Исследование оптических свойств мононуклеарных клеток, в том числе находящихся в процессе апоптоза, с целью их идентификации и характеризации по светорассеянию

Строкотов, Дмитрий Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование оптических свойств мононуклеарных клеток, в том числе находящихся в процессе апоптоза, с целью их идентификации и характеризации по светорассеянию
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование оптических свойств мононуклеарных клеток, в том числе находящихся в процессе апоптоза, с целью их идентификации и характеризации по светорассеянию"

005000763

На правах рукописи

Строкотов Дмитрий Игоревич

ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК, В ТОМ ЧИСЛЕ НАХОДЯЩИХСЯ В ПРОЦЕССЕ АПОПТОЗА, С ЦЕЛЬЮ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ХАРАКТЕРИЗАЦИИ ПО СВЕТОРАССЕЯНИЮ

03.01.02-биофизика

1 7 НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Красноярск-2011

005000763

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической кинетики и горения Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск)

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук

Юркин Максим Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор

Омельянчук Леонид Владимирович

доктор физико-математических наук профессор

Белобров Пётр Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт

оптики атмосферы им. Зуева Сибирского Отделения РАН (г. Томск)

Защита состоится "29" ноября 2011 г. В 13°° часов на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 при Учреждении Российской академии наук Институте Биофизики Сибирского отделения РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, д. 50 стр. 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института Биофизики Сибирского отделения РАН. Автореферат разослан "21" октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

'М-^

Л.А. Франк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В составе крови человека имеется большое количество клеток, однако решающую роль для иммунитета среди них играют Т-, В- и недифференцированные лимфоциты. В частности, Т-лимфоциты способны отличать клетки своего организма от чужеродных, после чего они координируют действие других клеток крови для реализации иммунного ответа, то есть для защиты организма от микробных и других повреждающих факторов.

За последние 50 лет наблюдается неуклонное возрастание частоты врожденных и приобретенных иммунодефицитных состояний, чему способствует глобальное распространение некоторых вирусных инфекций и серьезное ухудшение экологической ситуации. Большинство иммунодефицитов связано с нарушением деятельности иммунокомпетентных клеток крови, и особенно Т-лимфоцитов. По мере прогрессирования иммунодефицитного заболевания, качество Т-лимфоцитов в крови неуклонно снижается, и их количество меняется. Вследствие всего этого организм постепенно утрачивает способность защищаться от окружающих его микроорганизмов, вызывающих воспаление, последствия которого могут быть фатальными. Решение задач идентификации и характеризации лимфоцитов обеспечит оценку количественных показателей клеточного иммунитета у больных, которая при динамическом наблюдении в процессе терапии может быть использована для определения возможных вариантов течения заболевания и, в последующем, подбора оптимальных иммунокорригирующих средств.

Воссоздание новых клеток крови и других специализированных клеток тканей организма, например, клеток печени, мозга, нервной ткани, происходит благодаря стволовым клеткам. Самое существенное свойство стволовых клеток заключается в том, что они могут самоподдерживаться в течение длительного времени и при этом производить дифференцированные клетки, которые выполняют в организме специфические функции. Таким образом, все клетки нашего организма возникают из стволовых клеток. Стволовые клетки обновляют и замещают клетки, утраченные в результате каких-либо повреждений во всех органах и тканях. Детальное изучение стволовых клеток, включающее в себя решение задач идентификации и характеризации, даст возможность применять эти клетки не только для развития методов клеточной терапии, но и для изучения действия новых лекарств и изучения механизмов возникновения дефектов и аномалий развития человека.

Все вышеописанные клетки являются мононуклеарными, т.е. имеют одно ядро. Для идентификации и характеризации таких клеток широко используются оптические методы, поскольку они неинвазивны и обладают высокой скоростью анализа. Наиболее важными среди них являются методы, основанные на измерении светорассеяния и флуоресценции. Классическим оптическим методом изучения морфологии клеток является микроскоп, но он обладает низким быстродействием и малой точностью определения параметров, поэтому для идентификации и характеризации мононуклеарных клеток широко применяются проточные цитометры, которые позволяют одновременно измерять сигналы светорассеяния и флуоресценции от одиночных клеток со скоростью десяток тысяч частиц в секунду.

Методы, основанные на светорассеянии, быстро развивались в 1980-х. Но в начале 1990-х многоцветный флуоресцентный анализ перехватил инициативу и в

дальнейшем определял развитие проточной цитометрии. Флуоресцентные метки позволяют быстро и достоверно решить задачу идентификации, а именно разделять и подсчитывать любые субпопуляции клеток крови, но не решают задач характеризации их морфологии, т.к. флуоресцентные метки используются для изучения химической структуры клетки в масштабе нанометров, поэтому они не предоставляют никакой информации о морфологии клетки, т.е. об её размере и форме, ядре и других элементах внутренней структуры. Они определяют лишь наличие определённых макромолекул на поверхности или внутри клетки, тем самым разделяя «положительные» и «отрицательные» клетки, т.е. клетки, которые экспрессируют или не экспрессируют эти макромолекулы. Кроме того, мечение занимает некоторое время (обычно полчаса) и может модифицировать живые клетки. Это особенно важно для кинетических исследований, например апоптоза, когда требуется отслеживать состояние системы в определённые моменты времени в течение биологического процесса. Более того, одним из важнейших медицинских приложений данных методов является рутинный анализ крови. При этом актуальной проблемой становится дороговизна флуоресцентных меток. Их цена добавляется к себестоимости каждого анализа крови, в то время как методы, основанные на светорассеянии, требуют только определённого количества электричества и воды для каждого анализа.

Светорассеяние определяется распределением показателя преломления внутри клетки, которое в свою очередь напрямую связано с её морфологией. В обычных проточных цитометрах регистрируется весьма скудная информация о светорассеянии для решения задачи идентификации и характеризации клеток: можно получить лишь неточную оценку объёма клетки и идентифицировать только основные типы клеток крови.

Сканирующий проточный цитометр (СПЦ) позволяет измерять индикатрису светорассеяния одиночных частиц, которая содержит информацию, потенциально достаточную для характеризации их морфологии. Одним из преимуществ СПЦ по сравнению с микроскопом и другими оптическими методами является высокая скорость анализа клеток и большой объём собираемой информации, что обеспечивает высокую статистическую точность. Однако, такая характеризация требует решения обратной задачи светорассеяния (ОЗС), т.е. определения характеристик частицы из данных о светорассеянии, что нетривиально даже для простейших форм частицы.

Целью данной диссертационной работы является развитие методов характеризации мононуклеарных клеток и их применение для исследования клеток крови, в том числе находящихся в процессе апоптоза, с помощью сканирующего проточного цитометра. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Модифицировать сканирующий проточный цитометр для измерения принципиально нового сигнала - поляризационной индикатрисы светорассеяния, и разработать метод характеризации димеров микросфер с использованием этого измеряемого сигнала.

2. Разработать методы характеризации мононуклеарных клеток по индикатрисе светорассеяния с помощью модели двухслойного шара и применить их к эмбриональным стволовым клеткам и лимфоцитам крови человека.

3. Разработать метод определения доли Т-лимфоцитов относительно всех лимфоцитов в крови человека.

4. Исследовать различия между морфологическими характеристиками Т- и В-лимфоцитов в пробах крови нескольких доноров.

5. Разработать метод определения новых параметров апоптоза лимфоцитов крови человека.

Научная новизна работы определяется следующими наиболее значимыми результатами:

Впервые внедрен поляризационный канал в оптическую схему сканирующего проточного цитометра, что позволило решить обратную задачу рассеяния для бисфер, оптические свойства которых описываются шестью характеристиками. В настоящее время это максимально возможное число характеристик частицы, которые можно восстановить по светорассеянию.

Разработан метод характеризации бисфер с использованием поляризационной индикатрисы. Погрешность определения размеров составляет от 8 до 88 нм.

Разработан метод определения доли Т-лимфоцитов в крови человека, благодаря которому впервые продемонстрирована возможность определения доли Т-лимфоцитов в пробе по светорассеянию без использования дорогостоящих флуоресцентных меток. Метод обеспечивает определение доли Т-лимфоцитов в крови с ошибкой не хуже чем 4.5% (абсолют.).

Впервые разработан метод характеризации мононуклеарных клеток и применён

для:

1) Модели двухслойного шара с неоднородностью ядра (показана адекватность погрешностей определения параметров);

2) Нормальных лимфоцитов крови человека (средние по пробе диаметры В-лимфоцитов на 0.3 мкм больше чем у Т-лимфоцитов);

3) Лимфоцитов в апоптозе и некрозе.

Практическая ценность работы связана с развитием потенциала сканирующего проточного цитометра для проведения общего гематологического анализа. Это развитие обусловлено с одной стороны измерением дополнительной информации (поляризационной индикатрисы светорассеяния), а с другой - новыми методами характеризации. В частности, эти методы позволяют определять новые параметры клеток крови, которые потенциально являются диагностически важными. Более того, использование поляризационного сигнала позволяет приблизиться к характеризации нативных эритроцитов. Это позволит исключить процедуру сферизации эритроцитов из гематологического анализа, которая в данный момент и приводит к значительной систематической ошибке определяемых характеристик эритроцитов. Также использование новых методов характеризации открывает возможности для изучения апоптоза под действием различных факторов, таких как онколитические вирусные препараты. Таким образом, разработанные методы позволяют проводить более полную характеризацию клеток крови, в том числе и получать новые параметры апоптоза мононуклеарных клеток.

На защиту выносятся следующие положения: 1. Точность определения размеров микросфер в бисфере с использованием поляризационной индикатрисы светорассеяния составляет от 8 до 88нм.

2. Средние по пробе диаметры В-лимфоцитов достоверно больше чем у Т-лимфоцитов. Различие между средними диаметрами составляет от 0.25 до 0.32 мкм в пробах крови 2 доноров.

3. Уменьшение объема клетки на ранней стадии апоптоза лимфоцитов крови человека составляет 29% в пробе крови условно здорового донора.

Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены в 4 публикациях, включенных в прилагаемый перечень. Содержание диссертации докладывалось на международной конференции «Оптика биологических частиц» (Новосибирск, 3-6 октября 2005 г.), на международном симпозиуме «Прогресс в электромагнитных исследованиях», PIERS (Москва, 18-21 августа 2009 г.), на XXV конгрессе международного общества развития цитометрии, ISAC (Сиэтл, США, 8-12 мая 2010 г.), на международных конференциях «Атомные и молекулярные импульсные лазеры» (Томск, 10-14 сентября 2007 г., 14-18 сентября 2009 г.), на международных научных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 3-6 октября 2005 г., 26-30 апреля 2008 г., 11-15 апреля 2009 г.), на молодежных конкурс-конференциях «Фотоника и оптические технологии» (Новосибирск, 10-12 февраля 2010 г., 9-11 февраля 2011 г.), на III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА - 2010" (Москва, 21-25 июня 2010 г.), а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН.

Публикации. Основное содержание изложено в 4-х статьях в рецензируемых журналах и в тезисах международных конференций.

Личный вклад. Все приведённые в работе результаты получены либо самим автором, либо при его непосредственном участии.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 176 наименований. Диссертация изложена на 100 страницах, включает 9 таблиц и 36 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, определены цель и задачи работы, сформулированы основные положения, выносимые на защиту, и дано краткое описание диссертации по главам.

Первая глава представляет собой общий литературный обзор, в котором рассмотрены мононуклеарные клетки крови, эмбриональные стволовые клетки мыши, методы измерения и моделирования светорассеяния и существующие подходы к решению обратной задачи светорассеяния. В первом разделе описаны некоторые важнейшие для человека мононуклеарные клетки (эмбриональные стволовые клетки, Т- и В-лимфоциты), описаны их основные функции и важность определения морфологических параметров этих клеток. В частности, известно, что показатель преломления цитоплазмы циркулирующих лимфоцитов повышается у пациентов со злокачественной опухолью, а в процессе дифференцировки ЭСК изменяются размеры и форма клеток, в том числе и ядерно-цитоплазматическое соотношение.

