода амплификации существенна концентрация термофильной ДНК-полшеразы. При увеличении концентрации фермента до 3 ед. акт. (на 50 мкл инкубационной смеси) возрастает интенсивность амалпфиклции, а дальнейкее увеличение концентрации полимеразы приводит к образованию 'неопецифичэс гах продуктов реакции. Оптимальной для, ТШ-полииеразн была концентрация 1,5-2 ед. акт. при кон- . цэнтрацшГ прайшроз - 150 нг/50 мял. Поскольку многократное прогревание при высокой температуре (94 С и вше) приводит к частичной потере активности ТЫч-полимеразы , фермент добавляли в два этапа: 1,0.-1,5 ед.акт. & начала реакции и еще 0,5-1,0 ед.акт. фермента после 85-30 циклов с .поодедуюшдм проведением дополнительных 10-15 циклов.

Шла проведена таю® оптимизация времени амплификации на стадии синтеза (от 1 до 5 мин.): . оптимальное время составило 2 мин.. Температурный режим реакции подбирали на основе расчета, предложенного в статье (1хтэ е! а1., 1990) и проверяли'эмпирически.

Весьма существе нна^ для хода реакции концентрация ионов мэг,чия. Оптимальной была концентрация 1% 7,5 мМ для ПЬ-полимеразы и 3 мМ для Тал-по.чиме разы . При уменьшении количества магния снижалась эффективность. амплифчкации, при увеличении г появлялись нестецифичес-ки© продукты реакции . Следует отметите, что этот фа тор существен-то варьирует в зависимости от длины и состава праймеров, их концентрации, длины ашлифлцируешго <Г агкенгз, качества и удельной активности фэрыента-

Услозия* амплификации ' при использовании в качестве матриц- ре-сочбииантных плазмидкых ДНК или геномньос ДНК были идентичны, чо 1ец -полшераза более эффективна для проведения амплификации геношых ■ Щ, а такие; для получения високомеченных зондов.

Поскольку амплифицированкые фрагменты использовались для анаша рестрикционБСго полиморфизма ДНК, одной из стоящих перед нами задач был подбор условий рестрикции, обеспечивающих "полноту гидро-шаа продуктов. С этой целью были апробированы несколько вариантов: 1) рестрикцию проводили в том лэ буфере, что и для ПЦГ (2) пробу

перед рестрикцией разводили дистилированной водой, добавлял!! спер-шдага i! 10 х кратньй буфер для соответствующей рестрикции, (3) рестрикцию проводили посль депротешшзацпи и осаждения пробы в оптимальных для рестриктазн условиях.

Было показано, что в первом варианте результаты анализа были хорокимл, если рестрикции проводили сра^у по окончании ПДР. При хранении препарата при -20 С (от нескольких дней до 1,5 месяцев) полнота после£/юшрй рестрикции по первому способу не была исчерпывающей, что затрудняло интерпретацию результатов. Два других способа оба давали хорошие результаты, но второй вариант менее трудоемок, поэтому в большинстве случаев он и бил использован для рестрикгчошюго анализа амшшфицировашюго материала.

По литературным данным для PCR-амплификации могут быть .использованы два варианта буфера, включающих в свой состав в качестве стабилизирую «.его фактора желатин (буфер В") или бычий сывороточный альбумин (буфер "А"). Как показали соответствующие эксперименты, при использовании для амплификации буфера "Б" ашлмфнцировашьй материал хранится лучще и с болышш успехом может бкгь использован в опытах по рисгрикгаи. " .

3. ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ.

