Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование морфо-функциональных изменений мужских половых клеток при сохранении IN VITRO и IN SITU
ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Исследование морфо-функциональных изменений мужских половых клеток при сохранении IN VITRO и IN SITU"

На травахрукописи

Мохаммадзаде Сайд Мозбан

ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФО-ФУНКЦНОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МУЖСКИХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ СОХРАНЕНИИ IN VITRO И IN SITU

03.00.30 - Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре Эмбриологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: Доктор биологических наук,

' Ю.К. Доронин

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

Кандидат биологически наук, доцент МА. Ланге

Ведущая организация: Институт биологии развития РАН

Защита состоится « » _2004 г. в /Т" ч 3/) мин на заседании

Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, д. 1, корп. 12, Биологический факультет МГУ, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « /¿/» ^ 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы На протяжении последних десятилетий сперматозоиды различных животных служили предметом интенсивных исследований. Причины этого предопределены бурным развитием репродуктивных технологий животных и человека. Один из важнейших вопросов такого рода исследований - оценка фертильности сперматозоидов в эякулятах, либо в тех или иных суспензиях сперматозоидов. Известно множество работ, в которых оценивалась жизнеспособность сперматозоидов в соответствии с их морфологическими, физиологическими и биохимическими показателями. Это, прежде всего, двигательная активность сперматозоидов; структура акросомы и выраженность акросомальной реакции; целостность мембраны клетки; активность митохондрий; морфология ядра и состояние хроматина. Однако, до сих пор нет методов, позволяющих гарантированно предсказать фертильность всякого эякулята по отдельно взятым показателям сперматозоидов.

Очевидно, что наиболее достоверной, исчерпывающей характеристикой качества сперматозоидов является успешность оплодотворения (при условии качественности женских гамет). Этот способ, однако, по сути процедуры, достаточно редко приобретает прогностическую ценность. Нарушение нормального (часто недостаточно четко определенного) статуса структурных компонентов сперматозоидов -- каждого в отдельности, либо в тех или иных сочетаниях одного с другим — как правило, достаточно для прерывания сложнейшего каскада событий оплодотворения. Из этого следует, что оплодотворяющая. способность сперматозоидов находится в прямой связи с их жизнеспособностью: непосредственно после получения, либо по мере хранения эякулята или суспензии in vitro.

Для конкретизации понятия «жизнеспособность» в приложении к сперматозоидам мы обратились к общеизвестной, но крайне редко употребляемой в сперматологии, общебиологической закономерности. Факт полового размножения предполагает чередование различающихся шюидностью поколений, т.е. жизненный цикл организмов. В таком контексте зрелые половые клетки высших организмов есть ни что иное, как гаплоидная форма этих организмов

Признание гаплоидной формы существования организмов позволяет применить методологию и хорошо развитые приемы анализа выживаемости в популяции диплоидных, наделенных "сомой", организмов. Показатели выживаемости, по

определению, опосредуют все многообразие жизненных проявлений, и могут служить исчерпывающей интегральной характеристиками.

Множество переживающих в тех или иных условиях in vitro половых клеток, возможно представить как своеобразную клеточную культуру. Поскольку эти клетки, по определению, не пролиферируют, такая культура должна быть признана "стационарной" и, соответственно, испытывать "стационарное старение" (Khokhlov, 2000). Старение клеточных культур на протяжении стационарной фазы их существования связывают с изменениями структуры и состояния ДНК (Виленчик, 1987, Хохлов 1988). Поскольку гаметы транскршщионно пассивны, то последствия стационарного старения смогут проявиться только после активации их генома, т.е. после оплодотворения в составе диплоидного ядра, но никак не участвуют в собственно "старении" переживающих гамет. Иными словами, если гаметы стареют, то механизмы этого процесса следует полагать связанными с изменениями морфологии и функциональных проявлений образующих их структур, но только не ядер.

Цели и задачи исследования. Опираясь на изложенное выше, мы предприняли попытку оценить жизнеспособность зрелых мужских гамет как по динамике изменения их численности, так и в соответствии с "парциальной" динамикой изменения их функциональных проявлений. Для достижения этой цели мы воспользовались стандартными набором средств для оценки состояния клеточной мембраны, митохондриального аппарата и двигательной системы клеток, регистрируя эти показатели по мере существования суспензий сперматозоидов рыбы и мыши in vitro и сперматозоидов мыши in situ post mortem. Своего рода интегральной оценкой жизнеспособности сперматозоидов, опосредующей как минимум, три из названных выше - двигательную активность, деятельность митохондрий и состояние клеточной мембраны, - служила внутриклеточная концентрация АТФ.

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые на примере двигательной функции продемонстрирован факт «дозревания» сперматозоидов в минеральной среде, свидетельствующий об автоматии процесса спермиогенеза. Продемонстрирована последовательность событий, ведущих к потере специфических проявлений мужских гамет. В первую очередь, в тесной ассоциации с изменениями состояния наружной мембраны, происходит утрата двигательной активности, сопровождающаяся существенным снижением внутриклеточного содержания АТФ.

Показано, что - кинетика. таких переходных процессов хорошо описывается сигмоидальными зависимостями, что позволяет предполагать участие в них процесса «старения» соответствующих внутриклеточных компонент. Показана способность переживания эпидидимальных сперматозоидов мыши при низких положительных температурах в течение 18 дней после умерщвления животных и возможность дальнейшего переживания сперматозоидов in vitro на протяжении 4-21 дня. В совокупности, сперматозоиды мышей сохранялись при низких положительных температурах от 22 до 39 дней. Последнее, с учетом современного уровня технологий экстракорпорального оплодотворения, создает хорошие предпосылки для сохранения и репродукции уникальных геномов в случае скоропостижной гибели их носителей.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на 3-ей Международной Ирано - Российской конференции «Сельское хозяйство и естественные ресурсы» (Москва, 2002 г.), на V Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения», (Харьков, 2002 г.), на научно- практической конференции «Зоокультура и биологические ресурсы» (Москва, 2004 г.), на 10-м Семинаре Иранских исследователей в Европе (Cambridge, UK, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура работы. Диссертация включает разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждения результатов» и «Выводы», изложена на 128 страницах, содержит 43 рисунка и 24 таблицы. В списке цитированной литературы представлены 130 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сперматозоидырыбы

Использованные в опытах вьюны (Misgurnus fossilis L.) были отловлены в Мещерском районе Рязанской области. В лаборатории самки и самцы содержались отдельно в 20-литровых емкостях в холодильнике при температуре +4 - +8°С.

Рыбы умерщвлялась декапитацией. От ближайшей к выводному протоку части семенника отделяли небольшой участок, который измельчали в 10 мл раствора Рингера (NaCl- 0,65%, КС1 - 0,025%, NaHCO3 - 0,20%, CaCl- 0,03%). Плотность полученной суспензии определяли с помощью камеры Горяева и разводили раствором Рингера до

окончательной концентрации - 10' клеток на мл. Образцы суспензий сохраняли в пластиковых пробирках при температурах 10°С, 18°С и 25°С.

Сперматозоидымыши

В опытах были использованы 25 половозрелых (9-месячных) самцов белых мышей (SHK) весом около 30 г. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, вскрывали и извлекали один из семенников. Семявыводящий канатик отделяли от связок и жировой ткани и отрезали его в области сразу после эпидидимиса и дистальнее места впадения протоков семенных желез. Фрагмент помещали в предварительно взвешенную пробирку с 1 мл нагретой до 37°С среды «FertiCul? » (Бельгия). Далее, пробирки повторно взвешивали для определения веса образца и, периодически встряхивая, инкубировали в течение 15 минут при 37°. Концентрацию сперматозоидов в полученной таким образом суспензии оценивали с помощью камеры Горяева. Из исходной суспензии готовили рабочую суспензию с концентрацией 106 клеток в 1 мл-Полученные суспензии сперматозоидов инкубировали при температурах 37°и 6°С.