Кроме того, описан апоптоз лимфоцитов крови человека и методы его изучения. К характерным признакам апоптоза принято относить: дегидратационное сжатие

клеток, утрату межклеточных контактов, сморщивание цитоплазматической мембраны, разрушение цитоскелета, конденсацию хроматина, фрагментацию ядер и деградацию ДНК. Методы изучения апоптоза достаточно разнообразны, и чрезвычайно удобным и информативным является метод, при котором регистрируется ранний признак апоптоза - экспрессия на поверхности клеток фосфатидилсерина. Для обнаружения этой экспрессии используют конъюгат аннексина V, который обладает сродством к фосфатидилсерину, с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

В разделе 1.2 описаны неполяризационные и поляризационные экспериментальные методы измерения светорассеяния мононуклеарных клеток, которыми являются, в частности, эмбриональные стволовые клетки, Т- и B-лимфоциты. Благодаря внедрению сканирующей проточной цитометрии к настоящему моменту достигнуты значительные успехи в изучении оптических характеристик клеток крови. Применение данной технологии расширило понимание оптических характеристик красных кровяных клеток, тромбоцитов, лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов человека, а результатом исследования стала разработка оптической клеточной модели, позволившей решить задачу характеризации, т.е. обратную задачу светорассеяния. Но разработанные оптические модели довольно просты и не могут надлежащим образом описывать сложные формы и внутренние структуры клетки. Поэтому для характеризации клеток со сложной формой и внутренней структурой необходимо вместе с измерением угловой зависимости элемента Sn для матрицы Мюллера измерять также и другие элементы этой матрицы или их комбинации.

Раздел 1.3 посвящен обзору существующих методов моделирования светорассеяния, которые можно разделить на строгие и приближённые. К последним относятся приближения Рэлея, Рэлея-Дебая-Ганса (РДГ) и Вентцеля-Крамерса-Бриллюена (ВКБ), аномальная дифракция (АД) и геометрическая оптика. Приближённые теории обладают быстротой и простотой, однако границы их применимости не определены чётко, так как их точность сильно зависит от формы частицы и от того, какую именно величину требуется вычислить. Клетки крови лишь частично попадают в область применимости РДГ, АД и ВКБ. Строгие методы, в свою очередь, удобно разделить на аналитические, частично аналитические и численные. К аналитическим методам относятся различные варианты метода разделения переменных (МРП), которые практически применимы только к шарам и сфероидам, возможно многослойным. Частично аналитические методы базируются на разложении решения дифференциального уравнения для электрического поля в частотной области в ряд по собственным функциям этого уравнения. К ним относятся обобщённый МРП, дискретизированный формализм Ми, метод согласования в конечном числе точек и метод расширенных граничных условий. Все эти методы позволяют вычислить Т-матрицу, содержащую всю необходимую информацию для быстрого моделирования светорассеяния частицей в любой ориентации или для усреднения по ориентации. Они существенно упрощаются для осесимметричных частиц, в этом случае они быстры и точны. Однако, если осесимметричная частица имеет вогнутости, применение вышеописанных методов сильно осложняется. Существуют частично аналитические методы, применимые к таким задачам, например, метод дискретных источников

(МДИ) и программа на основе нескольких мультиполей, хотя они и не вычисляют Т-матрицу. В принципе, некоторые поверхностные методы применимы к однородным частицам произвольной формы, но тогда их быстродействие сравнимо с численными методами. Неоднородные частицы произвольной формы составляют область применения численных методов, которые напрямую дискретизируют дифференциальные или интегральные уравнения для электромагнитного поля. К ним относятся метод конечных разностей во временной области (КРВО), метод конечных элементов, метод моментов (ММ) и метод дискретных диполей (МДЦ).

В данной диссертации объектами исследования являются мононуклеарные клетки, описывающиеся моделью двухслойного шара, димеры шаров (осевая симметрия) и модель двухслойного шара с неоднородностью в ядре. Для сферически-симметричных частиц быстрым и надёжным методом является теория Ми, в частности программа Борена-Хаффмана. Для касающихся димеров шаров надёжным методом является метод Т-матриц, в частности программа Мищенко. Для моделирования светорассеяния неоднородной моделью выбран МДЦ, в частности программа ADDA. Одним из факторов в пользу данного метода является то, что МДЦ показал себя намного быстрее чем КРВО для моделирования светорассеяния биологическими объектами в жидкости.

В разделе 1.4 описаны существующие подходы к решению обратной задачи светорассеяния. Для анализа одиночных частиц в реальном времени наиболее предпочтительны эмпирические или приближённые методы, которые обычно основаны на сжатии информации, содержащейся в индикатрисе, до нескольких специально подобранных параметров, которые получаются либо напрямую из индикатрисы, либо из её спектра Гегенбауэра или Фурье. При этом многомерное отображение параметров частицы (размер, показатель преломления и т.д.) в параметры индикатрисы обращается приближённо. Обобщением этого подхода является нейронная сеть, которая автоматически обращает многомерное отображение, - в настоящее время эта область быстро развивается, но для характеризации одиночных частиц нейронные сети применялись пока только для шаров. Эффективность сильно зависит от используемых параметров индикатрисы, которые подбираются вручную.

Методологически самым простым способом решения обратной задачи светорассеяния является прямая подгонка экспериментальной индикатрисы по результатам решения прямой задачи для многих наборов параметров. В данной диссертации обратная задача светорассеяния решается для мононуклеарных клеток, моделируемых двухслойным шаром, и для димеров полистирольных микросфер. В обоих случаях основой алгоритма, посредством которого решалась обратная задача, является глобальная оптимизация с помощью алгоритма DiRect. При этом для оценки погрешностей определения характеристик клеток используется оригинальный алгоритм, основанный на анализе поверхности суммы квадратов, как функции характеристик клетки, описанной в процессе работы DiRect.

Вторая_глава посвящена

модернизации существующего

прототипа сканирующего проточного ' цитометра для получения

; дополнительной информации о структуре поля рассеяния,

возникающего в результате взаимодействия лазерного излучения с клетками крови. В частности, разработаны принципы измерения поляризационной индикатрисы

светорассеяния, изготовлен и установлен в блок измерения цитометра „ , „

Кис. 1. Схема оптической системы поляризационныи канал, создано усовершенствованного сканирующего проточного математическое обеспечение для цитометра. визуализации и обработки результатов

измерения поляризационной индикатрисы светорассеяния. В первом разделе описана оптическая схема поляризационного сканирующего проточного цитометра (рис. 1). Модернизированная установка позволяет измерять одновременно регулярные и поляризационные индикатрисы одиночных частиц с угловым разрешением не хуже 0.4°.

В разделе 2.2 оптическая передаточная функция современной измерительной системы поляризационного сканирующего проточного цитометра, включающей лазеры, поляризаторы, фазовые детекторы, частицы, кюветы и фотодетекторы, описывается в формализме матриц Мюллера. Модернизированный сканирующий проточный цитометр позволяет измерять две независимые комбинации элементов матрицы Мюллера:

+ £24(#, (р))со$(2(р) - (£3| (б,(р)+ 534(в,(р))$\п{2(р)\Ь(р.

Нужно отметить, что = О для частиц, имеющих ось симметрии

бесконечного порядка. При измерении светорассеяния сферических частиц проявляется важная особенность сканирующего проточного цитометра: элементы матрицы рассеяния не зависят от азимутального угла <р и элемент 5)4 = 0 для сферической частицы, из чего следует, что

1,(в)°с 5„

ф)= 0 (2)

В разделе 2.3 представлен блок приёма данных сканирующего проточного цитометра. Оптическая система сканирующего проточного цитометра предполагает измерение с помощью фотосенсорных модулей четырех сигналов: импульсов

Поляризатор 1 + пластинка Л/4

Линза 1

Делительный кубик + 2

запуска и флуоресценции, регулярных и поляризационных сигналов

светорассеяния. Модули включают усилители и фильтры нижних частот третьего порядка с пределом верхней частоты 4 МГц. Сигналы далее усиливаются и дополнительно фильтруются фильтром нижних частот второго порядка с той же частотой. Все сигналы ФЭУ оцифровываются отдельным 14-битовым аналого-цифровым преобразователем. Сбор данных запускается с помощью компьютерной программы. На первом этапе мы получаем регулярный сигнал светорассеяния, где интенсивность

а) т б) I

/ ® 4 <1 / т "" J 8Ц ■У

Ч. *

@р

7000 80001 3900 «ООО 6000 Отсметы АЦП

7000 800013900 14000 14100 Отсчеты АЦП

аналого-цифрового Далее сигнал преобразуется в умножением на нормализации

. „ Рис. 2. Сигналы светорассеяния и флуоресценции от

светорассеяния - функция отсчетов шара (а) и от бисферы (б>1 ИЗМереннь.е сканирующим

реобразователя. проточным цитометром. Цифры соответствуют: 1 -

светорассеяния регулярному сигналу светорассеяния; 2

индикатрису поляризационному сигналу светорассеяния; 3 -

коэффициент ИМПУЛЬС* сканирующего

проточного цитометра и преобразованием отсчётов аналого-цифрового преобразователя в углы рассеяния. После этого индикатриса модифицируется умножением весовой функции, что дает взвешенную индикатрису светорассеяния. Весовая функция является приблизительным выражением нормирующего коэффициента аппаратной функции сканирующего проточного цитометра. Фактически весовая функция обеспечивает корректное отношение сигнал/шум в области углов соответствующим измеряемым экспериментальным данным. Такие преобразования применялись и к регулярному, и к поляризационному сигналам светорассеяния.

В разделе 2.4 описана проверка настройки поляризационного сканирующего проточного цитометра. Обнаружено полное соответствие между экспериментальными измерениями и теоретическим моделированием для шара в диапазоне углов от 10° до 70°. В соответствии с утверждением (2) выполнена точная юстировка лазерного луча и траектории частиц с помощью измерения сигнала светорассеяния шаров. Точность настройки сканирующего проточного цитометра контролировалась по поляризационному сигналу светорассеяния от шаров. Естественно, что поляризационный сигнал светорассеяния от шаров колеблется около нуля, что соответствует 1р{0) из уравнения (2). Данный факт служит индикатором правильной настройки оптической и гидродинамической систем сканирующего проточного цитометра.

Стандартный сигнал от димера шаров представлен на рис. 2(6). Также показаны: регулярный сигнал светорассеяния - 1, поляризационный сигнал светорассеяния - 2 и импульс флуоресценции - 3. Поляризационный сигнал светорассеяния димеров значительно превосходит уровень шума, а структура регулярного сигнала

светорассеяния от димеров была более сложной в сравнении с регулярным сигналом светорассеяния от отдельных шаров.

Поляризационный канал

сканирующего проточного цитометра предполагает дополнительную проверку соответствия экспериментальных

| данных и теории Ми. Были измерены те рис. з. Сечение конфокального изображения (слева) же шары без четвертьволновой И (усовершенствованная) оптическая модель (справа) I пластинки в оптической системе лимфоцита, сканирующего проточного цитометра,

чему соответствует линейная поляризация падающего излучения. В этом случае также наблюдается хорошее соответствие между экспериментальными и теоретическими данными.

Третья глава посвящена развитию методов решения обратной задачи светорассеяния. Предложена оптическая модель лимфоцитов, а также развиты спектральный метод, метод глобальной оптимизации Левенберга-Марквардта в режиме мультистарта и метод глобальной оптимизации с использованием алгоритма DiRect. Также предложен метод характеризации димеров сферических микрочастиц, использующий поляризационную индикатрису светорассеяния.