В конце 80-ых годов появились первые програхаш, способные обеспечивать относительно широкий набор возможностей для выбора -и тестирования олигоиуклеотидкых бондов или пар праймеров (Ryciilik et. al., 1989; Rosas, 1S21). E нашей работе мы примзняли разные версии программы первого автора, названной им Oligo. Эта ирогра\ш дает возможность выбрать определенную последовательность ¡¡¡НЕС. .и вести в рамках. этой последовательности яогзк высокослецяфичных оли-гокуклертидов, учитывая при этой'воэшжюсти образования агоричдой структуры или компдемонтарности праймеров друг на другом. Однако, несмотря на больше воамозиюстий .¡рограммы, довольно часто драймерц найденные' с ее помощью и имеющие хорошие ра. йтнкз характеристики давали *«i6o относительно, небольшой выход, -либо нерлецифичзм'ше продукты амплификации. Позднее были созданы программы, сканирующие базы данных, содержвдие последовательности ДНК в поисках неспецифических комплементарных участков (например Oliscan, автор-II Monpotit,1991). Паралельно -быдч опубликованы и методические приемы для улучшения специфичности отжига праймеров. . Один из них - поиск

- о -

оптимальной температуры гибридизации праймеров.

Высокая температура отжига прайме ров должна привестл к повышений специфичности реакции. Как правило в работах, посвященных ПЦР рекомендуют устанавливать Температуру отакга на 3-5 ниже .температуры плавления менее стабильного праймера. Учитывая необходимость определения оптимальных значений других параметров (как кшцентрация I.Í2++, а '"иногда и концентрации праймеров, дезокспнуюкюзидтрифосфа-тов и фермента) иозшо сделать вывод, что возможности теоретического расчета оптимального значения какого либо из параметров сократят количество экспериментов по оптимизации ПЦР.

Вскоре после публикации характеристик программы Tiro ее автор опубликовал эмпирически полученную формулу (ßychlik ot. al. , 1990) дополняющую возможности Olico при определении температуры отжига праймероп. На основе этой формулы нами была сделана небольшая программа - ТОРТ (температурный оптимум) для перерасчета температуры отлита прайшров. ¿o -многих случаях удалось повысить выход и уменьшить неспоцпфичность , хотя полученные результаты не всегда были корректными из за разницц ыегхг' реагадаш аш.члф нации с приме-ени-ем Taq и Tth поянмэраз. - •. _

•В процессе все более интенсивного применения ПЦР в насей работе »и расгаригд программ/ ТОРТ',- включая в нее возможности производить дополнит с лыще вичиолеция, необходимые в процессе практического • применения ввдзгфяюздии ,ЩПС. В tííioew конечной варианте эта програм ш называется Primers. Она состоит та двух разделов, первый из которых предназначен длг -текуцих расчетов, а второй для сохранепиг информации рб используемых прзЛмсрах в "плэстройной картотеке" и расчетов при практической работе с нем Программа читает молекулярное массы , температуры плавленши- огккга, общее количество, температуру плавления:продукта, концентрацию раствора и разведение до рабочей концентрации в ну;?лом соотношения и количество реакций при qaimolt корце расхода. • Бз втором разделе, кроме щавеперечисденних зозгЬнгостей, кояхо . вести подсчет расхода праймероз и производит ■ Юлек в "электронной картотеке" по отдельным параметрам.

В последнее время была нами сделана такта и программа (SEQ) для ггення ск®ево.:нх радиоавтографов и ввода последовательностей в г е.кстовнй/файл. Перед началом работы-следует прикрепить рентгеновскую планку с радиоавтографом к монитору, после чего монитор можно ?спользовать в качестве светящегося экрана, а чтение и ввод осуществляю с помощью светового указателя.

Таким образок, в результате проведенной работы нами было создано программное обеспечение, необходимое для оптимизирования экспериментальной работа и обработки полученных результатов.