Анализ суспензий сперматозоидов

Анализ суспензий состоял в определении ряда, морфологических и функциональных показателей.

1. Численность головок сперматозоидов вьюна и каждого из 6 выделенных основных морфологических элементов эпидидимальной суспензии мышей (см. ниже) подсчитывали на микрофотографиях различных участков камеры Горяева.

2. Двигательную активность сперматозоидов вьюна определялась в капле суспензии, разбавленной дистиллированной водой (чем достигается активация движения). Препарат немедленно помещали на столик микроскопа и фотографировали в темном поле с 4-секундной экспозицией через каждые 15 секунд на протяжении всего времени движения сперматозоидов (1-2,5 мин). Повторные определения двигательной: активности сперматозоидов производили через 1 - 2,5 часа на протяжении всего времени хранения сперматозоидов in vitro.

Длину треков двигавшихся сперматозоидов на фотографиях измеряли с использованием программы "Plana" (разработка ин-та Биофизики РАН, Пущино-на-Оке).

3. Показателем двигательной активности эпидидимальных сперматозоидов мыши служило отношение числа движущихся (поступательное движение, вращение на месте, движение хвоста в отсутствии поступательного движения) сперматозоидов к общей численности сперматозоидов в поле зрения микроскопа. Каплю суспензии помещали на предметное стекло между двумя покровными стеклами и накрывали третьим покровным стеклом. Под микроскопом (объектив - х16, окуляр — х 16) подсчитывали количество движущихся и неподвижных сперматозоидов в 20 - 25 неперекрывающихся полях зрения.

4. Состояние мембраны сперматозоидов (так же как ядросодержащих фрагментов сперматозоидов) определяли с помощью люминесцентного красителя йодида пропидия (5 мкг/мл) и эозина (0, 2%), подсчитывая численность метящихся структур на фотографиях, полученных на обычном световом ("Invertascope - D") и люминесцентном ('Axiovert 25") микроскопах.

5. Состояние митохондрий целых сперматозоидов и содержащих митохондрии фрагментов сперматозоидов (отдельные хвосты, комплексы головки с шейкой) определяли так же, как в предыдущем случае. К 5 мкл суспензии добавляли 5 мкл рабочего раствора родамина 123 (Sigma, 10мкг/мл), приготовленного на инкубационной • > среде. Пять полей зрения фотографировали в видимом и ультрафиолетовом свете. Изображения одной области совмещали на компьютере и определяли долю метящихся родамином структур.

6. Концентрацию АТФ в элементах суспензии определяли биолюминисцентным методом (Угарова, 1993) на люминометре 3550i ("New Horizons Diagnostic Corp.", США), используя «АТФ-реагент» (Химический факультет МГУ).

Протокол опыта по выживанию сперматозоидовмыши в трупе

Дня исследования выживания сперматозоидов в мертвых телах трупы мышей сразу после умерщвления заворачивали в фильтровальную бумагу, вкладывали в маркированный полиэтиленовый пакет и помещали в холодильник. Трупы сохраняли при температуре + 6°С. По истечении срока хранения, труп вскрывали и извлекали один из семенников. Суспензию сперматозоидов готовили таким же образом, как описано -выше. Полученную из трупов суспензию анализировали немедленно после получения и далее сохраняли в течение 1,5-2 недель при температуре +6°С.

Математическая обработка полученных в эксперименте данных была ориентирована на выявление закономерностей переходных процессов. Переход системы из некоторого состояния 1 в некоторое альтернативное состояние 2 возможно описать разнообразием сигмоидальных функций. Для аппроксимации экспериментальных данных мы использовали набор сигмоидальных функций, представленных в пакете программ "SigmaPlot". Это:

• собствен"" Я-у Т/Г 4-у ТТЯПЯМРТПТТОРГ1ЛЖР < ■ тп \т( ит гу гг,1 гг.п ■ ^яниСИМОСТИ

/=а/(! +ехр(-(Но)/Ь)) и/=уо+а/(1+ехр(-(Ы^/Ь));

3-х и 4-х пар-""™"""™™

f~a/[l+(t/lo)hb] и f=y0 + а/[]+ШАЬ];

4-х параметрическое уравнение Вейбулла:

f=yo+a*(l-exp(-(abs(t-to+b*ln(2r(l/c))/b)*c)))

3-х и 4-х параметрические уравнения Гомпертна:

fra exp{-exp[(t-ta)/b]} nf=y0 + aexp{-exp[(t-ta)/b]}

• • 3-х и 4-х параметпические уравнения Хилла:

f=atAb/(c*b+t*b) и f=yo+at*b/(c*b+t*b)

Полученные в опыте материалы обрабатывали статистически, используя (помимо упомянутых выше) пакеты программ "Stadia", "Ststistica" и "Mathematica 4".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выживание сперматозоидов вьюна in vitro

Динамика численности элементов суспензии тестикулярных сперматозоидов вьюна

Незначительные размеры сперматозоидов вьюна (головка - 2 мкм, хвост - 30-40 мкм), не позволяют, с достаточным уровнем достоверности, количественно характеризовать динамику численности нормальных и аномальных сперматозоидов и фрагментов сперматозоидов. В связи с этим, мы ограничились определением численности головок сперматозоидов, без указания того, автономны ли они (т.е. являются. ли они фрагментами клеток), либо включены в состав целостных сперматозоидов.

Кривые изменения - численности головок сперматозоидов в суспензиях, инкубировавшихся при температурах 10°С, 18°С и 25°С, демонстрируют сравнительно слабо выраженную динамику убыли элементов. В каждом из этих случаев, кривые наилучшим образом алпрокисимируются сигмоидальными зависимостями (по Гомпертцу, логистическими кривыми, простой сигмоидой), и наименее удачно -экспоненциальной зависимостью. Последнее позволяет полагать, что вероятность элиминации головок сперматозоидов возрастает со сроком их содержания in vitro. Иными словами, возможно говорить о том, что в целых клетках и (или) в отдельных головках сперматозоидов со все большей интенсивностью развивается эндогенный процесс, старение, завершающийся элиминацией этих структур.

Двигательная активность сперматозоидов вьюна.

В' результате одного тестирования двигательной активности сперматозоидов вьюна с помощью предложенного выше метода определяются: (1) доля подвижных сперматозоидов, (2) скорость движения и (3) продолжительность движения сперматозоидов.

На протяжении большинства раундов тестирования доля подвижных сперматозоидов и скорость их движения монотонно убывают. Но при некоторых тестированиях эти кривые становятся фазическими, т.е. монотонное убывание: сменяется периодом возрастания численности движущихся сперматозоидов и значений скоростей их движения. Такая форма кривой свидетельствует о латентной активации не способных к движению сперматозоидов. В каждом из режимов инкубации сперматозоидов всегда регистрировалась фазическая реакция сперматозоидов, амплитуда которой существенно превышала предшествующие. В результате, кривые, отражающие изменения доли подвижных сперматозоидов, среднюю скорость и количества их движения на протяжении всего периода наблюдений • имеют ряд последовательных максимумов и минимумов. Такой характер кривых свидетельствует о том, что состояние сперматозоидов изменяется по мере их содержания in vitro. При этом часть из них приобретают способность к движению в различные моменты времени, но вскоре, спонтанно, без всякой активации теряют эту способность. (В противном случае кривая выглядел бы монотонно возрастающей, но не многофазной). Иными словами, полученная в результате измерений кривая является.