В первом разделе предложена оптическая модель лимфоцитов. Лимфоцит имеет почти сферическую форму и одно ядро. Конфокальный микроскоп Carl Zeiss LSM 510 МЕТА использовался для разработки оптической модели лимфоцитов. 3D изображения нескольких клеток получены конфокальной микроскопией, и сечение одного из них представлено на левой части рис. 3. Можно увидеть, что двухслойный шар - это адекватная модель первого порядка, и данная модель использовалась для решения обратной задачи светорассеяния. Очевидно, что ядро не абсолютно однородно, поэтому для изучения влияния такой неоднородности ядра на светорассеяние была усовершенствована оптическая модель добавлением сплюснутого сфероида в ядро (рис. 3 справа). Также данная модель использовалась для проверки результатов алгоритмов глобальной оптимизации при наличии модельных ошибок. Таким образом, глобальная оптимизация в нашем случае основывается на более простой модели двухслойного шара, в то время как более сложная модель использовалась только для нескольких случаев моделирования.

В разделе 3.2 развит спектральный метод характеризации. В данной работе используется Фурье-спектр индикатрисы, который использовался ранее для однородных шаров, но уже для определения характерных размеров двухслойного концентрического шара. Для двухслойного шара имеется четыре характерных размера (диаметр клетки Dc , ядерно-цитоплазматическое отношение DJDс , показатель преломления цитоплазмы mQ и показатель преломления ядра т„), а спектр индикатрисы такой частицы содержит четыре пика. Положение этих пиков пропорционально соответствующим характерным размерам, что, позволило построить алгоритм определения обоих диаметров по положениям пиков в спектре.

В разделе 3.3 представлено развитие метода глобальной оптимизации Левенберга-Марквардта в режиме мультистарта. Суть этого метода заключается в

поиске наилучших параметров модели концентрического двухслойного шара из заданного интервала. При разработке методов глобальной оптимизации в первую очередь учитывают свойства целевой функции и допустимого множества рассматриваемого класса систем, для которых разрабатывается метод. Одним из возможных подходов в отсутствии априорной информации о минимизируемой функции является метод мультистарта. В нашем случае целевой функцией является среднеквадратичное отклонение (СКО) десятичного логарифма модельной индикатрисы, вычисленной по теории Ми, от логарифма индикатрисы частицы. В качестве алгоритма регрессии (поиска локального минимума) был использован метод Левенберга-Марквардта, который превосходит по производительности метод наискорейшего спуска и другие методы сопряженных градиентов в различных задачах.

В разделе 3.4 предложен метод характеризации, использующий алгоритм Б1Яес1. Решение обратной задачи выполнено методом наименьших квадратов, т.е. минимизацией взвешенной суммы квадратов:

где ß - это вектор р параметров модели, а и 1екр - это теоретические и экспериментальные индикатрисы соответственно. Для лимфоцитов индикатриса, рассчитанная из ур. (1), характеризуется осцилляторной структурой, поэтому функция 5(ß) имеет разные локальные минимумы, что может представлять проблему для прямых (локальных) алгоритмов оптимизации. Для решения данной проблемы мы используем алгоритм DiRect, что обеспечивает всесторонность исследования пространства параметров, описанного 4-размерным прямоугольным параллелепипедом В. Этот алгоритм требует большого количества расчетного времени (несколько минут на лимфоцит). Однако в дополнение к обнаружению глобального минимума 5(ß), т.е. лучшей оценки ß0, приблизительно описывается вся поверхность наименьших квадратов, что далее используется для оценки ошибок параметров.

Варьируются следующие клеточные характеристики: диаметр клетки Dc, соотношение диаметра ядра к диаметру клетки DJDC, коэффициенты преломления цитоплазмы тс и ядра т„. Область В определяется их граничными значениями:

£>с е [4.5,10] мкм, DJDC е [0.7, 0.95], тс е [1.34,1.41], тп е [1.41,1.58],

перекрывающими диапазон морфологических характеристик лимфоцита.

Предложенный метод характеризации позволяет определить ошибки определения параметров. В нашем случае существует значительная зависимость между отклонениями г„ которая может характеризоваться модельной автокорреляционной функцией рк . Существуют точные методы работы с коррелированными экспериментальными ошибками, однако они являются довольно трудоемкими. В данной диссертации используется намного более простой метод. Известно, что сумма квадратов случайно распределенных зависимых случайных величин может быть приблизительно описана распределением если зависимость между случайными величинами может быть описана стационарным гауссовским процессом, т.е. если он полностью характеризуется рк. Количество эффективных степеней свободы результирующего распределения

■V

(3)

л^_

N + 2

Далее мы применяем Байесовский подход: Р(ст,Р) ~ а'1. Постериорная плотность вероятности Р в экспериментальной индикатрисе определяется таким образом: Р(р|/е*р) = 48(р)]"/2, где к- это нормирующая константа:

«Ф , (5)

Для расчета интегралов, включающих [8(Р)]~"/2, по В используется результат алгоритма - деление В на М (~ 104) частей с объемами V¡ и центрами р,; с

величинами = ОД), которые также известны. Среднее /(Р) рассчитывается следующим образом:

Поскольку мы знаем полное распределение вероятности параметров любой измеренной частицы, то можем найти любые статистические характеристики данного распределения. В настоящей работе мы рассчитываем математическое ожидание ц = <р> и матрицу ковариаций С = <(Р - ц)ф - ц)г>, используя ур. (6), поскольку в большинстве случаев распределение вероятности хорошо описывается многомерным нормальным распределением.

По известным характеристикам для каждого лимфоцита с известными ошибками определения этих характеристик (т.е. р., и С„ / = 1....Д» ~ количество анализируемых клеток), предложен метод оценки среднего и биологической вариабельности для всей пробы. Преимущество данной процедуры -автоматическое снижение относительного веса измерений с большими ошибками. Поэтому мы можем естественным образом включить все измерения в оценку характеристик клеток, даже те, которые кажутся ненадежными из-за больших сумм квадратов и/или стандартных отклонений характеристик.

В разделе 3.4 предложен метод характеризации димеров сферических частиц с помощью поляризационного сканирующего проточного цитометра.

Мы характеризуем бисферу по размерным параметрам х,,_ где -

размеры шаров, составляющих димер, Л - длина волны падающего лазерного луча, щ - коэффициент преломления окружающей среды; относительные коэффициенты

преломления т ="и/, где - коэффициенты преломления шаров,

/ п*>

составляющих димер. Углы Эйлера таковы: угол /? - это угол между направлением оси симметрии димера и направлением распространения лазерного луча (осью ¿), а угол а - это угол между проекцией оси симметрии димера в плоскости ху и осью х, соответствующий направлению детекторного поляризатора оптической системы сканирующего проточного цитометра (Поляризатор 2 на рис. 1). Мы применяли алгоритм ОШей, используя метод Т-матриц для решения прямой задачи для бисферы, характеристики которой варьировались в следующих диапазонах: размерный параметр и относительный коэффициент преломления шаров,

составляющих димер от 12 до 14 и от 1.12 до 1.24, соответственно; углы а и/? от 0° до 180° и от 0° до 90° соответственно. Для одновременного использования независимой информации, содержащейся в регулярной и поляризационной взвешенных индикатрисах, алгоритм реализовывался в три этапа. На первом этапе алгоритм DiRect применялся к регулярной взвешенной индикатрисе, варьировались х\,2' mi.2 и угол Р, поскольку регулярная взвешенная индикатриса не зависит от угла а. Четыре характеристики бисферы и угол [i получались на первом этапе решения обратной задачи светорассеяния. Далее мы применяли алгоритм DiRect к поляризационной взвешенной индикатрисе, варьируя углы Эйлера и фиксируя характеристики бисферы, полученные на первом этапе. Второй этап дал нам откорректированные углы а и р. Также рассчитано СКО регулярных и поляризационных экспериментальных взвешенных индикатрис от теоретических, найденных методом глобальной оптимизации. Экспериментальные точки поляризационной взвешенной индикатрисы умножили на коэффициент, чтобы уравнять СКО, рассчитанные на предыдущих двух этапах. На третьем этапе решения регулярная и домноженная на коэффициент поляризационная взвешенные индикатрисы были объединены, и алгоритм DiRect применялся для "сшитой" взвешенной индикатрисы при варьировании всех 6 характеристик. Таким образом, решение обратной задачи светорассеяния для одиночной бисферы позволяет определить четыре характеристики бисферы и углы Эйлера.

В четвёртой главе представлены результаты проведенных исследований модельных систем (полимерные микросферы и их димеры) с одновременным измерением основной и поляризационных индикатрис светорассеяния. Продемонстрированы возможности светорассеяния в определении доли Т-лимфоцитов в периферийной крови человека. Представлены экспериментальные результаты характеризации эмбриональных стволовых клеток, Т- и В-лимфоцитов крови человека и экспериментальное исследование апоптоза лимфоцитов крови человека. Первый раздел посвящен измерению бисфер. Мы использовали микросферы, поверхность которых модифицирована карбоксильными группами. Такие микросферы самопроизвольно агрегируют, образуя бисферы. Проба, содержащая мономеры и димеры шаров, измерена поляризационным сканирующим проточным цитометром.

о ш

с; о

20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60 70

Угол рассеяния, градусы

Рис. 4. Распределение среднеквадратичного отклонения регулярных и поляризационных взвешенных индикатрис бисфер от теоретических, полученных в результате глобальной оптимизации - (а). Результаты глобальной оптимизации применительно к сшитой регулярной и поляризационной взвешенным индикатрисам бисфер - (б), (в), (г).

Мы проанализировали 500 бисфер и получили распределение СКО (рис. 4(а)). Результаты решения ОЗС для трех бисфер с разными СКО показаны на рис. 4(б)-(г). Также на рис. 4(б)-(г) приведены теоретические взвешенные индикатрисы, полученные методом наименьших квадратов и рассчитанные методом Т-матриц. Кроме того, приведены характеристики бисферы и углы Эйлера для каждого шара с ошибками определения этих характеристик и углов.

Основная проблема при измерении поляризационной индикатрисы - это относительно слабый сигнал. К счастью, мы добились 1% соотношения сигнал/шум для поляризационного сигнала в сравнении с регулярным, а поляризационная индикатриса светорассеяния показала хорошее соответствие с теорией Ми в двух сериях экспериментов.

Дополнительные данные о светорассеянии, т.е. о поляризационной индикатрисе, позволили решить обратную задачу светорассеяния для бисферы, результатом чего явилась подробная характеристика пробы (таблица 1). Средний размер шаров в димерах рассчитывался путем усреднения размеров шаров, составляющих димер в пробе. Также приведены средние значения и их стандартные отклонения для

Таблица 1 Характеристики мономеров и шаров в димерах, полученные в результате решения ОЗС, используя одновременно регулярные и поляризационные индикатрисы.

размера, коэффициента преломления и углов Эйлера. Статистические результаты, приведенные в таблице 1, демонстрируют абсолютное

соответствие характеристик шаров, полученных из двух разных решений обратной задачи светорассеяния. При этом важно, что эти решения основаны на двух разных методах решения прямой задачи светорассеяния - теории Ми и метода Т-матриц. Размер шара в мономерах определялся со средней погрешностью в 13 нм, в то время как в димерах - 49 нм.

В разделе 4.2 представлены результаты характеризации мышиных

эмбриональных стволовых клеток спектральным методом и методом Левенберга-Марквардта в режиме мультистарта (таблица 2). Для каждого алгоритма показана доля успешно обработанных клеток и результаты определения параметров клеток в формате «среднее ± дисперсия» (по всей пробе).

В разделе 4.3 представлены первые экспериментальные измерения абсолютного дифференциального сечения светорассеяния лимфоцитов крови человека. Дифференциальное сечение рассчитывалось по следующей формуле:

Характеристики Мономеры шаров Шары в димерах

Средний размер, мкм Ср. зн. 2.049±0.001 2.050±0.002

Ст. откл. 0.043 0.066

Коэффициент преломления Ср. зн. 1.5975±0.0004 1.5975±0.0005

Ст. откл. 0.014 0.016

Угол Эйлера а,градус Равномерное распределение от 0 до 180

Угол Эйлера /?, градус Ср. зн. - 18.4±0.4

Ст. откл. - 9

¿в ( 2л- т„

(7)

-это

где I - это индикатриса СПЦ [ур. (1)], Я - это длина волны падающего света, т0 -коэффициент преломления окружающей среды.

