Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование некротического и апоптотического механизмов цитолиза опухолевых клеток под действием лак-клеток человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование некротического и апоптотического механизмов цитолиза опухолевых клеток под действием лак-клеток человека"

«

2 7 ^ ^ На правах рукописи

КАБАНОВА Ольга Дмитриевна

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКРОТИЧЕСКОГО И АП0ПТ0ТИЧЕСК0Г0 МЕХАНИЗМОВ ЦИТОЛИЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛАК-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

специальность 03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

к

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук Гнучев Н. В.; кандидат биологических наук Сащенко Л. П.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Терских В. В.; дэктор химических наук Габибов А. Г.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт иммуннологии Минздравмедпро-ма РФ.

Защита диссертации состоится « » ¿%/1(у(0_ 1995 г.

п /О час. мин, на заседании Диссертационного^Совета Д.200.30.01

при Институте биологии гена РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан « »_ 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат фарм. наук

Грабовская Л. С.

с

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Смерть -клетки - это естественный физиологический процесс.Классификация клеточной гибели основывается на морфологических и биохимических признаках.В настоящее время известно два пути клеточной гибели - некроз и ашштоз. Некроз - процесс, начинающийся с повреждения мембраны и приводящий к необратимому нарушению гомеостаза. Для алоп^тоза характерна упорядоченная межнунлеосомальная фрагментация адерной ДНК без нарушения целостности клеточной мембраны. Определение типа клеточной гибели имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Гибель клеток по впоптотическому механизму лежит в основе патогенеза многих болезней, и часто, апоптоз - цель терапевтических мероприятий при лечении опухолей. Механизмы гибели клеток в настоящее время интенсивно изучаются. Предложены схемы гибели как по некротическому, так и апоптоти-ческому пути.Охарактеризованы фераентные системы, участвуыцие в этих процессах.Но все эти достижения связаны с изучением таких моделей, как гибель тимоцитов при действии гликокортекостероидов и облученных лим£юкдных клеток. Однако, гибель клеток-мишеней (КМ) при действии лк, ЦГЛ и ЛАК-клеток (лимфокин-активированных киллеров) имеет особенности,отличающиеся от классических форм апоптоза. Несмотря на то,что биология клеток-эффекторов хороша изучена,механизм логического действия этих клеток недостаточно исследован,многое остается неясным относительно участия КМ в процессе цитолиза. Цель работы. В настоящей работе была поставлена задача изучения механизмов цитолиза трансформированных клеток при действии ЛАК-клеток разных фенотипов.а также цитотоксических белков, которым!: обусловлена цитотоксичность ЛАК-клеток.Конкретные задачи заключались в сравнительном исследовании гибели различных типов КМ

(ык-чувствителъных и нк-рэзистветнкх) под действием КЗ (клеток-

эффекторов ), цитотокскческих белков, ассоциированных с мембраной этих эффекторов, и растворимых цитотоксических белков, секратируемых ЛАК-клетками.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые на одной модели было продемонстрировано, что механизм гибели опухолевых клеток, некроз или вгоптоз, зависит от фенотипа ЛАК-клеток и типа КМ.Показано,что лимфоциты могут индуцировать в опухолевых клетках смешанный тал цитолиза.Изучены процессы гибели КМ под действием цитотоксических белков, ассоциированных с мембраной лимфоцитов, а также белкоз.свкрвтируемых ЛАК-клетками.Приведенные результаты демонстрируют гибель КЫ под действием этих белков как сумму дискретных цтаолитшеских процесов.Установлено,что гибель клеток-мишеней- активный метаболический процесс .обусловленный активацией собственных ферментов деградациигливосомальных ферментов и ядерных нуклеаз.Охарактеризованы -зависимый и Са24"-независимый пути цитолиза. Обнаружено, что скорость гибели КМ при действии секре-тируемых балков зависит от концентрации вгих белков.Полученные результаты дают новые представления о клеточной гибели. Дальнейшее исследование действия мембранных и растворимых белков ЛАК-клеток на опухолевые КМ откроит перспективы получения фармакологических антиканцерогенных 1фвпаратов нового поколения. Изучение механизмов цитолиза опухолевых КМ при действии ЛАК-клеток, управление етими процессами позволит достичь успеха иммуннотерапии рака. Апробация работы. Материалы работы были представлены:

на Международном симпозиуме "Структура и функции-регуляторных полипептидов", Москва,1992; на 8 Международном иммуннологическом конгрессе, Будапешт,1992; на 22 совещании Федерации европейского обцвства( ягзз ), Стокгольм,Швеция, 1993; на 9 Российско-германском симпозиуме по химии белков и пептидов .Пущино, 1994. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных

работ.Описок публикаций приведен в конце автореферата. Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения,материалов и методов,выводов и списка цитируемой литературы. Работа излокенд на 90 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков,1 таблицу.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ. 1.ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА' ГИБЕЛИ КМ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛАК-КЛЕТОК. Известие,что ЛАК-клетки - гетерогенная популяция клеток и наличие двух максимумов цитотоксичности связано с изменением фенотипов этих клеток,- поэтому мы анализировали экспрессию антигенов СБа, сшб.сиз на мембранах ЛАК-клеток в течении 8 суток.Методом проточной цитофлуориметрии было обнаружено,что на 4 сутки культивирования с ИЯ-2 выявляются клетки с фенотипом сшб+св8+свз", характерным для Ш.Дпя 6-суточных лимфоцитов получен фенотип спз+сш+стб~, что соответствует ЦТЛ.(Рис 1) Следовательно, срок инкубации ЛАК-клеток с ИЛ-2 определяет не только цитолитическую активность, но и фенотип этих клеток, на начальных стадиях инкубации с ИЛ-2 лимфоциты имеют -фенотип, на последних- ЦТЛ.

На следующем этапе работы мы исследовали механизм гибели клеток-кишеней под действием КЗ различных фенотипов.В качестве КМ использовали два типа: НК-чувствительные клетки К562 и мк-резистентные - 1-929.Для выявления апоптотического или некротического пути гибели КМ мы сравнивали проницаемость клеточной мембраны и фрагментации ДНК. Отношение степени деградации ДНК (Д) к

количеству мертвых клеток (М), окрашенных трипаноЕым синим,

Ч

определяет тип гибели.Если —- < 1,- то клетки гибнут некротически:

%и

целостность мембраны нарушается быстрее, чем деградация ДНК.В слу-«Д

чае- > 1 внутриядерные изменения в гибнущих клетках опережает

процессы,происходящее в мембране, т.е.клетки гибнут апоптотичеекк. Действие различных субпопуляций ЛАК-клеток на ИК-чувствктелъ-

экспрессия

АНТИГЕННЫХ МАРКЕРОВ (8)

80

60 -

40

20

□ СШб

Ш СВЗ

■ С08

<п

7 в" суш'

Рис.1.Изменение экспрессии антигенных маркеров ЛАК-кявток человека в зависимости от времени стимуляции Ю1-2.

нув линию клеток К562 приведено на рис.2.В клетках К562 в первые два часа при действии ЛАК-клеток, имэщих ева+сшб+свз~- фенотип, наблюдаются некротические явления:мембрана становится проницаемой раньше, чем накопление ДНК-фрагментов ( %Д/ *Ы <1 ), ЛАК-клетки с фенотипом ст+сш+СБ16- вызывают Оолее ранние изменения в ядре, чем в мембране КМ, что характерно для апоптога.

Взаимодействие активированных лимфоцитов с другой мишенью,ик-резистентными мышинными фибробластами 1.929, показано на рис.3. В первые три часа при взаимодействии с лимфоцитами обоих 'фенотипов в ЮЛ развивается некроз ( ад/ ям <1 ).Сравнивая результаты, приведенные на рис.2 и на рис.З,мокно предположить, что путь клеточной гибели зависит от типа КЗ, физиологического состояния КМ и

времени взаимодействия.

При действии лимфоцитов, тлеющих СС8+СС16+СПЗ- - фенотип, в

обоих типах КМ наблюдали признаки некроза.