дифференциальной кривой, отражающей изменения двигательной, активности сперматозоидов по мере их инкубации. Это позволяет реконструировать интегральную кривую, характеризующую убыль потенциальной способности • сперматозоидов к движению. Интегральные кривые наилучшим: образом аппроксимируются сишоидальными зависимостями.

Динамика метящихся эозином сперматозоидов

При содержании суспензии сперматозоидов при 25°С доля метящихся эозином клеток монотонно возрастает. В суспензиях, содержавшихся при 18°С и 10°С, кинетика возрастания численности эозинофильных клеток достаточно сложна и, что наиболее интересно, имеет фазовый характер. Последнее обстоятельство позволяет полагать, что способность к окраске эозином, эозинофилия, так же как способность к движению, при сохранении клеток in vitro развивается самопроизвольно. Из этих кривых следует также,, что в суспензиях, сохраняющихся при 18°С и 10°С, находятся как минимум две популяции, достигающие максимальной эозинофильности через 8- 10 часов и 25 - 30 часов культивирования.

Характер полученных в результате измерений кривых позволяет, так же как в случае с двигательной активностью, восстановить интегральную кривую, характеризующую потенциальную - эозинофилию сперматозоидов; по мере их содержания in vitro. Интегральные кривые, характеризующие этот показатель, описываются сигмоидальными зависимостями по Гомпертцу существенно лучше, чем экспоненциальными.

Динамика метки йодистым пропидием

По мере сохранения суспензии тестикулярных сперматозоидов при температурах 10, 18 и 25°С возрастает доля метящихся йодистым пропидием ядер. Кинетика этого процесса наилучшим образом описываются сигмоидальными зависимостями по Гомпертцу.

Динамика внутриклеточной концентрации. АТФ в переживающих при

различных температурах сперматозоидах

Концентрация АТФ падает по мере сохранения тестикулярных суспензий вьюна Это падение зависит от температуры инкубации суспензии и хорошо аппроксимируется как экспоненциальной, так и сигмоидальной зависимостями. При прочих равных условиях, аппроксимация сигмоидальными (4-х параметрическими логистическими) кривыми представляется более адекватной разбросу полученных данных. Из этих аппроксимаций следует, что концентрации АТФ не снижается до нуля: достигнув нижнего предела (0,22-10-13, 0,47*10'13, 0,58*10"13 мМ/мл в клетке при 25 °С, 18°С и 10°С, соответственно), концентрация АТФ более не изменяется.

Активация движения сопровождается 1,5-1,2 - кратным, падением концентрации АТФ на протяжении 1,5 - 1,7 минут. Очевидно, что градуальность падения концентрации АТФ обеспечена градуальным падением количества движущихся сперматозоидов - и градуальным замедлением движения отдельных сперматозоидов. Стационарный уровень содержания АТФ после прекращения движения,. вероятно, обеспечен, внутриклеточной концентрацией. АТФ в неактивировавпгахся сперматозоидах и «остаточной» концентрацией. АТФ в. активировавшихся и завершивших движение сперматозоидов..

Динамика активности митохондрии сперматозоидов.

Относительное количество метящихся родамином 123 клеток не изменяется при-инкубации суспензии при трех температурах. Уравнения линейных трендов, аппроксимирующих эту динамику не различаются одно от другого и от линии, параллельной оси X, пересекающей ось У в координате, равной 1.

Сперматозоиды мыши Динамика компонентов суспензии

Анализ суспензий, полученных от различных животных позволил выделить следующие, наиболее обычные структуры: морфологически нормальные сперматозоиды (44 - 48%); сперматозоиды с изогнутыми хвостами (39 - 43%) и сперматозоиды, у которых хвост скручен в циркулярную структуру, к которой примыкает головка (0,9 - 2%). Помимо целостностных сперматозоидов, для суспензий

обычны фрагменты сперматозоидов: отдельные головки (4,8 - 7%), отдельные хвосты (точнее, комплексы собственно хвоста и шейки) (1,2 — 2,6%), и комплексы головки и шейки сперматозоидов (1,4 — 4,8%).

Анализ линейных трендов временной динамики: компонентов суспензий свидетельствует о том, что наименее стойкой структурой являются сперматозоиды с изогнутыми хвостами, численность которых снижается как при 37°С (коэффициент наклона отличается от 0, р<0,001), так и при 6°С (р<0,001). Численность морфологически нормальных сперматозоидов падает при инкубации в 37°С (р<0,0001), но сохраняется неизменной при 6°С (коэффициент наклона не отличается от О, р>0,05). Наиболее устойчивыми представляются «скрученные» сперматозоиды, численность которых не. изменяется на протяжении всего периода наблюдений в обоях температурных режимах (р>0,05). Накопление головок сперматозоидов происходит существенно быстрее при 37°С (р<0,05), чем при 6°С (р<0,001). При 6°С темп роста численности отдельных хвостов сравним с темпом роста численности головок сперматозоидов (р<0,05), а при 37°С статистически не отличается от 0 (р>0,05). Распад комплексов головок с шейкой при 6° (р>0,05) затруднен, хотя при 37° эти структуры достаточно интенсивно деградируют (р<0,05).

В целом, при 37° численность сохраняющих целостность сперматозоидов падает (коэффициент наклона линейного тренда равен -1,51 ± 0,294, достоверно отличается от 0, р<0,001), в то время как численность клеточных фрагментов следует считать неизменной (коэффициент наклона равен 0,49 ± 0,406 и не отличается от 0, При 6° развивается противоположная ситуация: количество целых сперматозоидов изменяется незначительно (коэффициент наклона: -0,03 ± 0,036, не отличается от 0, в то время как вполне значимо возрастает численность клеточных фрагментов (039 ± 0,100; отличается от 0, р<0,05).

Динамика функциональных показателей

Доля метящихся йодистым пропидием головок - отдельных, в составе целых сперматозоидов или в комплексе с шейкой сперматозоида, - так же как доля метящихся родамином 123 структур - в целых сперматозоидах и в комплексах головки с шейкой и хвоста и шейки, - сохранялись неизменно высокими на протяжении периода

исследования: 0,90 ± 0,040 (коэффициент наклона линейного тренда не отличается от 0, р>0,05) и 0,91 ±0,023 (р>0,05), соответственно.

К 7-8 часу инкубации суспензии при 37°С исчезают подвижные сперматозоиды. Динамика сокращения двигательной активности во времени достаточно хорошо описывается простой экспоненциальной зависимостью:

М(1) = ае'ы,

где: а = 0,189 ± 0,0296, (значимость коэффициента р <0,0001), Ь = 0,306 ± 0,0892 (р = 0,0045), коэффициент корреляции (Я) равен 0,773.

Концентрация АТФ в элементах суспензии (в расчете на 106 структур), содержащих митохондрии (целые сперматозоиды, хвосты, комплексы головка с шейкой), при 37° падает в течение трех часов после помещения сперматозоидов в среду инкубации. Далее, скорость падения замедляется: концентрация АТФ медленно понижается, стремясь не к нулю, а к некоторому предельному значению. Динамика изменения концентрации АТФ, С(1), хорошо аппроксимимруется экспоненциальной зависимостью:

а = (6,67 ± 1Д83)10"7, Ъ = 1,46± 0,267, С0= (2,49 ± 0,871)10"', Я = 0,955.