Метод проточной цитометрии уже ранее применялся для изучения субпопуляций лимфоцитов. Однако возможность определения доли Т-лимфоцитов в крови этим методом в данном разделе диссертации демонстрируется впервые. Анализ лимфоцитов проводился на сканирующем проточном цитометре с одновременным измерением светорассеяния и специфической флуоресценции одиночных клеток. Флуоресценция была вызвана излучением флуорохрома, связанного с моноклональным антителом, специфичным к определенному типу лимфоцитов. Анализ особенностей светорассеяния лимфоцитами различных типов позволил выявить зависимость асимметрии распределения параметров светорассеяния лимфоцитов от доли Т-лимфоцитов в пробе. Метод обеспечил определение доли Т-лимфоцитов в

' _ „ .... Таблица 2 Результаты характеризации

крови с ошибкои не хуже чем 4.5% эм6риональных стволовых клеток (абсолют.). Анализ по предложенный нами методике занимает 10-15 минут, в то время как иммунофлуоресцентный анализ занимает десятки минут. Кроме того, современные методы

количественного анализа

Параметр Спектрал. Глоб. оптим.

Доля обраб. 35% 28%

Д, 11.0 ±4.7 мкм 10.7 ±1.1 мкм

ДД>£ 0.85 ± 0.04 0.82 ±0.04

тс - 1.38 ±0.05

т„ - 1.43 ±0.01

субпопуляций лимфоцитов очень дорогостоящи по сравнению с нашим методом. Таким образом, разработана сравнительно дешевая методика определения доли Т-лимфоцитов среди всех лимфоцитов по рассеянному ими свету, и эта доля является важной характеристикой иммунного статуса человека.

Также в данном разделе представлены результаты апробации разработанных методов характеризации на Т- и В-лимфоцитах (таблица 3). Как было обнаружено, основная разница в морфологии Т- и В-лимфоцитов - это большие средние диаметры последних. Однако эта разница меньше естественной биологической вариабельности одиночной клетки. Полагаем, что неоднородность ядра - это возможная причина отклонения измеренных индикатрис реальных лимфоцитов от рассчитанных для модели двухслойного шара.

Также выполнено предварительное моделирование с использованием более сложной модели, полученной на основе анализа конфокальных изображений реальных лимфоцитов. Из результатов характеризации можно предположить, что отклонения индикатрис реальных лимфоцитов от наиболее точно соответствующих индикатрис двухслойных шаров может быть вызвано неоднородностью ядра. Более того, такая неоднородность, возможно, немного менее выражена для В- , чем для Т-лимфоцитов, что приводит, в основном, к меньшим ошибкам в оценках параметров первого из двух. Однако гораздо более подробное исследование требуется для любого определенного вывода о точной форме неоднородности ядра лимфоцитов и его воздействии на их индикатрисы.

надежности алгоритма (достигая Таблица 3 Сравнение модельных характеристик Т- и

глобальных минимумов И достаточно В-л„мфоцитов двух доноров, о, оО, и о(<.>)

обозначают оценочное среднее, стандартное детального описания поверхности отклонение и стандартную ошибку среднего наименьших квадратов) и не соответственно, занимались его вычислительной эффективностью. Для возможности включения данного метода в стандартный анализ клеток крови требуется уменьшение времени обработки на два порядка. Это важная цель для будущего исследования.

В разделе 4.4 представлен альтернативный подход к

исследованию начальных стадий апоптоза на основе измерения морфологических изменений клеток. Основная проблема в таком исследовании состоит в том, что на

Донор t Донор 6

T В T В

Размер выборки 225 146 330 86

<Д>,мкм 6.31 6.63 6.38 6.63

офДмкм 0.50 0.65 0.57 0.73

o(<Dc>),MKM 0.04 0.06 0.04 0.09

<DJDr> 0.901 0.904 0.903 0.905

<*DJDc) 0.005 0.007 0.005 0.008

o(<.DJDc>) 0.00 i 0.001 0.001 0.001

<mc> 1.3759 1.3766 1.3765 1.3766

a(mc) 0.0026 0.0024 0.0026 0.0027

cs(<m<>) 0.0005 0.0006 0.0004 0.0008

<"'„> 1.4479 1.4502 1.4476 1.4490

o(m„) 0.0080 0.0086 0.0080 0.0094

o(<m„>) 0.0007 0.0009 0.0006 0.0013

начальной стадии апоптоза в клетке происходят только небольшие морфологические изменения, которые сложно зарегистрировать

существующей экспериментальной техникой с достаточной точностью.

Сканирующий проточный цитометр собирает большой объем информации о каждой клетке, и, используя эту информацию, разработанный в данной диссертации метод характеризации обеспечил чрезвычайно высокую (для оптических методов) точность определения параметров

Норма (а);

Средний размер: 6.56±0.03 мкм

Аполтоз * '

Средний размер: 5.86Ю.02 мкм

Оа

Некроз

Средний размер: 8.24±0.02 мш

Норма

I Средний размер : Ь 82±0 03 мкм

Апоптоз 'Д'

Средней размер: 5.30*0.02 мкм

Некроз

Средний размер 6.78±0.02 мкм

Размер клетхи. мкм

Рис. 5. Распределения по размеру лимфоцитов (слева) и их ядер (справа), полученные в результате лимфоцитов характеризации нормальных лимфоцитов (а), (г),

лимфоцитов с индуцированным процессом апоптоза (б), (д) и лимфоцитов в некрозе (в), (е). Также показаны средние размеры клеток и их ядер вместе с ошибкой среднего.

как до индукции апоптоза, так и после. Результаты характеризации,

касающиеся размеров клетки и ядра, показаны на рис. 5. Таким образом, получены принципиально новые

параметры апоптоза, причем использование данного подхода возможно и для изучения апоптоза под действием онколитических вирусных препаратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

1. Модернизирован сканирующий проточный цитометр для измерения поляризационной индикатрисы светорассеяния одиночных частиц. Уровень шума составляет не более 1% от общей интенсивности рассеяния.

2. Разработан метод характеризации бисфер с использованием поляризационной индикатрисы. Погрешность определения размеров составляет от 8 до 88 нм.

3. Разработан метод определения доли Т-лимфоцитов в крови человека. Метод обеспечивает определение доли Т-лимфоцитов в крови с ошибкой не хуже чем 4.5% (абсолют.).

4. Разработан метод характеризации мононуклеарных клеток и применён для:

а. Модели двухслойного шара с неоднородностью ядра. Показана адекватность погрешностей определения параметров. Установлено, что неоднородность ядра (с объемной долей 10%) сильно искажает индикатрису и потенциально может объяснить отличие экспериментальных индикатрис от идеальной модели двухслойного шара;

Эмбриональных стволовых клеток и нормальных лимфоцитов крови человека. Средние по пробе диаметры В-лимфоцитов на 0.3 мкм больше чем у Т-лимфоцитов, однако эта разница меньше естественной биологической вариабельности одиночной клетки;

Лимфоцитов в апоптозе и некрозе. Уменьшение объёма при апоптозе составляет в среднем 29% за 6 часов и сопровождается соответствующим увеличением показателя преломления. При некрозе происходят обратные изменения.

Ь.

с.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Strokotov D.I., Yurkin М.А., Gilev K.V., van Bockstaele D.R., Hoekstra A.G., Rubtsov N.B., Maltsev V.P. Is there a difference between T- and B-lymphocyte morphology? //J. Biomed. Opt. - 2009. - V.14. - P.064036-12.

2. Strokotov D.I., Moskalensky A.E., Nekrasov V.M., and Maltsev V.P. Polarizing light-scattering profile - advanced characterization of non-spherical particles with the scanning flow cytometry. II Cytometry - 2011. - V.79. - P.570-579.

3. Строкотов Д.И., Мун В.И., Семьянов K.A., Мальцев В.П. Определение доли Т-лимфоцитов в крови по светорассеянию. // Вестник НГУ, серия: Физика -2008. - Т.З. - С.53-58.

4. Строкотов Д.И., Пичугин Ю.Г., Юркин М.А., Гридина М.М., Серов O.JI., Мальцев В.П. Использование решения обратной задачи светорассеяния для характеризации мононуклеарных клеток. // Вестник НГУ, серия: Физика - 2009 -Т.2. -С.61-68.

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Подписано в печать 18.10.2011. Заказ№ 105. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

.'л

/ с

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Строкотов, Дмитрий Игоревич

Введение 4»

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Мононуклеарные клетки'

1.1.1. Эмбриональные стволовые клетки.

1.1.2. Т- и В-лимфоциты.

1.1.3. Апоптоз лимфоцитов.

1.2. Существующие экспериментальные решения

1.2.1. Неполяризационные измерения.

1.2.2. Поляризационные измерения.

1.3. Моделирование светорассеяния

1.4. Обратная задача светорассеяния

Глава 2. Поляризационный сканирующий проточный цитометр

2.1. Оптическая схема

2.2. Измеряемый сигнал 29'

2.3. Блок приема данных 32 2.4: Проверка настройки С11Ц

2.4.1. Круговая поляризация.

2.4.2. Линейная поляризация.

Глава 3. Развитие методов решения обратной задачи светорассеяния

3.1. Оптическая модель лимфоцитов

3.2. Спектральный метод,

3.3. Метод Левенберга-Марквардта в режиме мультистарта

3.4. Использование алгоритма БШе^

3.4.1. Глобальная оптимизация.

3.4.2. Ошибки в оценках параметров.

3.4.3. Характеризация пробы.

З.5. Метод характеризации димеров сферических микрочастиц

Глава 4: Экспериментальные результаты

4.1. Измерение димеров полистирольных сферических микрочастиц

4.1.1. Пробоподготовка.

4.1.2. Характеризация.

4.1.3: Обсуждение результатов.

4.2. Измерение эмбриональных стволовых клеток

4.2.1. Пробоподготовка.

4.2.2. Характеризациястволовых клеток спектральным: методом и методом Левенберга-Марквардта в режиме мультистарта.

4.2.3. Обсуждение результатов.

4.3. Измерение Т- и В-лимфоцитов крови человека

4.3.1. Пробоподготовка.

4.3.2. Дифференциальное сечение светорассеяния лимфоцитов.

4.3.3. Определение долиТ-лимфоцитов в крови.

4.3.4. Характеризация лимфоцитов спектральным методом и методом Левенберга-Марквардта в режиме мультистарта.

4.3.5. Характеризация^Т- и В-лимфоцитов с использованием алгоритма Б1Кесе.

4.3.6. Сравнение клеточных характеристик Т- и В-лимфоцитов.

4.3.7. Обсуждение результатов.

4.4. Экспериментальное исследование апоптоза лимфоцитов крови; человека 79*'

4.4.1. Пробоподготовка.

4.4.2. Кинетическая схема апоптоза лимфоцитов.

4.4.3. Характеризация апоптоза лимфоцитов.

4.4.4. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование оптических свойств мононуклеарных клеток, в том числе находящихся в процессе апоптоза, с целью их идентификации и характеризации по светорассеянию"

В составе крови человека имеется большое количество клеток, однако решающую роль для иммунитета среди них играют Т-, В- и недифференцированные лимфоциты. В частности, Т-лимфоциты способны отличать клетки своего организма от чужеродных, после чего они координируют действие других клеток крови для реализации иммунного ответа, то есть для защиты организма от микробных и других повреждающих факторов [1].