ЛАК-клеткя с фенотипом сш+с03+сш б" в первые три часа после взаимодействия с ЮЛ вызывают апоптоз клеток К56Й и некроз 1.929-КЛ0-ток.Однако,через 3 часа в клетках К562 наблюдается переход к некрозу, когда проницаемость мембраны ЮЛ обгоняет процессы деструкции ДНК.В клеточной линии 1929 некротические признаки клеточной гибели сменяются алаптотичвскими.В этом случае для обоих видов ЮЛ при действии спз+св8+сВ1б"-лшмфоцитов характерен смешанный тип гибели КМ.

Определяя характер клеточной гибели, обычно, основываются на результатах по фрагментированию ДНК.Известно,что в деградации клетки наряду с нуклэазными участвуют и другие ферментативные_ системы, в частности, лизосомальные.

На налей системе ( ЛАК-клвтки- КМ ) мы попытались установить роль лизосомальных ферментов,КМ в процессе цитолиза - а также Сз2+-одного из вторичных мессенжеров, участвующего в регуляции клеточного метаболизма. С этой целью мы использовали лизогомальный ингибитор- МЯ С1, и реагент, связывающий свободный кальций - ЗГТА.

Рисунок 2.

вреия(час)

Рисунок 3.

вреыя(чао)

Гкс.2.Сравнение фрагментации ДНК (о) и лизиса клеток-мишенвй К562 (х) при дейстЕШ ЛАК-шютон человека, имеющих ' фенотипы Стб*Сй8*СВ2~ (А.) и ст+сб8+сб16" (б). Рис.3.Сравнение фрагментации ДНК (о)-и лизиса клеток-мишеней 1.929 (х) при действии ШК-клеток человека, имеющих фенотипы спIб*сш+свз~(А) и Спз+Све+СБ1б"(Б).

Присутствие в среде nh4ci и эгта не меняет активности СБа+сть+свь~ -лимфоцитов при инкубировании их с клетками К562 и L929 в первые три часа. ( Рис.4,Рис.5 ) В последущие 2 часа наблвдается снижение цитотоксичности под действием втих реагентов для обоих типов КМ.

Цитотоксическое действие ЛАК-клеток с другим фенотипом CD3+CD8+CD16~ на KM L929 снижается до нуля(в первые 3 часа),если в инкубационной среде присутствует NH^Cl .ЭГТА такие поникает (на 70%) цитотоксическое действие этих лимфоцитов .Затем ингибирование nh^ci и ЭГТА уменьшается и через 5 часов становится равным нулю. (Рис.5) Действие CD3+CD8+CD16~ - лимфоцитов на клетки К562, по-видимому, представлено суммой трех процессов,характеризущиеся различной за-висимостьв от влияния ионов Са и активности лизосомных ферментов (Рис.4).Маша видеть, что в течение первого часа после взаимодействия лимфоцитов с КМ в присутствии NH4C1 наблвдается 5СК-инги-Оирование цитотоксичности,ЭГТА в атом случае ингибируищего влияния не оказывает.В последующие 4 часа цитолиз представлен CÎ+ -зависимым, лизосомозависимым процессом и к 5-часам цитолиз км проходит без участия кальция и лизосом.

На основ вши приведенных результатов мокно сделаеть ряд обобщений.В зависимости от вида аффекторннх клеток, КМ могут гибнуть как по апоптотическому, так и некротическому пути. При действием nk-подобных лтфэцитов, независимо от типа КМ, в клетках развивается некроз.ЛАК-клетки,имеющие ЦТЛ-подобный фенотип,индуцируют смешашня тш цитолиза, который зависит от КМ. Он начинается либо с апоптога ( KM К562 ), либо с некроза ( КМ 1929) / Рис.2Б,ЗБ / Лизосомальные ингибиторы NH4ci и ЭГТА сникают цитотоксическое лей-ствие ЛАК-клеток, что свидетельствует об участии лизосом КМ в прс-цессе цитолиза.Активность лизосом была обнаружена в клетках-миле-

-УЧ2

СШ+СВа+СШб~

о

- 10

сшб+сБа"|"см"

ВРЕМЯ (ЧАО.)