4. ГЕГОГШШРОВАШЕ ЛОКУСА КАППА-КАЗЕИНА У КРУПНОГО СКОТА. С тшоыо ГОШШЕРАЗНОЯ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

РОГАТОГО

ВЫБОР АШШШЩРУЕШГО УЧАСТКА ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА Учитывая распределение полкшрфнш: сайтов рестрикции, позволяющих тестировать шдолыше вариант« гена калпа-каз&ина, был выбран для амшшфи-кадии участок гена длиной 228 п. и., располойаавьа в 4 -ом sisoe« гена (AI :am3eret al. ,1383), для кДПй каппа-казенна коровы это соответствует последоватеаьшсти с 440-го по 663-й нушгэотвд (Городецкий и др. ,1983). ШбрашшЯ участок гена кодирует аяпиокислотную последовательность с 103 ашвокшдоты до конца пептида, частично захватывая 3* -нетрансашруекуо область (праймзр SSO раепоаэаэи в 3' - области сразу после стоп-колона), и содержит полишрфяыз сайги рестрикции пхя четырех зндопукдааз: два (Teql а ЩгкИИ) - пая аа-леля В и два (Hlnfl н Pstl) - для амехя А (Рш. 1.): Езенчпэ полиморфных сайтов рестрювдш для нескольких рестргетез. оОесштавает возможность исппдь&ованш в дальнейзих эксверз&якзх дабой та. нвх, что расигрпат возможности исследователя щ>а аЕагзгзе шзззшрфшш амплифивдровантго учаютка.

+10809

Taq I Hind Ш

+21037 U-CnS

—,—{— Г

Pst I

k-CiiB .

SGE

--

I

rfinf r

228 n. H.

SGO

Рис. г. лок&ЕНзацая праЯдаров и рестркетная карта одбя&эдфо-ванного фрагмента гена капта-кэ-эина

Существенным моментом бшю расположение фрагианта внутри одно-

и

го экзона без захватывания интроншх областей. Это позволяло использовать те аз самыэ праймеры для амплификации рекомбинзнтних шзазыидных ДНИ, несущи кДНК аллельных вариантов А и В каппа-казеина коровы, что давало возможность иметь удобную контрольную систему для отработки условий проведения PCR и последующего рестрикционного анализа образцов.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ШШГФИКАЩШ. После проведения амплификации продолжительностью до 45 циклов при анализе электрофореграмм обнаруживалась одна полоса, подвижность которой соответствовала размеру заданного ашлпфицируемого фрагмента (228 п. н.).

О целью доказательства специфичности амплификации проводили блот -гиРтшизациа амшфщированной Д11К от нескольких случайно отобранных лязоткых. В гэчестве зонда использовали ллазмиду рКсаsk-7 ( э-родащжй й др. ,1983), гаченную "ник"-трансляций. Результаты, показали, что амядифицнровалнуе фрагменты эффективно гибридиэуются со сшцнфпческш зондом (Fiie. 2.) ■ •

Рис. 2. Блот гибридизация продуктов азяшфаетщя! плззгшдной (pXcasff ~7, доро-нсз 5) и геноиннх ДВК (1-4) с Г32И-КДВХ плазмзды pKcas;s-7..

Друтка дохазателъстЕом в пользу спещфтаости ашшфтацки ш-гут слупггь дашаз по ргстрпкцЕОНЕсыу анализу продуктов реггащя. 1&ходя -иа данных по •ауклеотвдтй носледовазельясста, в вшшфщиро-вшшои фрагменте шшааорСздо сайта дда эгщзнукгегэ [findlH, Tcql й Pstl хю,ащ5зуягся соответственно ва рЕсстозпзщ 134, 100 а 193 п. я. с? 5* -когща. Шхеэ обр&йояш продуктов амхЕп&зяггрпт одзгоЭ га сере-чгаыэкаых рестряк£аз для М-генотипа долэеп остетвся одея и&нт разгром 228 а в. ■ (дгяпа е»атг£щнроЕШКого «'ясгка), дет БЗ-геяо-тква - два фрагмента с размерами 94 и 134 п. я., 100 и 123> 0- а.