За последние 50 лет наблюдается неуклонное возрастание частоты врожденных и приобретенных иммунодефицитных состояний, чему способствует глобальное распространение некоторых вирусных инфекций и серьезное ухудшение экологической ситуации. Большинство иммунодефицитов связано с нарушением деятельности иммунокомпетентных клеток крови, и особенно Т-лимфоцитов. По мере прогрессирования иммунодефицитного заболевания, качество Т-лимфоцитов в крови неуклонно снижается, и их количество меняется. Вследствие всего этого организм постепенно утрачивает способность защищаться от окружающих его микроорганизмов, вызывающих воспаление, последствия которого могут быть фатальными. Решение задач идентификации и характеризации лимфоцитов обеспечит оценку количественных показателей клеточного иммунитета у больных, которая при динамическом ' наблюдении в процессе терапии может быть использована для определения возможных вариантов течения заболевания и, в последующем, подбора оптимальных < иммунокорригирующих средств [2].

Воссоздание новых клеток крови и других специализированных клеток тканей I организма, например, клеток печени, мозга, нервной ткани, происходит благодаря стволовым клеткам. Самое существенное свойство стволовых клеток заключается в том, что они могут самоподдерживаться в течение длительного времени и при этом производить дифференцированные клетки, которые выполняют в организме специфические функции. Таким образом, все клетки нашего организма возникают из стволовых клеток. Стволовые клетки обновляют и замещают клетки, утраченные в результате каких-либо повреждений во всех органах и тканях. Детальное изучение стволовых клеток, включающее в себя решение задач идентификации и характеризации, даст возможность применять эти клетки не только для развития методов клеточной терапии, но и для изучения действия новых лекарств и изучения механизмов возникновения дефектов и аномалий развития человека [3].

Все вышеописанные клетки являются мононуклеарными, т.е. имеют одно ядро. Для идентификации и характеризации таких клеток широко используются оптические методы, поскольку они неинвазивны и обладают высокой скоростью анализа. Наиболее важными среди них являются методы, основанные на измерении светорассеяния и флуоресценции. Классическим оптическим методом изучения морфологии клеток является микроскоп [4], но он обладает низким быстродействием и малой точностью определения параметров, поэтому для идентификации и характеризации мононуклеарных клеток широко применяются проточные цитометры [5, 6], которые позволяют одновременно измерять сигналы светорассеяния и флуоресценции от одиночных клеток со скоростью десяток тысяч частиц в секунду.

Обзор истории развития таких методов в проточной цитометрии был проведён в диссертации [7]. В частности, методы, основанные на светорассеянии, быстро развивались в 1980-х [5, 8, 9]. Но в начале 1990-х многоцветный флуоресцентный анализ перехватил инициативу и в дальнейшем определял развитие проточной цитометрии [6]. Флуоресцентные метки позволяют быстро и достоверно решить задачу идентификации, а именно разделять и подсчитывать любые субпопуляции клеток .крови, но не решают задач характеризации их морфологии, т.к. флуоресцентные метки используются для изучения химической структуры клетки в масштабе нанометров, поэтому они не предоставляют никакой информации о морфологии клетки, т.е. об её размере и форме, ядре и других элементах внутренней структуры. Они определяют лишь наличие определённых макромолекул на поверхности или внутри клетки, тем, самым разделяя «положительные» и «отрицательные» клетки, т.е. клетки, которые экспрессируют или не экспрессируют эти макромолекулы. Кроме того, мечение занимает некоторое время (обычно полчаса [10]) и может модифицировать живые клетки [11]. Это особенно важно для кинетических исследований, например апоптоза, когда требуется отслеживать состояние системы в определённые моменты времени в течение биологического процесса. Более того, одним из важнейших медицинских приложений данных методов является рутинный анализ крови. При этом актуальной проблемой становится дороговизна флуоресцентных меток. Их цена добавляется к себестоимости каждого анализа крови, в то время как методы, основанные на светорассеянии, требуют только определённого количества электричества и воды для каждого анализа.

Светорассеяние определяется распределением показателя преломления внутри клетки, которое в свою очередь напрямую связано с её морфологией. В обычных проточных цитометрах регистрируется весьма скудная информация о светорассеянии для решения задачи идентификации и характеризации клеток [6]: можно получить лишь неточную оценку объёма клетки и идентифицировать только основные типы клеток крови.

Сканирующий проточный цитометр (СПЦ) позволяет измерять индикатрису светорассеяния одиночных частиц [12], которая содержит информацию, потенциально достаточную для характеризации их морфологии. Одним из преимуществ СПЦ по сравнению с микроскопом и другими оптическими методами является высокая, скорость анализа клеток и большой объём собираемой информации, что обеспечивает высокую статистическую точность. Однако, такая характеризация требует решения обратной задачи светорассеяния (ОЗС), т.е. определения характеристик частицы из данных о светорассеянии, что нетривиально даже для простейших форм частицы [13].

В данной работе предложены три метода характеризации мононуклеарных клеток по индикатрисам светорассеяния, измеренных с помощью сканирующего проточного цитометра, и метод характеризации димеров сферических частиц, использующий дополнительную независимую информацию — поляризационную индикатрису светорассеяния. Также в работе показана возможность определения доли* Т-лимфоцитов в пробе по светорассеянию без использования дорогостоящих флуоресцентных меток. Методы были апробированы на димерах сферических .частиц, эмбриональных стволовых клетках мыши и Т- и В-лимфоцитах крови человека. Также разработанный- метод характеризации применялся на лимфоцитах с индуцированным механизмом апоптоза.

Задачами данной работы является:

3. Разработать метод определения доли Т-лимфоцитов относительно всех лимфоцитов в крови человека.

5. Разработать метод определения новых параметров апоптоза лимфоцитов крови человека.

Теоретическая ценность работы заключается в развитии методов решения обратной задачи светорассеяния для мононуклеарных клеток, которые непосредственно применимы к различных объектам имеющим такую же морфологию, например, моноцитам, эритробластам, клеткам альвеолярного эпителия, клеткам саркомы Юинга. Более того, предложенные идеи, например оценка погрешностей определения параметров частицы с помощью алгоритма ОШес! могут быть использованы для частиц более сложной (несферической) формы, например тромбоцитов, эритроцитов и бактерий. Кроме того, данная работа развивает многопараметрические методы классификации и указывает на пути их улучшения.

Практическая ценность работы связана с развитием потенциала сканирующего проточного цитометра для проведения общего гематологического анализа. Это развитие обусловлено с одной стороны измерением дополнительной информации (поляризационной индикатрисы светорассеяния), а с другой — новыми методами характеризации. В частности, эти методы позволяют определять новые параметры клеток крови, которые потенциально являются диагностически важными. Более того, использование поляризационного сигнала позволяет приблизиться к характеризации нативных эритроцитов. Это позволит исключить процедуру сферизации эритроцитов из гематологического анализа, которая в данный момент и приводит к значительной систематической ошибке определяемых характеристик эритроцитов [14]. Также использование новых методов характеризации открывает возможности для изучения апоптоза под действием различных факторов, таких как онколитические вирусные препараты. Таким образом, разработанные методы позволяют проводить более полную характеризацию клеток крови, в том числе и получать новые параметры апоптоза мононуклеарных клеток.

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения СО РАН в рамках интеграционных проектов СО РАН № 37 и № 7, грантов Федеральной Целевой Программы Министерства образования и науки Р422, Р2497, Р1039 и 14.740.11.0729, гранта № 2009-27-15 Президиума РАН, гранта Президента Российской Федерации № НШ-65387.2010.4 по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации и по договору НГУ с Министерством образования и науки № 11.034.31.0034 «Новые подходы к разработке лекарств: поиск, отбор и конструирование непатогенных для человека штаммов вирусов, перспективных для использования в качестве онколитических препаратов».

Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 176 наименований. Диссертация изложена на 100 страницах, включает 9 таблиц и 36 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Строкотов, Дмитрий Игоревич

Основные результаты работы докладывались на

1. Международной конференции «Оптика биологических частиц» (Новосибирск, 3-6 октября 2005 г.);

2. Международном симпозиуме «Прогресс в электромагнитных исследованиях», PIERS (Москва, 18-21 августа 2009 г.);

3. XXV конгрессе международного общества развития цитометрии, ISAC (Сиэтл, США, 8-12 мая 2010 г.);

4. Международных конференциях «Атомные и молекулярные импульсные лазеры» (Томск, 10-14 сентября 2007 г., 14-18 сентября 2009 г.);

5. Международных научных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 3-6 октября 2005 г., 26-30 апреля 2008 г., 11-15 апреля 2009 г.);

6. Молодежных конкурс-конференциях «Фотоника и оптические технологии» (Новосибирск, 10-12 февраля 2010 г., 9-11 февраля 2011 г.);

7. III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА-2010" (Москва, 21-25 июня 2010 г.);

8. Научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН; опубликованы в следующих статьях:

2. Strokotov D.I., Moskalensky A.E., Nekrasov V.M., and Maltsev V.P. Polarizing light-scattering profile — advanced characterization of non-spherical particles with the scanning flow cytometry. // Cytometry - 2011. - V.79. - P.570-579.

3. Строкотов Д.И., Мун В.И., Семьянов K.A., Мальцев В.П. Определение доли Т-лимфоцитов в крови по светорассеянию. // Вестник НГУ, серия: Физика — 2008. — Т.З.-С.53-58.

4. Строкотов Д.И., Пичугин Ю.Г., Юркин М.А., Гридина М.М., Серов O.JL, Мальцев

B.П. Использование решения обратной задачи светорассеяния для характеризации мононуклеарных клеток. // Вестник НГУ, серия: Физика — 2009. — Т.2. — С.61-68. и опубликованы в тезисах к конференциям:

1. Колесникова И.В., Строкотов Д.И. Исследование апоптозных клеток методом сканирующей проточной цитометрии. // Тезисы докладов конкурса студенческих научно-исследовательских курсовых работ — 11 и 25 октября 2004, Новосибирск.

C.13-14.

2. Strokotov D.I., Skribunov I.G., Yurkin M.A., van Bockstaele D.R., Lenjou M., Semyanov K.A. Identification of blood cells subpopulations from angle resolved light scattering. // In Proceedings of the NATO Advanced Research Workshop: Optics of Biological Particles — 3-6 October 2005, Novosibirsk. - V.104. - P.48-49.

3. Строкотов Д.И. Изучение характерных особенностей морфологии лимфоцитов по светорассеянию. // Материалы XLIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» — 11-13 апреля 2006, Новосибирск. - С.66-67.

4. Strokotov D.I., Semyanov К.А. The determination of the morphological parameters by scanning flow cytometry. // Conference abstracts VIII International conference Atomic and Molecular Pulsed Lasers (AMPL-2007) - 10-14 September 2007, Tomsk. - V.120. -P.61.

5. Строкотов Д.И. Изучение характерных особенностей морфологии лимфоцитов по светорассеянию. // Материалы XLVI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» — 26-30 апреля -2008, Новосибирск. - С.216.

6. Строкотов Д.И. Новые возможности в характеризации лимфоцитов и моноцитов крови человека по светорассеянию. // Материалы XLVII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» — 11-15 апреля 2009, Новосибирск. — С.59.

7. Yurkin М.А., Strokotov D.I., Gilev K.V., Van Bockstaele D.R., Hoekstra A.G., Rubtsov N.B., Maltsev V.P. Characterization of lymphocytes using the scanning flow cytometry. // in PIERS 2009 in Moscow Abstracts, Moscow - 2009. - P.352.

8. Strokotov D.I., Yurkin M.A., Maltsev V.P. Solution of inverse light scattering problem for mononuclear cell characterization. // Conference abstracts IX International conference Atomic and Molecular Pulsed Lasers (AMPL-2009) - 14-18 September 2009, Tomsk. -V.130. — P.109.

9. Строкотов Д.И., Юркин M.A. Использование решения обратной задачи светорассеяния для характеризации мононуклеарных клеток. // Материалы молодежной конкурс-конференции «Фотоника и оптические технологии» — 10-12 февраля 2010, Новосибирск. — С.53.

10. Strokotov D.I., Yurkin М.А., Gilev K.V., Maltsev V.P. Scanning flow cytometry in measurement of lymphocyte morphology: cell and nucleus sizes, cytoplasm and nucleus refractive indices. // XXV Congress of the International Society for Advancement of Cytometry - 8-12 May 2010, Seattle, Washington, USA. - P.217.