1 2 3 4 3 ВРЕМЯ (ЧАО.)

г ис. 4.Влияние ш^ш и ЭГТА на цитолиз К562 при действии ЛАК-клегок разных фенотипов ( ЛАК:НМ=20:1 ):

1- в отсутствии ИН4С1 и ЭГТА;

2- в присутствии ЭГТА;

3- в присутствии ин4С1.

и

нях, гибнущих как по некротическому, так и апоптотическому пути. Полученные результаты свидетельствуют о существовании следующих типов клеточной гибели:

1.Некроз. Гибель клетки начинается с нарушения клеточной мембраны, процессы деградации ДНК отстают по времени.Пример такого типа клеточной гибели-взаимодействие лимфоцитов як-подобного фенотипа в первые часы с обоими видами рассматриваемых КМ.Ингибиторы лизосом не оказывают влияния на цитолитический процесс.(Рис.4,Рис.5)

2.Дпоптоз. Процесс начинается с фрагаентации ДНК и зависит от активации лизосомальных ферментов,как в случае гибели К562 при действии ЛАК-клеток ЦГЛ-подаОнаго фенотипа. (Рис.2Б,Рис..4)

3.Также был обнаружен тип клеточной гибели, не относящийся ни к апоптозу (ДНК-фрагментация отстает от проницаемости клеточной мембраны), ни к классическому некрозу, т.к. гибель зависит от метаболизма КМ и тормозится лизосомальными ингибиторами. С позиций представлений коллоидно-осмотической теории трудно объяснить, как ш4С1 и ЭГТА могут предотвратить нарушения водно-солевого баланса после образования пор в мембране КМ. Этот процесс мы назвали "активным некрозом",который .возможно, начинается не с образования пор,а с передачи сигнала от мембранного рецептора КМ к ее внутри клеточным системам деградации.С другой стороны не исключенно, что этот процесс может быть начальной стадией апоптотимеского процесса, когда происходит крушофрагментарная деградация ДНК. "Активный некроз" вызывают лимфоциты с ЦГЛ-подобным фенотипом в клеточной линии 1-929 (Рис.ЗБ,Рис.5).

Известно, что лизис опосредован либо секрецией растворимых, либо ассоциированных с мембраной белков.В следующих главах мы исследовали лизис КМ под действием мембранных и секретируемых белков.

- 12-см+сва+сшб~

. 20

о

й 10

ВРЕМЯ (ЧАО.)

§

ш

30

20.

10

. сшб+аза+сш

3 • 4 5

ВРЕМЯ (ЧАС.)

Рис.5.Влияние ЫН4С1 и ЭГТА на цитолиз 1-929 при действии ЛАК-клеток разных фенотипов ( ЛАК:КМ=20:1 ):

1- в отсутствии ЫН4С1 и ЭГТА;

2- е присутствии ЭГТА;

3- в присутствии Ш4С1.

5

2.ИЗУЧЕНИЕ МЕМБРАННОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ЛАК-КЛЕТОК НА КМ. Для изучения цитотоксического действия мембранных белков

на КМ были выделены мембраны ЛАК-клеток различных фенотипов. Ранее нами было показано, что мембраны разных фенотипов имеют разный состав белков. Так, в мембранах ЛАК-клвток с nk-подобным фенотипом обнаружены цитотоксические белки с молекулярными массами - 40,30,21 КДа, с ЦГЛ-подобнш фенотипом - 34,21КДа. Действие мембран лимфоцитов с nk- и ЦТЛ-подобным фенотипом