Подобным же образом (но в ином временном масштабе) изменяется концентрация АТФ в содержащих митохондрии структурах суспензии, инкубировавшихся при 6°. Уравнение, наилучшим образом аппроксимирующее динамику концентрации АТФ, в этом случае включает три слагаемых:

С(/) = С0 + ае~ы + се*, где

а = (1,25 ± 0,140)10-*, Ь = 3,63±0,452, с = (8,19-± 0,968>юЛ^ = (8,51-± 2,396) 10"2, С0= (1,59-± 0,316)10Л X = 0,988.

Выживание сперматозоидов мыши в мертвом теле

Результат исследования резюмирован в таблице. На протяжении всего периода существования в трупах плотность сперматозоидов во фрагментах семявыводящего канатика, численность каждого из основных компонентов суспензии, двигательная активность сперматозоидов и доля метящихся йодистым пропидием ядросодержащих структур- сохранялись неизменными: коэффициенты наклона линейных трендов перечисленных показателей не отличаются от 0. Исключением оказались лишь два

Таблица

Морфологические и функциональные показатели эпидидималъных сперматозоидов мыши, извлеченных из трупов разной

давности

Морфологические формы в Морфофункциональные характеристики сперматозоидов

Срок Исходная суспензии, *

существования плотность

сперматозоидов в суспензии в % Доля Доля Содержание

трупе, сутки пересчете на проявляющих меченых метящихся АТФ мМ/мл на

1 мг ткани, 1 2 3 4 5 6 двигательную йодистым родамином 106 содержащих

хЮ3 активность пропидием 123 митохондрии

единиц; xl О"7

1 415,52 53.53 30.31 1,02 4,04 2,02 9,09 14 0,54 0,907 0,169

2 71,01 52,74 31,51 9,59 0 0 6,16 28 0,93 0,944 2,441

3 130,19 52,9i3 27,06 1.18 12,94 1,18 4,7 22 0,833 0,961 1,892

4 62,28 56,13 16.67 0 18,42 2,64 6,14 15 0,719 0,88 1,172

5 203,48 54,43 18,99 0 18,35 5,70 2,54 28 0,674 -0,759 1,073

6 178,98 59,63 14,91 0,62 9,94 10,56 4,34 21 0,894 1,000 2,071

7 138,92 54,55 31,82 0 4,54 7,58 1,51 29 0,633 0,911 1,188

8 - 57,55 22,64 0,95 7,55 2,83 8,48 46 0,571 0,808 2,972

9 68,51 46,38 19,56 7,25 10,15 11,60 5,07 2 0,96 0,554 0,074

10 39,33 69,13 8,83 0 10,29 4,40 7,35 2 0,889 0,875 0,237

11 59,52 41,70 18,95 3,87 13,88 3,87 17,74 28 0,565 0,846 2,027

12 128,78 48,55 38,39 0,73 7,25 0,73 4,35 44 0,715 0,902 1,705

13 28,54 43,71 26,49 3,98 10,59 6,62 8,61 37 0,479 0,663 1337

14 111,42 48,35 31,66 1,66 5,83 1,66 10,83 28 0,555 0,875 0,850

15 65,45 57,03 25,97 0,99 13,01 2,00 0,99 0 0,567 0,429 0,020

16 22,32 39,54 1,15 1,15 45,38 10,46 2,33 0 0,912 0,641 0,050

17 - 78,99 3,11 1,94 10,11 3,50 2,33 0 0,913 0,574 0,040

18 285,62 64,42 14,77 2,01 8,73 0,68 9,39 15 0,825 0,935 0,199

* - I - нормальные спермии 1,2 - спермии с изогнутыми хвостами, 3 - «скрученные» спермии, 4 - отдельные головки, 5 -

хвосты, 6 - комплексы «головка - шейка.

показателя: достоверно снижаются доля метящихся родамином 123 структур и концентрация АТФ в митохондрионсодержащих структурах суспензии. Оба показателя положительно коррелируют один с другим (параметрическая корреляция: R = 0,525, значимость коэффициента корреляции, р = 0,024; значимая (р = 0,007) положительная непараметрическая корреляция по Кендаллу и по Спирмену).

Выживание извлеченных из трупов сперматозоидов in vitro

Коэффициенты наклона линейных функций, экстраполирующих динамику численности целых сперматозоидов и фрагментов разрушенных сперматозоидов в полученных г от трупов - различного срока суспензиях, сохранявшихся при 6°С, в подавляющем большинстве случаев оказались незначимыми (т.е. не отличающимися от 0). Иными словами, численность целых сперматозоидов следует полагать неизменной на протяжении каждого из наблюдений. Более того, динамика численности целостных сперматозоидов, извлеченных сразу после умерщвления животного, не отличается от таковой в суспензиях, полученных от трупов разного срока.

In vitro суспензии сохранялись от 4 до 21 дня после извлечения из трупов. Суспензии погибала в результате бурного развития бактериальной инфекции. Время. существования суспензия (Т) хорошо аппроксимируется уравнением

где / - срок существования сперматозоидов в трупе, а и Ь - постоянные, равные 17,58±2,629 (р 0,0001) и 0,06±0,019 (р = 0,004) соответственно, R = 0,649

В совокупности, в трупе и in vitro, сперматозоиды сохранялись от 14 до 26 дней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сведения, приведенные в обзоре литературы, результаты наших исследований и их сопоставление с рядом известных данных, позволяют заключить следующее.

Зрелый сперматозоид - гаплоидную клетку с инактивированным геномом,' -возможно представить как минимальную (вырожденную) систему макромолекулярных комплексов, синтезированных в необходимом и достаточном количестве в период сперматогенеза. Непрерывное взаимодействие этих комплексов, модулированное (посредством АТФ) деятельностью системы митохондрий, обеспечивает закономерные,

самопроизвольные изменения структуры и функциональных проявлений гаметы.

В первую очередь модифицируется структура и, соответственно, проницаемость наружной мембраны. Некоторые изменения внешней среды (осмотичности, появление ряда белковых факторов) играют роль своего рода триггеров, запускающих механохимический процесс.

В отсутствии таких триггерных воздействий состояние клетки самопроизвольно и кардинально изменяется: снижается внутриклеточная концентрация АТФ до уровня, характерного для невозбудимых соматических клеток; вероятно, повышается порог для запуска механохимических процессов. In vitro клетки фрагментируются на стандартные "блоки". Для клеток in situ, возможно предполагать развитие событий по иному "сценарию": формируются характерные морфологические аномалии - изгибание и скручивание хвоста (Holt, 1982; Sankai et al., 2001), сопровождающиеся, вероятно, уменьшением площади наружной мембраны, вплоть до полного заключения сократительной системы в общую с ядром и митохондриальным аппаратом, мембрану (Lobl, Mathews, 1978; Andersen Berg et al., 1996; Molnar et al., 2001).

Переход из первого состояния во второе осуществляется в соответствии с сигмоидальными зависимостями, в т. ч., в соответствии с сигмоидой Гомпертца.. Последнее позволяет определить такие переходные процессы как кульминационные моменты «старения» клеток.

В последние годы появились сообщения о том, что в сперматозоидов, как правило, с пониженной двигательной активностью, диагностируются признаки апоптоза: транслокация фосфатидилсерияа в наружных мембранах, активная каспаза-3 и фрагментация ядерной ДНК (Donnelly et al., 2000; Ricci et al., 2002; Weng et al., 2002). Представляется странным непосредственное приложение понятия «апоптоз», т. е. запрограммированной клеточной гибели, по отношении к клеткам с абсолютно репрессированным геномом. Существенно более продуктивным кажется концепция «дифференцирующего апоптоза» (Самуилов и др., 2000, Самуилов 2001), т.е. апоптоза, инициированного задолго до инактивации собственного генома гаметы. Очевидная закономерность распада сперматозоидов на «стандартные блоки» (головку, комплексы головки с шейкой и хвоста с шейкой) позволяет предполагать, что деструкция этой высокоспециализированной клетки обеспечена столь же закономерными эндогенными процессами.