11. Гилев К.В., Строкотов Д.И., Юркин М.А. Характеризация мононуклеарных клеток по светорассеянию методом глобальной оптимизации. // Сборник материалов III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА - 2010" - 2010, Москва. - Т.4. - С. 121 -122.

12. Строкотов Д.И., Юркин М.А., Москаленский А.Е., Некрасов В.М., Мальцев В.П. Поляризация рассеянного излучения — перспективный метод характеризации несферических частиц с помощью сканирующей проточной цитометрии. // Материалы молодежной конкурс-конференции "Фотоника и оптические технологии" — 9-11 февраля 2011, Новосибирск. — С.58.

Заключение

В данной диссертации проведено развитие методов решения обратной задачи светорассеяния, что позволяет получать характеристики мононуклеарных клеток. Внедрение поляризационного канал в оптическую схему Г.ПТТ позволило решить обратную задачу рассеяния для димеров сферических частиц. Предложен метод определения доли Т-лимфоцитов в крови человека по индикатрисам, измеряемым сканирующим проточным цитометром. Была исследована устойчивость метода решения обратной задачи светорассеяния для мононуклеарных клеток к неоднородностям внутри ядра. Было проведено экспериментальное исследование апоптоза лимфоцитов крови человека с помощью СПЦ.

Модификация сканирующего проточного цитометра для измерения поляризационной индикатрисы светорассеяния

В отличие от стандартной оптической схемы сканирующего проточного цитометра, измеряющей только интенсивность светорассеяния (разрешённый по углу элемент 511 матрицы рассеяния Мюллера), усовершенствованный прибор позволяет дополнительно измерять поляризацию светорассеяния одиночных частиц. Теоретически поляризационная индикатриса светорассеяния является комбинацией нескольких элементов матрицы Мюллера и предоставляет дополнительные независимые данные, необходимые для решения обратной задачи светорассеяния для частиц со сложной формой и внутренней структурой. Перспективы использования поляризационного сигнала продемонстрированы на димерах полимерных бисфер. Характеристики бисферы, а именно размеры и коэффициенты преломления каждого шара, были с успехом получены с помощью метода решения обратной задачи светорассеяния. Благодаря использованию поляризационного сигнала стало возможным определить углы Эйлера, описывающие ориентацию бисфер относительно направления падающего лазерного луча и осью поляризатора оптической системы. И обычная, и поляризационная индикатрисы показывали хорошее согласие (в абсолютных единицах) с моделированием методом Т-матриц, обеспечивая среднюю точность 49 нм измерения размеров шаров в бисферах.

Развитие методов решения обратной задачи светорассеяния

В данной работе предложены три метода решения обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц, морфология которых описывается моделью двухслойного шара. При этом для решения обратной задачи использовались спектральный метод, метод глобальной оптимизации Левенберга-Марквардта в режиме

86 мультистарта и метод глобальной оптимизации с использованием алгоритма БШес!:. Работоспособность созданных алгоритмов решения обратной задачи подтверждается на примере анализа индикатрис лимфоцитов и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши, измеренных с помощью СПЦ. Оба метода, спектральный метод и метод глобальной оптимизации, использовались для определения диаметров и показателей преломления ядра и цитоплазмы ЭСК и лимфоцитов человека. Измеренные таким образом параметры клеток в целом согласуются с литературными данными. Определение этих параметров актуально для диагностики патологических состояний лимфоцитов и статуса дифференцировки ЭСК. Методики, описанные в данной работе, применимы для всех мононуклеарных клеток. Кроме того, рассмотрены ограничения предложенных методов и способы их улучшения.

Определение доли Т-лимфоцитов в крови

Метод проточной цитометрии уже ранее применялся для изучения субпопуляций лимфоцитов [175, 176]. Однако возможность определения доли Т-лимфоцитов в крови этим методом демонстрируется впервые. Анализ лимфоцитов проводился на сканирующем проточном цитометре с одновременным измерением светорассеяния и специфической флуоресценции одиночных клеток. Флуоресценция была вызвана излучением флуорохрома, связанного с моноклональным антителом, специфичным к определенному типу лимфоцитов. Анализ особенностей светорассеяния лимфоцитами различных типов позволил выявить зависимость асимметрии распределения параметров светорассеяния лимфоцитов от доли Т-лимфоцитов в пробе. Метод обеспечил определение доли Т-лимфоцитов в крови с ошибкой не хуже чем 4.5% (абсолют.). Анализ по предложенный нами методике занимает 10-15 минут, в то время как иммунофлуоресцентный анализ занимает десятки минут. Кроме того, современные методы количественного анализа субпопуляций лимфоцитов очень дорогостоящи по сравнению с нашим методом. Таким образом, разработана сравнительно дешевая методика определения доли Т-лимфоцитов среди всех лимфоцитов по рассеянному ими свету, и эта доля является важной характеристикой иммунного статуса человека.

Характеризация лимфоцитов крови человека и эмбриональных стволовых клеток

Разработанные методы характеризации апробированы на Т- и В-лимфоцитах нескольких доноров и ЭСК, определяя диаметр клетки, соотношение диаметра клетки и ядра и коэффициент преломления ядра и цитоплазмы каждой отдельной клетки. Измерена картина светорассеяния с помощью сканирующего проточного цитометра и решена обратную задачу светорассеяния, используя двухслойный шар как оптическую модель клетки и основываясь на спектральном методе, методе глобальной оптимизации Левенберга-Марквардта в режиме мультистарта и методе глобальной оптимизации с использованием алгоритма DiRect. Как было обнаружено, основная разница в морфологии Т- и В-лимфоцитов — это большие средние диаметры последних. Однако эта разница меньше естественной биологической вариабельности одиночной клетки. Полагаем, что неоднородность ядра — это возможная причина отклонения измеренных индикатрис реальных лимфоцитов от рассчитанных для модели двухслойного шара.

В настоящее время обработка одной индикатрисы предполагаемым методом занимает приблизительно 150 секунд с помощью современного компьютера (1.8 ГГц). На поверхности наименьших квадратов в зависимости от конкретной индикатрисы было выявлено до пяти локальных минимумов. На настоящий момент мы сконцентрировали внимание на надежности алгоритма (достигая глобальных минимумов и достаточно детального описания поверхности наименьших квадратов) и не занимались его вычислительной эффективностью. Для возможности включения данного метода в стандартный анализ клеток крови требуется уменьшение времени обработки на два порядка. Это важная цель для будущего исследования.

Экспериментальное исследование апоптоза лимфоцитов крови человека

В данной работе разработан альтернативный подход к исследованию начальных стадий апоптоза на основе измерения морфологических изменений клеток. Основная проблема в таком исследовании состоит в том, что на начальной стадии апоптоза в клетке происходят только небольшие морфологические изменения, которые сложно зарегистрировать существующей экспериментальной техникой с достаточной точностью.

Сканирующий проточный цитометр собирает большой объем информации о каждой клетке, и используя эту информацию, разработанный в данной диссертации метод характеризации обеспечил чрезвычайно высокую (для оптических методов) точность определения параметров лимфоцитов как до индукции апоптоза, так и после. Кроме того, получены принципиально новые параметры апоптоза, причем использование данного подхода возможно и для изучения апоптоза под действием онколитических вирусных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Строкотов, Дмитрий Игоревич, Новосибирск

1. Fundamental 1.munology, 5th ed., T Cells & NK Cells, William E.P., ed. - Baltimore, USA: Lippincott Williams & Wilkins Publishers, August 2003. - Chapters 8-13.

2. Богуш П.Г, Важбин Л.Б., Чуксина Ю.Ю. et al. Оценка иммунологической реактивности у больных сифилисом. // Новости "Вектор-Бест" — сентябрь 2003. — №3. http://www.vector-best.mhost.ru/nvb/st294.htm

3. Stem cells and the future of regenerative medicine. Washington: National Academy Press. -2002.-59P.

4. Ruban G.I., Kosmacheva S.M., Goncharova N.V. et al. Investigation of morphometric parameters for granulocytes and lymphocytes as applied to a solution of direct and inverse light-scattering problems. И J. Biomed. Opt. 2007. - V.12. - P.0440I7.

5. Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds. New York: Wiley-Liss, 1990.-824P.

6. Givan A.L. // Flow Cytometry: First Principles, 2nd ed. New York: Wiley-Liss, 2001. -280P.

7. Юркин M.A. Моделирование светорассеяния клетками крови с помощью метода дискретных диполей: Дис. . канд. физ.-мат. наук. — Новосибирск: Институт Химической Кинетики и Горения СО РАН, 2008. 231 С.

8. Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis., van Dilla M.A., Dean P.N., Laerum O.D., Melamed M.R., eds. New York: Academic Press, 1985. - 300P.

9. Flow Cytometry Protocols., Jaroszeski M.J., Heller R., eds. — Totowa, USA: Humana Press, 1998.-274P.

10. Sloot P.M.A., Hoekstra A.G., Vanderliet H., Figdor C.G. Scattering matrix-elements of biological particles measured in a flow through system theory and practice. // Appl. Opt. -1989. - V.28. - P.1752-1762.

11. Maltsev V.P. Scanning flow cytometry for individual particle analysis. // Rev. Sci. Instrum. -2000. — V.71. — P.243-255.

12. Maltsev V.P., Semyanov K.A. // Characterisation of Bio-Particles from Light Scattering. -Utrecht: VSP, 2004. 132P.

13. Chernyshev A.V., Tarasov P.A., Semianov K.A., Nekrasov V.M., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Erythrocyte lysis in isotonic solution of ammonium chloride: Theoretical modeling and experimental verification. // J. Theor. Biol. 2008. - V.251. - P.93-107.

14. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. // Л.: Наука, 1988. — 228С.

15. Мануйлова Е.С., Гордеева О.Ф., Гривенников И.А., Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки: спонтанная и направленная дифференцировка. II Известия АН. Сер. Биологическая. 2001. -№ 6. - С.704-710.

16. Савченкова И.П, Фляйшманн З.М., Булла Й., Брем Г. Использование плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток мыши для получения химерных животных. // Цитология 1994. - Т.38. - С.1118-1123.

17. Эрнст Л.К. Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельско-хозяйственных животных. // М.: Агропромиздат, 1989.

18. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. // Пер. с англ. -М.: Мир, 2002. - 589С., ил.

19. Репин B.C. Эмбриональная стволовая клетка (от фундаментальной биологии к медицине). // Успехи физиологических наук — 2001. — Т.32. — С.3-18.

20. Grompe М., Finegold М. Liver stem cells. // Stem Cell Biology. Marshak D.R., Gardner R.L., Gottlieb D. eds. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. -P.455-497.

21. Wan H., Yuan M., Simpson C. et al. Stem/progenitor cell-like properties of desmoglein 3dim cells in primary and immortalized keratinocyte lines. // Stem cells 2007. - V.25. - P.1286-1297.

22. Roitt's Essential Immunology, 9th ed., Roitt I.M. Blackwell Science, Oxford, 1997.

23. Wintrobe's Clinical Hematology, 11th ed., Greer J.P., Foerster J., Lukens J.N., eds. Baltimore, USA: Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 2003. - 2800P.

24. Flow Cytometry Protocols, Hawley T.S., Hawley R.G., eds. Totowa, USA: Humana Press, 2004.

25. Alexander H.D., Markey G.M., Nolan R.L., Morris T.C.M. Cell sizing in chronic lymphoproliferative disorders: an aid to differential diagnosis. // J. Clin. Pathol. 1992. - V.45. -P.875-879.

26. Galimberti S., Riccioni R., Azzara A., Testi R., Fazzi R., Testi C., and Petrini M. Unusual morphology in a case of large granular cell leukemia. // Ann. Hematol. 2001. - V.80. - P.755-757.

27. Zipursky A., Bow E., Seshadri R.S., and Brown E.J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. // Blood 1976 - V.48. - P.361-371.