на клеточную линию L929 приведено на pic. 6. Цитотоксичность складывается из двух процессов,характеризующиеся различной скоростью. Первый максимум регистрируется через 3 часа после взаимодействия КМ с мембранами,второй - через 48 часов .Появление двух максимумов связано с существованием либо двух независимых процессов, либо двух стадий одного процесса.Для выяснения этого предположения мы исследовали влияние nh4ci и ЭГТА на гибель КМ при действии мембран ЛАК-клеток. Эти ингибиторы полностью тормозят цитотоксическое действие мембранных белков обоих фенотипов на L929 в быстром процессе, и не оказывают никакого влияния на медленный.По влиянию NH^Cl и ЭГТА на цитолиз удалось установить,что оба процесса, быстрый и медленный- дискретные,т.е.независимые друг от друга.(Рис.6) Действие мембранных белков ЛАК-клеток с NK-годобным фенотипом на клеточную линию К562 показано на Рис.7Б.Быстрый процесс характеризуется зависимостью от лизосом.ЭГТА полностью ингибирует цитолити-

ческое действие этих белков; на медленный процесс данные- ингиОкг торы не влияют.

При исследовании цитотоксичности мембранных белков ЛАК-клеток с ЦТЛ-подобным фенотипом на клеточную линию К562 был установлен интегральный характер гибели КМ, т.к.отсутствует четко выявленный максимум цитотоксичности,соответствующий быстрому процессу.(Рис.7А) Второй процесс отличается от рассмотренных Еыше примеров тем, что

Рис.6.Влияние и ЭГТА на цитолиз 1929 при действии

мембранных белков ЛАК-клеток (30 мкг) разных фенотипов: - А - свз+соз+со1 б~- фенотип;Б - Стб+Сва+СБЗ~- фенотип; лизис КМ в присутствии ЫН^С1; »- лизис КМ в присутствии ЭГТА; х- лизис КМ в отсутствии и ЭГТА (контроль);

о- фрагментация ДНК клеток-мишеней.

проходит с высокой скоростью.Цитотоксичность достигаеет 604 через

9 часов после взаимодействия КМ с мембранами ЛАК-клеток. ын4сг и ЭГТА полностью ингибирувт цитотоксическое действие мембранных белков в первом процессе,во втором процессе ингибирование отсутствует.

Следующий этап работы заключался в определении типа клеточной гибели кавдого процесса. Клетки 1-929 при действии мембран лимфоцитов, обоих.фенотипов, гибнут апоптотически как в медленном, так и быстром процессе, т.к. накопление ДНК-фрагментов опережает проницаемость мембраны КМ.( Рис.в ) Эти данные подтверждаются результатами электрофореза - первые фрагменты ДНК появляются через 3 часа после взаимодействия КМ с мембранами.ДНК- фрагменты,регистрируемые

при электрофорезе, присутствуют и в медленном процессе .

В клетках К562 под действием мембран ЛАК-клеток с Ж-подобным

фенотипом в начальные, часы наблвдается некроз( Рис.7Б ).Затем начинает расти фрагментация ДНК, опережая проницаемость мембраны,

через 3 часа появляются ДНК-фрагменты при электрофорезе-Эти данные

свидетельтвуют о смешанном процессе цитолиза (некроз,, переходящий

в апоптоз).протекающего с быстрой скоростыо.Гибель КМ завершается

медленным процессом апоптотического характера (электрофоретические ДНК-фрагменты регистрируется через 24 часа.)

Гибель клеток К562 при действии мембранных белков лимфоцитов с другим, ЦГЛ-подобным, фенотипом представлена на Рис.7А.Быстрый

процесс, проходящий за 5 часов, имеет характеристики апоптоза, т.к.проницаемость клеточной мембраны отстает от процессов деструкции ДНК, и фрагменты ДНК при электрофорезе обнаруживаются через 3 часа.Второму процессу, присущи как признаки апоптоза (ДКК-фрагменты при электрофорезе), так и признаки некроза (проницаемость клеточной мембраны КМ опережает накопление фрагментов ДНК ).

На основании полученных данных можно сделать следующие выводы.

Действие мембранных белков лимфоцитов с разными фенотипами на КМ складываются из двух дискретных процессов,характеризующиеся разной

-/(Г-

1 г 8 9 время (час)

VC

W

Н О м а К й

20.