- 12 - ' •

или 163 и 35 п. н, для НихНП, Тац1 и Реи соответственно, что и было подтверждено в экспериментах с вмялифацированшм! ДНК от вотных с известным генотипом по локусу каппа-казеина (Рис. 3.). В качестве положительного контроля (наличие сайтов рестрикции) рассматривались продукты амплификации ДНК рекоыбинантной плазмиди рКсаз к-7 (аллель Б), в качестве отрицательного контроля (отсутствие сайтов рестрикции) - продукты амплификации ДЕК плазшды, рКС 371(А1ехапс]ег е1.а1. , 1988) (аллель А).

Проведанные эксперименты по гибридизации и рестрикционному 'анализу не оставляли сомнений в специфичности амплификации выбранного участка гена каппа-казеина, что позволило приступить к анализу

его аллелышх вариантов у крупного рогатого скота.

1

1 2 3 4 5 6- 7 О Э 13 11 12 13 14 15

шшшжишлш

«—22В 1Г.А

«—ia-J '

Рис. 3. Схема электрофореграыкы в 6X-noi,i полиакриламяднои геле проб плазшдиых (pKcasK-7 - дорожки- 2,9; рКС 371 - 3,10) и геномных (Г) ДНК крупного рогатого скота (образцы 1Г-4.11; ЗГ-5,12; БГ -6,13; 7Г-7Д4; ЮГ-8,15) после рестрикции Taq I (2-8) ' и Hind III (9-15). Генотипы по к-казеину: АА-ЗГ, ЮГ и рКО 371; ЕВ-1Г-, БГ, 7Г и рКсазк-7.' В качестве ыаэкера молекулярных 'весов использованы Игл Л1 -фрагменты'плазмиди pBR 322 (Alexandor et. al., 1988) !

.ОПРЕДЕЛЕН!® ШЕЯЬЕЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА КАППА-*КАЗЕИНА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА. Были исследованы геноьпше да ¡снютнах с извосгкьы • генотипом по белкам молока, а также на охарактеризованных по этому параметру. Для тестирования алдэльных вариантов гена каппа-казеина были использованы два подхода: определение ПДРФ с использованием HindiII и последующей блот-ппЗридкаацяей и ГСй-анализ с прикекзнизм " рбстриктаз Hindi II, TaqI и PstI . При использовании рестриктаз HindiII и TaqI во всех случаях наблюдалось точное соответствие ал-дельиых вариантов гена каппа-казеина, определи яья на „слове анализа белкового полиморфизма и с Йонощью ЦЦРФ и PGR-анализа, что и следовало ожидать, исходя из,-природы'данного полиморфизма. 'Как от-

началось в литературе. (Rando et al. ,1988), рестриктаза PstI такж мо;:нт быть применена для тестирования аллельных форм гена • к-казеи-на, поскольку полиморфизм ДНК r/o PstI коррелирует с аллельными вариантам.!,' icanna -казеина, хотя и не связал с амтагажлотными заменами, гак ¡так скрывается выродденностью кода.

В данной работе типир.ованш по локусу каппа-казеина животных черно-пестрой гибридной и "зебувидпой" пород крупного рогатого скота проводили методом PCR-анализа с использованием, гак правило, пары рестрк-сгаз, пюпдо сайты рестрикции в разных аллел> чых вариантах гена каппа-газеина, .например, пара HindiII и PstI или пара Hindlll и ¡¡infi.*

Использование дпух рестржтаз позволяет избежать артефактов из -за неполной рестрикции продукте!) амплнфш'лщш и увеличить тем ,а-ш достоверность, определения А- и В-аллелей гена каппа-казеина. Одновременно бил проведен аналиэ полиморфизма белков полога методом электрофореза в полакриламидном геле. Была показана высогая частота В-аллеля каппа-казеина у "зебувйдиой" (0,343, п-134) и у гибридной черно-пестрой породи (0,531, п-64). Для сравнения нолю привести дачные, полученные иеш при элегагрофоретическом анализе белков молока животных холмогорской и черно-пестрой пород: частота В-аллэля составила у них 0,194 (п-124) и 0,263 (п-228) соответственно. Для зебувидной породы следует отметить так в высокий уровень гетерози-готнссти по локусу к-клзеина (62,7%).

АШЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АШШ-ИЦИРОБШЮГО ФРАГМЕНТА ' ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА ЭЕБУ. При анализе полиморфизма гена каппа-казеина у зебувидиого скота могло било ожидать появления новых необычных вариантов рестрикцшшого полиморфизма-, поскольку в фори чэврчии этой породы участвовали зобу, которые могли внести свои варианты полиморфизма в исследуемо породу. Однако, никаких необычных вариантов наш обдэрудано не било. Поэтому прибегли к прямому анализу нуклео1 тидной последовательности амплкфицировапного участка у. зебу. С этой цолья била проведена гетерологичнат амплификация' с использованием прайме-юв SGE и SGO (подобранных на основа нуклеотидной последовательности -ДНК корови и использовавшихся для амплификации да европейского крупного рогатого скота) и геномной ДЕК зебу в качестве

^Экспериментальная работа по генотшшровашго jtanna-it-jeiraa животных черно-пестрой гибридной породы методом ПЦР-анализа была проведена совместно с О. П. Семикозовой.

матрицы. Амп.инфицированный продукт был затеи передан для клонирования и последующего секвенировакия_в ШЮ "Праймер".

Полученная нуклеотидная последовательность била транслирована в аминокислотную с помощью .компьютерной программы "Üicro Genie" и в открытой рамке чтения был получен ожидаемый участок первичной структуры А-аллельной формы белка каппа-казеина. Полученную таким образом последовательность аминокислотных остатков сравнивали с аналогичными участками первичной структуры белков аллельных форм А и В2. На этом уровне не было никаких,замен или делеций по сравнению с известными последовательностями.

Нуклеотидную последовательность анализировали на гомологию с известными последовательностями этого участка IV экзона гена каппа-казеина крупного рогатого скота, а шенно;

-полной последовательности кДНК А-аллеля каппа-казеина ¡гаровы длиной 849 п. о. (Stewart et. al., 1984; Рис.4 - 1).

-полной последовательности «ДНК В2-аллеля каппа-казеина коровы длиной 839 п. о. (ßorodetskii & Kaledln, 1987; Рис.4 - 2).

- 3' -областью кДНК В-аллеля каппа-казеина коровы длиной • 391 • п. о. (Gorodetskii et. al., 1983; Pi;c.4 - 3).

-частичной последовательностью'А-аллеля природного гена каппа казеина коровы (Alexander et. al., 1S8B; Рис.4 - 4).

Компьютерный анализ выполнений с помощью программы Micro Genie . показал следующие особенности анализируемой последовательности (Рис. 4.): " -

-последовательность имела гомологию со всеми из перечисленных выше. Гомология имела место в участке, занимающем всю длину-продукта амплификации, и процент одинаковых оснований, был от 97 до 100 X.

-х^иплеты,- кодирующие отличающиеся аминокислотные остатки в аллельных формах А и Б совпадали полностью при сравнении с последовательностью соответствующего участка А-аллеля природного гена кап- • па-казеина коровы (Alexander et. al., 1988).

-исследуемая последовательность отличалась от соответствующего участка кДНК А-аллэля каппа-казеина коровы (Stewart et. al., 1984), точечной заменой в кодоне 128 аминокислоты. Замена не выявляется ва счет Вырожденности кода. *

-последовательность оснований в исследуемом участке гена каппа-казеина зебу отличается от последовательностей, код дующих Б-ал-лелей каппа казеина заменами в кодонах'135, 148 и 153 аминокислотных остатков, характеризующими различия в аллельных вариантах.