28. Metcalf W.K., Metcalf N.F., and Gould R.N. Lymphocyte cytoplasmic refractive index (LCRI). //Antibiot. Chemother. 1978.-V.22.-P.149-154.

29. Giacomini A., Legovini P., Antico F., Gessoni G., Valverde S., Salvadego M.M., Manoni F. Evaluation of platelet analysis on the ADVIA 120 hematology system. // Lab. Hematol. 2001. — V.7. — P.180-185.

30. Ghys Т., Malfait R., and Bossche J. van den. Performance evaluation of the Sysmex XS-lOOOi automated haematology analyzer. // Int. J. Lab. Hematol. 2008. - V.31. - P.560-566.

31. Lehto T. and Hedberg P. Performance evaluation of Abbott CELL-DYN Ruby for routine use. // Int. J. Lab. Hematol. 2008. - V.30. - P.400-407.

32. Peng L., Bai L., Nie L., Wu Z., and Yan C. Performance evaluation of BC-3200 hematology analyzer in a university hospital. // Int. J. Lab. Hematol. 2008. - V.30. - P.205-213.

33. Guerti K., Vertessen F., Daniels L., and Planken M. van der. Performance evaluation of the PENTRA 60C+ automated hematology analyzer and comparison with the ADVIA 2120. // Int. J. Lab. Hematol. 2009. - V.31. - P. 132-141.

34. Nagata S., Golstein P. Fas death factor. // Science 1995.- V.267. - P.1449-1456.

35. Cleveland J.L., Ihle J.N. Contenders in Fas/TNF death signaling. // Cell 1995. - V.81. - P.479-482.

36. Shaw P., Bovey R., Tardy S., Sahli R., Sordat В., Costa J. Induction of apoptosis by wild-type p53 in a human colon tumor derived cell line. // Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 1992. - V.89. -P.4495-4499.

37. Martins L.M., Earnshaw W.C. Apoptosis: alive and kicking in 1997. // Trends in Cell Biology -1997. -V.7. P.l 11-114.

38. Bar P.R. Apoptosis the cell's silent exit. // Life Sci. - 1996. - V.59. -P.369-378.

39. Savill J., Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. // Nature 2000. -V.407. - P.784-788.

40. Hacker G. The morphology of apoptosis. // Cell Tissue Res. -2000. -V.301. -P.5-17.

41. Bortner C.D., Cidlowski J.A. Apoptotic volume decrease and the incredible shrinking cell. // Cell Death Differ. 2002. - V.9. - P. 1307-1310.

42. Darzynkiewicz Z., Bedner E., Traganos F., Murakami T. Critical aspects in the analysis of apoptosis and necrosis. // Hum. Cell. 1998. - V.l 1. -P.3-12.

43. Umansky S.R., Korol B.A., Nelipovich P.A. In vitro DNA degradation in the thymocytes of y-irradiated or hydrocortisone-treated rats. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V.655. -P.9-14.

44. Fisher D.E. Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold. // Cell 1994. - V.78. - P.539-542.

45. Kroemer G. Pharmacology of T cell apoptosis. //Adv. Immunol. 1995. - V.58. -P.211-296.

46. Ярилин A.A. Апоптоз. Природа феномена и его место в целостном организме. // Бюлл.эксп. биол. мед. 1998. - №2. - С.38-48.

47. Ярилпн А.А. Апоптоз и патология. // В кн. "Аллергия и иммунопатология (иммунные механизмы формирования и принципы терапии)" под ред. Г.В.Порядина. — Москва, 1999. -С. 167-184.

48. Cheng J. Zhou Т., Liu С., Shapiro J.P., Brauer M.J. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Gas molecule. // Science 1994. - V.263. - P. 1754-1762.

49. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. //J.Cell.Biol. 1992. - V.l 19. -P.493-501.

50. McCloskey T.W., Oyaizu N., Coronezi M., Pahwa S. Use of a flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes. II Clin. Immunoljgy Immunopathology. 1994. — V.71. — P.14-18.

51. Diaz C., Schroit A.J. Role of translocations of the generation of phosphatidylserine asymmetry. // J. Membr. Biol. 1996. - V. 151. - P. 1 -9.

52. Van Engeland M., Nieland L.J.W., Ramaekers F.C.S., Schutte В., Ruetelingsperger C.P.M. Annexin V-affmity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // Cytometry 1998. - V.31.-P.1-9.

53. Kroemer G., Zamzami N., Susin S.A. Mitochondrial control of apoptosis. // Immunol. Today -1997. V. 18. — P.44-51.

54. Sandro В., Rotstein O., Parodo J. et al. Hypertonic inhibition of exocytosis in neutrophils: central role for osmotic actin skeleton remodeling. // Am. J. Physiol.: Cell Physiol. — 2000. — V.279.-P.619-633.

55. Shchyogolev S. Yu. Inverse problems of spectroturbidimetry of biological disperse systems: An overview II. // J. Biomed. Opt. 1999. - V.4. - P.490-503.

56. Szczuczynski D.K., Mroczka J. Comparing the quality of solution of inverse problem in nephelometric and turbidimetric measurements. // Optica Applicata — 2009. — V.39. P.521-531.

57. Chapman E., Kurec A., Davey F. Cell volumes of normal and malignant mononuclear cells. II J. Clin. Pathol. 1981. - V.34. - P.l 083-1090.

58. Chalmers J., Haam S., Zhao Y. et al. Quantification of cellular properties from external fields and resulting induced velocity: cellular hydrodynamic diameter. // Biotechnol. Bioeng. — 1999. -Y.64.-P.509-518.

59. Mourant J., Canpolat M., Brocker C. et al. Light scattering from cells: the contribution of the nucleus and the effects of proliferative status. // J. Biomed. Opt. 2000. - V.5. - P.131-137.

60. Bertoncello I., Pretlow T.G., Pretlow T.A. Comparison of cell separations obtained with centrifugal elutriation and sedimentation at unit gravity. // Cell Separation Methods and Selected Applications, Academic Press, San Diego 1987. - P.89-I08.

61. Lasky L., Zanjani E. Size and density characterization of human committed and multipotent hematopoietic progenitors. // Exp. Hematol. 1985. -V. 13. - P.680-684.

62. Ghosh N., Buddhiwant P., Uppal A. et al. Simultaneous determination of size and refractive index of red blood cells by light scattering measurements. // Applied physics letters — 2006. — V.88. —P.084101.

63. Zharov V.P., Galanzha E.I., Shashkov E.V. et al. In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents. // Opt. Lett. 2006. - V.31. -P.3623-3625.

64. Bonetta L. Flow cytometry smaller and better. // Nature Methods 2005. - V.2. - P.785-795.

65. Борен К., Хафмен Д. // Поглощение и рассеяние света малыми частицами. — М.: Мир, 1986.-664Р.

66. Wheeless L.L. Slit scanning. // Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds. -New York: Wiley-Liss, 1990 P.109-126.

67. Condrau MA., Schwendener R.A., Niederer P., Anliker M. Time-resolved flow-cytometry for the measurement of lanthanide chelate fluorescence .1. Concept and theoretical evaluation. // Cytometry 1994.-V.16.-P.187-194.

68. Neukammer J., Gohlke C., Hope A., Wessel T., Rinneberg H. Angular distribution of light scattered by single biological cells and oriented particle agglomerates. // Appl. Opt. — 2003. — V.42. — P.6388-6397.

69. Doornbos R.M.P., Schaeffer M., Hoekstra A.G., Sloot P.M.A., Degrooth B.G., Greve J. Elastic light-scattering measurements of single biological cells in an optical trap. // Appl. Opt. — 1996. — V.35. — P.729-734.

70. Kaye P.H., Aptowicz K., Chang R.K., Foot V., Videen G. Angularly resolved elastic scattering from airborne particles. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. London: Springer, 2006 - P.31-61.

71. Salzman G.C., Singham S.B., Johnston R.G., Bohren C.F. Light scattering and cytometry. // Flow Cytometiy and Sorting, 2nd ed., Melamed M.R., Lindmo T., Mendelson M.L., eds. New York: Wiley-Liss, 1990-P.81-107.

72. Hirst E., Kaye P.H. Experimental and theoretical light scattering profiles from spherical and nonspherical particles. // J. Geophys. Res. Atmos. 1996. -V. 101. - P. 19231-19235.

73. Mishchenko M.I., Travis L.D. Polarization and depolarization of light. // Light Scattering from Microstructures 2000. - P. 159-175.

74. Lee J., Koh J., Collins R.W. Multichannel Mueller matrix ellipsometer for real-time spectroscopy of anisotropic surfaces and films. // Opt. Lett. 2000. - V.25. — P.1573-1575.

75. Sankaran V., Everett M.J., Maitland D.J., Walsh J.T. Comparison of polarized light propagation in biological tissue and phantoms. // Opt. Lett. 1999. -V.24. - P. 1044-1046.

76. Nordin G.P., Meier J.T., Deguzman P.C., Jones M.W. Micropolarizer array for infrared imaging polarimetry. // J. Opt. Soc. Am. A. 1999. -V. 16. - P. 1168-1174.

77. Chou P.C., Fini J.M., Haus H.A. Real-time principle state characterization for use in PMD compensators. // IEEE Photon. Techno. Lett. -2001. -V. 13. P.568-570.

78. Bickel W.S., Davidson J.F., Huffman D.R., Kilkson R. Application of polarization effects in light scattering: a new biophysical tool. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. - P.486-490.

79. Bickel W.S., Stafford M.E. Polarized Light Scattering from Biological Systems: a Technique for Cell Differentiation. // J. Biol. Phys. 1981. - V.9. - P.53-66.

80. Bronk B.V., Van De Merwe W.P., Stanley M. In vivo measure of average bacterial cell-size from a polarized light scattering function. //Cytometry — 1992. — V. 13. —P. 155-162.

81. Bronk B.V., Druger S.D., Czege J., Van De Merwe W.P. Measuring diameters of rod-shaped bacteria in vivo with polarized light scattering. // Biophys. J. 1995. - V.69. - P.l 170-1177.

82. Van De Merwe W.P., Li Z., Bronk B.V., Czege J. Polarized light scattering for rapid observation of bacterial size changes. // Biophys. J. 1997. — V.73. - P.500-506.

83. Van De Merwe W.P., Czege J., Milham M.E., Bronk B.V. Rapid optically based measurements of diameter and length for spherical or rod-shaped bacteria in vivo. II Appl. Opt. — 2004. V.43. -P.5295-302.

84. Ding H., Lu J.Q., Brock R.S., McConnell T.J., Ojeda J.F., Jacobs K.M., Hu X.H. Angle-resolved Mueller matrix study of light scattering by B-cells at three wavelengths of 442, 633 and 850 nm. // J. Biomed. Opt. 2007. - V.12. - P.034032.

85. Hovenier J.W., De Hann J.F. Polarized light in planetary atmospheres for perpendicular directions. // Astronomy and Astrophysics 1985. - V.146. - P.185-191.

86. Mukai S., Sano I., Takashima T. Investigation of atmospheric aerosols based on polarization measurements and scattering simulations. // Opt. Rev. 1996. - V.3. -P.487-491.

87. Wang M. Aerosol polarization effects on atmospheric correction and aerosol retrievals in ocean color remote sensing. // Appl. Opt. 2006. - V.45. - P.8951-8963.

88. Phillips D.T., Wyatt P.J., Berkman R.M. Measurement of the Lorenz-Mie scattering of a single particle: polystyrene latex. //J. Colloid Interface Sci. 1970. - V.34. - P. 159-162.

89. Yurkin M.A., Semyanov K.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. Discrimination of granulocyte subtypes from light scattering: theoretical analysis using a granulated sphere model. // Opt. Express -2007. V.15. -P.16561-16580.

90. Kolesnikova I.V., Potapov S.V., Yurkin M.A., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Semyanov K.A. Determination of volume, shape and refractive index of individual blood platelets. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer 2006. - V.102. - P.37-45.