10

время (час)

1 2 3 4 5 6 7" Fue.7.Влияние NH^Cl и ЭГТА на цитолиз К562 при действии

мембранных белков JIAK-клеток (ЗОмкг) разных фенотипов:

А - CD3+CD8+CH16~- фенотип;Е - стб+св8+ст~- фенотип;

лизис КМ в присутствии NH^Cl;

*- лизис КМ в присутствии ЭГТА;

х- лизис КМ в отсутствии НН4С1 и ЭГТА(контроль^

о- фрагментация ДНК клеток-мишеней.

скоростыо.Быстрый процесс - Са - , лизосомозависимый;медленный -не зависит ни. от ЭГТД, ни от ш4С1.

Тип гибели клеток-мишеней зависит от вида КМ и мембранных белков.Клетки 1-929 при действии мембранных белков ЛАК-клеток обоих фенотипов гибнут ашшототически. Гибель клеточной линии К562 при действии мембранных белков носит смешанный характер и зависит от фенотипа лимфоцитов,из которых были выделены мембраны.Так, процесс гибели под влиянием мембранных белков ЛАК-клеток ПК-подобного фенотипа начинается с не1фоза и завершается апоптозом.При действии ЦТЛ-подобных мембранных белков клетки К562 гибйут апоптотически с признаками некроза во втором процессе.

3.ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ СУПЕРНАТАНТА ЛАК-КЛЕТОК НА КМ.

Мы исследовали действие цитотоксических белков, секретируемых разными фенотипами ЛАК-клеток на Ж-чувствительные й Ж-резистент-ные линии клеток. Ранее мы обнаружили, что различные субпопуляции ЛАК-клеток секретируют разные цитотоксические белки.Для ык-подобного фенотипа ЛАК-клеток это "белки с молекулярной массой -75,38,22 КДа. Для ЦТЛ-подобных лимфоцитов- белки с молекулярной массой 30,40 КДа.Источником растворимых , цитотоксических белков е наших экспериментах служил супернатант ЛАК-клеток (СН),получаемый после 18-часовой инкубации с клетками К562.

На Рис.8 приведены схематические кривые гибели КМ при действии ци-токсических белков,секретируемых лимфоцитами с ЦТЛ-подобным фенотипом.Можно видеть,что в зависимости от концентрации цитотоксических белков меняется профиль кинетической кривой,число отдельных процессов. и время их проявления.Кривая гибели клеток 1929 под действием неконцентрированных СН ЛАК-клеток ЦТЛ-подобного фенотипа представлена,в основном,медленным процессом,проходящим за 48 часов с низкой

время(час)

Рис.8.Гибель клеток-мишеней при действии разных концентраций супернатантов ЛАК-клеток ЦТЛ-подобного фенотипа:

а - неконцентрированные СИ;

б - концентрирование СН в 10 раз; скоростью. (Рис 8) При концентрировании этого супернатанта увеличивается скорость ыедлешого процесса гибели клеток 3-929 и выявляется процесс,цротекящий с более высокой скоростью и максимумом цито-токсичности через 3 часа. (Рис.8) При изучении действия тех не белков и тех же концентраций СН на клеточную линию К562 выявить быстрый процесс не удалось.(Рис.8)

Действие супернатанта ЛАК-клеток, с нк-лодобным фенотипом на КМ не отличается от супернатанта лимфоцитов, имеющих ЦГЛ-подобный фенотип. Однако .ЯК-чувствительные клетки К562 обладают, меньшим сродством к белкам супернатантов, и для получения кинетических кривых, аналогичным 1фивым гибели клеток 1-929 .необходимо значительно увеличить концентрацию растворимых цитотоксическкх белков (в 10-20 раз).

Как и для мембранных белков, с помощью Ш4С1 и ЭГТА, удалось разобщить интегрированные процессы гибели КМ при действии раствори-

60 _ _

о 40 .

н ©

5 зо.

о 20 _ я

г»

|10 -!

X

о

т I—:—I-1-1-

1'3 5 24 48 время (час)

Рис.9.Цитолиз клеток 1.929 при действии 10-кратных супернатантов ЛАК-клеток КК-подобного (А) и ЦГЛ-подобного (Б) фенотипов: о- лизис КМ в присутствии ИНдСИ; *- лизис КМ в присутствии ЭГГА; х- лизис КМ в отсутствии Ш4С1 и ЭГТА(контроль).