П i—1

Z 228 ATTTATGOCCATT | EJG t ACCAAAGAAAAATCAGGATAAAACAGAAATCCCTАССЛТ

1 436 ATTTAT6GCCATT|CC|АССЛAAGAAAAATCAGGATAAAACAGAAATCCCTACCAT

2 425 ATTTATGGCCATT |CC|ACCAAAGAAAAATCAGGATAAAACAGAAATCCCTACCAT

3 03 ATTTATGGCCATT |CC|ACCAAAGAAAAATCAGGATAAAACAGAAATCCCTACCAT

4 5205 ATTTATGGCCATT | CC | ACCAAAGAAMATCAGGATAAAACAGAAATCCCT ACCAT

1-1 Z В

n I—I

Z 175 CAATACCATTGCÏAGTGG|T!GAGCCTACAAGTACACCTACCA|C|CGAAGCAGTAGAGAGCAC

1 4.09 CAAT ACCATTGCTAGTG31С | GAGCCTACAAGTACACCTACCA | С | CGAAGCAGT AGAGAGCAC

2 4P8 CAATACCATTGCTAGTGG|T|GAGCCTACAAGTACACCTACCA|T1CGAAGCAGT AGAGAGCAC

3 1GG CAATACCATTGCTAGTGG |T)GAGCCTACAAGTACACCLACCA|T|CGAAGCAGT AGAGAGCAC

4 5268 CAATACCATTGCTAGTGGIT|GAGCCTACAAGTACACCTACCA|С|CGAAGCAGTAGAGAGCAC'

i__J i_i

H ' В II в

i—ii—il—i 'm

Z 115 TGTAGCTACTCT | A | GAAG | A | TTC | T j CCAGAAGTTA | T | T GAGAGCCCACCT GAG AT С A АС AC Al 1.559 TGTAGCTACTCr|A|бААЙ|A|TTC !T|CCAGAAGTTA|T|TGAGAGCCCACCTGAGATCAACACAi

2 548■ TGTAGCTACTCr|A|GAAG|С|TTC|T|CCAGAAGTTA|С|TGAGAGCCCACCTGAGATCAACACAf

3 216 TGTAGCTACTCT | fi |6AAG|C|TTC|H |CCAGAAGTTA|С|TGAGAGCCCACCI'GAGATCAACACAi

4 5328 TGTAGCTACTCT! A!GMG!AiTTC|T ICCAG^.GTTAIT 1T GA6AGCCC ACCT GAG AT С ЛАС АС Al

i_I,I_ii_i i—J

В В в

i—i r i r~i

Z 55 CCAAGTTACTTCAÀC(T|GC|Л'"TCTAAA|AIACTCTAAGGAGACATCAAAGAAGAC

1 619 CCAAGTTACTTCAAC (T|GC|A |GTCT A'AS | A | нСПСТ WiGGAGACAT^. AAi ™ AAGAC

2 608 CCAAGTTACTTCAAC!C|GC|GjGTCTAAA|T|ACTCTA/4GGASACATCAAAGAAGAC 65a

3 276 CCAAGTTACTTCAAC\Сj GC|G|GTCTAAA|T|ACTCTAAGGAGACATCAAAGAAGAC 327

4 5388 CCAAGTTACTTCAAC | T | GC | A | GTCTAAA | A | ACTCTAAG3AGACATCAAAG,4AGAC 541 .

i_il_i i—i

Рис. 4. ' Сравнение последовательности участка гена каппа-казеина зебу с гомологичными участками того .те гена у корсви. Означения см. в тексте.

Сам факт идентичности нухлеотидной последовательности у зебу и крупного рогатого скота представляет значительный интерес, так гак указывает на высокую функциональную значимость исследуемой области гена, сохранившейся в неизмененном виде с момента эволюционного расхождения этих двух видов.

5. анализ полиморфизма 5' -нетранодируемой области гена бета- • казеина у крупного рогатого скота

Полиморфизм 5'-нетранелируемой области гена Ь-казеина также исследовали у животных черно-пестрой гибридной и "зебувидной" пород с применением рестригегаз В^Ш и НтГI. Длина амплифицируемого продукта во всех случаях была одинакова (813 п. н. )(Рис. б.), что. указывает на отсутствие делеций и инсерций. ,

-767 ' • ; +41

нтг I Вг1 и

II I ' ' .

5'-1-1-;-1-=- 3'

. Саз81 ■ ' СаБВг '

Рис. Б.' Локализация прайме ров. и рестриктная карта амлифициро-Еанного фрагмента гена бета-казеина.

*

Рестрикционный полиморфизм по эйдонуклеазе Вдг! II не'наблюдался (у всех исследованных образцов ДНК присутствовал сайт рестрикции в положении 463 п. и. ог 5'-конца фрагмента, как это следовало и из данных по нуклеотщноЯ последовательности (ВопзШд е1 а1.,1988). Для рестриктазы ШпГ Г согласно сигаенсу (Еопз'тс .еЬ а1. ,1988) в ашлифицированном фрагменте должны быть' два сайга рестрикции в по-ложеник 9 п. н. и 104 п.'н. ог его 5'-ганца;. В наших экспериментах щ «югли '1 вотировать только второй сайг, который у черно-пестрдй гибридной породы оказался полиморфным (аллель-(+) с сайтом рестрикции и аллель (-) бев такового), частота аллеля (-) била довольна низкой' (0.071, п-47). Кроме того, использование рестриктазы ШпГ I позволило выявить еще один вариант полиморфизма, обусловленный появлони-ем дополнительного сайта рестрикции для ШпГI. Этот вариант полиморфизма (Частота - 0,071, п-21)' встречался у животных "ёебувидной" породы (Рис, 6.), но отсутствовал у представителей черно-пестрой гибридной породи (п-4.7).

12 Э 4 5 6

плллмл

ta .

Рис. 6, Схема элетрофореграммы в 6% полиакриламидном. геле амп-лифицированиых фрагментов гена бега-казеина. На дороже 2 представлена проба до рестрикции, а на дородаах 3-5' после обработки эндонук-леазоЯ Hinf I. ДЬрояки 3 и'5 фрагменты длиной около 661 п. о. (с до-польшпгельяым сайтом Hinf. I), 4 а б -'709 п. о. В качестве маркера юлекулярных весов использованы btep I-фрагменты плазмиди pBR 322.

Поскольку этот вариант полиморфизма ранее не был описан, была предпринята полотка на основе адалина .дослеотидной последовательности гена (Bonsing, et al. ,1983) гт размера Hinfl-фраг ментов локализовать Еознсгдао места иукдеотидных замен, которые могли бы привести к образованию дополнительного .сайта' рестрикции для Hinfl. Наиболее вероятной представляется замена Т на С в -положении 145-ом (GACTT па GAGTC7, сайт рестрикции Hinf I - GANTC), с образованием после рестрикции Hinfl- фратееитов длиной 661, 95, 48 и 9 п. н., что хороэо соответствует•экспериментальным данным . Яроыв того, из литературных дачных известка, что наиболее часто встречаюсь замены димера CG на TQ или СА (Barder et al. ; 1084), причем из них замена Т. ка С составляет более .70Однако окончательная локализация точ-к^вой 1утации, приводящей к появления дополнительного Hinfl сайта и соответствующего ему рестрикционвого полиморфизма требует проведения специальных экспериментов.

Ранее методом ПДРФ-акализа был изучен полиморфизм З'-нетранс-лируемой и бедок-коднруйщэй областей гена ^казеина (Сулидава, Городецкий, 1988). В этой работе был показан высокий уровень полиморфизма для структурной части гена (7 вариантов спектров ЧДЩ в

отличие от З'-негранслируе.ыой области, для которой, кроме основного-варианта, был обнаружен ишь один вариант ЕДРФ по рестриктазе Шр1 с частотой встречаемости 0,032 (п-32). В настоящей работе изучен-полиморфизм ранее не исследовавшейся Б'-нетранслируешй области тона, которая такие продемонстрировала относительно низкий уровень полиморфизма. По-видимому наиболее консервативны!,и являются фукцио-налько значимые участии гена, к которым в первую очередь относятся 5' - и 3' -нетранслируеше области. На виз оку,» консервативность этих областей генов, в частности генов казеинов, указывалось и ранее (Городецкий и др., 1985). -

ВЫВОДЫ. .