Еще раз следует подчеркнуть, что последовательность событий деградации сперматозоидов самопроизвольна и, хотя внешние факторы могут повлиять, например, на скорость ее осуществления, предотвратить ее невозможно. Очевидно, в этой связи, невозможно создание неограниченно долго переживающей стационарной культуры сперматозоидов. Между тем, как метаболически инертное ядро живого сперматозоида, так и ядро «убитого» (подвергнутого действию гистологического фиксатора, либо • высушенного сперматозоида), способно обеспечить формирование нормального диплоидного организма (Tateno et al., 1998; Wakayama, Yanagimachi, 1998; Kusakabe et al., 2001; Liu et al., 2004).

Выводы

1. Двигательная активность переживающих in vitro тестикулярных сперматозоидов вьюна изменяется фазически: периоды ослабления движения сменяются периодами его интенсификации. Двигательная активность на протяжении таких периодов может превосходить таковую сперматозоидов из свежеполученной суспензии. Это явление свидетельствует о самопроизвольном «дозревании» характерных функций клетки в лишенной нутриентов минеральной среде.

2. Потеря способности сперматозоидов к движению сопровождается повышением сорбции к витальным красителям и существенным падением внутриклеточной концентрации АТФ, но не может служить свидетельством гибели. клетка. Содержание АТФ в неподвижных, проницаемых для красителя сперматозоидах, обеспеченное неизменно высокой активностью митохондриальной системы, сохраняется на уровне, характерном для невозбудимых соматических клеток.

3. Сокращение численности и кинетика падения функциональных показателей сперматозоидов по мере их переживания in vitro хорошо описываются сигмоидальными зависимостями. Переходные процессы, кинетика которых соответствует сигмоидальной зависимости Гомпертца (падение численность элементов суспензии, повышение сорбции витальных красителей), возможно рассматривать как кульминацию процесса старения, как целых клеток, так и

внутриклеточных структур, обеспечивающих этот переход. Переходные процессы, осуществляющиеся в соответствии с логистический закономерностью (падение концентрации АТФ), напротив, позволяют предполагать существование эндогенных процессов, противодействующих завершению перехода.

4. Эпидидимальные сперматозоиды мыши способны переживать in situ при низких. положительных температурах в течение 18- суток после умерщвления животного. По истечении этого срока, извлеченные из эпидидимиса сперматозоиды могут сохраняться при той же температуре in vitro от 4 до 21 дня.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мохаммедзаде СМ.,. Максудов Г.Ю, Доронин Ю.К Кривые выживания активированных яиц вьюна (Misgumus fossilis. L), содержавшихся при различных температурах. В: V Международный симпозиум «Биологические механизмы старения». Тезисы докладов. 2002. Харьков, сс.35-36.

2. Мохаммедзаде СМ., Максудов Г.Ю, Доронин Ю.К. Кривые выживания активированных яиц вьюна. (Misgurnus fossilis L), содержавшихся при различных температурахЛЪе 3rd International Iran and Russia conference "Agriculture and natural resources" .2002. MTAA Moscow, p. 147.

3. Doronin U.K., Mohammadzadeh Saied. Investigation to motility form in loach (Misgumus Fossilis L). 10th Iranian Resarchers' Seminars in Europe. 2003, p. 53 Cambridge, UK.

4. Мохаммедзаде СМ., Доронин Ю.К. Максудов Г.Ю., Длительное сохранение жизнеспособности постмортальными эпндидимальными сперматозоидами мышей. Научно - практическая конференция «Зоокультура и биологические ресурсы», 2004 (Москва) (в печати).

5. jdf (hjJ ¿y^J * it ju i oi'jjJ giv (^is-jS jjjj j »¿l^w*

(Доронин Ю.К., Мохаммадзаде СМ. Старение. Научный журнал исламской ассоциаций иранских студентов в Москве. 2003, №6, ее. 16-23.)

.ТГ-U 1 .JUi ^ГАТ

»8- 74 24

Подписано в печать 13.04.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 77 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мохаммадзаде Саид Мозбан

Введение.

Обзор литературы. Механизмы специфической активности сперматозоидов.

Сперматозоиды рыб.

Сперматозоиды млекопитающих.

Материалы и методы.

Получение суспензии сперматозоидов.

Сперматозоиды рыбы.!.

Сперматозоиды м ыши.

Анализ суспензий сперматозоидов.

Протокол опыта по выживанию сперматозоидов мыши в трупе.

Статистическая обработка и приемы формального анализа результатов исследования.

Результаты исследования

Выживание сперматозоидов вьюна in vitro.

Динамика численности элементов суспензии тестикулярных сперматозоидов вьюна.

Двигательная активность сперматозоидов вьюна.

Изменение численности способных к активации движения сперматозоидов.

Изменение средней скорости движенияи пробега сперматозоидов.

Изменение количества движения сперматозоидов.

Динамика метящихся эозином сперматозоидов.

Динамика метки йодистым пропидием.

Динамика внутриклеточной концентрации АТФ в переживающих при различных температурах сперматозоидах.

Динамика внутриклеточной концентрации АТФ после активации движения сперматозоидов.

Динамика активности митохондрии сперматозоидов.

Выживание сперматозоидов мыши in vitro

Морфологические структуры в суспензии содержимого семенного канальца мышей.

Сперматозоиды мыши in vitro, 37° С.

Динамика форм суспензии.

Динамика функциональных показателей.

Сперматозоиды мыши in vitro, 6° С.

Динамика форм суспензии.

Выживание сперматозоидов мыши в мертвом теле.

Выживание сперматозоидов in vitro после извлечения из трупа.

Обсуждение результатов

Об аномальных формах сперматозоидов теплокровных.

Динамика показателей жизнеспособности сперматозоидов мыши in vitro.

Динамика показателей жизнеспособности сперматозоидов рыбы in vitro.

Стареют ли сперматозоиды?.

Как гибнут сперматозоиды?.

Постмортальное переживание сперматозоидов in situ.

Выводы.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Мохаммадзаде Саид Мозбан

Выводы

1. Двигательная активность переживающих in vitro тестикулярных сперматозоидов вьюна изменяется фазически: периоды ослабления движения сменяются периодами его интенсификации. Двигательная активность на протяжении таких периодов может превосходить таковую сперматозоидов из свежеполученной суспензии. Это явление свидетельствует о самопроизвольном «дозревании» характерных функций клетки в лишенной нутриентов минеральной среде.

2. Потеря способности сперматозоидов к движению сопровождается повышением сорбции к витальным красителям и существенным падением внутриклеточной концентрации АТФ, но не может служить свидетельством гибели клетка. Содержание АТФ в неподвижных, проницаемых для красителя сперматозоидах, обеспеченное неизменно высокой активностью митохондриальной системы, сохраняется на уровне, характерном для невозбудимых соматических клеток.