-яи~

-1-1-1-1-1-г

1 2 3 4 5 6 7

время (-час)

40 _

Я

30. »

о

§20.

8ю

о

Н «

2 3 4 5 6

*

я

о*

2

I Г г Г 24 30 48

время (час)

Рис.10.Цитолиз клеток К562 при действии 30-кратных супернатантов ЛАК-клеток НК-подобного (А) и ЦТЛ-подобного (Б) фенотипов: о- лизис КМ в присутствии ИН4С1; «- лизис КМ в присутствии ЭГГА; х- лизис КМ в отсутствии МН4С1 И ЭГТА(контроль).

мых белков (Рис.9, Рис. Ю).Можно видеть,что ын^сц влияет только на быстрые процессы, на медленные - тормозящего влияния не оказывает. Эффект влияния ЯН4С1 аналогичен для всех типов КМ и всех видов эффекторных белков.

Быстрые процессы при действии растворимых белков обоих СН на КМ зависят от кальция. (Рис.9,10) При исследовании медленных процессов цитолиза ЮЛ было обнаружено неоднозначнее ингибирущее действие ЭГТА на разные клетки-мишени.Можно видеть (Рис.9),что ЭГТА инги-бирует.цитолитические процессы в клетках 1929 на 5(К, и не влияет на цитотоксичность белков в отношении клеток К562. (Рис.10). Эти результаты позволяют предположить,что медленный цитолиз клеток КБ62 -процесс Са2+-независгалый,а цитолиз .клеточной линии 1-929 при действии

этих же белков,по-видимому, представлен суммой различных процессов. В клеточной линии К562 фрагменты ДНК . при электрофорезе появляются через час после взаимодействия ЮЛ с СН обоих типов, что свидетельствует об апоптотическон характере гибели этих клеток. ( Рис.11)

При гибели клеточной линии. 1929 при действии СН ЛАК-клэток обоих фенотипов в быстром процессе наблюдаются признаки некроза,что подтверждается отсутствием в первые 5 часов ДНК-фрагментов при электрофорезе( Рис. 12).К 6 часам появляются фрагменты ДНК, накапле-ние которых-регистрируется и в последующие часы .Таким образом, гибель клеток начинается с быстрого некроза и заканчивается медленным апоптозом.

Как видно из приведенных результатов, медленные процессы представлены апоптозом для всех цитатоксических белков и всех ви#бв клеток-мишеней.Гибель КМ при действии растворимых белков, как и

мембранных,протекает с различной скоростью.Процессы, протекающие с 2+

высокой скоростью- Са - , лизосомозависимые.Медленные процессы не связаны с активностью лизосом,влияние кальция на этой стадии зависит от типа- КМ. Путь клеточной гибели определяется видом КМ.

Z2

1 г з f ¿~ ( r g s ro

Cr1«l

~ -»'И ¿»г

"U i

Рис.12.

P c. 11 .Электрофорез ДНК. клеток К.ьбг,оораоотанних 30-кратным СН J! К-к^еток nk-подобного 1-4 и цт,Л--подобно го 5-8- фенотипе®. К троль:9-а.

1 о.у - через 1 час: 2.6 .10- через 3 часа:

3 7.1!- через Б ча.соз:А 8.12- через 24 часа.

Рис. 12. Электрофорез ДШ клеток 1-925. обработали»л Ю-крап/пм

СИ JiAif-KjjeTOK разня* фенотипов: 1.3.5.7 - через 3.6.5.2-1 часа после взаимодействуя с СН ЛАК-клегск мк,~подобного Фенотипа:

2 л 6.8 - через 3.6.9.24 часа после взаимодействия

с СН ЛАК-клеток ШЛ-полочного фенотипа: S. 1С - контроль 1-929 через 9.24 часа.

вывода.

1.Изучен цитолиз кк-чувствительных и №<-резистентных КЫ под действием ЛАК-клеток о фенотипамми СШ+СБ8+СВ16~ и стб+свд+сш~. Установлено,что путь гибели зависит как от фенотипа ЛАК-клеток,так и типа КМ.Показано,что под действием СШб+СЮ+С1)3--клеток оба типа клеток-мишеней гибнут ш некротическому пути. Цитолиз КМ, опосредованный ЛАК-клетками с сю ста СВ16 - сметанный процесс,- в котором присутствуют кав некротические,так и апоптотические характеристики. Гибель клеток К562 начиняется о апоптоза .который затем переходит в некроз.Начальный процесс цитолиза 1928 протекает ш некротическому пути и заканчивается апоптозом.

2.Показано,что гибель клеток при действии циталитических лимфоцитов -активный метаболический процесс, обусловленный активацией собственных ферментов деградации глизосомных ферментов и ядерных нуклеаз.

о. 2+

3.Охарактеризованы зависимый я Са -независимый пути цитолиза. Показано, что С^4"- зависимые процессы протекают о большей

о.

скоростью,чем Са - независимые.

4.Изучены процессы гибели КЫ под действием цнтотоксических белков, ассоциированных с мембранной лимфоцитов.С помощью ЭГТА и лизосом-ных ферментов удалось разобщить цитолиз КЫ на процессы, протекающие с различной скоростью. Механизм гибели клеток-мишеней зависит от типа КЫ и мембранных белков ЛАК-клеток.

5.Установлено, что гибель КЫ, индуцированная секретируемыми цито-токсичесними белками, состоит из дискретных циталитических процессов.Число и скорость процессов зависит от концентрации цнтотоксических белков.Быстрые процессы - С^*-зависимы,лизосомозависимы;на процессы .идущие с медленной скоростью, ЭГТА и лизосомальные ингибиторы влияния не оказывают. Апоптотический или некротический тип гибели завист от типа клеток-мишеней.

«

Список литературы.

1-Сащенко Л.П..Гнучев Н.В.,Лукьянова И..Кабанова О.Д..Редченко К.В.,Блищенко Е.Ю., Саптаев Д.К., Чертов О.Ю., Хайдуков С.В., Луканинин Е.М.- Влияние КЛ-2 на цитолитическую активность, экспрессию-поверхностных маркеров и секреции неполитических белков лимфокин-активироваяными киллерными клетками. Эксперим.онкология 19Э2,Т.14,N5,стр.54-58.

2- nabanova О. D. , fteacnenko I.V. , Lukjanova Т. I., Saschenko 1__Р.,

Lukamdiri Е.М. , Gnuchev N. V. , Blischenko Е. Yu. . Chertov О. Yu. —

cells induce Ootn necrosis and apoDtosis in target cells. Symposium "Structure and function of regulatory polypept iaes", Abstracts, Moscow, 15'3£:. p. ¿7.

3. Sascheriko L. P., Enuchev N.V.. Lukjanova Т. I. , fcedchenxo I. v. , NaDanova u. D. , Lukamdiri E. m. , B1 iscnenko E. Yu. , Satpaev D. K. , Knaidu— kov £. V. . Cnertov 0. Yu. — Tirne-aeperiDent cnanges of Lfir. cell pher.o— types correlate with tne secretion of different cytotoxic proteins. Irnrnunoiooy Letters 1S93, v. 37, p. 153-157.

4. haicneriko L. P., Kaoanova D. D. , Biiscrtermo E.Yu. . Lukjanova Т. 1. , Satpaev D. K. .Chertov 0. Yu., Gnucnev Tj.V. — Tne rcue of apoptotic and necrotic processes iri cvtoiysis mediated oy LhK cells with diffemt onenotypes. FEBS 1ЭЭЗ, v. 335, N£. p ,£70-£7£.

5.Гнучев К.В., Сащенко Л.П..Кабанова О.Д..Лукьянова Î.M., Блищенко Е.Ю., Быковская C.B.- Исследование фрагментации ДНК в клетках-мишенях, взаимодействующих с цитолитическими Т-лим£оцитами. ДАК 1994,T.335,N4,стр.522-524.