1. Составлены рекомендации по оптимальны!,! условиям быстрого и аффективного проведения Олот-гибридкзации с разными типами гибрнди-зационных мембран. •

2. Разработано дополнительное программное обеспечение для опти-■•изации полимеразиой цепной реакции, предусматривающее хранение н обработку нозой информации, а также программа для считывания последовательностей с секвенируюпда гелей. ' ' ...

3. Методом полимеразиой цепней реакции проводена амплификация участка экзона IV гена каппа-казеина у различных европейских пород крупного рогатого скота (Воз taurus) и у зебу'(Bos indiciis). Оптимизированы условия проведения ПЦР и последующего рестрикционного анализа для массовых тестирований. Гипирование аллельных вариантов. А и Б с использованием рестрккционного анализа ашлифицированиого продуета показанло высокое содержание В-аллеля у еебувидной породы (частота - 0.343) и высокий уровень гетерозиготности'.(62.7Z)

4. Определена нуклеотидная последовательность выиеуказансго, участка гена itanna-казеина у зебу, показано наличие лишь одной молчащей точечной замены по сравнению с одной из известных последова- • тельностьей А-аллеля калпа-1сазеина, ■ что свидетельствует о формировании структуры гена до эволюционного расхождения Bos taurus и. Bos lndicus. ' , ■ .

■ Б. Методом ПЦР-анализа с использованием рестриктаз Bgl И и Hinf I исследован полиморфизм 5'-кетранслируемой области гена бета-казеина (длина 813 н. п.) у разных пород крупного рогатого скота. У зебувидной породы выявлен новый, ранее не .описанный мриант рзст-рикционного полиморфизма по эндонуклеазе' Hinf I (частота - 0.072). 5'- нетранслируемой области, гена бета-каззина свойственен болзе низкий уровень полиморфизма по сравнению с белок-кодирующими областями того же гена. '* . ■

Спнсск работ, опублмаэвашпга по теме диссертации:

1. Сулимова Г. Б. , [¡Мхвев Г. О., Берберов Э. 11, Иарглрян А. ¡0. , Кандаяова Л. Г. , Геногипиросание джуса каппа-1сазеина у крупного рогатого скота с помощью поллмеразной цепной реакции. - Генетика, т. 27, Но 12, .1091, с. 2053-2062.

2. Сулимова Р. Е. , Соколова С. С. , Семикозова О. П. , Нгует Л. II , Берберов 3. 11, Анализ полиморфизма ДЖ кластерных генов у крупного рогатого скота: гены кааеинов и гены главного южплекса гнстосовыестисости (BoLA)., Цитология и генетика, т. 26, "о 5, 1992, с. 18-26. ,

3. Семикозова 0. II , Бзрбзров Э. 1L , Шайхаев Г. О., Сулишьй Г. Е. Оптимизаций условий блог-пйрпдлгации ДЩ для различных типов мембран. Шлек. генетика, шкробиологля и Еирусология, 1992, No И-*-, с.14-19. .

. 4. Сулимова Г. Е., Сеипксзова 0. П., Берберов Е. М , Прш,'Мнение "гетерологичлой" ПИР в исслэдовоннях гена каппа-казеина человека Сб. -трудов 2-й' всес. конфи "Геном чеяовейа". Переславль-Валесс-кнй, oict. 1991. с. 94-05. , • •

5. SulirovaG. Е., Sernikosova'O. Р., Borfasrov Е. Я, The use of polymerase chain reaction in a study of human kappa-casein geno. .Abstracts oi th® 24-th Armal l.feeting of Europian Society of