3. Сокращение численности и кинетика падения функциональных показателей сперматозоидов по мере их переживания in vitro хорошо описываются сигмоидальными зависимостями. Переходные процессы, кинетика которых соответствует сигмоидальной зависимости Гомпертца (падение численность элементов суспензии, повышение сорбции витальных красителей), возможно рассматривать как кульминацию процесса старения, как целых клеток, так и внутриклеточных структур, обеспечивающих этот переход. Переходные процессы, осуществляющиеся в соответствии с логистический закономерностью (падение концентрации АТФ), напротив, позволяют предполагать существование эндогенных процессов, противодействующих завершению перехода.

Эпидидимальные сперматозоиды мыши способны переживать in situ при низких положительных температурах в течение 18 суток после умерщвления животного. По истечении этого срока, извлеченные из эпидидимиса сперматозоиды могут сохраняться при той же температуре in vitro от 4 до 21 дня.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мохаммадзаде Саид Мозбан, Москва

1. Виленчик М.М. 1987. Биологические основы старения и долголетия. М., "Знание", 221 сс.

2. Гаврилов JLA., Гаврилова Н.С. 1991. Биология продолжительности жизни. М., Наука,, 280 сс.

3. Доронин Ю.К., Максудов Г.Ю. 2002. Зрелые половые клетки как объект цитогеронтологии. В: "Биологические механизмы старения". V Международный симпозиум. Тезисы докладов. Харьков, с. 35.

4. Максудов Г.Ю., Артюшкова В.А. 1988. Физиологическая консервация семени животных., Пущино ОНТИ НЦБИ, 78 сс.

5. Самуилов В.Д. 2001а. Программируемая клеточная смерть у растений. Соросовский образовательный журнал. 7, №10, с. 12-17.

6. Самуилов В.Д. 20016. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных. Соросовский образовательный журнал. 7, №10, с. 18-25.

7. Самуилов В.Д., Олескин A.B., Лигунова Е.М. 2000. Программируемая клеточная смерть. Биохимия, 65, вып. 8, с.1029-1045.

8. Скулачев В.П. 2001. Явление запрограммированной смерти. Организм. Соросовский образовательный журнал. 7, №10, с.2-6.

9. Турдаков А.Ф. 1972. Воспроизводительная система самцов рыб. «Илим», Фрунзе,. 144 сс.

10. Турдаков А.Ф. 1971. Влияние температурных условий на скорость движения и оплодотворяющую способность спермиев некоторых иссыккульских рыб. Вопросы ихтиологии, 11, № 2, с.258-270.

11. Угарова Н.Н. 1993. Биоаналитические применения люциферазы светляков Прикл. биохимия и микробиол. 29. с. 180-192.

12. Хохлов А.Н. 1988. Пролиферация и старение. В: Итоги науки и техники. Серия «Общие проблемы физико-химической биологии», Т. 9. М., ВИНИТИ, 176 сс.

13. An T.Z., Wada S., Edashige К., Sakurai Т., Kasai M. 1999. Viable spermatozoa can be recovered from refrigerated mice up to 7 days after death. Cryobiology, vol. 38, p. 27-34.

14. Andersen Berg K., Filseth O., Engeland E. 1996. A sperm midpiece defect in a Hereford bull with variable semen quality and freezability Acta Vet. Scand., 37, p.367 373.

15. Babcock D.F., Pfeiffer D.R. 1987. Independent elevation of cytosolic Ca2+. and pH of mammalian sperm by voltage-dependent and pH-sensitive mechanisms. J. Biol. Chem., 262, p. 15041-15047.

16. Baldi E.M., Luconi M., Bonaccorsi L., Krausz C., Forti G. 1996. Human sperm activation during capacitation and acrosome reaction: role of calcium, protein phosphorilation and lipid remodeling pathways. Front. Biosci., 1, p. 189-205.

17. Barrios В., Perez-Pe R., Gallego M., Tato A., Osada J., Muino-Blanco Т., Cebrian-Perez J.A. 2000. Seminal plasma proteins revert the cold-shock damage on ram sperm membrane. Biol. Reprod., 63,p.l531-1537

18. Baynes S.W., Scott A.P., Dowson A.P. 1981. Rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, spermatozoa: Effects of and pH on motility. J Fish Biol., 19, p. 259-267.

19. Beltran C., Darszon A., Labarca P., Lievano A. 1994. A high-conductance voltage-dependent multistate Ca channel found in sea urchin and mouse spermatozoa. FEBS Lett., 338, p. 23 26.

20. Billard R., Cosson M.P. 1988. Sperm motility in rainbow trout Parasalmo mykiss; effect of pH and temperature. In: "Reproduction in Fish . Basic and Aspects in Endocrinologie and Genetics" (ed. B.Breton, B.Zohar), p. 161-167. INRA, Paris.

21. Billard R., Cosson M.P. 1990. The energetics of fish sperm motility. In: "Controls of Sperm Motility: Biological and Clinical Aspects" (ed. C.Gagnon), p. 153-173. CRC Press, Boston.

22. Billard R., Cosson M.P. 1992. Some problems related to the assessment of sperm motility in freshwater fish. J. Exp. Zool., 261, p. 122 131.

23. Bishop M.W. 1970. Ageing and reproduction in male. J. Reprod. Fértil., 12, p. 65-87.

24. Blom E. 1966. A new sterilizing and hereditary defect (the "Dag defect") located in the bull sperm tail // Nature, 209, p. 739 740.

25. Blom E., Wolstrup C. 1976. Zinc as a possible causal factor in the sterilizing sperm tail defec? The "Dag-defect", in Jersey bull. Nord. Vet. Med., 28, p.515 518.

26. Boatman D.E., Robbins R.S. 1991. Bicarbonate: carbon-dioxide regulation of sperm capacitation, hyperactivated motility and acrosome reactions. Biol. Reprod., 44, p. 806 813.

27. Boitano S., Omoto C.K. 1988. Ionic requirements for the initiation of trout sperm motility. J. Cell Biol., 107, p. 168.

28. Boitano S., Omoto C.K. 1991. Membrane hyperpolarization activates trout sperm without an increase in intercellular pH. J. Cell Sci., 98, p. 343-349.

29. Boitano S., Omoto C.K. 1992. Trout sperm swimming pattern and role of intracellular Ca^. Cell Motil. Cytoskel., 21, p. 74 82.

30. Bujan L., Mieusset R., Mondinat C., Mansat A., Pontonnier F. 1988. Sperm morphology in fertile men and its age related variation. Andrologia, 20, p.121 128.

31. Calvete J.J., Mann K., Sanz L., Raida M., Topfer-Petersen E. 1996. The primary structure of BSP-30K, a major lipid-, gelatin-, and heparin-binding glycoprotein of bovine seminal plasma. FEBS Lett., 399, p. 147-152.

32. Christen R., Gatty J. L., Billard R., 1987. Trout sperm motility, the transient movement of trout sperm is related to changes in content of ATP following the activation of flagellar movement. Eur. J. Biochem., 166. p. 667-671.

33. Clark E.N., Corron M.E., Florman H.M. 1993. Clatrin, the calcium transport regulatory peptide of spermatozoa, modulates acrosome axocytosis in the response to the egg's zona pellucida. J. Biol. Chem., 268, p. 5309 5316.

34. Cohen-Dayag A., Tur-Kaspa I., Dor J., Mashiash S., Eisenbach M. 1995. Sperm capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, p. 11039- 11043.

35. Cordoba M., Santa-Coloma T.A., Beorlegui N.B., Beconi M.T. 1997. Intracellular calcium variation in heparin-capacitated bovine sperm. Biochem. Mol. Biol. Int., 41, p. 725 733.

36. Cornwall G.A., Smyth T.B., Vindivich D., Harter C., Robinson J., Chang T.S. 1986. Induction and enhancement of progressive motility in hamster caput epididymal spermatozoa Bio.Reprod. 35, p. 1065-1074.

37. Cornwall G.A., Vindivich D., Tillman S., Chang T.S. 1988. The effect of sulfhydryl oxidation on the morphology of immature hamster epididymal spermatozoa induced to acquire motility in vitro. Biol Reprod. 39, p. 141155.

38. Cosson J., Linhart O. 1996. Paddlefish (Polyodon spathula) spermatozoa: effects of potassium and pH on motility. Folia Zoologica, 45, p. 361 370.

39. Cosson J., Linhart O., Mims S.D., Shelton W.L., Rodina M. 2000. Analysis of motility parameters from paddlefish (Polyodon spathula) and shovelnose sturgeon (Scaphirhynchus platorynchus) spermatozoa. J. Fish Biol., 56, p. 1348- 1367.

40. Cosson M.P., Billard R., Letellier L. 1989. Rise of internal Ca++ accompanies the initiation of trout sperm motility. Cell Motil. Cytoskel., 14, p. 424 434.

41. CossonM.P., Cosson J., Andre F., Billard R. 1995. cAMP/ATP relationship in activation of trout sperm motility: their interaction in membrane-deprived models and in live spermatozoa. Cell Motil. Cytoskeleton, 31, p. 159 -176.

42. Cox T., Peterson R.N. 1989. Identification of calcium conducting channels in isolated boar sperm plasma membranes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, p.162 168.

43. Cross N.L., Razy-Faulkner P. 1997. Control of human sperm intracellular pH by cholesterol and relationship to the response of the acrosome to progesterone. Biol. Reprod., 56,p.ll69 1174.

44. Cummins J.M., Jequier A.M., Kan R. 1994. Molecular biology of the human male infertility: links with aging, mitochondrial genetics and oxidative stress. Mol. Reprod. Dev. 37,p. 345-362.

45. Darszon A., Labarca P., Nishigaki T., Espinosa F. 1999. Ion channels in sperm physiology. Phisiol. Rev., 79, p. 481 510.

46. Davis B.K., Byrne R., Bedigian K. 1979. Studies on the mechanism of capatitation: albumin-mediated changes in plasma membrane lipids during in vitro incubation of rat sperm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, p. 257 -266.

47. Donnelly E.T., O'Connell M., MeClure N., Lewis S.E. 2000. Differences in nuclear DNA fragmentation and mitochondrial integrity of semen and prepared human spermatozoa. Human Reprod., 15, p. 1552-1561.

48. Flechon J.E., Hunter R.F. 1981. Distribution of spermatozoa in the utero-tubal junction and isthmus of pigs, and their relationship with the luminal epithelium after mating: a scanning electron microscope study. Tissue Cell, 13:p.l27-139.

49. Florman H.M., Corron M.E., Kim T.D.-H., Babcock D.F. 1992. Activation of voltage-dependent calcium channels of mammalian sperm is required for zona pellucida-induced acrosomal exocytosis. Dev. Biol., 152:p.304-314.

50. Garner D.L., Thomas C.A., Gravance C.G., Marshall C.E., DeJarnette J.M., Allen C.H. 2001. Seminal plasma addition attenuates the dilution effect in bovine sperm. Theriogenology, 56:p.31-40.

51. Gatti J.L., Billard R., Christen R. 1990. Ionic regulation of the plasma membrane potential of rainbow trout (Salmo gairdneri) spermatozoa: role in the initiation of sperm motility. J. Cell. Physiol., 143: p.546 554.

52. Ginsburg A.S. 1963. Sperm-egg assotiation and its relationship to the activation of the egg in salmoid fishes. J. Embriol. And Exp. Morphol.,11: p.13-33

53. Go K.J., Wolf D.P. 1985. Albumin-mediated changes in sperm sterol content during capacitation. Biol. Reprod., 32, p. 145 153.

54. Hellander J.C., Samper J.C., Carbo B.G.1991. Fertility of a stallion with low sperm motility and a high incidence of an unusual sperm tail defect. Vet. Rec., 128, 449-451.

55. Hishinuma A., Suzuki K., 2003.Sekine J. Recovery and cryopreservation of Sika-Deer (Cervus-Nippon) spermatozoa from epididymides stored at 4-degrees-C. Theriogenology, vol. 59, p. 813-820.

56. Jenkins A.D., Lechene C.P.,Howard S.S. 1980. Concentration of seven elements in the intraluminal fluids of the rat seminiferous tubules, rat testis, and epididymis. Biol. Reprod. 23,p.981-987.

57. Kaabi M., Paz P., Alvarez M., Anel E., Boixo J.C., Rouissi H., Herraez P., Anel L. 2003. Effect of epididymis handling conditions on the quality of ram spermatozoa recovered post-mortem. Theriogenology, , vol. 60, p. 12491259.

58. Kelso K.A., Redpath A., Noble R.C., Speake B.K. 1997. Lipid and antioxidant change in spermatozoa and seminal plasma throughout the reproductive period of bulls. J. Reprod. Fertil. 109, 1-6.

59. Khokhlov A.N. 2000. Cell aging studies at the junction of millennia. In: "Recent Advancement of Aging Mechanism". Program and Proceedings of the 2nd International Aging Symposium, p 23-31.

60. Kishikawa H., Tateno H., YanagimachiR 1999. Fertility of mouse spermatozoa retrieved from cadavers and maintained at 4 degrees C. J.Repr. Fert.,, vol. 116, p. 217-222.

61. Kusakabe H, Szczygiel M.A., Whittingham D.G., Yanagimachi R. 2001. Maintenance of genetic integrity in frozen and freeze-dried mouse spermatozoa. Proc Natl Acad Sci U S ANov 20,98, p. 13501-13506.

62. Marian T., Krasznai Z., Balkay L., Balazs M., Emri M., Bene L., Tron L. 1993. Hypo-osmotic shock induces an osmolality-dependent permeabilization and structural changes in the membrane of carp sperm. J. Histochem. Cytochem. 41, p. 291 297.

63. Marian T., Krasznai Z., Balkay L., Emri M., Tron L. 1997. Role of extracellular and intracellular pH in carp sperm motility and modification by hyperosmosis of regulation of the Na+/H+ exchanger. Cytometry, 27, p.374 382.

64. Mims S.D. 1991. Evaluation of activator solutions, motility duration and short-term storage of paddlefish spermatozoa. World Aquacult. Society, 22, p. 224 229.

65. Molnar A., Sarlos P., Fancsi G., Ratky J., Nagy S., Kovacs A. 2001. A sperm tail defect associated with on fertility in goat case report. Acta Vet. Hung., 49, p.341-348.

66. Morisawa M., Suzuki K. 1980. Osmolality and potassium ion, their roles in initiation of sperm motility in teleost. Science, 210, p. 1145 1147.

67. Morisawa M., Suzuki K., Shimizu H., Morisawa S., Yasuda K. 1983. Effects of osmolality and potassium on motility of spermatozoa from freshwater cyprinid fishes. J. Exp., Biol., 107, p. 95 103.

68. Nakamura M., Moriya M., Baba T., Michikawa Y., Yamanobe T., Arai K., Okinaga S., Kobayashi T. 1993. An endoplasmic reticulum protein, calreticulin, is transported into the acrosome of rat sperm. Exp. Cell Res., 205,p.l01-110.

69. Neil J.M., Olds-Clarke P. 1987. A computer-assisted assay for mouse sperm hyperactivation demonstrates that bicarbonate but not bovine serum albumin is required. Garnet Res., 18, p. 121 140.

70. Oda S., Morisawa M. 1993. Rises of intracellular Ca2+ and pH mediate the initiation of sperm motility by hyperosmolality in marine teleosts. Cell Motil. Cytoskeleton, 25, p. 171 178.

71. Parrish J., Susko-Parrish J.L., First N.L. 1989. Capacitation of bovine sperm by heparin: inhibitory effect of glucose and role of intracellular pH. Biol. Reprod., 41 ,p. 683-699.

72. Perchec G., Jenlin C., Cosson J., Andre F., Billard R. 1995. Relationship between sperm ATP content and motility of carp spermatozoa. J. Cell Sci., 108, p.747-753.

73. Perchec P.G., Gatti J.L., Cosson J., Jeulin C., Fierville F., Billard R. 1997. Effects of extracellular environment on the ocmotic signal transduction involved in activation of motility of carp spermatozoa. J. Reprod. Fertil., 110, p.315-327.

74. Ponce A.A. Airies V.A., Carrascosa R., Fiol de Cuneo M., Ruiz R.D., Lacuara J.L. 1998. Functional activity of epididymal Chinchilla laniger spermatozoa cryopreserved in different extenders. Res. Vet. Sei. vol. 64, p. 239-243.

75. Rait D.M., Goldenberg M., Fetterolf P., Thompson D., Dor J., Mashiach S., Garbers D.L., Eisenbach M. 1991. Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88 , p.2840-2844.

76. Redondo-Muller C., Cosson M.P., Cosson J., Billard R. 1991. In vitro maturation of the potential for movement of caep spermatozoa. Mol. Rep. Dev., 29, p. 259 270.

77. Ricci G., Perticarari S., Fragonas E., Giolo E. et al. 2002. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reprod., 17, p.2665-2672.

78. Robitalle P.M., Munford K., Brown G. 1987.31P nuclear magnetic study of trout spermatozoa at rest, after motility, and during short-term storage. Biochem. Cell. Biol., 65, p. 474 485.

79. Rufo G.A., Singh J.P., Babcock D.F., Lardy H.A. 1982. Purification and characterization of a calcium transport inhibitor protein from bovine seminal plasma.J. Biol. Chem., 257, p. 4627 4632.

80. Sankai T., Tsuchiya H., Ogonuki N. 2001. Short-term nonfrozen storage of mouse epididymal spermatozoa Theriogenology, 55, p. 1759-1768.

81. Schwartz D., Mayaux M.J., Guihard-Moscato M.L., Spira A, et al. 1984. Study of sperm morphologic characteristics in group of 833 fertile men Andrologia, 16, p.423-428.

82. Scott F.P., Baynes S.M. 1980. A review of the biology, banding storage of salmonid spermatozoa. J. Fish. Biol., 17, p. 707 739.r127

83. Shi Q.X., Roldan E.R.S. 1995. Evidence that a GABAA-like receptor is involved in progesterone-induced acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa. Biol. Reprod., 52 ,p.373-381.

84. Simeon F.A., Young W.C. 1930.A study of the function of the epididymis. IV. The fate of non-ejaculated spermatozoa in the genital tract of the male guinea-pig., p. 163 175.

85. Soler A.J., Perezguzman M.D., Garde J.J. 2003. Storage of Red Deer epididymides for 4 days at 5-degrees-C effects on sperm motility, viability, and morphological integrity. J. Exp. Zool. vol. 295A, p. 188199.

86. Songsasen N., Tong J., Leibo S.P. 1998. Birth of mice derived by in vitro fertilization with spermatozoa retrieved up to the twenty-four hours after death. J. Exp. Zool. vol. 280, p. 189-196.

87. Stephens R.E., Prior G. 1992. Dynein from serotonin-activated cilia and flagellar extraction characteristics and distinct sites for cAMP-dependent protein phosphorilation. J.Cell Sci., 103, p. 999 1012.

88. Storey B.T. 1995. Interaction between gametes leading to fertilization: the sperm's eye view. Reprod. Fertil. Dev., 7, p. 927-942.

89. Takai H., Morisawa M. 1995. Change in intracellular K+ concentration caused by external osmolality change regulates sperm motility of marine and freshwater teleosts. J. Cell Sci., 108, p. 1175 1181.

90. Tanimoto S., Morisawa M. 1988. Roles for potassium and calcium channels in the initiation of sperm motility in rainbow trout. Dev. Growth Differ., 30, p.117-124.

91. Tash J.S., Krinks M., Patel J., Means R.L., Klee C.B., Means A.R. 1988. Identification, characterization, and functional correlation of calmodulin-dependent protein phosphotase in sperm. J.Cell Biol., 106, p.1625 1633.

92. Tash J.S., Means A.R. 1983. Cyclic adenosine 3',5' monophosphate, calcium and protein phosphorilation in flagellar motility. Biol. Reprod., 28, p. 75 -104.

93. Toth G.P., Ciereszko A., Christ S.A., Dobrowski K. 1997. Objective analysis of sperm motility in the lake sturgeon (Acipenser fulvescens): activation and inhibition conditions. Aquaculture, 154, p. 337 348.

94. Villanueva-Diaz C., Vadillo-Ortega F., Kably-Ambe A., Diaz-Perez M., Krivitzky S.K. 1990. Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa. Fertil. Steril., 54, p. 1180-1182.

95. Vines C.A., Yoshida K., Griffin F.J., Pillai M.C., Morisawa M., Yanagimachi R., Cherr G.N. 2002. Motility initiation in herring sperm is regulated by reverse sodium-calcium exchange. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, p. 2026-2031.

96. Visconti P.E., Bailey J.L., Moore G.D., Pan D., Olds-Clarke P., Kopf G.S.I995a. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development, 121, p.l 129-1137.

97. Visconti P.E., Kopf G.S. 1998. Regulation of protein phosphorylation during sperm capacitation. Biol. Reprod., 59, p. 1 6.

98. Vishwanath R., Shannon P. 1997. Do sperm cells age? A review of physiological changes in sperm during storage at ambient temperature. Reprod. Fertil. Dev. 9,p.321-331.

99. Wakayama T, Yanagimachi R. 1998. Development of normal mice from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa. Nat Biotechnol. 16(7),p.639-641.

100. Weil M., Jacobson M.D., Raff M.C. 1998. Are caspases involved in the death of cells with a transcriptionally inactive nucleus? Sperm and chicken erythrocytes. J. Cell Sci., Ill, p.2707-2715.

101. Weng S.L., Taylor S.L., Morshedi M., Schuffner A. et al. 2002. Caspase activity and apoptotic markers in ejaculated human sperm. Mol. Human Reprod., 8,p.984-991.

102. White D.R., Aitken R.J. 1989. Relationship between calcium, cyclic AMP, ATP and intracellular pH and the capacity of hamster apermatozoa to express hyperactivated motility. Garnet Res., 22 p. 163-177.

103. Witman M. 1992. Axonemal dyneins. Curr. Opin. Cell Biol., 4, p. 74 79.

104. Young W.C. 1929a. A study of the function of the epididymis. I. Is the attainment of full spermatozoon maturity attributable to some specific action of the epididymal secretion? J. Morph. Physiol., 47, p. 479 495.

105. Yu I., Leibo S.P. 2002. Recovery of motile, membrane-intact spermatozoa from canine epididymides atored for 8 days at 4 degrees C. Theriogenology, 57 ,p. 1179-1190.

106. Zeng Y., Clark E.N., Florman H.M. 1995. Sperm membrane potential: hyperpolarization during capacitation regulates zona pellucida-dependent acrosomal secretion. Dev. Biol., 171 ,p. 554-563.