91. Orlova D.Y., Yurkin M.A., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Light scattering by neutrophils: model, simulation, and experiment. // J. Biomed. Opt. 2008. - V.13. - P.054057.

92. Strokotov D.I., Yurkin M.A., Gilev K.V., van Bockstaele D.R., Hoekstra A.G., Rubtsov N.B., Maltsev V.P. Is there a difference between T- and B-lymphocyte morphology? // J. Biomed. Opt. 2009. - V.14. - P.064036.

93. Mie G. Beitrage zur optik trüber medien, speziell kolloidaler metallosungen. // Ann. Phys. -1908. V.330. - P.377-445.102. van de Hülst H.C. // Light Scattering by Small Particles. New York: Dover, 1981. - 479P.

94. Mishchenko M.I., Travis L.D., Lacis A.A. // Scattering, Absorption, and Emission of Light by Small Particles. Cambridge: Cambridge University Press, 2002. - 448P.

95. Kahnert F.M. Numerical methods in electromagnetic scattering theory. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer 2003. - V.79. - P.775-824.

96. Generalized Multipole Technique for Electromagnetic and Light Scattering., Wriedt T., ed. -Amsterdam: Elsevier, 1999.-264P.

97. Wriedt T., Cornberg U. Comparison of computational scattering methods. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer- 1998. V.60. - P.411-423.

98. Cornberg U., Wriedt T. Comparison of scattering calculations for aggregated particles based on different models. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer 1999. - V.63. - P.149-162.

99. Taflove A., Hagness S.C. // Advances in Computational Electrodynamics: the Finite-Difference Time-Domain Method, 3rd ed. Boston: Artech House, 2005. - 1038P.

100. Silvester P.P., Ferrari R.L. // Finite Elements for Electrical Engineers, 3rd ed. New York: Cambridge University Press, 1996. -512P.

101. Yurkin M.A., Hoekstra A.G. The discrete dipole approximation: an overview and recent developments. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. 2007. - V.106. - P.558-589.

102. NASA GISS: Scattering T-Matrix Codes (http://www.giss.nasa.gov/staff/mmishchenko/tmatrix.html).

103. Yurkin M.A., Hoekstra A.G., Brock R.S., Lu J.Q. Systematic comparison of the discrete dipole approximation and the finite difference time domain method for large dielectric scatterers. // Opt. Express 2007. - V. 15. - P. 17902-17911.

104. Semyanov K.A., Tarasov P.A., Zharinov A.E., Chernyshev A.V., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Single-particle sizing from light scattering by spectral decomposition. // Appl. Opt. 2004. — V.43.-P.5110-5115.

105. Min S.L., Gomez A. High-resolution size measurement of single spherical particles with a fast Fourier transform of the angular scattering intensity. // Appl. Opt. 1996. - V.35. - P.4919-4926.

106. Ludlow I.K., Everitt J. Application of Gegenbauer analysis to light-scattering from spheres -theory. // Phys. Rev. E 1995. - V.51. - P.2516-2526.

107. Ulanowski Z., Wang Z.N., Kaye P.H., Ludlow I.K. Application of neural networks to the inverse light scattering problem for spheres. // Appl. Opt. 1998. - V.37. - P.4027-4033.

108. Berdnik V.V., Gilev K.V., Shvalov A.N., Maltsev V.P., Loiko V.A. Characterization of spherical particles using high-order neural networks and scanning flow cytometry. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer 2006. - V. 102. - P.62-72.

109. Haykin S. // Neural Networks: a Comprehensive Foundation, 2nd ed. Englewood Cliffs, NJ: Prentice Hall, 1998. - 842P.

110. Zharinov A.E., Tarasov P.A., Shvalov A.N., Semyanov K.A., van Bockstaele D.R., Maltsev V.P. A study of light scattering of mononuclear blood cells with scanning flow cytometiy. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transfer 2006. - V.102.-P.121-128.

111. Jones D.R., Perttunen C.D., Stuckman B.E. Lipschitzian optimization without the Lipschitz constant. //J. Optim. Theor. Applic. 1993.-V.79.-P.157-181.

112. Chernyshev A.V., Prots V.I., Doroshkin A.A., Maltsev V.P. Measurement of scattering properties of individual particles with a scanning flow cytometer. // Appl. Opt. — 1995. — V.34. -P.6301-6305.

113. Collett, E. Polarized Light: Fundamentals and Applications. // Marcel Dekker, New York, 1993.

114. Орлянская И.В. Современные подходы к построению методов глобальной оптимизации. // Электронный журнал «Исследовано в России». МГУ, факультет ВмиК 2002. - Т.5. -С.2097-2108.

115. Nocedal J., Wright S.J. Numerical Optimization. // New York: Springer 1999. - P.276-311.

116. Гущина Ю.Ю. Плескова C.H., Звонкова М.Б. Исследование различий морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. — 2005. — Т.1. — С.48-53.

117. Dunn А.К. Modelling of light scattering from inhomogeneous biological cells. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. London: Springer, 2006 -P. 19-29.

118. Loiko V.A., Ruban G.I., Gritsai O.A., Gruzdev A.D., Kosmacheva S.M., Goncharova N.V., Miskevich A.A. Morphometric model of lymphocyte as applied to scanning flow cytometry. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. 2006. - V. 102. - P.73-84.

119. Seber G.A.F., Wild C.J. Nonlinear regression, Wiley-Interscience, Hoboken, N.J., 2003.

120. Bates D.M., Watts D.G. Nonlinear regression analysis and its applications, Wiley, New York, 1988.

121. Алейник C.B. Приближенная плотность распределения суммы квадратов зависимых гауссовских случайных величин. // Радиотехника —1999. — №1. — С.53-55.

122. Fuller W.A. Prediction of true values for the measurement error model. // Statistical analysis of measurement error models and applications, Brown P. and Fuller W.A., eds. American Mathematical Society, Providence, Rhode Island, 1990 - P.41-58.

123. Zhou Q., Jouneau A., Brochard V. et al. Development potential of mouse embryos reconstructed from metaphase embryonic stem cell nuclei. // Biology of Reproduction 2001. - V.65. -P.412-419.

124. Андерсон ILL Атлас гематологии. M.: Логосфера, 2007. 608С.

125. Ormerod M.G. Preparing suspensions of single cells. // Flow Cytometry: A Practical Approach, 3rd ed., Oxford University Press, Oxford, 2000. P.35-45.

126. Бородин A.H. Элементарный курс теории вероятностей и математической статистики. // Санкт-Петербург: изд-во "Лань", 1999.

127. Terstappen L., Mickaels R.A., Dost R. Increased Light Scattering Resolution Facilitates Multidimensional Flow Cytometric Analysis. // Cytometiy 1990. - V.l 1. - P.506-512.

128. Shido F., Kobayashi K., YamanakaN. Cell-size distribution of human tonsillar lymphocytes // Arch. Otorhinolaryngol. 1984. - V.239. - P.211-218.

129. Cheung R.K., Grinstein S., Gelfand E.W. Volume regulation by human lymphocytes. Identification of differences between the two major lymphocyte subpopulations. // J. Clin. Invest. 1982. - V.70. - P.632-638.

130. Grinstein S., Smith J.D. Calcium-independent cell volume regulation in human lymphocytes. Inhibition by charybdotoxin. // J. Gen. Physiol. 1990. - V.95. - P.97-120.

131. Konwinski M., Kozlowski T. Morphometric study of normal and phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes. // Cell Tissue Res. 1972. - V. 129. - P.500-507.

132. Hoekstra A.G., Grimminck M.D., Sloot P.M.A. Large scale simulations of elastic light scattering by a fast discrete dipole approximation. // Int. J. Mod. Phys. С 1998. - V.9. - P.87-102.

133. Murray A., Hunt T. The Cell Cycle, Oxford University press, Oxford, 1993.

134. Terstappen L.W., Grooth B.G. De, Ten Napel C.H., van Berkel W., Greve J. Discrimination of human cytotoxic lymphocytes from regulatory and B-lymphocytes by orthogonal light scattering. // J. Immunol. Methods 1986. - V.95. - P.211-216.

135. Kerr J.F. Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death. // J. Pathol. 1971. - V.l05. -P.13-20.

136. Shapiro H.M. Practical flow cytometry. New York: Alan R. Liss, Inc., 1988. 353P.

137. Okada Y., Maeno E., Shimizu Т., Dezaki K., Wang J., Morishima S. Receptor-mediated control of regulatory volume decrease (RVD) and apoptotic volume decrease (AVD). // J. Physiol. -2001.-V.532.-P.3-16.

138. Thomas N., Bell P.A. Glucocorticoid-induced cell-size changes and nuclear fragility in rat thymocytes. // Mol. Cell. Endocrinol. 1981. - V.22. - P.71-84.

139. Wyllie A.H., Morris R.G. Hormone-induced cell death. Purification and properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. // Amer. J. Pathol. — 1982. — V.109.-P.78-87.

140. Cohen G.M., Sun X.M., Snowden R.T., Ormerod M.G., Dinsdale D. Identification of a transitional preapoptotic population of thymocytes. //J. Immunol. 1993. - V.151. -P.566-574.

141. Веренинов А.А., Горячая В.В., Матвеев В.В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Сакута Г.А., Широкова А.В., Юринская В.Е. Дегидратационное сокращение объема клеток при апоптозе факультативный признак. // Цитология — 2004. — Т.46. — С.609-619.

142. Веренинов А.А., Юринская В.Е., Рубашкин А.А. Роль калия, калиевых каналов и симпортеров в апоптозном сокращении клеточного объема. Эксперимент и теория. // Докл. РАН. 2004. - Т.398. - С.555-559.

143. Morales M.P., Galvez A., Eltit J.M., Ocaranza P., Diaz-Araya G., Lavandero S. IGF-1 regulates apoptosis of cardiac myocyte induced by osmotic-stress. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2000. V.270. - P.l 029-1035.

144. Michea L., Combs C., Andrews P., Dmitrieva N., Burg M.B. Mitochondrial dysfunction is an early event in high-NaCl-induced apoptosis of mINCD3 cells. // Amer. J. Physiol. Renal Physiol. 2002. - V.282. - F981-F990.

145. Friis M.B., Friborg C.R., Schneider L., Nielsen M.B., Lambert I.H., Christensen S.T., Hoffmann E.K. Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts. // J. Physiol. -2005. -V.567. — P.427-443.

146. Benson R.S., Heer S., Dive C., Watson A.J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. // Amer. J. Physiol. — 1996. — V.270. CI 190-C1203.

147. McCarthy J.V., Cotter T.G. Cell shrinkage and apoptosis: a role for potassium and sodium ion efflux. // Cell Death Differ. 1997. - V.4. - P.756-770.

148. Maeno E., Ishizaki Y., Kanaseki Т., Hazama A., Okada Y. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulations an early prerequisite to apoptosis. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97. - P.9487-9492.

149. Boyle P.J., Conway E.H. Potassium accumulation in muscle and associated changes. // J. Physiol. 1941.-V.100.-P.1-63.

150. Веренинов A.A., ст., Веренинов A.A., мл. Ионный, электрический и водный баланс в животной клетке. Система с активным транспортом катионов, гольдмановскими каналами и симпортом типа Na + К + 2С1. // Цитология 1991. - Т.ЗЗ. — С.4-17.

151. Babcock G., Taylor A., Hynd В. et al. Flow cytometric analysis of lymphocyte subset phenotypes comparing normal-children and adult. // Diagnostic and clinical immunology -1987. — V.5. — P.175-179.

152. Sack U., Gerling F., Tarnok A. Age-related lymphocyte subset changes in the peripheral blood of healthy children a meta-study // Transfusion medicine and hemotherapy - 2007. - V.34. -P.176-181.

Информация о работе

Строкотов, Дмитрий Игоревич
кандидата физико-математических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование оптических свойств мононуклеарных клеток, в том числе находящихся в процессе апоптоза, с целью их идентификации и характеризации по светорассеянию - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы